冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作

冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作

实验目的

1 掌握冷冻切片的方法

2 掌握冷冻切片的用途

实验原理

冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度并通过冰起支撑作用来进行切片的一种方法。

速冻可减小冰晶直径，避免组织细胞损伤。

制冷压缩机佛里昂制冷、半导体温差电制冷

实验材料

新鲜动物肝脏

实验方法

1 准备将仪器打开，样品台温度调至-40 ℃。

2 取材组织必须新鲜，尽可能不经水洗。取材时应避免组织挤压，防止人为假象。样品大小5X5X3mm。

3 速冻将样品放在样品台上，样品四周加水加固，冷冻5－10min.

4 切片升高温度至-15℃（视样品而定），约5min后开始切片，厚度6-15um。

5 制片将切片直接放在载波片上或先放在盛水（固定液）的培养皿中再转移到载波片上。

6 染色观察吸干水，加一滴苏木精，加盖玻片，用显微镜观察。

7 记录将观察的结果绘于实验报告上，整理自己用过的物品。

附：切片温度的设定

脑 -12℃

肝脏 -14℃

肾脏 -16℃

肌肉 -20℃

皮肤 -25℃

多脂肪组织 -30℃

经过固定的组织 -5℃～-10℃

附：快速永久制片

1 固定 70％乙醇5～10min；

2 水洗 2min；

3 苏木精染色 5～10min；

4 脱色 %HCl 至变红；

5 蓝化变蓝；

6 水洗 5～10s ；

7 脱水 70% 2min ；

8 伊红染色 5～10min ；

9 脱水 100%乙醇2minX2；

10 透明二甲苯 3min；

11 封片中性树胶封片。

冷冻切片机的基本操作：

1.在使用前2小时开启电源，并将温度设定在-25℃;

2.将适当大小和厚度的标本放在蘑菇状杯上，加上冷冻蜡，夹在切片机的固定槽内;

3.准备好玻片，选择切片厚度，摇动手柄，即可做成切片;

4.将做成的切片小心的吸附在玻璃片上;

5.使用结束后关闭电源,清洁腔体和擦干水气, 做好使用记录。

6.为让水蒸气蒸发，请不要马上关闭切片机的上盖移门，应到第二天再关。如需详细说明，请借阅说明书。

冰冻切片实验方案和HE染色

2-3人一组，分为7组（上课时需携带实验步骤） 冰冻切片操作方法及步骤： 1取材：(昆明小鼠各个组织或器官) 取材时不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 2包埋： 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。 小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 注意：大组织进行包埋时，只要使组织固定在支承器上即可，切勿浪费包埋剂。 3修平： 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机直承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 注意：修平过程中，正确使用切片机，不要一次性大量切割组织块，以防损毁切片刀。 4切片： 调好切片的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 5调防卷板： 制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 6切片工作完成后，将冷冻机内的所有废物清理干净，切勿乱扔。 冰冻切片时的注意事项： 1 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 2 多例多块组织同时需做冰冻且片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 3 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。 4 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。 5 当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。 6 用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

LeicaCM冰冻切片机使用说明

L e i c a C M1950冰冻切片机使用说明 一、开机 1.利用主机右侧的开关开启电源，用箱体温度设置按钮将切片机温度设置到切片所需温 度，当设置温度时温度显示窗口显示设置温度，设置停止5秒后显示实际温度。只要按下箱体温度设置按钮，即可随时检查设置温度。样品头温度设置按同样方法进行。 若样品头设为最低温度（-50度），则按样品头最低温度设置按钮即可。 二、切片 1.利用切片机的厚度调节按钮调节切片厚度，调整切片角度，安装切片刀。如是一次性 刀片，请利用刀架的左右移动来使用不同的刀口，勿移动刀片 2.将样品放到样品托上，利用包埋剂固定，放到冷台上冷冻，在即将完全冷透前用热交 换装置压平。 3.将冷却透的样品放到样品头上，设置样品头温度，用样品快进按钮将样品移近刀口， 调整要切的平面，利用慢进按钮开始修片，修好后即可放下防卷板切片，如有需要可调节防卷板的上下位置，使切出的样品平整的进入防卷板与刀片的狭缝，取出后染色观察。 三、注意事项 1.切片后为防止别人改变参数，可利用控制面板上的键盘锁定按钮将键盘锁定，即按下 键盘锁定按钮5秒钟左右，时间窗口中间的两个点停止闪烁，表示键盘锁定，此时再按键盘锁定按钮5秒钟即可解除键盘锁定。 2.当停机时，应将玻璃窗打开，再次开机前应先检查切片机内是否有水，如有应吹干后 再开机，并取出隔板检查切片机箱体底部是否有水，如有需拔开底部的塞子，将水排除，吹干后再开机。 3.如常年开机，夜晚可将切片机温度设到零下十度以下，不能高于零下十度。由于切片 机冷却到工作温度大约需两个小时，如关机后第二天有样品，应提前一天开机制冷，以免影响第二天的工作。 4.若要关闭压缩机，按一下锁定开关，再按一下样品头温度设置按钮，则样品头压缩机 关闭，若按箱体温度设置按钮则箱体压缩机关闭，重复以上步骤，压缩机又打开。

