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荧光分析法基本概念

荧光分析法基本概念
荧光分析法基本概念

紫外可见吸收光谱

一紫外吸收光谱分析

基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱,是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。

二紫外光谱的产生

物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征)。一个分子有一系列能级,其中包括许多电子能级,分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱

分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的,从化学键的性质上考虑,与电子光谱有关的主要是三种电子:(1)形成单键的σ电子;(2)形成双键的π电子;(3)分子中非键电子即n 电子。

化合物不同,所含的价电子类型不同,所产生的电子跃迁类型不同,根据分子轨道理论,分子中这三种电子能级的高低次序大致是:(σ)<(π)<(n)<(π*)<(σ* )σ,π是成键轨道,n 是非键轨道,σ* ,π* 是反键轨道

由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。

二紫外光谱的表示方法

紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。

横坐标表示吸收光的波长,用nm(纳米)为单位。

纵坐标表示吸收光的吸收强度,可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。

吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置,纵坐标为它的吸收强度。

四、紫外光谱中常用的几个术语

1.发色基团和助色基团

发色基团:是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团,不论是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团(C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等)

助色基团:指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团,但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波,同时使吸收强度增加。助色基团通常是由含有孤对电子的元素所组成(-NH2, -NR2, -OH , -OR , -Cl等),这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度,从而使电子跃迁的能量下降。

2.红移、蓝移、增色效应和减色效应

由于有机化合物分子中引入了助色基团或其他发色基团而产生

结构的改变、或者由于溶剂的影响使其紫外吸收带的最大吸收波长向长波方向移动的现象称为红移。与此相反,如果吸收带的最大吸收波长向短波方向移动,则称为蓝移。

由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响,使吸收带的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应或减色效应、

分子荧光分析法

一、荧光的产生

物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。分子吸收能量后,从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级(这一过程速度很快,大约10-15s),成为激发单重态分子。激发态分子不稳定,可以通过以下几种途径释放能量返回基态

1. 振动驰豫

这一过程只能发生在同一电子能级内,即分子通过碰撞以热的形式损失部分能量,从较高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。由于这一部分能量以热的形式释放,而不是以光辐射形式发出,故振动驰豫属于无辐射跃迁。

2. 内转换

即激发态分子将多余的能量转变为热能,从较高电子能级降至较低的电子能级。内转换也属于无辐射跃迁

3. 系间窜跃

有些物质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最低振动能级后,有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态,这一过程伴随着自旋方向的改变,称为系间窜跃。对于大多数物质,系间窜跃是禁阻的。如果分子中有重原子(如I、Br等)存在,由于自旋-轨道的强偶合作用,电子自旋方向可以改变,系间窜跃就变得容易了

4. 磷光

经系间窜跃的分子再通过振动驰豫降至激发三重态的最低振动能级,停留一段时间(10-4~10 s,称作磷光寿命),然后以光辐射形式放出能量返回到基态各振动能级,这时发出的光称为磷光(phosphorescence)。由于激发三重态能量比激发单重态最低振动能级能量低,故磷光辐射的能量比荧光更小,即磷光的波长比荧光更长。

5. 荧光

较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动能级后,仍不稳定,停留较短时间后(约10-8 s,称作荧光寿命),以光辐射形式放出能量,回到基态各振动能级,这时所发射的光称为荧光。当然也可以无辐射跃迁形式返回基态

二、激发光谱和荧光光谱

荧光检测

光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光,照射到样品溶液上,激发样品产生荧光。样品发出的荧光为宽带光谱,需通过发射单色器分光后再进入检测器,检测不同发射波长下的荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收,可透过溶液,为了防止透射光对荧光测定的干扰,常在与激发光垂直的方向检测荧光(因荧光是向各个方向发射的)。

激发光谱与荧光发射光谱的形成

任何荧光物质,都具有两种特征光谱,即激发光谱(excitation spectrum)和荧光发射光谱(fluorescence emission spectrum)。

1. 激发光谱

保持荧光发射波长不变(即固定发射单色器),依次改变激发光波长(即调节激发单色器),测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F(即激发光波长扫描)。然后以激发光波长为横坐标,以荧光强度F为纵坐标作图,就可得到该荧光物质的激发光谱。

激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长,是激发荧光最灵敏的波长。物质的激发光谱与它的吸收光谱相似,所不同的是纵坐标。

2. 荧光光谱

荧光光谱,又称发射光谱。保持激发光波长不变(即固定激发单色器),依次改变荧光发射波长,测定样品在不同波长处发射的荧光强度F。以发射波长为横坐标,以荧光强度F为纵坐标作图,得到荧光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长

发射光谱与激发光谱的关系

1.发射光谱形状与激发光波长无关由于荧光是分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态的各振动能级时释放的光辐射,与分子被激发至哪一个电子激发态无关。

2.发射光谱比激发光谱波长为长

由于分子吸收激发光被激发至较高激发态后,先经无辐射跃迁(振动驰豫、内转换)损失掉一部分能量,到达第一电子激发态的最低振动能级,再由此发出荧光。因此,荧光发射能量比激发光能量低,发射光谱波长比激发光波长长。

3.镜像对称

对于高度对称的有机分子,其荧光发射光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。

解释:能级结构相似性

荧光为第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁到基态的各个振动能级而形成,即其形状与基态振动能级分布有关。

激发光谱是由基态最低振动能级跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能级而形成,即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。由于激发态和基态的振动能级分布具有相似性,因而呈镜像对称。

三、影响荧光产生及荧光强度的因素

1.物质产生荧光的必要条件

一种物质能否发荧光以及荧光强度的高低,与它的分子结构及所处的环境密切相关。能够发射荧光的物质都应同时具备两个条件:

1. 物质分子必须有强的紫外吸收(有π~π*跃迁);

2. 物质具有较高的荧光效率(fluorescence efficiency)。荧光效率也称

荧光量子产率,用Φf 表示。

可见,凡是使 k F 增加,使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。通常,k F 由分子结构决定(内因),而其它参数则由化学环境和结构共同决定。

2.影响荧光及其强度的因素

跃迁类型:如上所述,物质必须在紫外可见区有强吸收和高荧光效率才能产生荧光。具有π—π* 跃迁的分子才有强吸收。π—π* 跃迁的ε大。

共轭效应:大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环,具有共轭的π~π* 跃迁。其共轭程度愈大,荧光效率也愈大,且最大激发和发射波长都向长波长方向移动,如苯、萘、蒽三种物质。

