高效液相色谱与质谱联用分析测定川芎中有效成分阿魏酸与藁本内酯_孔亮 (2)

高效液相色谱与质谱联用分析测定

川芎中有效成分阿魏酸与藁本内酯

孔 亮 于志远 邹汉法* 孙乃昌 吴丽华 倪坚毅

(中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心,大连116011)

摘 要 采用HPL C -M S 系统地研究了中药川芎有效成分阿魏酸(f er ulic acid )和藁本内酯(ligustilide )的定

量分析方法。利用制备色谱制备了藁本内酯对照品,并对其进行了紫外光谱、质谱、红外光谱等结构鉴定。分

别考察了水、甲醇、乙醇、95%乙醇4种溶剂以及提取时间对川芎中阿魏酸和藁本内酯提取量的影响。结果表

明:水是阿魏酸的最佳提取溶剂,提取时间45min 为宜;乙醇是适合提取藁本内酯的溶剂,提取时间75min

为宜。以外标法对市售川芎中的阿魏酸与藁本内酯进行了定量分析,二者含量分别是0.15%(m /m )和0.

82%(m /m )。

关键词 高效液相色谱与质谱联用,川芎,质量控制,阿魏酸,藁本内酯

2003-10-31收稿;2004-02-12接受

本文系国家自然科学基金资助项目(No.90209056)

1 引 言

川芎(Rhiz oma Chuanx iong)为伞形科植物川芎(L igusticum chuanx iong Hort.)的干燥根茎,具有行气活血、祛风止痛之功效,为活血化瘀常用中药。据报道其含有内酯类、生物碱、有机酸类或酚类以及中性油类等多种有效成分[1,2]。中药作为天然产物,有效成分含量易受产地、气候、加工工艺等因素的影响,因此,中药质量控制是保证其药效稳定的重要技术课题[3,4]。由于阿魏酸(f er ulic acid )与藁本内酯(ligustilide )是川芎的主要活性成分(其分析结构见图1),因此,对二者或其中之一的定量分析应用于质量控制的研究较多,如:薄层色谱法(TLC)、分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、气/液质联用 图1 阿魏酸(a)和藁本内酯(b)的分子结构式F ig.1 M olecular structur e of ferulic acid (a )and ligustilide (b)

(GC/LC -M S)、毛细管电泳(CE )及指纹图谱(FPS )

等[5~11]。本实验采用高效液相色谱与质谱联用对川芎

中的阿魏酸和藁本内酯两种主要有效成分进行定性、定

量分析。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

LCMS -2010型液相色谱质谱联用仪(日本岛津公司);LC -8A 高效液相制备色谱仪,SPD -10Avp 紫外可见检测器(日本岛津公司);7725i 进样阀(美国Rheodyne 公司),WDL -95色谱工作站(国家色谱研究分析中心,大连)。C 18色谱柱(分析型4.0m m @200mm i.d.,5L m;制备型8.0mm @250mm i.d.,5L m,色谱填料均为Kromasil)和DL 型固相萃取器及萃取柱(国家色谱研究与分析中心)。

乙腈(色谱纯,上海陆都化学试剂厂);无水乙醇(分析纯,天津石英钟厂霸州市化工分厂);甲醇(色谱纯,山东禹王实业有限公司禹城化工厂);95%乙醇(分析纯,天津市科密欧化学试剂开发中心);无水乙醚(分析纯,天津市博迪化工有限公司);冰醋酸(分析纯,沈阳市联邦试剂厂);川芎(购于当地中药店);藁苯内酯从川芎中制备,用制备高效液相色谱进一步纯化;阿魏酸购于Sigma 公司(St.Louis,MO,U SA);纯水经Mill-i Q 水处理系统(美国M illipore 公司)纯化。

2.2 单味中药的提取

准确称取10g 经粉碎的川芎粉末(粒径[0.5m m)置入烧瓶内,加入75mL 的水/甲醇/乙醇/95%乙醇浸泡30min,回流煮沸计时,将提取液经微孔滤膜(0.5L m)过滤得到进样溶液。

第32卷

2004年11月分析化学(FENX I HU AX U E) 研究报告Chinese Journal of A naly tical Chemistry 第11期1421~1425

考察提取时间时,采用两口烧瓶,其中之一与回流冷凝管相连,另外一个瓶口用玻璃塞密封,可用于定时取样。为防止长时间加热引起提取液蒸发而导致溶液损失,将回流冷凝管溢出的蒸汽再冷凝回流到提取液中。在加热过程中定时从提取液中抽取样品0.1mL,离心过滤后即得进样溶液。

定量分析时,川芎提取液要经过SPE 预处理:精确移取3mL 提取液加入到经活化的SPE 柱中(250mg C 18,40L m,活化条件:5mL 乙腈淋洗后,用6mL 水淋洗备用。)滤过,收集滤液;再精确移取1mL 乙腈淋洗,收集滤液;合并滤液,并转移至50mL 容量瓶中定容得分析样品溶液。

2.3 色谱条件

定量分析:流动相A 为乙腈(含0.1%乙酸);流动相B 为水(含0.1%乙酸)。梯度洗脱,0~8m in 30%A~50%A;8~40min 50%A 。流速0.76mL/min,二极管阵列检测器检测。

色谱制备:流动相为50%甲醇,流速3.0mL/min,280nm 检测。

2.4 藁本内酯的制备

称取经粉碎的当归160g 置入烧瓶内,加入700mL 无水乙醇,浸泡30min,加热回流1h,过滤(0.5L m)制备提取液。40e 减压蒸馏挥发掉提取液中溶剂得膏状物。以装有30g 的40L m C 18填料的SPE 柱分离上述提取物,分别用30/70,50/50,20/80(V /V )的甲醇/水溶液和纯甲醇淋洗,收集洗脱的馏分。经液/质联用分析,藁本内酯在80%甲醇溶液洗脱的馏分中。40e 减压蒸馏挥发掉溶剂得膏状物。以制备型C 18柱纯化经初步提纯的藁本内酯。经固相萃取(SPE)柱浓缩,减压蒸馏挥发掉溶剂,得到纯度大于98%的藁本内酯。藁本内酯最终由RP -HPLC 、紫外光谱、质谱及红外光谱作结构鉴定。