冰冻切片实验步骤

全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗？？？ 冰冻切片不能用热修复啊！！！ 以下是我的步骤： 1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。 2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色（DAB）。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。

关于冰冻切片的若干问题

1.做冰冻切片用的固定后样品能在蔗糖溶液放多久？ 问：本人将样品固定过后冲洗过后，放入蔗糖溶液，因有事耽搁，放了一个星期了，不知是否还可切片．还有固定过后冲洗用普通蒸馏水冲洗可以吗？我是做免疫组化 答：1、不知道你放置的蔗糖浓度是多少，如果是30%最好是三天之内，50%的浓度可以方久一点，一两个月应该没什么问题。因为蔗糖是高渗环境，不会影响实验结果。祝好运吧！ 2、我认为组织在20％蔗糖放一周还是可以切片的，至于固定后的冲洗，可以免掉，也可用0.01MPBS涮洗一下，蔗糖液的量要多加一些 2、关于冰冻切片的问题(冰冻切片,免疫荧光,蔗糖,脱水)问：请拟准备做免疫荧光的标本,经前固定灌注后取全脑,后固定4小时后,30%的蔗糖脱水过夜,再用OCT包埋后保存在-80的冰箱,冰冻切片后HE染色,发现整个视野都是大小不等的圆形洞洞,不知道是什么原因. 答:1、个人认为可能是以下几个方面的问题: 30%的蔗糖脱水过夜---- 一般我所采取的是灌注固定后取脑,然后放入30%蔗糖的多聚甲醛溶液中,待脑下沉到底后(大约2天)再切片,用这样的高渗糖既可以防止冰晶又可以继续后固定.单纯的蔗糖过夜应该是不够的.

从30%蔗糖的多聚甲醛溶液中捞出脑后应放入液氮迅速冷冻然后进行切片,不建议用-80度冰箱,曾经用过-80度冰箱结果脑片出现许多冰晶孔.

2、用0.01M的PBS配置的4%多聚甲醛灌注固定后，20%蔗糖（沉底）→30%蔗糖（沉底），然后直接进冰冻切片机急冻15~20min，我们实验室的技术员曾说过，脑标本千万不能用OCT 包埋、液氮冷冻。只要蔗糖脱水彻底，是不会形成冰晶的；而用OCT包埋、液氮冷冻，你没做过，时间不好把握——时间长了，组织会冻裂；时间不够，冷冻效果不好，切片不好切。 3、这个就是实验室和实验室操作方法有所区别了,我说的方法肯定是没有问题的,我们都是这样操作没有出现过冰晶,不用OCT包埋,但确实用液氮,冻10秒,不会冻裂,效果良好. 4、液氮速冻可以防止组织冰晶的形成 冰冻切片心得 1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的 2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做 3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作. 4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤) 5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.