苯 萘 蒽 维生素A 205nm 286nm 356nm

327nm 278nm 321nm 404nm 510nm

Φ

0.11 0.29 0.36

F f F VR IC ISC EC P

k Φk k k k k k ==+++++发射的荧光量子数吸收的光量子数

刚性平面结构:当荧光分子共轭程度相同时,分子的刚性和共平面性越大,荧光效率越大。

荧光物质(荧光素) 非荧光物质(酚酞)

芴(Ф=1.0) 联苯(Ф=0.2)

有些物质本身不发荧光或荧光较弱,但和金属离子形成配合物

后,如果刚性和共平面性增加,就可以发荧光或增强荧光。如8-羟基喹啉是弱荧光物质,与Mg 2+、Al 3+ 等金属离子形成的配合物的荧光增强,利用这一特点可以间接测定金属离子。

O -O O COO --O O

COO -

N OH N O Al /3

8-羟基喹啉8-羟基喹啉-铝

取代基团

荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都有很大影响。给电子取代基如—NH2、—OH、—OCH3、—CN、—NHR、—NR2等,能增加分子的π电子共轭程度,使荧光效率提高。而-COOH、—NO2、—C=O、—F、—Cl等吸电子取代基,可减弱分子π电子共轭性,使荧光减弱甚至熄灭。还有一类取代基则对荧光的影响不明显,如—R、—SO3H、—NH3等。

温度

温度对被测溶液的荧光强度有明显的影响。当温度升高时,介质粘度减小,分子运动加快,分子间碰撞几率增加,从而使分子无辐射跃迁增加,荧光效率降低。故降低温度有利于提高荧光效率及荧光强度。

由于荧光仪器光源的光强度大、温度较高,容易引起溶液温度升高,加之分析过程中室温可能发生变化,从而导致荧光强度改变。另外,有些荧光物质的溶液在激发光较长时间的照射下,还会发生光分解,使荧光强度下降。因此,试样不应长时间受光照射,只在测定荧光强度时才打开光闸,其余时间应关闭。在较高档的荧光分光光度计中,样品室四周设有冷却水套或配有恒温装置,以使溶液的温度在测定过程中保持恒定。

溶剂:同一种荧光物质在不同的溶剂中,其荧光光谱的位置和荧光强度可能会有一定的差别,尤其是那些分子中含有极性取代基的荧光物质,它们的荧光光谱易受溶剂的影响。

溶剂的影响可以分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。一般溶剂效应是指溶剂极性的影响。通常情况下,随着溶剂极性增大,π~π* 跃迁所需的能量差?E减小,跃迁几率增加,从而使荧光波长长移,荧光强度增大。

一般而言,探针激发态的偶极矩大于基态偶极矩,当荧光基团被激发后,溶剂的偶极子在激发态的荧光基团的周围重新定向而降低激发态的能量,溶剂的极性越大,荧光团激发态能量降低的越多,因而从激发态跃迁回基态时发射的能量越低,发射的波长就越长

特殊溶剂效应是指溶剂与荧光物质形成化合物,或溶剂使荧光物质的电离状态改变,使荧光峰的波长和荧光强度都发生较大变化。如在萘胺的乙醇溶液中加入盐酸,随着溶液中盐酸浓度的增加,萘胺的—NH2基逐渐被—NH3Cl基所代替,而—NH3Cl基对萘环特征频率的影响小于—NH2,因此溶液的荧光光谱趋近于萘的荧光光谱。

pH值:溶液的酸度(pH值)对荧光物质的影响可以分两个方面:

1.若荧光物质本身是弱酸或弱碱时,溶液pH 值改变,物质分子和其离子间的平衡也随之发生变化,而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。例如苯胺

无荧光(离子形式) 蓝色荧光(分子形式)

无荧光(离子形式)

2. 对于金属离子与有机试剂生成的荧光配合物,溶液pH 值的改变会影响配合物的组成,从而影响它们的荧光性质。例如Ga 3+离子与邻-二羟基偶氮苯,在pH3~4的溶液中形成

1:1配合物,能产生荧光。而在pH6~7的溶液中,则形成1 2的配合物,不产生荧光。

总之,溶液pH 值对荧光物质的荧光光谱、荧光效率及荧光强度均有影响。需通过条件实验找出pH 与荧光强度的关系,确定最适宜的pH 范围,以提高分析的灵敏度和准确度。

3NH -

--

Fluorescence signaling mechanisms

荧光响应机理

1 Photoinduced electron transfer,PET

典型的光诱导电子(Photoinduced electron transfer,PET)转移体系是由包含电子给体的受体部分R(receptor),通过间隔基S(spacer,-CH2-)和荧光团F(fluorophore)相连而构成的。其中荧光团部分是能吸收光和荧光发射的场所,受体部分则用来结合客体,这两部分被间隔基隔开,又靠间隔基相连而成一个分子,构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。

PET mechanism

Fig.1 The principle of guest recognition by PET fluorescent molecular probe

PET荧光分子探针中,荧光团与受体单元之间存在着光诱导电子转移,对荧光有非常强的淬灭作用,通常是电子从供体转移到激发态荧光团(还原型PET)。因此在未结合客体之前,探针分子不发射荧光,或荧光很弱。一旦受体与客体相结合,光诱导电子转移作用受到抑制,

甚至被完全阻断,荧光团就会发射荧光解释

Fig.2 Frontier orbital energy

diagrams illustrating the mechanism of PET

当电子给体被激发时,引入的电子受体就可作为淬灭剂,

通过LUMO 轨道的电子转移,引起荧光淬灭。

电子转移

激发分子为

电子给体

淬灭剂为

电子受体

荧光淬灭和

生成离子自由基

LUMO

激发分子为

电子受体

淬灭剂为

电子给体

荧光淬灭和

生成离子自由基LUMO

Fig.2 Frontier orbital energy diagrams illustrating the mechanism of PET

当电子受体被激发时,引入的电子给体就可作为淬灭剂,通过HOMO 轨道的电子转移,引起荧光淬灭。

PET应用到传感器上需要的条件:

一、传感器分子中要包含一个荧光团,其应具有高的量子产率;

二、还应包含电子给体(Electron Donor),可以发生向荧光团的PET 过程;

三、当结合目标分子(或离子)后,会引发或抑制电子给体与电子受体间的光诱导电子转移,引起荧光团荧光猝灭或荧光恢复,实现信号报告目的。

基于PET过程的阴离子识别与传感

PET

选择性识别HPO4-的荧光传感器

此分子为首例利用PET机理识别阴离子的荧光分子传感器。其以蒽为荧光团,多胺阳离子为阴离子的识别位点。在进行阴离子识别前,先对多胺进行部分质子化,残留一个自由氨基作为荧光团蒽的猝灭剂。当HPO42?的加入后,其羟基与残余氨基孤对电子结合后,阻断了PET的发生,可使蒽荧光得到恢复,表现为受体分子荧光显著增强,实现在在pH = 6 的水中选择性识别磷酸氢根离子(HPO42? )。

