冷冻切片操作指南

超薄切片机操作指南

超薄切片为透射电子显微镜观察提供超薄高分子和生物材料样品的专门技术。针对高分子和生物材料，由于电子束穿透能力的限制，必须把样品切成厚度小于100 nm，即采用超薄切片机进行切片。

一、切片类型

材料的超薄切片分为两大类，一类是常温超薄切片：主要应用于一般的高分子材料；另一类是冷冻超薄切片（Cro-Ultramicrotomy）：主要应用于软材料如软塑胶和橡胶等，在低于其玻璃转变温度时进行切片（温度越低、块越硬）。

二、切片原理

采用机械推进式。即刀固定，样品每上下运动一次时向前推进一小段距离，进行切片。特点：在设定的切削行程区间，样品以可控速度切片。

三、衡量超薄切片的质量

3.1样品结构保存良好；

3.2切片厚度为70nm左右；

3.3切片均匀，无污染，表面无褶皱，无刀痕、无震颤及染色沉淀等现象；

3.4样品支持膜耐受电子束轰击，观察时无膜的漂移和破裂现象。

四、常温切片的一般操作流程：

1、包埋

2、修样

3、制刀槽

4、装样品

5、装刀

6、注水

7、定位

8、设定参数，切片

9、捞取样品

10、复位

11、关机

4.1 包埋

包埋的目的：用包埋剂支持整个样品结构，并形成特定的机械性能,以便于切片。

4.1.1 一般选用Spurr树脂环氧树脂进行包埋

标准硬度的配方（试剂可以按比例增减）

DMAE 聚合时间0.4

8

0.4

8

0.4

8

0.4

8

1.0

3

0.2

16

* ERL-4221：二氧化乙烯基环，分子小，粘度低，聚合块硬度大。

*DER－736：聚丙二醇二缩水甘油醚，增韧剂，分子小，有低粘度性质，可调节包埋块硬度。*NSA：壬烯基琥珀酸酐，一种特殊硬化剂，应避免暴露在潮湿的大气中，以防环氧或酐链的水解作用。

*DMAE：二甲基氨基乙醇(DMAE)，固化加速剂，使树脂混合物的使用期限延长。调整DMAE 的量，可调整固化时间。

·Spurr树脂最终硬度可用DER－736量调节；调整固化时间，可调整DMAE的量。

4.1.2 包埋方法：前三种试剂依次称量，均匀混合后加入加速剂DMAE，再搅拌均匀，保证没

有气泡。包入样品，放入烘箱，一般固化7-8h，烘烤温度为75度。

4.1.3 注意事项：

（1）所有试剂要防潮；

（2）配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；

（3）包埋时动作要轻巧，防止产生气泡。

4.2 修样

包埋完成后的样品块须先经过修整，降样品块尖端修整长适当大小及形状，并将要观察的部分露出。习惯上将样品块修成金字塔形（从侧面观察），顶面修成梯形或长方形，每边长度大小应小于0.5 mm（一般0.2~0.3mm），金字塔高度不宜超过0.2 mm。将样品块修成平顶的金字塔型，是为了让样品在切片过程中得到最佳的支持力。高度过大，切片时容易发生震动，在切片上留下深浅交替的平行条纹，或导致样品块前端断裂。较小的样品块较容易进行切片，但过小的切片在电子显微镜下可观察到的东西较少。

修样步骤：

4.2.1固定样品：把烘好的环氧树脂取出，固定在修样台上；

4.2.2修样

（1） 削去表面的包埋剂，露出样品；

（2） 用双面刀片在样品的四周削去包埋剂，将样品块修成金字塔形（从侧面观察），顶面修成梯形或长方形

修样详细步骤示意图：

4.2.3 注意事项：

（1）修样品是最关键的一步，修样过程中不要破坏样品；

（2）保证修好的顶部有样品；保证顶部足够小。

（3）样品顶部不管修成哪种形状，其顶边和底边必须平行，否则不能形成连续切片带

4.3 制刀槽

4.3.1制刀

切片一般用玻璃刀，也可用钻石刀。钻石刀可以切较硬的样品，但其价格昂贵。一般选用玻璃刀，玻璃刀由5～7mm厚的硬质玻璃制成，用专门的制刀机（用RMC公司的Glass Knife Maker）制刀。适宜的刀刃应该是平整光滑，无锯齿状波纹。整把刀最适合切片的部分为Z 区，约占1/3；S区不用于切片；而E区的使用需视刀口的品质而定。

4.3.2制刀槽

超薄切片只有漂浮在水面上或其他合适的液面上才便于收集、伸展和捞取，为此在刀口背部装上一个小的水容器，通常称为“刀槽”。刀槽可用塑料水槽围成，刀与塑料水槽接触处要用熔化的石蜡封固接口，以防漏水。

4.3.3注意事项

（1）三角形刀只有一边可做刀口。

（2）酒精清洗刀槽，不能有污染物；

（3）保证水面稍低于刀口，让样品沿着这个斜面一片连着一片往下走

4.4 装样品

把已修好的样品夹入样品架内，把样品架装在样品臂上。

4.5 装刀

把刀槽装在刀座上，固定。把上刀架放到下刀架上，移动上刀架，在刀口离样品1mm时，固定下刀架。并根据样品软硬程度不同调节玻璃刀的倾斜角度，一般为4°。

刀座介绍

注意事项：装刀的时候要小心不要让刀口碰到样品。

4.6注水

液面的调节一般先加稍过量的液体使之凸起，以保证浸湿刀刃。然后在双筒显微镜下用注射器或移液管慢慢吸去一部分液体，调整照明系统，当液面变成凹面、可见一反射光线的弧面，即为正确的液面，在显微镜下液面呈黄色。从这一光亮的反射光可看到切出的片子。在切片过程中由于液体蒸发，需加液以保证正确的液面。