快速石蜡切片在临床病理中的应用总结

快速石蜡切片在临床病理中的应用总结 发表时间：2013-10-29T14:40:51.750Z 来源：《中外健康文摘》2013年第28期供稿作者：杨麦青王雪冬[导读] 快速诊断结果与常规病理诊断结果符合率100%。自我院开展快速病理诊断以来未出现差错情况。 杨麦青王雪冬（山东省昌邑市人民医院病理科 261300) 【中图分类号】R197.3【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）28-0403-01 1.资料和对象 我院自开展快速石蜡切片至今5000余例临床病例。 2.讨论 快速病理诊断在临床手术中应用的越来越广泛。随着临床手术新技术项目的开展，临床手术科室在很多手术中期待着以快速病理诊断对病变进行定性，决定手术方式，快速病理诊断在这些过程中起着至关重要的作用。近几年来快速病理诊断的病例逐年增多，并且在基层医院也日益普及，目前在综合性医院中冰冻切片是最常用的快速诊断技术，但是一些基层医院尚不具备冰冻切片的条件，并且冰冻切片机价格比较贵，冰冻切片的组织结构和细胞形态与石蜡切片相比较清晰度差，对于基层医院而言，由于送检的病例标本比较局限、片面,冰冻切片的诊断较石蜡切片要困难得多，使冰冻切片技术的应用受到一定限制。所以快速石蜡切片制做无疑是弥补这一缺欠的最好方法。我院应用超声波快速组织处理仪，将改进的快速石蜡切片技术应用于临床，从接收标本至发出病理诊断结果时间控制在30分钟之内，取得了良好的成效。回顾5000余例快速石蜡病例，我们成功地为临床手术科室提供便利，取得了较为满意的效果，并总结了相关经验，现总结报告如下。 （一）快速石蜡详细过程 （1）快速石蜡预约由临床大夫提前一天以书面形式告知病理科，使病理科大夫对手术情况及患者病情有所了解，并通知家属签署快速石蜡知情同意书，根据临床大夫预约手术时间提前将机器开启预热。 （2）术中由家属迅速将切除的标本送至病理科。 （3）由病理诊断医师核对标本并取材，取材要求：为了易于脱水浸蜡,取材组织块必须规整且不能太大,大小1.5cm×1.0cm,厚度<2mm,一般切取组织2块。将所取组织块放入预热好(水温设定为75℃)的超声波快速组织处理仪中将组织按照既定程序逐步处理,第一步:20%甲醛固定液固定7分钟，在振荡过程中将组织取出整修，削得更薄些。第二步:将已经固定的组织取出放在滤纸上吸一下，放入丙酮中脱水5分钟。第三步:将已经脱水的组织取出。直接放入石蜡溶液中浸蜡5分钟。将已经浸蜡的组织包埋在事先准备好的蜡块中，放入冰箱冷却后进行切片。快速HE染色，此过程需5分钟左右,然后阅片,将诊断意见以书面形式通知手术医生。剩余标本行常规病理检查并与快速诊断结果相对比。 （二）对比总结 （1）与快速冰冻切片相对比，从时间而言：快速石蜡切片出具结果时间要比快速冰冻推迟10分钟，但相对于基层医院而言，该设备价格便宜，且取材标本比较局限，能够满足临床需要。 （2）快速诊断结果与常规病理诊断结果相比，除去特殊标本如：标本比较大、脂肪比较多等不易制片结果待常规情况。快速诊断结果与常规病理诊断结果符合率100%。自我院开展快速病理诊断以来未出现差错情况。 3.总结 综上所述，快速石蜡切片与冰冻切片相比较，对于基层医院而言，基本能够满足临床需要，在病理科向更深远的层面发展前，积累了丰富的诊断经验，对于病理科的发展和临床手术科室的发展都起到了至关重要的作用。使病理科诊断医师能够掌握更多的病历资料，为适应以后更多快速病理的诊断积累经验。为将来娴熟的开展快速冰冻切片奠定基础。

免疫组化方法(冰冻切片)