PET过程被阻断

选择性识别CH3COO-的荧光传感器

PET

受体分子以硫脲盐类为阴离子识别位点,荧光团为萘。在激发态时,会发生从萘向硫脲盐方向的PET过程,致使萘的荧光被猝灭,在乙腈中,阴离子如AcO?与硫脲盐以静电吸引和多重氢键协同作用结合后,提高了硫脲盐的还原电位,阻断了PET的发生,荧光强度显著增强,可实现在水中识别HPO42?和AcO?,其与HPO42?形成2:1的配合物。

选择性识别Hg离子-的荧光传感器

PET

受体分子3是选择性识别Hg2+的PET传感器。萘酰亚胺是分子3的荧光团,2,6-二胺甲基吡啶上的氮原子既是荧光团的猝灭基又是金属离子的结合位点,其半刚性结构可增强与金属离子结合的选择性。在pH=6.98的HCl-Tris缓冲溶液中受体自身的荧光较弱,荧光量子产率为0.007,过渡金属离子中的Zn2+、Cd2+、Ag+和Pb2+均能使3的荧光不同程度的增强(Φ/Φ0 < 3),唯有Hg2+使其的荧光增强17倍,其它金属离子的加入并不影响3的荧光行为。受体分子中的羟基可增加

荧光分析法检测原理及应用举例

1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态,当其从激发态回到基态时,过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光,称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光,供能一旦停止,荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光,由光激发引起的荧光称为光致荧光,课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同,荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光,课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上,分子对此光有吸收作用,光能量被分子所吸收,分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级,称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态,并随时在激发态的不同振动能级下降至基态,在下降过程中,分子产生发光现象,此过程为释放能量的过程,即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区,光具有较高的能量,当某一特征波长的光照射分子时,是的分子会吸收此特征波长的光能量,能量由光传递到分子上,此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程,在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差,即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中,存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1,它表示电子在自转过程中,具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0,即所有电子都是自旋配对的,那么2S+1=1,电子所处的激发态为单重态, 用S i 表示,由此可推出,S 即为基态的单重态,S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态,S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对,说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化,存在不配对的电子为2个,2S+1=3,电子 在激发态中位于第三振动能级,称为三重态,用T i 来表示,T 1 即为第一激发态中 的三重态,T 2 即为第二激发态中的三重态,以此类推。

荧光分析法练习题82675

第十二章荧光分析法(药学) 一、A型题 1.若需测定生物试样中的微量氨基酸应选用下述哪种分析方法()。 A、荧光光度法 B、磷光光度法 C、化学发光法 D、X荧光光谱法 E、原子荧光光谱法 答案:A 2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是()。 A、分子荧光光谱为线状光谱,而分子吸收光谱为带状光谱 B、能发射荧光的物质比较少 C、荧光波长比相应的吸收波长稍长 D、荧光光度计有两个单色器,可以更好地消除组分间的相互干扰 E、分子荧光分析线性范围更宽 答案:B 3荧光量子效率是指()。 A、荧光强度与吸收光强度之比 B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比 C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比 D、激发态的分子数与基态的分子数之比 E、物质的总分子数与吸收激发光的分子数之比 答案:B 4.激发光波长和强度固定后,荧光强度与荧光波长的关系曲线称为()。 A、吸收光谱 B、激发光谱

C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案:C 5.荧光波长固定后,荧光强度与激发光波长的关系曲线称为()。 A、吸收光谱 B、激发光谱 C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案:B 6.一种物质能否发出荧光主要取决于()。 A、分子结构 B、激发光的波长 C、温度 D、溶剂的极性 E、激发光的强度 答案:A 7.下列结构中荧光效率最高的物质是()。 A、苯酚 B、苯 C、硝基苯 D、苯甲酸 E、碘苯 答案:A

8.下列因素会导致荧光效率下降的有()。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子 E、激发光强度增大 答案:D 9.为使荧光强度和荧光物质溶液的浓度成正比,必须使()。 A、激发光足够强 B、吸光系数足够大 C、试液浓度足够稀 D、仪器灵敏度足够高 E、仪器选择性足够好 答案:C 10.在测定物质的荧光强度时,荧光标准溶液的作用是()。 A、用做调整仪器的零点 B、用做参比溶液 C、用做定量标准 D、用做荧光测定的标度 E、以上都不是 答案:D 11.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于()。 A、光源 B、光路 C、单色器 D、检测器

荧光分析法实验报告

荧光分光光度法 一、 实验目的 1、学习荧光分光光度法的基本原理; 2、学习荧光光谱仪的结构和操作方法; 3、学习激发光谱、发射光谱曲线的绘制方法。 二、 实验原理 荧光分光光度法(fluorescence spectroscopy, FS )通常又叫荧光分析法,具有灵敏度高、选择性强、所需样品量少等特点,已成为一种重要的痕量分析技术。荧光(fluorescence )是分子吸收了较短波长的光(通常是紫外光和可见光),在很短的时间内发射出比照射光波长较长的光。由此可见,荧光是一种光致发光。 任何荧光物质都有两个特征光谱,即激发光谱(excitation spectrum )和发射光谱(emission spectrum )或称荧光光谱(fluorescence spectrum )。激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱时,将发射单色器固定在某一波长,通过激发单色器扫描,以不同波长的入射光激发荧光物质,记录荧光强度对激发波长的关系曲线,即为激发光谱,其形状与吸收光谱极为相似。荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。绘制荧光光谱时,使激发光的波长和强度保持不变,通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度,记录荧光强度对发射波长的关系曲线,即为荧光光谱。激发光谱和荧光光谱可用于鉴别荧光物质,而且是选择测定波长的依据。 荧光强度(F )是表征荧光发射的相对强弱的物理量。对于某一荧光物质的稀溶液,在一定波长和一定强度的入射光照射下,当液层的厚度不变时,所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比,即 该式即荧光分光光度法定量分析的依据。使用时要注意该关系式只适用于稀溶液。 三、 仪器与试剂 F-4500荧光光谱仪;比色管(10mL );牛血清白蛋白(BSA ) 四、 实验内容 1、 开机准备:接通电源,启动电脑。打开光谱仪主机电源,预热15分钟。 2、 运行FL solution 软件,设定检测方法和测量参数: EX (激发波长):280nm EM (发射波长):340nm EX 扫描范围:210nm ~330nm EM 扫描范围:290nm ~450nm EX 缝宽:2.5nm ,EM 缝宽:2.5nm 扫描速度:240nm/min PMT 电压:700V 3、 激发光谱和发射光谱的绘制: 先固定激发波长为280nm ,在290~450nm 测定荧光强度,获得溶液的发射光谱,在343nm 附近为最大发射波长λem ;再固定发射波长为λem ,测定激发波长为200nm ~λem 时的荧光强度,获得溶液的激发光谱,在280nm 附近为最大激发波长λex 。 4、 退出FL solution 软件,关闭光谱仪主机电源,关闭计算机。 Kc F