2.5 标准溶液的配制

精确称取16.0mg 藁苯内酯,将其转入25mL 容量瓶中,50B 50(V /V )乙腈/水溶液溶解,定容至刻度。移取2mL 所配溶液,用50B 50(V/V )乙腈/水溶液稀释于50mL 容量瓶中,定容后制成进样溶液。

精确称取19.3mg 阿魏酸标准品,将其转入50mL 容量瓶中用50B 50(V /V )乙腈/水溶液溶解,定容至刻度。准确移取3mL 所配溶液至50mL 容量瓶中,定容至刻度制成进样溶液。

3 结果与讨论

3.1 川芎中阿魏酸与藁本内酯的结构鉴定

川芎的水提取物与乙醇提取物的色谱分离图见图2。其中1号峰的紫外光谱图与阿魏酸对照品一致(见图3A),HPLC -M S 测得分子离子峰的分子量为193[M -H +]-(图略),从而可以确定1号峰是阿 图2 川芎的水提取物(A)和乙醇提取物(B)的色谱图

Fig.2 Chro matogr ams of w ater extracts (A )and ethanol ex tracts (B)from Rhiz oma Chuanxiong 1.阿魏酸(ferulic acid); 2.藁本内酯(ligustilide)。魏酸。通过HPLC -DAD 获得2号峰的紫外光谱图,分别在

206、280、326nm 有3个吸收峰(见图3b),H PLC -MS 测得

分子离子峰的分子量为232[M +H ++CH 3CN]+(图略),

制备2号峰(见实验部分),并测定其红外光谱,主要的红外

吸收峰(cm -1)是:3049(C H )、1764(内酯键)、1670、

1624(C C C C )、1272、961(C C ),光谱

数据与标准的藁本内酯红外谱图一致[12],确定为藁本内

酯。

3.2 对川芎的提取溶剂及提取时间的考察

实验考察了水、甲醇、乙醇及95%乙醇4种溶剂及加热提取时间对川芎活性成分浸出量的影响。4种溶剂在提

取川芎的实验中,随着加热时间的变化,在C 18色谱柱上保

留组分含量(色谱峰面积)相应发生变化。以阿魏酸、藁本

内酯为指标,分别测定二者色谱峰面积随提取时间的变化

趋势。从图4中可知,水作为阿魏酸的提取溶剂的浸出效率最高,在45m in 时达到最大值。由于水的沸点高,阿魏酸随着加热浸出时间的延长缓慢分解,峰面积逐渐减少。95%乙醇在120m in 时阿魏酸的提取量达到极值,随后峰面积因阿魏酸的分解相应减少。甲醇与乙醇的提取量随时间缓慢增加,但提取1502 分析化学第32卷

量要低于水。

图3 阿魏酸与藁本内酯的紫外光谱图

F ig.3 U ltraviolet (U V)spectra for ferulic acid and ligustilide

a.阿魏酸对照品($)与色谱峰1(()的紫外光谱图(UV spectra for standard of ferulic acid ($)and peak 1

(()); b.色谱峰2的紫外光谱图(U V spectrum of peak 2)。峰1和峰2见图2(peak 1and peak 2are show n

in Fig.2)。

在4种溶剂中,水作为提取藁本内酯溶剂的提取量最低(见图5);乙醇、95%乙醇、甲醇分别在75、105和135min 时藁本内酯的峰面积达到最高值。由此可见,水不适合用于提取象藁本内酯这样的疏水性成分,而另外3种溶剂对藁本内酯的最高提取量基本相同,但乙醇耗时短,更适用于提取藁本内酯。从以上数据可以看出,提取川芎中的阿魏酸时,水的沸点比较高,长时间加热会使阿魏酸分解或转化,最佳提取时间为45min;提取藁本内酯时,乙醇无疑是上述4种溶剂中的最佳溶剂,提取时间以75min

为宜。 图4 溶剂与提取时间对川芎中阿魏酸浸出的影响

Fig.4 Effect of the ex tracting time on the extracted

amount of fer ulic acid in Rhizoma Chuanx iong

with different solvents

(u )水(w ater );(p )甲醇(methanol);(w )乙醇(ethanol);(o )95%乙醇(ethanol)

。 图5 溶剂与提取时间对川芎中藁本内酯浸出的影响F ig.5 Effect of the extr acting time on the ex traced amounts of ligustilide in Rhizoma Chuanxiong w ith different solvents (u )水(water);(p )甲醇(methanol);(w )乙醇(ethanol);(o )95%乙醇(ethanol)。

3.3 市售川芎中阿魏酸与藁本内酯的定量分析

实验使用的所有提取液都经过SPE 处理,原因是中药的提取液中有大量的非极性成分,其在反相色谱柱上保留极强,尤其是在C 18柱上,造成分析时间过长,影响分析效率。经过SPE 处理后,强保留的非极性成分大部分被除去,从而缩短了分析时间。采用外标法对市售川芎提取液中的阿魏酸与藁本内酯进行定量。阿魏酸与藁本内酯的标准曲线方程如下:

阿魏酸:

y =(1.88697@10-7?2.55164@10-9)x -(0.00192?0.00248),r =0.99973,n =5,P <0.0001藁本内酯:

y =(2.10833@10-7?7.01107@10-10

)x +(0.00217?0.00193),r =0.99998,n =5,P <0.0001。y 为进样量(L g),x 为峰面积(325nm)。检测结果及精密度实验见表1。