注意事项：要保证水槽干净，水干净，没有污染物。保证水平面稍低于刀面，使切出的样品漂浮在水面上。

4.7对刀、定位

4.7.1对刀

（1） 在显微镜下倾斜、旋转包埋块，使样品块切面的底边成水平放置，让长边在下方；（2） 调节刀口的角度，使块面的两个平行边与刀刃平行，即使样品与刀的横截面垂直；（3） 移动刀使可用部分对准块面。

（a）不正确（b）调整正确

刀刃调整正面观

4.7.2定位

目的：保证样品在切削窗口内以所设定的速度切片。

（1） 开控制面板

控制面板介绍

（2） 样品在刀口上方1mm处，按下控制面板“CUTTING WINDOW”设置上限，控制器发出嘟嘟两声表示定位成功；

（3） 移动手轮，样品到刀口下方，按下“CUTTING WINDOW”下限按键。

4.8设定参数切片

4.8.1 按“Cutting Speed” 可以自行设定切片速度和“Cutting Thickness”设定切片厚度。

4.8.2 按“CUT”进行切片

开始时切片可稍厚些，先停止切片，然后把切出的片拨开，随后可根据切片情况调节切片速度和厚度，重新切，此次切出的片即为所要测试的样品。切片机上厚度指示往往并非代表切片实际数值。一般是利用反射光干涉色来判断切片的厚度，即从切片表面反射的光和从切片下面的水面的反射光发生干涉现象（见下表）。

包埋切片厚度与干涉色的近似值

干涉色厚度

暗灰色＜40nm

灰色40nm～60nm

银色 60nm～80nm

金黄色80nm～130nm

紫色130nm～190nm

蓝色 190nm～240nm

实际切片过厚不能用于电镜观察，较好图像一般是银灰色切片。

4.9用微栅或铜网捞取样品

按控制面板“CUT”停止切片，捞取切片。通常有两种方法：

（1）通常用镊子夹住铜网，对准液面上的切片轻轻一沾（有支持膜时，膜面向下），使切片覆于铜网上；

（2）先用眼睫毛或钢针固定切片条位置，再用镊子夹住铜网，浸入水槽，将之自下而上捞起。此法操作难度较大，但有利于捞取连续切片。

4.10复位：按控制面板的复位键“Reset”

4.11关闭控制面板

五、常温切片注意事项

?超薄切片过程中，切片成功与否，对刀很关键，要仔细耐心；

?刀槽中的蒸馏水可能是污染源，尽可能用新鲜蒸馏水；

?注意切片时碎屑对水槽造成的污染；

?室内温度要相对稳定，室内要安静、清洁、无震动；

?固定刀时注意不要损坏封固刀槽的石蜡，否则造成漏水，要重做刀槽；

?每次切完，记得按复位键Reset；

?切片所用的玻璃刀非常锋利，在操作过程中一定要注意安全。

六、冷冻超薄切片一般步骤

6.1 包埋

6.2 修样

6.3 制刀

6.4 装冷冻附件

6.5 装样品

6.6 装刀

6.7 注液氮

6.8 定位

6.9 设定参数，切片

6.10 捞取样品

6.11 “warm”加热，“Reset”复位

6.12 关机

注意事项：

?冷冻切片之前，摆放好液氮罐、控制器等组件的位置。一旦开始降温，导流管的外保护层会逐渐硬化，从此时起，请不要再调整液氮罐、导流管等组件，更不要尝试弯曲导流管，否则导流管外层的保护套会断裂并导致液氮外泄。如需调整，请先停止液氮导入，并等待保护套恢复常温后再进行操作。

?保证环境湿度低于60%，如果过高，一定要先开空调或者抽湿机，过高的环境湿度，过高的环境湿度，容易引起冷冻腔内结霜。

?按切片工作完成后，按 “warm”键对冷冻腔进行加热，控制器上会显示温度逐步升高，直达最后稳定在 35°C，以烘干腔体内的液氮和水分，从而延长仪器各部件的使用寿命。

冰冻切片快速病理诊断30年总结

冰冻切片快速病理诊断30年总结 秦皇岛市肿瘤医院病理科康文喜谢芳芳王小聪李英邮编：066001 术中冰冻切片快速病理诊断是1818年由Pieter de Riemer首先创造发明的，1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法。目前国内外已将此项技术普遍应用于临床，解决手术中的病理诊断问题。并日益受到外科医生和患者的欢迎和肯定。随着冰冻切片技术和临床外科手术的发展，要求做冰冻的病例逐年增多，截止到2012年10月份，本院病理科开展快速冰冻病理诊断30余年，共完成冰冻快速病理诊断1476例，积累了一定的经验和教训，为了更进一步提高冰冻快速病理诊断水平，提高冰冻诊断准确率，降低误诊率，作者将30年来所有冰冻切片快速病理诊断病例进行总结分析如下。 1 材料和方法 1.1 一般资料本组1476例大部分来自本院住院病人，小部分来自其他医院。其中男897例，女579例，年龄最大81岁，最小5个月。 1.2 病变部位乳腺1052例，软组织42例，胃33例，淋巴结33例，骨12例，腹膜9例，睾丸及附睾8例，甲状腺47例，小肠15例，大肠25例，膀胱5例，脊椎5例，阑尾10例，胆道14例，阴茎19例，卵巢53例，脑及脑膜3例，前列腺3例，肝12例，肾26例，脊髓2例，喉2例，子宫42例，精索1例，纵隔1例，腹膜后1例，眼1例。 1.3 方法本组1476例均采用德国进口莱卡冰冻切片机切片，HE染色，普通光学显微镜观察。 1.4 结果1476例中，恶性肿瘤687例，良性肿瘤388例，瘤样病变170例，炎症202例，结核29例，确诊1457例，未能确诊15例，误