免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。

以前做冰冻切片

冰冻切片与漂片免疫组化 以前做冰冻切片,总是遇到问题,后来查文献,自己又做实验比较,总算找到了又快又好地办法, 拿出来和大家分享一下. 1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的 2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做 3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作. 4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤) 5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等. 蔗糖俺用25%/PBS 的，不用换液，只要过夜12个小时就能沉下去了。包埋的时候不用冲洗，但是要注意一定要用吸水纸擦干蔗糖溶液，否则切片有麻烦 我做切片的时候，先用20％蔗糖（PB配）沉底，再用30％蔗糖沉底，这样脱水比较充分。一般是等切片机温度达到-22度之后，再将包埋好的脑组织放入。脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。一直这样做了很久，效果都还不错。 取脑后，直接投到液氮？？我试过，由于脑组织水分多，下液氮后直接就碎了～～ 防止脑袋冻碎办法： 先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯中放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。 脑片切好后保存方法： 1、先用手指在玻片（已挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。 2、37度干燥箱中烘干。 3、放入切片盒中，盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。于-20度可保存半年以上，于-80度可保存一年以上。 切忌经常打开盒子。

微小组织快速冰冻切片法

微小组织快速冰冻切片法 自1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法以来,国内外病理同仁在这方面做了大量工作,随着技术的不断完善,冰冻切片已成为病理科的常规工作,这为术中诊断提供了条件。随着人们生活水平的不断提高和医学科学技术的不断发展,人们对健康越来越重视,临床医生和患者常常要求对直径小于0.3 cm的微小组织作出快速诊断,由于组织小,有时难以制片和诊断,影响了此项工作的全面开展。为解决这一问题,在实际工作中,我们不断摸索、改进、完善,总结出了一种较实用的微小组织快速冰冻切片法,现介绍如下。 1材料与方法 1.1材料①微小组织包括纤维胃镜活检标本,肾穿刺标本,脱落细胞沉淀后剩余物等,均为我院门诊及住院部送检。②原西德产Leitz 1720型低温恒冷冰冻切片机。③组织包埋托的改进:找一直径为0.8～1 cm,高约1 cm的圆柱形铜质材料,一端可上螺丝,在机器所配的组织包埋托中央打一小孔,将铜质的圆柱体用螺丝与组织包埋托固定,铜质圆柱体周围缠以3～4圈医用胶布,周围略高于铜质圆柱体。④包埋剂:取适量甲基纤维素,然后加入适量蒸馏水调成糊状,煮沸,放凉,再加入适量麝香草酚,分装于空的超声耦合剂瓶内,贮存于4℃冰箱待用。 1.2方法①开机预冷:提前开机,将低温恒冷切片机冷台及切片刀冷至-22℃左右。②滴加包埋剂:在改进后的组织包埋托上滴加包埋剂,待冷冻好后修平,将微小组织平放于修好的平面上,冷冻片刻,修切,若是长条组织,如肾穿刺标本,组织与组织包埋托旋钮呈60°角,若是多块组织则应放置于同一平面,且不互相重叠。③切片:用手术刀片切去组织周围多余的包埋剂。使之成为长方形或正方形,然后开始切片,切片厚度3～5 μm。④固定:95%乙醇或乙醚酒精混合液(乙醚,95%乙醇等量混合)固定5～10 s。⑤染色:苏木素1～2 min,0.5%盐酸酒精分化1 s,0.25%氨水返蓝,伊红染1 min,95%乙醇3 s,无水乙醇3 s,在烘片机上烤干,封片。 2结果 组织切片完整,可连续切片,HE染色组织结构清晰,色彩鲜艳,细胞核、细胞质对比明显。 3讨论 快速低温恒冷冰冻切片是手术中病理诊断的方法之一,具有较广泛的应用,在很大程度上决定了手术的方式和治疗方案的确定,因此质量较好的冰冻切片,对病理医生和临床医生都至关重要。对于大块组织的冰冻切片基本不成问题,既可用一块组织多切,又可再次取材,然而,对于直径小于0.3 cm的微小组织来说,材料显得尤为珍贵,要作出正确的诊断,就必须要有一张高质量的冰冻切片。笔者将原组织包埋托进行改进,使切片刀与组织包埋托的接触面缩小,这样便于观察组织,又不至于损伤刀口,修切时防止将组织切完,有利于切片。

冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么 1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的 抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。 2、从研究目的来看。石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形 态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。 3、从抗原的保真性来看。冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程 中可能会对抗原的性质造成影响。 4、从操作步骤的繁琐程度看。染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。 5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立 即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 编辑本段冰冻切片的应用

冰冻切片步骤 很全面

冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。 1.取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。 2.速冻： 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。 液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。 3．固定： 样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min 让OCT胶浸透组织。取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及