荧光分析法在生物领域的应用于发展

荧光分析法在生物领域的应用于发展摘要:本文对荧光分析法在检测细胞活性,测定生物样品,推断生物成虫日龄,研究生 物群落动态的应用与进展进行了综述与分析。并就其包含的不同方法进行一一介绍,展望了荧光分析法技术在生物领域中的应用前景。 关键词:荧光分析法生物领域应用发展 引言:利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光,可以进行定性或定量分析的方法。当照射停止后,如化合物的发射在10-9秒钟内停止,则称荧光超过此限度即称为磷光。特点:灵敏度更高10-10-10-12g/ml,应用不如UV广泛。SO2分子受特定光照射后处于激发态的SO2分子返回基态时发出荧光, 其荧光强度与SO2呈线性关系, 从而可测出气体浓度。当检测仪器系统确定后,荧光总光强I与SO2浓度的之间的关系可表示为:I=KC 在稳定的条件下,这些参数也随之确定,k可视为常数。因此,式I=kC 表示的紫外荧光光强I与样气的浓度C成线性关系。这是紫外荧光法进行定量检测的重要依据。 荧光色谱法相关内容 1.荧光色谱法的近期发展状况 (1)近10年来,由于微量分析的需要迅速增加,灵敏度高选择性强的荧光分析法日益受到重视。有关文献数量猛增,内容也从一般仪器及分析方法介绍发展到高精度、高灵敏度、自动化、多用途的新仪器新技术研究。荧光分析对象从以无机样品为主发展到以有机及生化样品为主,并从成分分析向化学结构、化学形式、微观分析、空间分布等状态分析发展,应用遍及各个领域。荧光光谱图册也陆续出版,美国费城Sadtler研究实验室自1974年起出版标准荧光光谱图及各专用荧光光谱图(如药物)。荧光分析法的应用范围与发射光谱法、火焰光度法、质谱法等相仿,成为一种重要的仪器分析方法。 (2)荧光分析法在纳米生物分析中的应用巨大。纳米荧光探针、纳米生物传感器等纳米生物分析材料器件的特性及其在生物分析中的应用。对发光量子点、复合型荧光纳米粒子和具有光学活性的金属纳米粒子作为生物分子的标记探针取得了成果。 2.荧光分析法基本原理分子角度 分子的激发态,单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子,在基态时,这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中,成对自旋,方向相反,电子净自旋等于零:S=?+(-?)=0,其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数),因此,分子是抗(反)磁性的,其能级不受外界磁场影响而分裂,称“单线态”

荧光光谱法

荧光分析法测定维生素B2 一、实验目的 1.学习与掌握荧光光度分析法测定维生素B2的基本原理与方法; 2.熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法; 3、学习掌握固体及液体试样的荧光测试方法。 二、实验原理 当用一种波长的光照射某种物质时,这种物质会在极短的时间内,发射出一种比照射光波长较长的光,这种发射出来的光就叫做荧光。当照射光停止照射时,荧光也随之很快地消失。利用某些物质被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光,以进行该物质的定性分析与定量分析,称为荧光分析。 实验证明,荧光通常发生于具有刚性平面的л-电子共轭体系分子中。随着л-电子共轭度与分子平面度的增大,荧光也就越容易产生。因此几乎所有对分析化学有用的荧光体系都含有一个以上的芳香基团,芳环数越多,荧光愈强。能发荧光的纯无机物很少,通常就是利用有机配位体与金属离子形成荧光络合物进行无机离子的分析。 图1.荧光分光光度计的结构原理图

荧光分光光度计工作原理(图1)可简述为:光源发出的光束经激发单色器色散,提取所需波长单色光照射于样品上,由样品发出的荧光经发射单色器色散后照射于检测器上,检测器把荧光强度信号转变为电信号并经放大器放大后,由信号显示系统显示或者记录。 荧光光谱包括激发光谱与发射光谱两种。激发光谱就是就是指发射单色器波长固定,而激发单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随激发光波长变化的曲线。荧光发射光谱就是指激发单色器波长固定,发射单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随发射光波长变化的曲线。一般所说的荧光光谱实际上仅指荧光发射光谱。这一光谱为分析指出了最佳的发射波长。 荧光定性定量分析与紫外可见吸收光谱法相似。定性时,就是将实验测得样品的荧光激发光谱与荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分,一般荧光定性的依据就是荧光光谱峰的个数、位置、相对强度及轮廓。 定量分析时,一般以激发光谱最大峰值波长为激发光波长,以荧光发射光谱最大峰值波长为发射波长,测量样品的荧光强度。对同一物质而言,荧光强度F 与该物质的浓度c 有以下的关系: F = 2、303Фf I0 a b c ⑴ Фf-荧光过程的量子效率; a-荧光分子的吸收系数; I0-入射光强度; b-试液的吸收光程。 在I0 与b 不变时,2、303Фf I0 a b为常数,则⑴式可以表示为 F=Kc ⑵ ⑵即可作为荧光定量检测的依据。 图2 VB2的结构式

荧光分析法实验(有思考题答案)

实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量五.数据处理 1.用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱图(如图3、4)。2.从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值,以及它们相对应的峰高。在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。 苯丙氨酸的荧光光谱图 苯丙氨酸扫描激发波长在214nm和285m两处出现最高峰,本实验选择214nm为最大激发波长。此外,激发波长曲线在280-300nm处出现了一个十分完美的峰,此峰为倍频峰,非激发波长峰,我们通过同步扫描荧光光谱技术可以验证,如图,我们通过同步扫描荧光光谱技术获得的激发波长也在215nm,与之前基本吻合。 色氨酸的荧光光谱图