诊4例。 2. 讨论 冰冻切片质量差，最初很多著名的病理学家如Ewing、Brewer、Simpson等曾经怀疑冰冻切片的准确性，1960年Cryostat冰冻切片机正式应用于临床后，冰冻切片质量有了很大提高，但和石蜡切片相比仍很逊色，对准确的冰冻病理诊断带来一定困难，尤其对年轻的病理科医生来说难度较大，缺乏经验的病理科医生难以胜任此项工作，下面根据自己个人的经验发表一点看法。 2.1 冰冻切片快速病理诊断的优缺点：冰冻切片快速病理诊断的优点是在手术过程中随时取材，迅速做出准确可靠的病理诊断，同时也减少了病人二次手术的痛苦。缺点是切片厚，细胞大，层次多，易造成错觉。另外冰冻切片诊断要求报告快，没有更多思考讨论余地，一旦报错，将造成严重的无法弥补的后果。 2.2 准确率：本文对1476例冰冻切片进行了统计分析，结果准确率为98.7%，未能确诊率为1.02%，误诊率为0.3%，与国内报道相比准确率相仿，而误诊率低于各家报道。 2.3 未能确诊和误诊的原因：⑴取材不当：恰当准确的取材是正确诊断的必备条件，取材不当就不可能得出正确的病理诊断。当临床切取肿物困难时，所送检的肿物标本不一定是肿物中心组织，很可能是肿物边缘组织，这种组织大部分是肿物周围的正常成分，或仅带有少量肿物，此时应多切几个切面进行观察，在把握不足的情况下可多取几块组织做切片，以防漏诊。⑵切片质量不佳：切片过厚，组织未能展平出现折叠，组织缺损，染色深浅不均等都直接影响诊断结果。

冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么 1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的 抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。 2、从研究目的来看。石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形 态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。 3、从抗原的保真性来看。冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程 中可能会对抗原的性质造成影响。 4、从操作步骤的繁琐程度看。染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。 5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立 即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 编辑本段冰冻切片的应用

LeicaCM冰冻切片机使用说明

L e i c a C M1950冰冻切片机使用说明 一、开机 1.利用主机右侧的开关开启电源，用箱体温度设置按钮将切片机温度设置到切片所需温 度，当设置温度时温度显示窗口显示设置温度，设置停止5秒后显示实际温度。只要按下箱体温度设置按钮，即可随时检查设置温度。样品头温度设置按同样方法进行。 若样品头设为最低温度（-50度），则按样品头最低温度设置按钮即可。 二、切片 1.利用切片机的厚度调节按钮调节切片厚度，调整切片角度，安装切片刀。如是一次性 刀片，请利用刀架的左右移动来使用不同的刀口，勿移动刀片 2.将样品放到样品托上，利用包埋剂固定，放到冷台上冷冻，在即将完全冷透前用热交 换装置压平。 3.将冷却透的样品放到样品头上，设置样品头温度，用样品快进按钮将样品移近刀口， 调整要切的平面，利用慢进按钮开始修片，修好后即可放下防卷板切片，如有需要可调节防卷板的上下位置，使切出的样品平整的进入防卷板与刀片的狭缝，取出后染色观察。 三、注意事项 1.切片后为防止别人改变参数，可利用控制面板上的键盘锁定按钮将键盘锁定，即按下 键盘锁定按钮5秒钟左右，时间窗口中间的两个点停止闪烁，表示键盘锁定，此时再按键盘锁定按钮5秒钟即可解除键盘锁定。 2.当停机时，应将玻璃窗打开，再次开机前应先检查切片机内是否有水，如有应吹干后 再开机，并取出隔板检查切片机箱体底部是否有水，如有需拔开底部的塞子，将水排除，吹干后再开机。 3.如常年开机，夜晚可将切片机温度设到零下十度以下，不能高于零下十度。由于切片 机冷却到工作温度大约需两个小时，如关机后第二天有样品，应提前一天开机制冷，以免影响第二天的工作。 4.若要关闭压缩机，按一下锁定开关，再按一下样品头温度设置按钮，则样品头压缩机 关闭，若按箱体温度设置按钮则箱体压缩机关闭，重复以上步骤，压缩机又打开。

免疫组化技术全程原理

免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法

冰冻切片实验步骤

全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗？？？ 冰冻切片不能用热修复啊！！！ 以下是我的步骤： 1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。 2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色（DAB）。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。

关于开展术中快速冰冻切片病检的通知

关于开展术中快速冰冻切片病检的通知 各临床科室： 手术中快速冰冻切片病理检查是一项特殊的临床病理急会诊工作。我院与××医院病理科协作，开展术中快速病理冰冻检查，现将相关事宜通知如下： 1、目的： （1）明确送检标本是否有病变； （2）明确病变的性质（良性或恶性或交界性），确定淋巴结是否转移或邻近脏器有无浸润，以便制定手术方案； （3）了解手术切缘有无癌瘤残留，以决定手术范围。 2、预约： 手术前一天由手术者电话预约，预约电话：﹢﹢﹢﹢﹢（科室座机）或﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢（手机）。 已预约申请的患者，如根据术中实际情况或其它原因不再进行快速冰冻切片病理检查时，临床医师应及时通知病理科撤销预约申请。 3、送检标本注意事项： （1）对需做术中冰冻切片病理检查的标本请勿用生理盐水或流水冲洗，请勿固定，离体后尽快送达病理科。 （2)送检肿物要完整，不得只送检部分，否则病理科有权拒收标本。 （3）对于怀疑乳腺导管内病变的标本，请临床手术医师务必在病变导管开口标记（可系线）；对于乳腺不可触及的影像学检查有异常的病变部位请务必标记（可金属针定位）；对于保乳手术的标本，请务必标记切缘。 （4）对于肿物较小的标本请务必做好标记。 （5）对于肿瘤肉眼可见的种植或转移灶或转移的淋巴结，请与肿瘤一并送检，尤其是卵巢肿瘤。 4、收费： 凡送术中冰冻切片病理检查同时也应做常规病理检查。 冰冻﹢﹢元+常规﹢﹢元=﹢﹢元（一个标本）。 5、送检：由检验科协同司机班送检。 6、流程： 手术者术前填写好术中快速病检同意书——患者或家属签字——处置单上账——术中取出的标本、同意书、已上账的处置单一并送病理科——××分钟左右病理科电话反馈快速冰冻病检结果——×天后病理科反馈常规病检结果。 医务科 二〇××年×月×日