大鼠肾脏冰冻切片的体会

大鼠肾脏冰冻切片的体会 发表时间：2016-03-01T14:17:27.000Z 来源：《中国综合临床》2015年9月供稿作者：张丽娥[导读] 福建省南平市第二医院病理科福建建阳３５４２００冰冻切片不仅要求病理技师在短时间内制出高质量的切片,还需要病理技师具有娴熟的技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用. 张丽娥 福建省南平市第二医院病理科福建建阳３５４２００ 【中图分类号】R５８７．２【文献标识码】B 【文章编号】１００１－５３０２(２０１５)０９－０８５７－０１ ０．引言由于肾脏组织质地柔软,含水量高,或在取材过程中肾组织与水分接触, 突遇低温,易形成冰晶,快速冷冻切片的制作难度大,我们通过对大鼠肾脏的冰冻制片,总结经验如下. １材料使用德国产Leica—CM１９５０型冰冻切片机,Leica一次性刀片,冷冻组织包埋剂(O．C．T．),AF固定液,改良Gill苏木素染色液,２％碳酸氢钠返蓝液,逐级梯度酒精,中性树胶. ２方法２．１取材及包埋２．１．１取新鲜大鼠肾脏标本常规取材,标本要新鲜,无需固定,严禁浸入甲醛, 酒精,生理盐水等液,尤其是不可以用酒精固定,酒精固定后组织将无法冷冻.２．１．２将样本托放入冰冻切片机的冻台上预冷,加少许O．C．T．,在OCT 未完全冻结前快速的将组织放于样本托上,在组织周围适量的补充O．C．T,待包埋剂约１/３未冻结时压上冷冻锤,打开加强冷冻,使组织快速冷冻.２．１． ３冰冻切片机温度设定在－１６oC—－１８oC为宜.冷冻时间一般为１min~２min.冷冻时间过长,组织易变硬变脆,细胞结构会发生改变,难于切片.２．１．４包埋组织时应将组织周边多留出O．C．T．用于牵引展开切片,O．C．T．中的小气泡应尽量去除,以免切片时挤压旁边组织产生皱褶,影响切片效果. ２．２切片组织切片厚度设定为５um－６um.刀具提前安放好,调整好刀具角度,切片时控制好操作窗,以利保温.肾脏组织细胞比较致密,若时间过长会变脆且易碎,在冰冻切片时可用手指轻压组织回温,再进行切片. ２．３固定切片后立即放入AF固定液固定３０s—１min,不可待切片干后再固定,这样会造成细胞核染色质不清晰,呈现毛玻璃样改变,细胞胞浆边界不清等组织细胞的退变现象. ２．４染色封片固定好的冰冻切片在苏木素染液中染色３０s—５０s,经１％盐酸分化,２％碳酸氢钠水溶液返蓝,伊红染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片. 制好的切片核浆对比分明,红蓝适度,颜色鲜艳,达到理想染色效果. ３讨论与分析:３．１冰晶是由于冷冻缓慢,冷冻时间过长,胞质内与组织间隙未结合的水分析出形成的.肾脏因其组织结构,在组织冷冻过程中,组织内易产生大量的冰晶影响冰冻切片的诊断,为了防止组织内冰晶的产生,最佳的办法一是使用冻锤:新鲜标本包埋后放入冷冻台时,不能将冻锤马上按压在组织上,那样会使组织受挤压变形.应该待O．C．T．凝固６０％~７０％时,再将冻锤轻压在组织上, 这样既能防止冰晶的产生,又能得到较平整的切面;另一种方法为使用液氮冷冻,可将组织放入液氮中２s－３s,待组织冻至８０％时即可取出制片,否则过冻会引起组织发脆,冻头与组织分离[２]. ３．２将包埋剂放入－１０OC或－４OC冰箱内保存,包埋剂要使用OCT,而不能用胶水等替代,因OCT 的主要成分为PVP,其能通过渗透的作用将细胞内的水分移出,减少冰晶形成. ３．３冰冻的速度与样品的表面积和体积成正比,取材时组织块尽可能薄,０．２cm 为宜,扁平状冷冻速度快,切片的前几张冰晶少,越后冰晶越多,切片不能求快,而要确保切片质量,力争一次完成一张高质量的切片[１]. ３．４可预先做好OCT冻头,将冻头上的OCT 修平,有利于将组织放平,再在冰冻机内在肾组织上滴加OCT,有利于OCT迅速降温,避免组织复温,减少冰晶形成. ３．５肾脏冰冻制片时易产生不规则裂痕,与切片时温度和切片速度有关,操作时应注意操作窗不要开太大,免工作箱的温度升高;OCT的用量太少易产本皱褶,滴加OCT时要上下俩端多,俩侧少,同时要注意OCT不要有小气泡. ３．６冰冻切片机应安放在冷室内,避免压缩机反复工作,仪器要定期维护,除霜,清洁消毒. 总之,冰冻切片技术是病理科最重要的常规工作之一,也是较难掌握的病理实验技术.要做好一张冰冻切片需要病理技术人员具有严格的责任心、严谨的工作态度、丰富的工作实践经验[３]在日常的工作中还需不断摸索经验提高切片质量,冰冻切片不仅要求病理技师在短时间内制出高质量的切片,还需要病理技师具有娴熟的技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用. 参考文献[１] 陈乐真,徐庆中,陈国璋手术中病理诊断图鉴１版北京:科学技术文献出版社,２００５:２(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[２] 范慧,陈立华,刘宇冷冻切片的制作体会及常见问题分析．诊断病理学杂志,２００８,１３８(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[３] 吴艳霞．冰冻切片的制作方法分析．吉林医学,２００９,３０(６):４９３．