根据样品溶液的配制,可以计算出阿魏酸与藁本内酯分别占川芎干重的0.15%和0.82%;在波长为325nm 时,阿魏酸和藁本内酯的检出限分别为2.0和2.4ng(信噪比为2)。1503第11期孔 亮等:高效液相色谱与质谱联用分析测定川芎中有效成分阿魏酸与藁本内酯

表1检测结果、精密度和回收率(n=3)

T able1Results of determination,precision and recovery(n=3)

样品Sample

测定值

M easured value

(10-6g/L)

相对标准偏差

RSD

(%)

SPE回收率

Recovery of solid phase

extracti on(%)

实际值

Actual value

(10-6g/L L)

阿魏酸Ferulic acid0.18430.291.950.2004

藁本内酯Liquistilide 1.0025 1.091.5 1.0955

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Determination of the Active Ingredients in Rhizoma Chuanxion g by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

K ong Liang,Y u Zhiyuan,Zou Hanfa*,Sun Naichang,Wu L ihua,Ni Jiany i

(N ational Chromatogr ap hic Research&A nalysis Center,Dalian I nstitute of Chemical Physics,

Chinese A cademy of Sciences,Dalian116011)

Abstract The main active ingredients,f er ulic acid and ligustilide in Chinese traditional medicine,Rhi-z oma Chuanx iong,were separated and identified by high performance liquid chromatography-mass sepc-trum(H PLC-MS).The standard lig ustilide w as prepared w ith preparative scale HPLC and identified by HPLC-diode array detection,m ass spectrometry,infrared spectroscopy.Four kinds of ex tractiting solvent and ex traction time affecting on the ex traction efficiency of f er ulic acid and ligustilide in Rhiz om a Chuanx iong were examined,and a quality control method w as also developed based on the quantitative de-termination of f erulic acid and liguistilide in ex tracted solutions of Rhiz oma Chuanx iong by w ater and ethanol.T he amount of f er ulic acid and ligustilide in Rhiz oma Chuanxiong determined are as much as 0.15%(W/W)and0.82%(W/W).

Keywords H ig h performance liquid chromatography-mass spectrometry,Rhiz oma Chuanx iong,quality control,ferulic acid,ligustilide

(Received31October2003;accepted12February2004) 1504分析化学第32卷

高效液相色谱 质谱联用技术的应用

高效液相色谱质谱联用技术的应用 高效液相色谱(HPLC或LC)是以液体溶剂作为流动相的色谱技术，一般在室温下操作，可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)，分析范围广，而且不需衍生化步骤。质谱是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，是理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度。串联质谱（MS/MS）是将一个质量选择的操作接到另一个质量选择的后面，在单极质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多极裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物定量等。［1］ 高效液相色谱一质谱(HPLC—MS)联用技术是近几年来发展起来的一项新的分离分析技术，将HPLC 对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、环境分析等许多领域得到了广泛的应用。［2］ 本文着重讲述液相色谱质谱联用仪在药物分析、环境分析上的应用。 1液相色谱质谱联用在药学分析上的应用 1.1LC/MS在药物代谢中的应用 Lee等［3］总结了利用LC／MS鉴定药物代谢产物的方法，主要包括以下几个步骤：测定原形药物的质谱；选择准分子离子、加合离子和主要的碎片离子进行多级质谱分析；选择原形药物的主要中性丢失，测定生物样品的中性丢失谱，图谱中的离子即为原形药物和可能的代谢物的分子离子；选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱，所得母离子即为各个代谢物；测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱，解谱得到代谢物的结构。 王宁生等［4］以LC／MS联用技术及标准品对照法，分离检测健康志愿者口服复方丹参滴丸后，血清中水溶性成分及代谢产物，从一级质谱的分子离子峰推测，丹参素及原儿茶醛在体内分别与硫酸及葡萄糖醛酸结合，产生丹参素硫酸结合物及原儿茶醛的葡糖醛酸结合物。 Hsiu SL等［5］研究芍药苷在小鼠体内药代动力学，用LC／MS方法检测体内药物浓度，未检测到芍药苷原形药物；但在血浆及各种排泄物中，均可检测其代谢物，经液相色谱一质谱分析，结合核磁共振(NMR)，确定其为芍药苷的脱糖基代谢物，提示芍药苷给药后，在肠道经细菌转化为PG后，被吸收进入血液循环中发挥作用。 Chen SJ等［6］用LC／DAD／MS／MS联用技术，对山豆根碱在小鼠体内的代谢进行了研究，用ESI ／MSn技术检测山豆根碱的代谢物，并鉴定其主要代谢物为N一去甲基山豆根碱。 1.2LC/MS在药学浓度上的应用 M．Brolis等［7］采用I-IPLC—DAD—MS法从贯叶金丝桃Hyoericum performm中分离鉴定出槲皮素、异槲皮素、金丝桃苷等成分。 Gerthard Brillgma等［8］采用HPLC—NMR和HPLC—ESI—MS—MS法对Habropetalum dawei进行分析，分离鉴定出dioneopeltine、N-methyldioncophylline、N-methyl-7-epi-dioncophylline、tetralone、(1R，3R)和(1S，3R)-N-formyl-8-hydroxy-6-methoxy-l,3-dimthyltetra-hydroisoquinoline等7个已知化合物，以及5’-O-methydioncopeltine、isoquinoline phylline 2个新化合物。 徐智秀等［9］以反相高效液相色谱法分离了9种人参皂苷（I）, 利用三级四级杆质谱研究了9种I的一级质谱（主要给出相对分子质量信息）和二级质谱（提供碎片结构信息），通过它们的质谱图差异对其进行了鉴别, 并将方法用于实际样品中的9种I的定性。 郭继芬等［10］选用Discovery C18柱，以甲醇-水-甲酸(40:60:0.025)为流动相，经紫外检测后，在ESI- 扫描方式下，对HPLC—UV图谱中各色谱峰进行一级和二级质谱分析，与对照品比较鉴定了提取物中4个已知的黄酮类化合物，推断出3个未知黄酮苷类化合物可能的结构。 2液相色谱质谱联用在环境分析上的应用 1