色氨酸扫描激发波长在217nm处有一个最大峰,所以激发波长为217,发射波长为361。发射波长曲线在450-460nm处出现了一个十分完美的峰(在这张图上没显示出来),此峰为倍频峰,非激发波长峰,我们通过同步扫描荧光光谱技术可以验证。 六.讨论与思考 1.对待测溶液进行预扫描的有何作用? 从预扫描得到激发和发射波长的初步结果,根据我们得到的初步结果对仪器进行设置,然后对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。 2.观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点?该波长是否适合于进行定量分析? 激发波长的整数倍处荧光发射光谱会出现以很强的峰,是倍频峰。不适合定量分析。 3.同步荧光技术有哪些优点?比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长,比较他们的不同,并解释原因。 同步荧光法能简化光谱,减少光谱重叠和散射的影响,提高对荧光性质相近化合物同时测定的选择性和灵敏度。同步荧光法相对于激发光谱和发射光谱, 得到的峰比较窄,更明显。同步荧光光谱不是荧光物质的激发光谱和发射光谱

分子荧光分析法基本原理

分子荧光分析法基本原理 一. 分子荧光的发生过程 (一)分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子,在基态时,这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中,成对自旋,方向相反,电子净自旋等于零:S=?+(-?)=0,其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数),因此,分子是抗(反)磁性的,其能级不受外界磁场影响而分裂,称“单线态”; 图1 单线基态(A)、单线激发态(B)和三线激发态(C) 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后,被激发跃迁到能量较高的轨道上,通常它的自旋方向不改变,即 ?S=0,则激发态仍是单线态,即“单线(重)激发态”; 如果电子在跃迁过程中,还伴随着自旋方向的改变,这时便具有两个自旋不配对的电子,电子净自旋不等于零,而等于1: S=1/2+1/2=1 其多重性: M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂,这种受激态称为“三线(重)激发态”; “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的,即跃迁几率非常小,只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。 (二)分子去活化过程及荧光的发生: (一个分子的外层电子能级包括S0(基态)和各激发态S1,S2,…..,T1…..,每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级) 处于激发态的分子不稳定,在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量(辐射或非辐射跃迁)回到激态,这个过程称为“去活化过程”,这些途径为: 1. 振动弛豫:在溶液中,处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞,把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子(环境),在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级,这一过程称为振动弛豫。

(完整版)荧光分析法习题参考答案

荧光分析法 思考题和习题 1.如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光?如何减少散射光对荧光测定的干扰? 荧光:是某些物质吸收一定的紫外光或可见光后,基态分子跃迁到激发单线态的各个不同能级,然后经过振动弛豫回到第一激发态的最低振动能级,在发射光子后,分子跃迁回基态的各个不同振动能级。这时分子发射的光称为荧光。荧光的波长比原来照射的紫外光的波长更长。 磷光:是有些物质的激发分子通过振动弛豫下降到第一激发态的最低振动能层后,经过体系间跨越至激发三重态的高振动能层上,再通过振动弛豫降至三重态的最低振动能层,然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能层.这种光辐射称为磷光。磷光的波长比荧光更长。 瑞利光:光子和物质分子发生弹性碰撞时.不发生能量的交换,仅是光子运动的方向发生改变,这种散射光叫做瑞利光,其波长和入射光相同。 拉曼光:光子和物质分子发生非弹性碰撞时,在光子运动方向发生改变的同时,光子与物质分子发生能量交换,使光于能量发生改变。当光子将部分能量转给物质分子时,光子能量减少,波长比入射光更长;当光子从物质分子得到能量时,光子能量增加,波氏比入射光为短。这两种光均称为拉曼光。 为了消除瑞利光散射的影响,荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行,并通过调节荧光计的狭缝宽度来消除 为消除拉曼光的影响可选择适当的溶剂和选用合适的激发光波长 2.何谓荧光效率?具有哪些分子结构的物质有较高的荧光效率? 荧光效率又称荧光量子效率,是物质发射荧光的量子数和所吸收的激发光量子数的比值称,用Ψf表示。 以下分子结构的物质有较高的荧光效率: (1)长共轭结构:如含有芳香环或杂环的物质。 (2)分子的刚性和共平面性:分子的刚性和共平面性越大,荧光效率就越大,并且荧光波长产生长移。 (3)取代基:能增加分子的π电子共轭程度的取代基,常使荧光效率提高,荧光长移,如-NH2、-OH、-OCH3、-CN等。 3.哪些因素会影响荧光波长和强度? (1)温度:物质的荧光随温度降低而增强。 (2)溶剂:一般情况下,荧光波长随着溶剂极性的增大而长移,荧光强度也有增强。溶剂如能与溶质分子形成稳定氢键,荧光强度减弱。 (3)pH:荧光物质本身是弱酸或弱碱时,溶液的pH对该荧光物质的荧光强度有较大影响。 (4)荧光熄灭剂:荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用引起荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。 (5)散射光的干扰:包括瑞利光和拉曼光对荧光测定有干扰。 4.请设计两种方法测定溶液Al3+的含量。(一种化学分析方法,一种仪器分析方法) 配位滴定:利用铝与EDTA的配位反应进行滴定分析,因铝与EDTA的反应速率比较缓慢,而且铝对指示剂有封蔽作用,因此铝的测定一般用EDTA作为标准溶液,返滴定法或置换滴定法测定。 仪器分析法:利作铝离子与有机试剂如桑色素组成能发荧光的配合物,通过检测配合物的荧光强度以来测定铝离子的含量。另可采用原子吸收分光光度法或原子发射光谱法进行测定。

分子荧光光谱法实验报告范文

分子荧光光谱法实验报告范文 一、实验目的 1.掌握荧光光度计的基本原理及使用。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱:激发光谱、发射光谱的测定方法。 4.了解影响荧光产生的几个主要因素。 5.学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性和定量分析。 二、实验原理 原子外层电子吸收光子后,由基态跃迁到激发态,再回到较低能级或者基态时,发射出一定波长的辐射,称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光,平时所说的荧光指分子荧光。 具有不饱和基团的基态分子经光照射后,价电子跃迁产生荧光,是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。 (1)激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长,纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低;也表示用不同波长的光激发材料时,

使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光,合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下,测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法:先把第二单色器的波长固定,使测定的λem不变,改变第一单色器波长,让不同波长的光照在荧光物质上,测定它的荧光强度,以I为纵坐标,λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱,从曲线上找出λex,,实际上选波长较长的高波长峰。 (2)发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中,横坐标为波长(或频率),纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱,有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法:先把第一单色器的波长固定,使激发的λex不变,改变第二单色器波长,让不同波长的光扫描,测定它的发光强度,以I为纵坐标,λem为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱;从曲线上找出最大的λem。 (3)荧光强度与荧光物质浓度的关系 用强度为I0的入射光,照射到液池内的荧光物质时,产生荧光,荧光强度If用仪器测得,在荧光浓度很稀(A0.05)时,荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系:If=KC。 三、实验试剂和仪器