CM1950冷冻切片机使用说明

Leica CM1950 冷冻切片机操作规程一. 控制键盘说明

二. 调节部件 1.切片厚度调节旋钮 2.调节切片平面的旋钮，松开后可调节切片平面切片时要拧紧 3.夹紧样品托的旋钮 4.调节切削刀口的压杆，松开后，刀架可左右移动，选择切片刀口 5.调节切片角度的压杆，松开后可调节切片角度，右侧有角度指示 6.刀座夹紧压杆，松开后刀座可前后移动 7.防卷板上下移动旋钮，移动时防卷板要离开刀刃 8.装卸刀片压杆 三操作说明 (一)开机 1.利用主机右侧的开关开启电源，用箱体温度设置按钮将切片机温度设置到切片 所需温度，当设置温度时温度显示窗口显示设置温度，设置停止5秒后显示实际温度。只要按下箱体温度设置按钮，即可随时检查设置温度。样品头温度设置按同样方法进行。若样品头设为最低温度（-50度），则按样品头最低温度设置按钮即可。

2.第一次开机时利用基准时间设置按钮设置一个基准时间，一般为北京时间，利 用除霜时间设置按钮设置一除霜时间，一般为晚上12时左右，如果在该时间切片，应将时间推迟，当设置除霜时，时间显示窗口显示除霜时间，5秒后显示基准时间。手动除霜时先按下手动除霜按钮，听到峰鸣音后，按箱体温度设置按钮，则箱体手动除霜；如按箱体温度设置按钮，箱体手动除霜，按此顺序再按一次可关闭手动除霜，如按样品头温度设置按钮，则样品头除霜，按此顺序在按一次关闭。 (二)切片 1.利用切片机的厚度调节按钮调节切片厚度，调整切片角度，安装切片刀。如是 一次性刀片，请利用刀架的左右移动来使用不同的刀口，勿移动刀片 2.将样品放到样品托上，利用包埋剂固定，放到冷台上冷冻，在即将完全冷透前 用热交换装置压平。 3.将冷却透的样品放到样品头上，设置样品头温度，用样品快进按钮将样品移近 刀口，调整要切的平面，利用慢进按钮开始修片，修好后即可放下防卷板切片，如有需要可调节防卷板的上下位置，使切出的样品平整的进入防卷板与刀片的狭缝，取出后染色观察。 (三)注意事项 1.切片后为防止别人改变参数，可利用控制面板上的键盘锁定按钮将键盘锁定， 即按下键盘锁定按钮5秒钟左右，时间窗口中间的两个点停止闪烁，表示键盘锁定，此时再按键盘锁定按钮5秒钟即可解除键盘锁定。 2.当停机时，应将玻璃窗打开，再次开机前应先检查切片机内是否有水，如有应 吹干后再开机，并取出隔板检查切片机箱体底部是否有水，如有需拔开底部的塞子，将水排除，吹干后再开机。 3.如常年开机，夜晚可将切片机温度设到零下十度以下，不能高于零下十度。由 于切片机冷却到工作温度大约需两个小时，如关机后第二天有样品，应提前一天开机制冷，以免影响第二天的工作。

CM1950冷冻切片机性能指标

徕卡CM1950冰冻切片机性能指标 1. 自动和手动除霜功能 *2. 全封闭设计，冷冻箱和样本头各自独立的除霜设置 *3. 双压缩机制冷，两个独立的制冷系统 *4. 单独一个压缩机供给样本头制冷，保持切片过程中样本温度，样本头温度-10 到-50 ° C 任意设定，以1K 递进，速冻台可放15 个样品 5. 加热的滑窗可移动 *6. UV紫外灯杀菌 *7. 机器表面银离子，抑菌 8.温度实时指示 9.记忆功能 10.切片范围:1-60um,连续设定 11.最大样本:直径55mm 12.水平进样:25mm 13.垂直幅度:59mm 14.电动粗进, 0.8mm/sec，可进行修块 *15. 8度精确样本定位 *16. 专业冷冻消毒剂，无毒副作用，可在低温下有效杀毒 *17.最优化的空气循环系统，专利的技术CryoZoneTM ； *18.全新的CE 刀架可兼容宽刀片和窄刀片，集成的红色安全护手，带取刀辅助装置； *19 .根据不同器官组织的推荐温度表，可以在用户手册中找到。 20.手轮安全锁定； *21.温度实时指示，高效明了容易看懂的LED 示意显示和操作，无需用多级菜单进行显示； *22 选配真空负压辅助切片，防止切片打卷，并吸走废屑