高效液相色谱质谱联用HPLC

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 高效液相色谱质谱联用HPLC .液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索一、实验目的1、了解 LC-MS 的主要构造和基本原理； 2、学习 LC-MS 的基本操作方法； 3、掌握 LC-MS 的六种操作模式的特点及应用。 二、实验原理 1、液质基本原理及模式介绍液相色谱 - 质谱法（ Liquid Chromatography/Mass Spectrometry ， LCMS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。 但是，LC 是液相分离技术，而 MS 是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。 LC-MS 经过了约 30 年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。 现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。 质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。 （一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是 1/ 13

2015年版药典高效液相色谱法、质谱法.doc

2015 年版药典高效液相色谱法、质谱法

2015 版药典 --- 高效液相色谱法、质谱法 0512 高效液相色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处 理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为 3.9 ～ 4.6mm，填充剂粒径为 3～lOμm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约 2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物 等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰 基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残 留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当 提高色谱柱的温度，但一般不宜超过 60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相 pH 值一般应在 2～8 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚 合物色谱柱可耐受更广泛 pH值的流动相，适合于 pH 值小于 2 或大于 8 的流动相。 （2）检测器最常用的检测器为紫外 - 可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、 蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外- 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与 其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射 检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外 - 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈 线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外 - 可见分光检测器所用流动相应符合紫外 - 可见分光光度法（通则 0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测 器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇 - 水系统和乙腈 - 水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈 - 水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动 相中有机溶剂一般不低于 5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。

液相色谱-质谱联用(LC-MS)

液相色谱-质谱联用(LC-MS) LCMS分别的含义是：L液相C色谱M质谱S分离（友情赠送：G是气相^_^） LC-MS/MS就是液相色谱质谱/质谱联用 MS/MS是质谱-质谱联用（通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等） LC-MS/MS与LC-MS比较，M（质谱）分离的步骤是串联的，不是单一的。 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。 色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。 现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。 一、色谱分离基本原理： 由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。 色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。 使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。 由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 二、色谱分类方法： 色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。 从两相的状态分类：

高效液相色谱质谱联用 HPLC-MS 实验 含思考题

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索 一、实验目的 1、了解LC-MS的主要构造和基本原理； 2、学习LC-MS的基本操作方法； 3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。 二、实验原理 1、液质基本原理及模式介绍 液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。 但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。 质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。 （一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。实例：（Q1 = 100-259m/z） （二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。实例：（Q1 = 259m/z） 本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：

液相色谱串联质谱联用仪检测技术

液相色谱串联质谱联用仪检测技术 实验指导 （2014、2015级） 课程内容（一个实验8学时）： （1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。 （2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量。 吉林农业大学农业部参茸质检中心 2017.03

实验一AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用 一.实验目的和意义 通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。 （一）检测仪器 1、仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）。型号：4500 QTRAP（美国Applied Biosystems公司）。 2、仪器组成液相色谱部分：岛津LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱部分：QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱。 3、主要性能指标离子化方式：ESI电离质量范围：（5 ~ 1700）amu 分辨率：> 6900 质量稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM扫描（m/z : 609/195），信噪比S/N > 120:1 扫描速度：4000 amu/sec 质量准确度：< 0.01%（全质量数范围） 4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器。4500QTRAP 的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成。Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件控制完成。

液相色谱—质谱联用

液相色谱—质谱联用来进行物质分离的实验 一、实验目的 1.了解液相色谱—质谱联用的基本原理； 2.掌握液相色谱—质谱联用时的操作步骤及实验方法； 3.学习分析色谱图和质谱图。 二、实验原理 利用不同的物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数，当两相作相对位移时，使这些物质在两相间进行反复多次分配， 使得原来微小的分配差异产生明显的分离效果，从而依先后次 序流出色谱柱，以此来达到分离多种物质的目的。然后依次流 出的物质进入质谱中被打碎成为各种离子而被检测到。以此达 到分离的目的。 三、实验仪器和材料 高效液相色谱仪及质谱仪（见下图）、甲醇、水、TADB（相对分子量516）、TAIW（相对分子量336）、色谱柱

四、实验步骤 1.将待分离的两种物质的混合物配成溶液加入到2号样瓶中去； 2.启动联机软件，在四元泵模块的空白处右键单击，在弹出的 “方法”选项中编辑好流动相和流速，点击确定，以使体系过 渡到目标状态，直到压力稳定为止； 3.进入“方法”菜单，“编辑完整方法菜单”，按照“方法参考”进行编 辑（“方法参考”中的参数编辑完成后继续进行编辑，编辑质 谱的相关参数：选择正负极及电压等），编辑完成后再次进 入“方法菜单”，选择“方法另存为”命名后点击“确定”进入“序列” 菜单，“序列表菜单”，然后编辑样品瓶位置为1号、样品名称、 使用方法、进样次数、数据文件、进样量，确定后再次进入 “序列菜单”的“序列参数”菜单，再选择文件夹，确定； 4.方法编辑完成且压力稳定后，点击进样器左上方的“序列/开 始序列”按钮，进行测试，等待测试完毕，点击停止按钮。 然后进入“脱机”软件，查看积分测试报告。 五、实验结果及分析 实验时的液相色谱条件统一为：70%的甲醇，流速0.4ml/min，进样量1ul，波长230nm，测试时间15min。在正极性条件下：