荧光分析法在生物领域应用

荧光分析法在生物领域的应用与进展 班级:姓名:学号: 摘要:本文综述了荧光分析法在生物领域的研究进展,其中包括检测细胞活性,测定生物样品,研究生物群落动态,研究蛋白质、核酸等生物大分子与药物小分子的相互作用等,并展望了荧光分析法在生物领域的应用前景。 关键词:荧光分析法研究进展应用发展前景 0.引言 分子受光子激发后,由第一电子激发单重态回到基态的任一振动能级伴随的光辐射称为分子荧光。利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光,可以进行定性或定量分析的方法。它有如下特点:灵敏度高,选择性优于吸收光谱法,试样量小,操作简便,发光检测的灵敏度高,发光参数多。正是因为这些优点,荧光分析法在生物领域内获得了广泛的应用。 1.荧光分析法的发展状况 1.1近十年发展状况 近10年来,由于微量分析的需要迅速增加,灵敏度高选择性强的荧光分析法日益受到重视。有关文献数量猛增,内容也从一般仪器及分析方法介绍发展到高精度、高灵敏度、自动化、多用途的新仪器新技术研究。荧光分析对象从以无机样品为主发展到以有机及生化样品为主,并从成分分析向化学结构、化学形式、微观分析、空间分布等状态分析发展,应用遍及各个领域。荧光分析法的应用范围与发射光谱法、火焰光度法、质谱法等相仿,成为一种重要的仪器分析方法。 1.2荧光分析法在药物分析中被广泛应用 荧光分析法以其灵敏度高、选择性好、操作简便等优点受到分析工作者的青睐,将荧光分析法应用于药物分析,已在药物有效成分分析鉴定、药物代谢动力学研究、临床药物与药效分析等方面取得长足发展,并广泛应用于生化分析、生物医学等领域的痕量分析。 常规荧光分析法最早被应用与分析抗疟疾药物奎宁,随着荧光分析法的发展,其应用范围日益扩大,被广泛用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等的分析。由于自身具有发射荧光特性的物质相对较少,并且受到拉曼峰和散射光等背景的干扰,常规荧光分析法在药物分析中的应用受到限制。为使荧光

分子荧光光谱实验报告doc

分子荧光光谱实验报告 篇一:分子荧光光谱实验报告 分子荧光光谱实验报告 一、实验目的: 1.掌握荧光光度法的基本原理及激发光谱、发射光谱的测定方法;学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性分析。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.了解影响荧光产生的几个主要因素。二、实验内容:测定荧光黄/水体系的激发光谱和发射光谱; 首先根据已知的激发波长(如果未知,则用紫外分光光度计进行测量,以最大吸收波长为激发波长)测定发射光谱,得到最大发射波长;然后根据最大发射波长测定激发光谱,得到最大激发波长;然后在根据最大激发波长测定测定发射光谱; 根据所得数据,用origin软件做出光谱图。三、实验原理: 某些物质吸收光子后,外层电子从基态跃迁至激发态,然后经辐射跃迁的方式返回基态,发射出一定波长的光辐射,此即光致发光。光致发光现象分荧光、磷光两种,分别对应单重激发态、三重激发态的辐射跃迁过程。本实验为荧光光谱的测定。

激发光谱:在发射波长一定的条件下,被测物吸收的荧光强度随激发波长的变化图。 发射光谱:在激发波长一定的条件下,被测物发射的荧光强度随发射波长的变化图。 各种物质均有其特征的最大激发波长和最大发射波长,因此,根据最大激发波长和最大发射波长,可以对某种物质进行定性的测定。 四、荧光光谱仪的基本机构 五、实验结果与讨论: XX00 S1 / R1 (CPS / MicroAmps) 150000 100000 50000 0Wavelength (nm) 400000 S1 / R1 (CPS / MicroAmps) 300000 XX00 100000 Wavelength (nm)

荧光分析法在药物分析中的应用

荧光分析法在药物分析中的应用The Application of Fluorimetry in Pharmaceutical Analysis 摘要 药物分析主要应用在药物的质量控制、新药研究、药物代谢、体内药物分析等方面。荧光分析法以其灵敏度高、选择性好、方法简便、重现性好、取样量少、仪器设备简单且不昂贵等特点,近年来被广泛地运用于各种药物制剂和生物体液中的药物分析工作中.本文对荧光分析法在药物分析中的应用现状及其进展进行了综述。 关键词药物分析;荧光分析法 ABSTRACT Pharmaceutical analysis mainly used in the quality control, research, metabolism, and drug analysis in vivo. Fluorescence analysis method with its high sensitivity, good selectivity, simple method, equipment simple and inexpensive, in recent years is widely used in various pharmaceutical formulations and biological fluids works. In this paper, we will illustrate the progress of the fluorescence analysis and the application of the method in pharmaceutical analysis. Key word: Pharmaceutical analysis, Fluorescence analysis

荧光光谱分析实验讲义

实验荧光光谱分析 一、实验目的与要求: 1. 了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用; 2. 掌握荧光分光光度计的工作原理; 3. 掌握激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试方法。 二、基本概念 1. 发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中,横坐标为波长(或频率),纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱,有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。 2. 激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长,纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低;也表示用不同波长的光激发材料时,使材料发出某一波长光的效率。 3. 余辉衰减曲线 是指激发停止后发光强度随时间变化的曲线。横坐标为时间,纵坐标为发光强度(或相对发光强度)。 三、测试仪器 激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试采用日本岛津RF-5301PC型荧光分光光度计。 从150W氙灯光源发出的紫外和可见光经过激发单色器分光后,再经分束器照到样品表面,样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光,再经荧光端光电倍增管倍增后由探测器接收。另有一个光电倍增管位于监测端,用以倍增激发单色器分出的经分束后的激发光。 光源发出的紫外-可见光或者红外光经过激发单色器分光后,照到荧光池中的被测样品上,样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光,由光电倍增管转换成相应电信号,再经放大器放大反馈进入A/D转换单元,将模拟电信号转换成相应数字信号,并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。 四、样品制备 液体试样