CM1950是最新一代的临床冰冻切片机，和以往的冰冻切片机相比，在用户安全性、切片质量和工作流程优化几方面CM1950都有超乎寻常的出色表现。专利技术的箱体低温紫外线消毒技术可以杀灭或抑制绝大多数病原体，例如SARS，HIV，乙肝等多种病毒。且消毒的操作仅一键控制，可以随时开启或关闭。箱体探测器可以侦测滑窗状态，如果箱体未处于密闭状态，紫外灯可自动熄灭防止危害到人员。机器的面板和扶手上均带有专利的银离子涂层，有效抑菌，进一步保护操作者的安全。 主要功能 ?对患者的好处： ?样品可以迅速冷却到最适宜的温度，缩短切片时间。 ?优化的制冷效果，不仅提升切片速度更提高了切片的质量。 ?切片废屑处理系统可以同步除去切片碎屑，防止切片的污染。 详细介绍 Leica的双压缩技术在CM1950上得以传承，样品头和箱体温度的独立控制可以更好适应不同组织所需的理想切片温度，改良的样品头制冷系统可以让样品的温度下降更迅速。且改良的制冷技术确保冰冻切片机的工作区温度恒定。专利的负压展片功能，可以帮助操作人员得到高质量的切片。增大负压力度可以在每次工作结束后轻松吸走箱体内的废屑。改良的样品托设计可提高样品的制冷效果，并增强样品和样品头之间的贴附能力。在秉承徕卡切片机一贯出色表现的基础上，全新设计的刀架使切片效果更好，操作更符合人机工程学。电动切片功能不仅节省人力也保持切片质量的恒定。CM1950独有的最优化的空气循环系统CryoZoneTM，冷空气从蒸发器上直接向下吹到刀片架/刀架上。刀片架和防卷板得到“间接”制冷，且冷空气吹拂过样品的表面。这种目前独一无二的制冷技术可以确保切片的最佳质量。切片机箱体宽敞，内部部件的分配更合理。控制面板避免使用复杂的文字菜单而保持了徕卡传统的图形标识，按键位置更合理，使用者可以在最快时间熟悉并掌握机器的使用，更大程度上提高整个切片的效率，便于工作流程的合理分布。

1091例手术中冰冻切片病理诊断准确性分析

内容摘要：作者：张剑虹成日青林媛媛赵秀芳张凡刘军超张九鸿 作者：张剑虹成日青林媛媛赵秀芳张凡刘军超张九鸿 【关键词】冰冻切片; 病理诊断; 准确性 随着临床医学手术水平的不断提高，手术中要求送检冰冻病理切片快速诊断的病例日益增多，临床手术医师对病理报告的依赖性也逐渐增加，快速病理冰冻诊断已成为指导临床手术医师确诊和制订合理手术方案的必需手段之一。然而手术中冰冻切片病理诊断受到很多因素的制约，准确性很难达到与常规石蜡切片相一致的效果。为此我们收集我院病理科近两年的冰冻切片资料1091例，分析探讨冰冻切片诊断价值和准确性及其影响因素，旨在不断提高手术中病理诊断质量，从而降低医疗事故隐患。 1 材料与方法 选取我院2003.1～2005.12月的冰冻切片资料1091例，为防止制成的冰冻切片镜下组织形态发生改变，送检标本要求用干纱布包裹或置于不加任何液体的洁净容器内及时送达病理科，病理医师详细检查大体标本后取肉眼确认病变最明显区域1～2块组织，迅速置全自动恒冷切片机（英国产shandn as 620e型）上制作切片。每个组织块切取两张切片，厚4μm，经酒精固定，he染色，普通光镜（olympus bx51）下观察，并经2～3名医师阅片后集体讨论确诊；如送检组织不合格（凝血块、坏死渗出物等），立即请手术医师第二次取材送检，冰冻残余组织做常规石蜡切片，并与另外多处取材石蜡切片对照分析。 2 结果 1091例冰冻组织分布在12个系统及组织，如女性生殖系统485例，占总例数44.4%，乳腺病变364例，占33.3%，甲状腺58例，占5.3%，消化系统52例，占4.7%等。送检最活跃的科室为妇科、产科，其次为普外科等，见表1。表1 1091例冰冻标本在各系统分布情况石蜡证实良性病变775例，其中771例冰冻符合，冰冻准确率96.9%；石蜡证实恶性病变286例，冰冻报告恶性281例，冰冻准确率97.6%；石蜡证实交界性病变29例，冰冻报告交界性24例，冰冻准确率82.8%。1091例冰冻标本中，与石蜡切片报告相符的为1056例，冰冻切片总的诊断准确率为96.8%，误诊14例，误诊率为0.13%，见表2。表2 1091例冰冻与石蜡切片诊断结果比较 3 讨论 3.1 冰冻切片病理诊断病变的价值冰冻在外科手术中应用广泛，术中冰冻可使外科医生在手术中知晓病变性质（良性、交界性、恶性），从而决定适当的手术方案。自1960年cryostat 冷冻切片机在临床病理应用以来，随着病理技术人员素质的提高和切片设备的更新换代，冷冻切片质量与石蜡切片已相差无几，使病理医师对手术中冰冻切片诊断准确率不断提高。我院近年内投资进口大型衡冷柜式切片机，为冰冻切片的准确性提供了必要的保障。所以目前冰冻切片为临床快速确定诊断和决定手术范围的一个重要依据，主要应用价值体现在：1.决定病变的性质，要求病理医师在最短的时间内确定送检组织是肿瘤或是非肿瘤性病变，如为肿瘤则需再确定良性或恶性，因病变不典型而不能确定良性、恶性病变时，则提一个考虑性或倾向性意见供临床考虑，或待石蜡切片再定。2.确定切除肿瘤的边缘是否残留肿瘤组织。我们遇到最多的是乳腺癌手术实施保乳治疗时的上、下、左、右及基底五个切缘，如切缘发现癌组织，则需扩大切除范围，此时冰冻切片结果对临床手术范围起到了决定性作用。3.辨认组织，如先天性巨结肠须证实手术切缘的肠壁内是否有肌间神经节细胞存在，如未见神经节细胞则须再切肠管,直至查见肌间神经节细胞为止。 4.确定淋巴结有无癌转移，手术医师取