高效液相色谱-串联质谱法

附件 面膜类化妆品中氟轻松检测方法 （高效液相色谱-串联质谱法） 1范围 本方法规定了面膜类化妆品中氟轻松的高效液相色谱-串联质谱测定方法。 本方法适用于面膜类化妆品中氟轻松的定性定量测定。 2方法提要 面膜类化妆品用饱和氯化钠溶液分散，用乙腈从分散液中提取氟轻松，用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀提取液中大分子基质，经固相萃取小柱净化，用高效液相色谱仪分离，质谱检测器检测，采用保留时间和特征离子对丰度比定性，以待测物质相对应离子峰面积定量，以标准曲线法计算含量。 本方法的检出限为0.03 μg/g，定量限为0.05 μg/g。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为纯化水。 3.1甲醇：色谱纯。 3.2乙腈：色谱纯。 3.3冰醋酸：优级纯。 3.4饱和氯化钠溶液。 3.5 10%亚铁氰化钾溶液：称取115 g亚铁氰化钾K4Fe(CN)6·3H2O固体，

用水溶解定容至1000 mL。 3.6 20%乙酸锌溶液：称取239 g乙酸锌C4H6O4Zn·2H2O固体，用水溶解定容至1000 mL。 3.7Oasis HLB固相萃取小柱或相当者：60 mg，3 mL。 3.8 标准物质：氟轻松，纯度不小于99.0%；标准物质的分子式、相对分子质量、CAS登录号、化学结构图参见附录A。 3.9 标准储备液（ρ=1g/L）：准确称取氟轻松标准物质（3.8）10mg，精确到0.01 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，于－18℃下冷冻保存。 3.10 标准工作溶液：临用时，取标准储备液（3.9）适量，用乙腈稀释成0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL系列浓度的标准工作溶液。 4仪器和设备 4.1 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（ESI源）。 4.2 分析天平：感量0.0001g；0.00001g。 4.3 涡旋混合器。 4.4离心机：转速5000r/min，容量10mL；50mL。 4.5 固相萃取装置。 5分析步骤 5.1样品处理 5.1.1提取 称取样品（带有载体的面膜，去除载体后取样）0.2 g，精确至0.0001 g，置15 mL具塞离心管中，加入3 mL饱和氯化钠溶液（3.4），于涡旋混合器上混合使样品分散，准确加入2 mL乙腈，充分涡旋提取2 min，以

(完整word版)超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱联用仪

附件：技术参数 一、超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱联用仪 1.应用范围： 系统主要用于有机化合物的定性和定量分析。可分别通过多目标未知物筛查流程、完全未知物筛查流程等来开展未知物的发现和鉴定工作；还可以开展药物代谢、代谢物鉴定和代谢组学研究等。 2.工作环境条件： 2.1 电源：230Vac，±10%，50/60Hz，30A。 2.2 环境温度：15 ~ 26?C。 2.3 相对湿度：20 ~ 80%。 3.总体要求： 3.1 该系统基本组成包括超高效液相色谱部分和具有超高灵敏度、超快扫描速度的落地式高频四极杆-飞行时间串联质谱仪部分。仪器由计算机控制、配有独立的ESI和APCI离子源。软件包括仪器调节、数据采集、数据处理、定量分析和报告。 3.2 仪器灵敏度要高，性能稳定，重复性好。 3.3 国际知名质谱公司（10年以上商品化四极杆-飞行时间质谱生产经验）推出的主流产品，产品全部为原装进口，其性能达到或超过以下要求。 4. 质谱性能指标： 4.1 离子源：配有电喷雾离子源（ESI）、大气压化学电离源（APCI），离子源切换方便、快速，清洗、维护方便。

4.1.1 插拔式可互换ESI及APCI喷针，可实现ESI源及APCI源的快速更换。 4.1.2 大气压离子源采用锥孔结构，使用气帘气技术，而无毛细管（半径<1mm）设计装置，以同时保持高灵敏度和优异的抗污染能力。（要求提供接口结构图） 4.1.3 电喷雾离子源流速范围：在确保灵敏度不损失的前提下，实现高流速，无需分流，即可达到3ml/min；加快样品的分析速度同时，还可避免分流对样品造成损失。 4.1.4 大气压化学电离源流速范围：在确保灵敏度不损失的前提下，实现高流速，无需分流，即可达到3ml/min；加快样品的分析速度同时，还可避免分流对样品造成损失。 4.1.5 脱溶剂能力：离子源内采用辅助气体加热，气体最高温度可达700℃，确保最佳的离子化效率。（要求提供硬件结构图和软件界面截图作为证明文件） 4.1.6 离子源内废气排放：有主动废气排放装置，防止气体在密闭的离子源腔体中的回流，降低离子源的记忆效应和污染，降低机械泵的负荷延长机械泵泵油使用时间，维护试验环境，保障工作人员健康。 4.1.7 Q0聚焦技术：离子引入部分拥有高压离子聚焦技术，压力至少达7.5mtorr，以确保最佳的离子聚焦效果和离子传输效率，有效消除“记忆效应”和“交叉污染”。 4.1.8 校正方式：外置CDS辅助校正。 4.2 质量分析器：落地式四极杆-飞行时间串联质谱。