冰冻切片快速病理诊断30年总结

冰冻切片快速病理诊断30年总结 秦皇岛市肿瘤医院病理科康文喜谢芳芳王小聪李英邮编：066001 术中冰冻切片快速病理诊断是1818年由Pieter de Riemer首先创造发明的，1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法。目前国内外已将此项技术普遍应用于临床，解决手术中的病理诊断问题。并日益受到外科医生和患者的欢迎和肯定。随着冰冻切片技术和临床外科手术的发展，要求做冰冻的病例逐年增多，截止到2012年10月份，本院病理科开展快速冰冻病理诊断30余年，共完成冰冻快速病理诊断1476例，积累了一定的经验和教训，为了更进一步提高冰冻快速病理诊断水平，提高冰冻诊断准确率，降低误诊率，作者将30年来所有冰冻切片快速病理诊断病例进行总结分析如下。 1 材料和方法 1.1 一般资料本组1476例大部分来自本院住院病人，小部分来自其他医院。其中男897例，女579例，年龄最大81岁，最小5个月。 1.2 病变部位乳腺1052例，软组织42例，胃33例，淋巴结33例，骨12例，腹膜9例，睾丸及附睾8例，甲状腺47例，小肠15例，大肠25例，膀胱5例，脊椎5例，阑尾10例，胆道14例，阴茎19例，卵巢53例，脑及脑膜3例，前列腺3例，肝12例，肾26例，脊髓2例，喉2例，子宫42例，精索1例，纵隔1例，腹膜后1例，眼1例。 1.3 方法本组1476例均采用德国进口莱卡冰冻切片机切片，HE染色，普通光学显微镜观察。 1.4 结果1476例中，恶性肿瘤687例，良性肿瘤388例，瘤样病变170例，炎症202例，结核29例，确诊1457例，未能确诊15例，误