Leica CM1950冰冻切片机使用说明

Leica CM 1950冰冻切片机使用说明 一、开机 1.利用主机右侧的开关开启电源，用箱体温度设置按钮将切片机温度设置到切片所需温度，当设置温度时温度显示窗口显示设置温度，设置停止5秒后显示实际温度。只要按下箱体温度设置按钮，即可随时检查设置温度。样品头温度设置按同样方法进行。若样品头设为最低温度（-50度），则按样品头最低温度设置按钮即可。 二、切片 1.利用切片机的厚度调节按钮调节切片厚度，调整切片角度，安装切片刀。 如是一次性刀片，请利用刀架的左右移动来使用不同的刀口，勿移动刀片 2.将样品放到样品托上，利用包埋剂固定，放到冷台上冷冻，在即将完全冷透前用热交换装置压平。 3.将冷却透的样品放到样品头上，设置样品头温度，用样品快进按钮将样品移近刀口，调整要切的平面，利用慢进按钮开始修片，修好后即可放下防卷板切片，如有需要可调节防卷板的上下位置，使切出的样品平整的进入防卷板与刀片的狭缝，取出后染色观察。 三、注意事项 1.切片后为防止别人改变参数，可利用控制面板上的键盘锁定按钮将键盘锁定，即按下键盘锁定按钮5秒钟左右，时间窗口中间的两个点停止闪烁，表示键盘锁定，此时再按键盘锁定按钮5秒钟即可解除键盘锁定。 2.当停机时，应将玻璃窗打开，再次开机前应先检查切片机内是否有水，如有应吹干后再开机，并取出隔板检查切片机箱体底部是否有水，如有需拔开底部的塞子，将水排除，吹干后再开机。 3.如常年开机，夜晚可将切片机温度设到零下十度以下，不能高于零下十度。由于切片机冷却到工作温度大约需两个小时，如关机后第二天有样品，应提前一天开机制冷，以免影响第二天的工作。

4.若要关闭压缩机，按一下锁定开关，再按一下样品头温度设置按钮，则样品头压缩机关闭，若按箱体温度设置按钮则箱体压缩机关闭，重复以上步骤，压缩机又打开。

冰冻切片机的使用指南及注意事项修订稿

冰冻切片机的使用指南 及注意事项 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-

冰冻切片机使用步骤 1、按电源开关I/O侧的I（开）侧，接通仪器电源。待仪器进行短暂时间的初 始化（屏幕上将显示一个沙漏标志）后，请检查上方显示屏是否亮起，是否显示语言选择菜单。 2、请检查速冻台、冷冻箱及其切片厚度是否为实验所需要的相关数据，通 常速冻台为-35℃，冰冻箱为-20℃，切片厚度为6μm。如若不是，在屏幕 或调节到需要的数据。调节好后，等待机器降到所调节的温度。 3、将手轮手柄旋转到12点钟的位置，然后进行制动。将样品利用冰冻胶固定 在样本托上，并放于速冻台上降温。10min后，将带样品的样本托从速冻台取出，然后用样本夹钳将其固定在切片机头上。 4、取下护刀架，如果样本运行指示器上显示有足够“剩余移动距离”，那么， 您可以使用仪器左侧控制面板上的样本推进按键，使样本向刀架方向前 进。另外您也可以采用，将手轮旋转到3点钟，并且将其锁定在该位置。 将刀架左下方（黑色）的操控杆拉向你，然后小心地将刀架底座沿着滑槽向远离你的方向（前方）滑动，直至刀片快要接触到样本。将操控杆沿着远离你的方向推动，将刀架锁定在适当位置上。如果需要，可使用控制旋钮将样本精确定位在靠近刀架的位置。每旋转控制钮一个刻度，可将样本移动8μm。 5、打开手轮柄锁，顺时针（朝前）均力旋转摇手柄轮一圈，即出一张相应厚 度的切片。待切到样品位置时，放下防卷板再次切片。切好后，请将手轮锁定在6点或12点位置，使样本头移动到最低或最高位置便于取出切 片，掀起玻璃防卷板用载玻片上靠，切片立即附着在载玻片上。玻璃防卷板可以用螺丝左右调节平行。如刀上或防卷板上粘有脏东西，可用冷冻台内的毛笔刷干净。 6、当把最后一个组织切片取走后，请放好刀片护刀架，然后握住样本托的手 柄将其从夹钳处取出。锁定手轮，使用冰冻台内的刷子扫除多余组织碎 片，将其清扫到后面的废物铲上，并清理出冰冻箱体。

远程术中冰冻切片检查与诊断简介1

远程术中冰冻切片检查与诊断 一.简介及意义 冰冻切片检查与诊断（简称“术中冰冻”）是将手术中切除的病理组织在冰冻切片机中快速制片，经过特殊染色后供病理医师进行病理诊断的一种诊断方法；是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题请求病理医师快速进行的会诊方式，如果诊断为恶性肿瘤，就可以直接根据结果选择手术方式及范围，从而有效地避免了二次手术及损伤。 二．方法及原理 将手术中切除的病理组织无需固定、直接送检，在冰冻切片机中快速制片，经过特殊染色后供病理医师进行病理诊断，冰冻切片取材后剩余、未曾冷冻的组织（冻剩）均会制备石蜡切片并进行常规病理诊断。 三．应用范围 适用范围 1.需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤、良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案时。 2.了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。 3.确定肿瘤部位的手术边缘有无肿瘤组织残留。 4.确认切除的组织，例如甲状旁腺、输卵管、输精管及异位组织等。 不适用范围 1．疑为恶性淋巴瘤者。 2．过小的标本(标本长径≤0.2cm者)和含水分较多的脑组织。 3．术前易于进行常规活检者（例如：肠镜、胃镜、支气管镜、穿刺组织标本等）。 4．脂肪组织、骨组织和钙化组织。 5．需要依据核分裂计数判断良、恶性的软组织肿瘤。 6．主要根据肿瘤生物学行为特征（如浸润、转移）而不能依据组织形态判断良、恶性的肿瘤。 7．已知具有传染性的标本(例如结核病、病毒性肝炎、艾滋病等)。 8．钳夹、烧灼后的标本不能进行冰冻切片。

