Pei YX 实验室文档zengjieqiao 第七篇
农杆菌感受态细胞的制备
取-80℃保存的LBA4404于含50μg/ml链霉素平板划线,28℃培养。
挑取单菌落接种于5ml YEB液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养12-16 h。
取2ml菌液转接于100ml YEB液体培养基中,28℃ 220rpm振荡培养至
=0.5。
OD
600
转入无菌离心管,4℃,5000rpm离心5min,去上清液。
溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置20min。
加入30ml预冷的(0.05-0.1)M的CaCl
2
4℃ 5000rpm离心5min,去上清。
溶液,轻轻悬浮。
加入4ml预冷的含15%甘油的(0.05-0.1)M的CaCl
2
农杆菌悬浮液分装于无菌1.5 ml Eppendorf管中,每管200μl冻存于-80℃。注意:(0.05-0.1)M的CaCl
溶液都可以,差别不是很大!
2
转化
分别向200μL根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中分别加入20 ng质粒DNA,轻轻混匀。
在冰浴中共放置30min。
置液氮中速冻5 min。
37℃热激5 min之后。
置冰上5 min,然后加入600μl YEB液体培养基。
于28℃、200 r/min培养4 h。
取100μL菌液均匀涂布于筛选培养基上,28℃放置36-48 h后可见抗性菌落长出。
阳性鉴定
挑去菌落过夜培养,进行菌液PCR!(注意做对照即:空的LBA4404也摇上,同时PCR)。