荧光分析法基本概念

紫外可见吸收光谱 一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱,是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征)。一个分子有一系列能级,其中包括许多电子能级,分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的,从化学键的性质上考虑,与电子光谱有关的主要是三种电子:(1)形成单键的σ电子;(2)形成双键的π电子;(3)分子中非键电子即n 电子。 化合物不同,所含的价电子类型不同,所产生的电子跃迁类型不同,根据分子轨道理论,分子中这三种电子能级的高低次序大致是:(σ)<(π)<(n)<(π*)<(σ* )σ,π是成键轨道,n 是非键轨道,σ* ,π* 是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法

紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长,用nm(纳米)为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度,可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置,纵坐标为它的吸收强度。

四、紫外光谱中常用的几个术语 1.发色基团和助色基团 发色基团:是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团,不论是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团(C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等) 助色基团:指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团,但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波,同时使吸收强度增加。助色基团通常是由含有孤对电子的元素所组成(-NH2, -NR2, -OH , -OR , -Cl等),这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度,从而使电子跃迁的能量下降。 2.红移、蓝移、增色效应和减色效应 由于有机化合物分子中引入了助色基团或其他发色基团而产生

浅谈荧光分析法的特点及在环境分析中的应用

荧光分析法的特点及在环境分析中的应用 摘要:论文综述了荧光分析法的特点及在环境分析中的应用。重点分析了荧光分析法的原理、特点,以及常用的荧光分析法的讨论。分析了荧光分析法在环境监测中的应用,测定范围和发展情况。 关键词:荧光分析;环境分析;应用 1.引言 环境中分析、监测的对象往往是微量、超微量的物质,有很多还具有时间性和空间性,因此对分析技术要求越来越高。荧光分析法和分光光度法以其灵敏度高、检测限低、准确性好等优点在近年来得到了迅速发展。荧光分子探针的设计合成以及荧光分析法在环境分析化学中的应用是方兴未艾的研究方向[1]。 分子荧光分析具有检测限低,灵敏度高,选择性好,取样量少,方法简捷快速等特点,是一种重要的光谱化学分析手段,其中荧光分子探针检测技术在环境分析化学中占有重要的地位[2]。因此,在对环境的分析中,荧光分析法应用非常广泛,从天然水、饮用水到废水、污水;从土壤、大气到动植物;从人的头发、骨骼、血液到内脏等各个器官,涉及到的样品和应用范围几乎无所不有[3]。 2.荧光分析法的原理和特点 2.1.荧光分析法 2.1.1荧光及荧光分析 荧光是荧光化合物在受到紫外光、电和化学等能量激发后,电子从基态跃迁到激发态,然后通过辐射衰变释放出光子而回复到基态,即产生荧光。这些物质会在极短的时间内(8-10秒)发射出各种颜色和不同强度的可见光,而当紫外光停止照射时,所发射的光线也随之很快地消失。 荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。1852年G.G.斯托克斯(G.G.Strokes)发现荧光,真正的荧光光谱测量则始于本世纪60年代。 2.1.2荧光激发光谱和发射光谱 荧光是一种光致发光现象,由于分子对光的选择性吸收,不同波长的入射光便具有不同的激发效率。如果固定荧光的发射波长不断改变激发光的波长,并记

荧光分析法检测原理及应用举例

1荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态,当其从激发态回到基态时,过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光,称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光,供能一旦停止,荧光现象随之消失。 2荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光,由光激发引起的荧光称为光致荧光,课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同,荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光,课题主要研究分子荧光。 3光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上,分子对此光有吸收作用,光能量被分子所吸收,分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级,称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态,并随时在激发态的不同振动能级下降至基态,在下降过程中,分子产生发光现象,此过程为释放能量的过程,即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 3.1 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区,光具有较高的能量,当某一特征波长的光照射分子时,是的分子会吸收此特征波长的光能量,能量由光传递到分子上,此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程,在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差,即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中,存在多重态。多重态表示为2S+1 o S为0或1,它表示电子在自转过程中,具有的角动量的代数和。S=0 表示所有电子自旋的角动量代数和为0,即所有电子都是自旋配对的,那么2S+仁1,电子所处的激发态为单重态,用S i 表示,由此可推出,S0 即为基态的单重态,S1 为第一跃迁能级激发态的单重态,S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对,说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化,存在不配对的电子为2个,2S+仁3,电子在激发态中位于第三振动能级,称为三重态,用T i 来表示,T1 即为第一激发 态中的三重态,T2即为第二激发态中的三重态,以此类推。 分子跃迁至各个激发态中,状态不稳定,随时会释放出能量,释放能量的类型有两种:一种是辐射跃迁,另一种是非辐射跃迁,释放能量会回到稳定的基态。

(完整版)荧光分析法练习题

第十二章荧光分析法(药学) A型题 1.若需测定生物试样中的微量氨基酸应选用下述哪种分析方法()。 A、荧光光度法 B、磷光光度法 C、化学发光法 D、X荧光光谱法 E、原子荧光光谱法 答案:A 2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是()。 A、分子荧光光谱为线状光谱,而分子吸收光谱为带状光谱 B、能发射荧光的物质比较少 C、荧光波长比相应的吸收波长稍长 D、荧光光度计有两个单色器,可以更好地消除组分间的相互干扰 E、分子荧光分析线性范围更宽 答案:B 3荧光量子效率是指()。 A、荧光强度与吸收光强度之比 B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比 C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比 D、激发态的分子数与基态的分子数之比 E、物质的总分子数与吸收激发光的分子数之比 答案:B 4.激发光波长和强度固定后,荧光强度与荧光波长的关系曲线称为()。 A、吸收光谱 B、激发光谱 C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案:C 5.荧光波长固定后,荧光强度与激发光波长的关系曲线称为()。 A、吸收光谱 B、激发光谱 C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案:B 6.一种物质能否发出荧光主要取决于()。 A、分子结构 B、激发光的波长 C、温度 D、溶剂的极性

E、激发光的强度 答案:A 7.下列结构中荧光效率最高的物质是()。 A、苯酚 B、苯 C、硝基苯 D、苯甲酸 E、碘苯 答案:A 8.下列因素会导致荧光效率下降的有()。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子 E、激发光强度增大 答案:D 9.为使荧光强度和荧光物质溶液的浓度成正比,必须使()。 A、激发光足够强 B、吸光系数足够大 C、试液浓度足够稀 D、仪器灵敏度足够高 E、仪器选择性足够好 答案:C 10.在测定物质的荧光强度时,荧光标准溶液的作用是()。 A、用做调整仪器的零点 B、用做参比溶液 C、用做定量标准 D、用做荧光测定的标度 E、以上都不是 答案:D 11.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于()。 A、光源 B、光路 C、单色器 D、检测器 E、吸收池 答案:B 12.激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后,经系间窜越转移至激发三重态,再经过振动弛豫降至三重态的最低振动能级,然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级,这种光辐射称为()。 A、分子荧光 B、分子磷光 C、瑞利散射光 D、拉曼散射光