四、送检流程 1、预约： 1）项目开展时间为全周，工作时间是上午8:30－下午17:00。遇法定假期以具体通知为主。具体安排为：周一、三、五在本院病理科完成，周二、四、六、日送到金域检验中心病理科完成。推荐冰冻尽量安排在周一、三、五来完成。 2）预约方式：需要进行术中冰冻的临床科室需至少提前一天17:00前预约第二天手术。致电给病理科，登记患者姓名和手术时间等信息。 ① ②、电话预约客服中心(4001-111-120)工作时间为周一至周六8:00-21:00、周日8:00-17:30。 2、手术： 送检保存：手术标本送检冰冻时，无需加固定液，不要沾水，过小标本可用拧后的生理盐水湿棉布包裹防止坏死。 3、配送:由专门医护人员直接将手术标本从手术室送至本院病理科，并做好相关登记。 4、标本处理：标本处理依次经过标本接收、取材、冰冻切片、染色及封片等步骤制作成玻片，处理时间在20分钟内。 5、诊断： ①、病理医生上班时：直接阅片作病理诊断，做出诊断报告不超过10分钟。 ②、病理医生休息时：通过数字化远程病理系统将制片扫描上传，由金域检验中心病理室的病理医生（提前预约好）阅片作病理诊断。金域病理中心在收到远程图片后做出诊断报告不超过10分钟。 6、报告：病理医生做出诊断后，即时发送电话报告或传真报告，随后会再发出一份常规石蜡报告，确保结果准确性。

冰冻切片检查注意事项

手术中冰冻切片检查规范 一、手术中冰冻切片检查注意事项 (一) 手术中冰冻切片检查是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题，尤其需要临床医师与病理医师间的密切合作。 (二) 手术中冰冻切片检查要求病理医师在很短时间内，根据对切除标本的巨检和组织块快速冷冻切片的观察，向手术医师提供参考性病理诊断意见，由于组织未得到充分有效的固定、脱水以及切片较厚等等，与石蜡切片病理诊断的准确率有一定的差距，一般仅限于良、恶性的鉴别。与常规石蜡切片的病理诊断相比，手术中冰冻切片检查具有更多的局限性和误诊的可能性，误诊率5%以上。有的病例难以快速诊断，需要等待常规石蜡切片进一步明确诊断。 (三) 有关临床医师应于手术前向患者和／或患者授权人说明手术中冰冻切片检查的意义和局限性等，取得患者和／或患方的知情和理解。患者和／或患者授权人应在由医院制定的《手术中冰冻切片检查知情同意书》签署意见和签名。 (四) 主持手术的临床医师应在手术前一天向病理科递交手术中冰冻切片检查申请单，填写患者的病史，重要的影象学、实验室检查结果和提请病理医师特别关注的问题等。一般不接受电话预约和临时申请手术中冰冻切片检查。 （五）手术中冰冻切片检查的手术标本在切除后应立即送到病理科，并注明手术的部位，重点部位应做标记或加以说明。同时手术

标本应保持新鲜，不要加用固定液或用含水溶液清洗，以免影响制片和诊断。 （六）手术中冰冻切片检查诊断报告一般在手术标本送达病理科后30分钟内做出。并以书面文字形式通知临床手术科室。特殊情况（如标本过大，取材过多，或多个冰冻标本同时送检等），报告时间可以超过30分钟。 （七）工作开展时间：手术中冰冻切片检查的开展时间为周一至周五，周六和周日如有需要可提前预约。 （八）手术医师应在手术后及时填写常规石蜡病理检查申请单到病理科，以便病理科及时发出常规病理报告。 二、手术中冰冻切片检查适用范围 (一) 需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤／良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案的标本。 (二) 了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。 (三)确定肿瘤部位的手术切缘有无肿瘤组织残留。 三、手术中冰冻切片检查慎用范围 涉及截肢和其他会严重致残的根治性手术切除的标本。需要此类手术治疗的患者，其病变性质宜于手术前通过常规活检确定。 四、手术中冰冻切片检查不宜应用范围 五、(一)疑为恶性淋巴瘤。 六、(二)过小的标本。

冰冻切片机的使用指南及注意事项

冰冻切片机使用步骤 1、按电源开关I/O侧的I（开）侧，接通仪器电源。待仪器进行短暂时间的初始化（屏幕上将显示一个沙漏标志）后，请检查上方显示屏是否亮起，是否显示语言选择菜单。 2、请检查速冻台、冷冻箱及其切片厚度是否为实验所需要的相关数据，通常速冻台为-35℃，冰冻箱为-20℃，切片厚度为6μm。如若不是，在屏幕上点击要修改的事项，用或调节到需要的数据。调节好后，等待机器降到所调节的温度。 3、将手轮手柄旋转到12点钟的位置，然后进行制动。将样品利用冰冻胶固定在样本托上，并放于速冻台上降温。10min后，将带样品的样本托从速冻台取出，然后用样本夹钳将其固定在切片机头上。 4、取下护刀架，如果样本运行指示器上显示有足够“剩余移动距离”，那么，您可以使用仪器左侧控制面板上的样本推进按键，使样本向刀架方向前进。 另外您也可以采用，将手轮旋转到3点钟，并且将其锁定在该位置。将刀架左下方（黑色）的操控杆拉向你，然后小心地将刀架底座沿着滑槽向远离你的方向（前方）滑动，直至刀片快要接触到样本。将操控杆沿着远离你的方向推动，将刀架锁定在适当位置上。如果需要，可使用控制旋钮将样本精确定位在靠近刀架的位置。每旋转控制钮一个刻度，可将样本移动8μm。 5、打开手轮柄锁，顺时针（朝前）均力旋转摇手柄轮一圈，即出一张相应厚 度的切片。待切到样品位置时，放下防卷板再次切片。切好后，请将手轮锁定在6点或12点位置，使样本头移动到最低或最高位置便于取出切片，掀起玻璃防卷板用载玻片上靠，切片立即附着在载玻片上。玻璃防卷板可以用螺丝左右调节平行。如刀上或防卷板上粘有脏东西，可用冷冻台内的毛笔刷干净。 6、当把最后一个组织切片取走后，请放好刀片护刀架，然后握住样本托的手