液相色谱／质谱联用技术

液相色谱／质谱联用技术李立军 色谱是快速灵敏分离有机物的有效手段，各种检测器中，除了应用最广泛的 FID（GC）和UV（LC）外，质谱（MS）尽管价格较昂贵，但是其选择性、灵敏度、分子量及结构信息等优势，已被公认为高级的通用型检测器，把它与各种分离手段联用，将定性、定量结果有机地结合在一起，一直是人们所研究的目标。 GC／MS在我国已有 20多年的应用历史，随着台式小型仪器迅速增长，在色谱研究中已经成为重要的手段，气相色谱质谱技术成熟运用至今，人们越来越不满足仅仅分析那些具有挥发性和低分子量的化合物，面对日益增加的大分子量（特别是蛋白，多肽等）和不挥发化合物的分析任务，迫切需要用液相色谱／质谱联用解决实际间题。与气相色谱相比，液相色谱的分离能力有着不可比拟的优势，液相色谱／质谱联用技术为人们认识和改造自然提供了强有力的工具。HPLC可以直接分离难挥发、大分子、强极性及热稳定性差的化合物，LC ／MS联机曾长期为分析界所期待，由于LC流动相与MS传统电离源的高真空难以相容，还要在温和的条件下使样品带上电荷而样品本身不分解，大量的样品不得不采取脱机方式 MS 鉴定，或制成衍生物用 GC／MS分析。经过努力相继出现了多种液相色谱／质谱联用接口，实现了液相色谱／质谱的联用。特别是大气压电离质谱（APIMS）的实现为 LC／MS的兼容创造了机会，商品化的小型 LC／MS作为成熟的常规分析仪器在九十年代已经在生物医药实验室发挥着重要的作用。 一．液相色谱／质谱联用适用范围 液相色谱／质谱联用的基本流程为：混合的样品经高效液相色谱柱分离后成为多个单一组分，依次通过液相色谱／质谱接口进入质谱仪的离子源，离子化后的样品经过质量分析器分析后由检测系统记录，后经数据系统采集处理，得到带有结构信息的质谱图。 图1 液相色谱／质谱联用的基本流程 首先看看气相色谱／质谱联用的特点： ·要求样品气化后进入质谱仪 ·用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比 ·用毛细管色谱柱分离化合物，分高效率高 ·操作条件稳定、使用方法成熟

液相色谱质谱联用技术的应用

液相色谱质谱联用技术的应用 液相色谱质谱联用技术（LC-MS）是一种常规的样品分析技术，它结合了液相色谱（LC）的高分离能力和质谱（MS）的高选择性及高灵敏度。液相质谱联用LC-MS可与稳定同位素稀释相结合，用于复杂混合物中微量组分的准确定量，广泛应用于医药研究领域。 液相色谱质谱联用技术应用于生物医学研究 液相质谱联用LC-MS技术可用于体液中的类固醇药物及内源性类固醇激素的检测，具有很高的灵敏度。在患有先天性肾上腺增生症的患者中主要检测唾液中类固醇激素。唾液中的激素含量因不受唾液酶及唾液流动率的影响，故可作为衡量血液中类固醇激素生物活性含量的重要指标。 氨基酸是最早使用激光解吸和热喷雾相结合的液相色谱与质谱联用LC-MS分析的化合物之一。核苷、核苷酸、糖、脂肪酸、有机酸、蛋白质等都可用液相色谱与质谱联用LC-MS分析，结合电喷雾还可测出它们的分子量。 液相色谱质谱联用技术应用于环境分析 液相色谱与质谱联用LC-MS技术可用于土壤、饮用水或废水、空气和污泥等多种样品的分析。这些样品可能含有许多不同的化合物，从非极性碳氢化合物到离子型有机金属物质。农药和除草剂，包括三嗪衍生物、氯酚、苯氧烷酸和磺酰脲类除草剂，都可以用液相质谱联用技术进行分析，也可以用该技术分离多环芳烃和有机金属化合物。 液相色谱质谱联用技术应用于遗传病的生化筛选 通过液相色谱与质谱联用LC-MS技术分析新生儿的血液样本，检测代谢紊乱。目前，二级LC-MS检测已用于确认新生儿筛查中的一级免疫检测结果。 液相色谱质谱联用技术应用于药物成分分析 液相质谱联用技术广泛用于药物成分的测定，特别是光学活性药物的分离。药物代谢产物具有化学或热不稳定性，其检测、分离和纯化一般也用液相色谱质谱联用技术LC-MS。研究人员还利用液相质谱联用技术对天然产物（如复合脂质、生物碱和不饱和脂肪酸）粗混合物中的组分进行分离和表征。 液相色谱质谱联用技术应用于药物监测与毒理学分析 在药物监测方面，液相色谱质谱联用LC-MS技术已用于免疫抑制剂（他克莫司、环孢素、依维莫司、西罗莫司和霉酚酸）、氨基糖苷类药物、抗癌药物和抗逆转录病毒药物的分析检测。 液相色谱质谱联用LC-MS技术可以在一次运行中分析多种药物和代谢物，从而简化工作流

Agilent1100高效液相色谱质谱联用仪操作规程

Agilent 1100高效液相色谱/质谱联用仪操作规程 一．开机前准备 1．根据需要选择合适色谱柱。 2．在容器中放入已过滤脱气好的流动相，把吸滤过滤头放入容器中。 二．开机 1．打开微机，进入NT 2000，生成CAG Bootp Server界面。 2．打开空气泵开关，操作压力大于等于90PSI后，分别打开质谱、在线脱气机、泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源开关。打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针筒抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准。 3．在CAG Bootp Server上显示联机成功后过5分钟，点击instrument online1，进入工作站。 三．编缉仪器方法 1．在View 中选Diagnosis，进入Diagnosis 界面，选Maintenance，进入MSD pumpdown，将rough pump逆时针转2圈后，点Start，真空度达到后按Close，再回到Methord and Run 界面。 2．设置各仪器参数，等待整个系统平衡。 四．样品分析与采集 1．当色谱柱、系统平衡，基线稳定后。 2．在View 中选MSD TUNE，根据实验需要做相应的Autotune或Checktune，当MSD TUNE 通过后设置好样品信息，按Start，开始采集样品。 五．关机 1．冲洗色谱柱，排出流路中可能有的缓冲液。 2．在View 中选Diagnosis，进入Diagnosis 界面，点Maintenance，进入MSD Vent，将rough pump 顺时针关闭，点击 Start放真空，真空度放空后按Close，再回到Methord and Run control界面。 3. 退出工作站，关闭整个系统。 4. 在记录本上记录使用情况。 注意事项： 1. 所有的溶剂均选用HPLC级试剂。 2. 禁止使用含不挥发性缓冲盐的流动相，流动相中如含有挥发性缓冲盐，必须用5%甲醇或5%乙腈过渡冲洗；水相流动相需经常更换，防止长菌变质。

