农杆菌感受态细胞的制备和转化

Pei YX 实验室文档zengjieqiao 第七篇

农杆菌感受态细胞的制备

取-80℃保存的LBA4404于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

挑取单菌落接种于5ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 h。

取2ml菌液转接于100ml YEB液体培养基中，28℃ 220rpm振荡培养至

=0.5。

OD

600

转入无菌离心管，4℃，5000rpm离心5min,去上清液。

溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

加入30ml预冷的(0.05-0.1)M的CaCl

2

4℃ 5000rpm离心5min，去上清。

溶液，轻轻悬浮。

加入4ml预冷的含15%甘油的(0.05-0.1)M的CaCl

2

农杆菌悬浮液分装于无菌1.5 ml Eppendorf管中，每管200μl冻存于-80℃。注意：(0.05-0.1)M的CaCl

溶液都可以，差别不是很大!

2

转化

分别向200μL根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中分别加入20 ng质粒DNA,轻轻混匀。

在冰浴中共放置30min。

置液氮中速冻5 min。

37℃热激5 min之后。

置冰上5 min,然后加入600μl YEB液体培养基。

于28℃、200 r/min培养4 h。

取100μL菌液均匀涂布于筛选培养基上,28℃放置36-48 h后可见抗性菌落长出。

阳性鉴定

挑去菌落过夜培养，进行菌液PCR！（注意做对照即：空的LBA4404也摇上，同时PCR）。