免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)

免疫组化技术 原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 分类（常用） 1、免疫荧光方法 最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。 2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。 3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法 标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片

冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作

冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作 实验目的 1 掌握冷冻切片的方法 2 掌握冷冻切片的用途 实验原理 冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度并通过冰起支撑作用来进行切片的一种方法。 速冻可减小冰晶直径，避免组织细胞损伤。 制冷压缩机佛里昂制冷、半导体温差电制冷

实验材料 新鲜动物肝脏 实验方法 1 准备将仪器打开，样品台温度调至-40 ℃。 2 取材组织必须新鲜，尽可能不经水洗。取材时应避免组织挤压，防止人为假象。样品大小5X5X3mm。 3 速冻将样品放在样品台上，样品四周加水加固，冷冻5－10min. 4 切片升高温度至-15℃（视样品而定），约5min后开始切片，厚度6-15um。 5 制片将切片直接放在载波片上或先放在盛水（固定液）的培养皿中再转移到载波片上。 6 染色观察吸干水，加一滴苏木精，加盖玻片，用显微镜观察。 7 记录将观察的结果绘于实验报告上，整理自己用过的物品。 附：切片温度的设定 脑 -12℃ 肝脏 -14℃ 肾脏 -16℃ 肌肉 -20℃ 皮肤 -25℃ 多脂肪组织 -30℃ 经过固定的组织 -5℃～-10℃ 附：快速永久制片 1 固定 70％乙醇5～10min； 2 水洗 2min； 3 苏木精染色 5～10min；

4 脱色 0.1%HCl 至变红； 5 蓝化0.1NaOH 变蓝； 6 水洗 5～10s ； 7 脱水 70% 2min ； 8 伊红染色 5～10min ； 9 脱水 100%乙醇2minX2； 10 透明二甲苯 3min； 11 封片中性树胶封片。 冷冻切片机的基本操作： 1.在使用前2小时开启电源，并将温度设定在-25℃; 2.将适当大小和厚度的标本放在蘑菇状杯上，加上冷冻蜡，夹在切片机的固定槽内; 3.准备好玻片，选择切片厚度，摇动手柄，即可做成切片; 4.将做成的切片小心的吸附在玻璃片上; 5.使用结束后关闭电源,清洁腔体和擦干水气, 做好使用记录。 6.为让水蒸气蒸发，请不要马上关闭切片机的上盖移门，应到第二天再关。如需详细说明，请借阅说明书。

免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)

免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
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术中快速冰冻切片病理会诊患者知情同意书

成武县人民医院 术中快速冰冻切片病理会诊患者知情同意书 1. 术中快速冰冻切片病理检查是一项特殊的临床病理急会诊工作。其主要目的是：（1）明确送检标本是否有病变；（2）明确病变的性质（良性或恶性或交界性），确定淋巴结是否转移或邻近脏器有无浸润，以便制定手术方案；（3）了解手术切缘有无癌瘤残留，以决定手术范围。 2. 冰冻切片是将组织速冷后制成切片进行病理学观察，其优点是检查快速，然而组织受冰冻后，可能造成组织和细胞变形，发生人为假象，加上检材有限、切片较厚、染色不良，其质量远较常规石蜡切片为差，大大增加了诊断难度，故诊断正确性受到一定的限制，其诊断正确率最高仅达95%；同时，还存在误诊及微小病灶漏诊的可能。对此，病员及其家属应予以充分理解。术中冰冻切片检查仅作为临床手术治疗的参考，最终诊断以常规石蜡病理诊断为准。 3. 术中快速冰冻切片诊断单件标本一般30分钟内完成，多件标本依此类推。 4. 如果遇临时停电、停水则无法进行术中快速冰冻切片病理会诊。 5. 对于部分难以作出明确诊断的病例，允许延迟诊断，此时外科医师有权根据病理医师的建议改变手术方式，调整手术范围或等待常规石蜡切片报告出来后进行第二次手术；偶尔亦可术中由病理医师、手术医师及家属三方面取得共识后，确定手术与否及其范围。 6. 对术中冰冻切片病理检查结果与最后常规病理结果不一致，将导致治疗方案及治疗结果的变化，我院不负任何法律责任，但保证将会按医院规定进行追踪与讨论，并将最终结果告知患者或家属。 以上内容提请患者和家属仔细阅读后签字，并有权选择是否做术中冰冻切片检查。 医师签字：年月日 医师已向我详细交待术中冰冻切片病理检查的重要性及其存在一些缺点和限制，我已仔细阅读上述四项条款并理解其含义，决定同意接受术中快速冰冻切片病理检查。对术中冰冻切片病理检查结果与最后常规病理结果不一致，导致治疗方案及治疗结果的变化，愿给予理解，并承诺不以此为由追究病理医师和医院责任，也不以此为由拒付医疗费用。 签字人：联系电话： 签字人与患者关系：