agilent 1260-6460高效液相色谱质谱联用仪操作规程

1 仪器组成与开机 1 . 1 仪器组成本液质联用仪（LC-MS)主要由Agilent 1200系列液相色谱系统、质谱分析系统和仪器控制系统组成。液相色谱系统包括泵、脱气机、自动进样设备、柱温箱、二极管阵列紫外检测器;质谱分析系统包括气源（高纯氮气）、真空泵、离子源、四极杆质量分析器。 1 . 2 开机依次打开液相色谱各部件及电脑的电源开关;打开氮气瓶、液氮罐、真空泵和质谱检测器电源开关。 2 编辑实验方法 2. 1 点击桌面Data Acquisition图标，启动MassHunter软件；工作站画面分为仪器状态界面、实时绘图界面、方法编辑界面和工作列表界面。 2 . 2 在方法编辑界面设定HPLC条件：自动进样器参数、泵参数、柱温箱参数、检测器参数。 2 . 3 在方法编辑界面设定MS QQQ条件:选择调谐文件、设置扫描段Scan Segment、在MRM扫描段表中，设定母离子、子离子以及每个四极杆的分辨率（unit，wide和widest) 、设置QQQ仪器的电离源参数(ESI、APCI)。 2 . 4 保存方法文件。 2 . 5 运行单个样品：分别于样品栏中输人样品描述，瓶号以及数据文

件名等;点击工具栏Start Sample Run图标开始采样。 2 . 6 运行多个样品 2 . 6 . 1 添加一个样品：从工作列表菜单选择Add Sample并输人以下样品信息：样品名称、样品位置、方法、数据文件名称、样品类型、注射体积等。 2.6.2 添加多于一个的样品：从工作列表菜单选择Add Multiple Sample。在Sample Position表格，选择被分析样品的位置；在Sample Information 中设定运行信息，方法路径以及数据文件储存路径。 2 . 6 . 3 保存工作列表并开始运行。 3 数据分析 分别点击桌面上Agilent Masshunter Qualitative Analysis 和Agilent Masshunter Quantitative Analysis图标，进入数据分析系统，选择各种处理方式对所得到的数据进行定性和定量分析。 4 关机 确认前级泵的气镇阀（Gas Blast Valve)处于关闭状态；分别关闭液相泵、柱温箱和检测器;点击MS QQQ图标，选择放空Vent,等待仪器涡轮泵停转，且前后四极杆温度均低于50°C后关闭MS QQQ电源开关;关闭LC 1200各模块电源开关，关闭MassHunter软件，关闭计算机、碰撞气和液氮罐开关阀。 5 日常维护 5 . 1 电源管理本仪器使用电压稳定、相序正确、良好接地的220V交流电。当有停电通知时，应提前至少半小时，按照正确步骤关机。遇有任

2015年版药典高效液相色谱法、质谱法

2015版药典---高效液相色谱法、质谱法 0512 高效液相色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～lOμm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径和粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密和均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2～8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8的流动相。 （2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅和被测物质的量有关，还和其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅和被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值和被测物质的量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值和被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。

高效液相色谱_质谱联用技术在药物分析中的应用

第40卷第9期 当 代 化 工 Vol.40，No.9 2011年9月 Contemporary Chemical Industry September，2011 收稿日期： 2011-07-16 作者简介： 唐学红（1979-），女，江苏南通人，讲师，硕士，研究方向：从事仪器分析方面教学和和科研工作。E-mail：txhxxj@https://www.sodocs.net/doc/149563615.html, 。 高效液相色谱-质谱联用技术 在药物分析中的应用 唐学红，肖先举 （徐州工业职业技术学院， 江苏 徐州 221140） 摘 要：介绍了近年来高效液相色谱-质谱接口技术的研究进展，综述了该技术在中药指纹图谱研究、药物代谢分析、药物中非法添加化学药物成分的鉴定分析、以及残留药物成分的鉴定分析方面的应用。随着液质联用技术的不断完善、发展，其必将在药物分析中发挥越来越重要的作用。 关 键 词：高效液相色谱-质谱联用；接口技术；药物分析 中图分类号：TQ 460.72 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2011）09-0988-03 Application of HPLC-MS in Pharmaceutical Analysis TANG Xue-hong ，XIAO Xian-ji （Xuzhou Industrial V ocational and Technical Institute, Jiangsu Xuzhou 221140，China ） Abstract : Research progress of HPLC-MS access technique was introduced, and application of HPLC-MS was summarized, such as study of traditional Chinese medicine fingerprint spectrum , drug metabolism analysis, analysis of illegal additive chemical drugs in medication and analysis of residual drugs. With the development of the HPLC-MS technology, HPLC-MS will play an increasingly important role in pharmaceutical analysis. Key words : HPLC-MS; Access technique; Pharmaceutical analysis 高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术是将高效液相色谱与质谱串联成为一个整机使用的检测技术。该技术自20世纪70年代进行开创研究以来，经历了长期的实践和研究过程，直到90年代大气压电离技术成熟后，各种商品化仪器相继问世，液-质联用技术才得以迅速发展，成为科研和日常分析的有力工具。HPLC 可以直接分离不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白质、多肽、多糖和多聚物等）；MS 灵敏度高，样品用量少，分析速度快，可得到更多的化合物的结构信息。HPLC-MS 联用技术结合HPLC 的高分离能力和MS 的强定性能力，在生物、药物、临床医学、化工和环境等领域应用越来越广泛。 本文就近年来HPLC-MS 联用技术在中药指纹图谱研究、药物代谢分析、药物中非法添加化学药物成分的鉴定分析、以及残留药物成分的鉴定分析4个方面的应用作一综述。 1 HPLC-MS 联用接口技术 液质联用仪是由HPLC、接口装置及MS 三大结构单元组成。由于MS 的正常工作需要高真空环境，而常规HPLC 分析在常温常压下就可进行。如果要 实现高效液相色谱与质谱的联用，HPLC 与MS 的连接，即接口技术是关键。理想的“接口”装置必须能够使来自HPLC 的连续流动的液体迅速气化，在保证MS 高真空工作环境的前提下，去除流动相中的基质对质谱可能造成的污染，使待测样品电离成带电离子，然后进入质量分析器被分析。 在液质联用接口技术发展过程中，出现了20 多种接口，这些接口都有自己的开发、完善过程，都有自己的优点和缺点。采用过的接口主要有热喷雾接口（TSP）、粒子束接口（LINIC）、快原子轰击接口（FAB）、大气压离子化接口（API）等。大气压离子化接口（API）是当前应用最广泛的接口技术，它是一种常压电离技术，不需要真空，减少了许多设备，使用方便，近年来得到了迅速的发展。大气压电离的出现，成功地解决了在大气压条件下，使待测物质电离并有效的到达质谱进行分析，从而解决了接口问题，使液相色谱和质谱实现了真正的联用。API 主要包括三种操作模式：电喷雾离子化（ESI）、离子喷雾离子化（ISI）和大气压化学离子化（APCI）。这三种模式中样品的离子化均是在大气压下的离子化室内完成，离子化效率高，稳定性好，灵敏度高 [1] 。