荧光分析法在药物分析中的应用

荧光分析法在药物分析中的应用 【摘要】文章首先以胶束增敏荧光分析法以及同步荧光光谱法为例分析了荧光分析法在药物分析中的应用,然后分析了荧光分析法在药物分析中的应用进展,其中主要介绍了化学计量方法以及色谱-荧光联用技术这两种新型荧光分析法,然后在此基础上预测了荧光分析法未来的发展方向。 【关键词】荧光分析法;应用;药物分析;检测 药物分析是分析化学和药物化学的结合,主要分析化学原理、技术以及方法在生命科学以及药学研究中的具体应用。常见的药物分析法包括滴定分析法、重量分析法、电化学分析法、光化学分析法、以及色谱分析法等。其中光化学分析法又包括可见分光光度法、原子吸收光谱法以及荧光光谱法等。荧光分析法指的是利用物质的荧光特性来定性以及定量分析物质样品的方法,其具有选择性高、灵敏度高、检测限低以及信息量丰富等优点。由于很多有机药物分析都具有特征性的荧光光谱,因此在药物分析中得到了广泛应用,目前的主要应用方向有药物代谢动力学研究、药效分析、药物有效成分分析鉴定以及临床药理等。将荧光分析法应用到药物分析中具有很大的优越性,可以有效检测出药物的各项性质。 1.荧光分析法在药物分析中的应用 1.1胶束增敏荧光分析法 胶束增敏荧光分析法的基本原理如下:主客观分子的结构特征、表面电荷以及温度等所形成的微观环境有利于形成胶束,其降低了荧光分子非辐射过程的速率,但是速度常数不会发生变化,因此量子效率就会随之增加,客体分子吸附、穿入以及包络在胶束外,限制其行动。因此,客体分子的摩尔光系数以及有效吸光面积都会增加,激发态获得保护,荧光增强。胶束增敏荧光分析法利用这一点让荧光分子和表面活性剂在溶液中缔合,然后利用专属性荧光基团以及溶液化学等方法来改进荧光法专属性以及检测精度的分析法,具有操作简便、灵敏度高以及选择性好等优点,主要用来测定药物中氟罗沙星的含量。 1.2同步荧光光谱法 同步荧光法按照扫描方式的不同可以分为可变角法、恒能量法、恒基本法和横波长法,本文主要以恒波长法为例进行分析。 恒波长同步荧光分析法指的是在扫描过程中保持发射波长和激发波长固定间距的分析方法。该方法的使用需要注意波长间距△λ的选择,因为它会直接影响到荧光光谱的宽带、形状以及信号强度,继而对药物分析的结果造成影响。该方法主要用于测定多组分多环芳烃,这是因为多环芳烃的性质比较相似,各种化合物的发射和激发光谱会出现严重的光谱重叠现象,使用经典荧光法很难将混合物区分开来。而恒波长同步荧光分析法具有灵敏度高、干扰少等优点,用来测定

荧光分析法标准操作规程

荧光分析法标准操作规程 1 简述 某些物质受紫外光或可见光照射激发后,它会在极短时间内发射出较照射光波长为长的光,而当照射光源停止照射时,这种光线也随之消失,这种光称为荧光。荧光通常发生于具有共轭双键体系的分子。荧光分光光度法具有灵敏度高、选择性强、试样量少和方法简便等优点。 荧光光谱包括激发光谱和发射光谱,激发光谱是指不同激发波长的光引起物质发射某一波长荧光的相对效率,即发射波长不变,将激发波长进行扫描。发射光谱是指某一激发波长的光引起物质发射不同波长荧光的相对效率,即激发波长不变,将发射波长进行扫描。物质的激发光谱和荧光发射光谱,可用作定性分析。当激发波长、强度、所用溶剂等条件固定时,物质在较稀的一定浓度范围内其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系,可用作定量分析。 荧光强度的测量用下式表示 F=K'ΦI0(1—e-εbc) 式中F是荧光强度,K'是仪器常数,Φ是量子效率,I0是激发光强度,ε是摩尔吸收系数,b是样品池光程,c是样品的浓度。 由式可见荧光强度与仪器条件有关,以此供试品必须与对照品在相同条件下测定。 2 仪器和用具、溶剂 2.1 仪器荧光分析法所用的仪器为荧光分光光度计或荧光计,它由激发光源、激发单色器和发射单色器、样品池、检测器及记录仪表组成。 光源:多采用高压氙灯,它在紫外光区和可见光区都能给出连续辐射(220~700nm)。 单色光器:由光栅和狭缝组成。有两组,一组为激发单色器,光源的连续辐射经激发单色器得到单色光照射到样品池,供试品溶液经激发光照射后产生的荧光则常以激发光源呈900的角度照射到发射单色器,发射单色器分光以后照到光电倍增管转换为电信号,送入显示或记录仪表读数或记录。 样品池:常用石英池,质地应较纯,不含荧光杂质,固定受光面标志。如拟配对使用,则可盛稀硫酸奎宁溶液(1×10-8g/ ml),激发波长350nm,发射波长450nm,调节仪器示值为95%,选择各池荧光强度相差不大于1.0%者成对使用。 仪器的使用按各仪器说明书进行操作,通常应在光源点燃及主机预热20min后再进行测定。 2.2 仪器的性能检测荧光分光光度计,各仪器厂商有其自订的技术指标,国家技术监督局颁布有“JJG537—88荧光分光光度计试行检定规程”,对其技术性能有多项具体规定。 2.2.1 波长准确性可将发射单色器置零级位置,在灯室内安放笔形汞灯,并将漫反射板校正具放入样品室,选择分布均匀的5条谱线作参考波长,记录其最大读数时的波长为测量值,与已知波长值进行比较,或用氙灯的450.1nm谱线检查,其波长准确性应符合技术指标所规定。 2.2.2 灵敏度(信噪比S/N)采用水的拉曼谱线测定,可置激发波长为350nm,激发和发射单色器狭缝为10nm,用二次蒸馏水,调节灵敏度使发射波长为397nm时仪器示值在40%左右,发射波长退回到300nm,调仪器零位,扫描发射波长,记录300~430nm发射光谱曲线,发射光谱397nm 附近的峰值即为S,然后在峰值处记录2min,记录噪声曲线最大的峰—值即为N。 灵敏度应符合其技术指标。 其他技术指标如分辨率、线性误差、稳定度等,可参照JJG537—88检查规程。

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