高效液相色谱-串联质谱法分析

第39卷2011年4月 分析化学(FEN XI H U A XU E) 研究报告Chinese Journal o f Analytical Chemistr y 第4期534~539 DOI:10.3724/SP.J.1096.2011.00534 高效液相色谱 串联质谱法分析大肠杆菌代谢组中样品提取方法的比较 梅辉 1,2 戴军 *1 刘文卫3 凌霞3 朱鹏飞3 赵志军 1 1 (江南大学食品科学与技术国家重点实验室,无锡214122) 2 (江南大学食品学院,无锡214122) 3 (无锡市疾病预防控制中心,无锡214002) 摘 要 比较了基于液相色谱和串联质谱联用技术(L C M S/M S)的E.co li 代谢组分析的5种不同样品提取方法。在对样品进行淬灭和洗涤后,分别使用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/氯仿法、热甲醇法和高氯酸法对样品平行提取3次,每个样品重复进样3次。结果显示,冷甲醇法所得到的相对提取率最高,且重复性好(RSD <5%)。从相对提取率、重复性等方面综合考察5种提取方法,从优到劣依次为:冷甲醇法>甲醇/氯仿法>高氯酸法>热乙醇法>热甲醇法。此外,以冷甲醇法的提取溶剂配制系列不同浓度的代谢物标样测定的结果表明,本方法的代谢物检测线性较好,线性范围较宽,提取溶剂的基体效应对代谢物的定量分析影响较小。本方法的检出限为0.05~0.36m mol/L 。 关键词 代谢组分析;液 质联用;提取方法;大肠杆菌 2010 07 20收稿;2010 10 29接受 本文系江南大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题基金(No.SKLF T S 200803)资助项目*E mail:d j998lc@https://www.sodocs.net/doc/149563615.html, 1 引 言 饲料工业的发展及在医药工业上应用的不断扩大使色氨酸的需求量越来越大,目前我国色氨酸主要依赖进口。采用微生物直接发酵法生产色氨酸,其合成代谢途径较长,代谢流弱,调控机制复杂,很难实现工业化。代谢组学技术已应用于微生物表型分类、突变体筛选、代谢途径及微生物代谢工程等方面,但有关色氨酸生产的代谢组学及其分析策略的研究尚未见报道。 微生物代谢组学定义为对胞内所有低分子量代谢物的定性和定量分析[1]。微生物样品前处理是对代谢物进行准确定性和定量的关键步骤,一般包括微生物培养、淬灭、洗涤和代谢产物的提取等步骤[2]。本实验所研究的E scherichia coli (E.coli )全部代谢物仅占细胞干重的3%~5%,但其化学成分的复杂性和生物活性的多样性远超过一般化学合成和组合化学体系[3]。应用现代分析技术对大部分中心代谢途径的磷酸化代谢产物以及三羧酸循环中间代谢物的提取方法已有报道[4~6],多采用气 质联用(GC MS)[7]检测目标代谢物。但气 质联用法往往需要衍生化,且高温条件下易导致热敏性化合物的变性分解。本研究对生产色氨酸的E.coli 发酵液进行淬灭、洗涤处理后,分别运用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/氯仿法、热甲醇法和高氯酸法提取胞内代谢物,在LC M S/M S 的多反应检测模式(M RM )对目标代谢物进行检测,由于胞内代谢物数量巨大,而在代谢流研究磷酸化糖和磷酸化有机酸、有机酸和氨基酸起到关键作用。因此分别选择以上3类物质中有代表性的8种代谢物(共计24种)作为考察对象,比较5种提取方法的提取率及重复性。结果表明,冷甲醇法的相对提取率及其重复性均优于其它方法。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 1200型高效液相色谱仪(Agilent 公司);3200Q TRA P 质谱仪(Applied Biosystems 公司),配有电喷雾离子源;3L 发酵罐(NBS);高速冷冻离心机(T erm o 公司),超低温冰箱(NBS 公司);真空冷冻干燥机(Labconco 公司);JY 2006电子分析天平(Mettler T pledo 公司);YDS 6液氮罐(乐山东亚公司)。 苹果酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸、草酰乙酸、2 酮戊二酸、邻氨基苯甲酸的标准品均购自BBI 公司,其它