诊4例。 2. 讨论 冰冻切片质量差，最初很多著名的病理学家如Ewing、Brewer、Simpson等曾经怀疑冰冻切片的准确性，1960年Cryostat冰冻切片机正式应用于临床后，冰冻切片质量有了很大提高，但和石蜡切片相比仍很逊色，对准确的冰冻病理诊断带来一定困难，尤其对年轻的病理科医生来说难度较大，缺乏经验的病理科医生难以胜任此项工作，下面根据自己个人的经验发表一点看法。 2.1 冰冻切片快速病理诊断的优缺点：冰冻切片快速病理诊断的优点是在手术过程中随时取材，迅速做出准确可靠的病理诊断，同时也减少了病人二次手术的痛苦。缺点是切片厚，细胞大，层次多，易造成错觉。另外冰冻切片诊断要求报告快，没有更多思考讨论余地，一旦报错，将造成严重的无法弥补的后果。 2.2 准确率：本文对1476例冰冻切片进行了统计分析，结果准确率为98.7%，未能确诊率为1.02%，误诊率为0.3%，与国内报道相比准确率相仿，而误诊率低于各家报道。 2.3 未能确诊和误诊的原因：⑴取材不当：恰当准确的取材是正确诊断的必备条件，取材不当就不可能得出正确的病理诊断。当临床切取肿物困难时，所送检的肿物标本不一定是肿物中心组织，很可能是肿物边缘组织，这种组织大部分是肿物周围的正常成分，或仅带有少量肿物，此时应多切几个切面进行观察，在把握不足的情况下可多取几块组织做切片，以防漏诊。⑵切片质量不佳：切片过厚，组织未能展平出现折叠，组织缺损，染色深浅不均等都直接影响诊断结果。

冰冻切片免疫荧光染色流程

冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5） PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma 公司)，37℃孵育1小时； （7） PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光 附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）： （1）pH7.4 0.01MPBS： 配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS 配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g 定容至2000ml, 高压， pH7.2-7.4 （2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存

CM1950冷冻切片机使用说明

Leica CM1950 冷冻切片机操作规程一. 控制键盘说明

二. 调节部件 1.切片厚度调节旋钮 2.调节切片平面的旋钮，松开后可调节切片平面切片时要拧紧 3.夹紧样品托的旋钮 4.调节切削刀口的压杆，松开后，刀架可左右移动，选择切片刀口 5.调节切片角度的压杆，松开后可调节切片角度，右侧有角度指示 6.刀座夹紧压杆，松开后刀座可前后移动 7.防卷板上下移动旋钮，移动时防卷板要离开刀刃 8.装卸刀片压杆 三操作说明 (一)开机 1.利用主机右侧的开关开启电源，用箱体温度设置按钮将切片机温度设置到切片 所需温度，当设置温度时温度显示窗口显示设置温度，设置停止5秒后显示实际温度。只要按下箱体温度设置按钮，即可随时检查设置温度。样品头温度设置按同样方法进行。若样品头设为最低温度（-50度），则按样品头最低温度设置按钮即可。

2.第一次开机时利用基准时间设置按钮设置一个基准时间，一般为北京时间，利 用除霜时间设置按钮设置一除霜时间，一般为晚上12时左右，如果在该时间切片，应将时间推迟，当设置除霜时，时间显示窗口显示除霜时间，5秒后显示基准时间。手动除霜时先按下手动除霜按钮，听到峰鸣音后，按箱体温度设置按钮，则箱体手动除霜；如按箱体温度设置按钮，箱体手动除霜，按此顺序再按一次可关闭手动除霜，如按样品头温度设置按钮，则样品头除霜，按此顺序在按一次关闭。 (二)切片 1.利用切片机的厚度调节按钮调节切片厚度，调整切片角度，安装切片刀。如是 一次性刀片，请利用刀架的左右移动来使用不同的刀口，勿移动刀片 2.将样品放到样品托上，利用包埋剂固定，放到冷台上冷冻，在即将完全冷透前 用热交换装置压平。 3.将冷却透的样品放到样品头上，设置样品头温度，用样品快进按钮将样品移近 刀口，调整要切的平面，利用慢进按钮开始修片，修好后即可放下防卷板切片，如有需要可调节防卷板的上下位置，使切出的样品平整的进入防卷板与刀片的狭缝，取出后染色观察。 (三)注意事项 1.切片后为防止别人改变参数，可利用控制面板上的键盘锁定按钮将键盘锁定， 即按下键盘锁定按钮5秒钟左右，时间窗口中间的两个点停止闪烁，表示键盘锁定，此时再按键盘锁定按钮5秒钟即可解除键盘锁定。 2.当停机时，应将玻璃窗打开，再次开机前应先检查切片机内是否有水，如有应 吹干后再开机，并取出隔板检查切片机箱体底部是否有水，如有需拔开底部的塞子，将水排除，吹干后再开机。 3.如常年开机，夜晚可将切片机温度设到零下十度以下，不能高于零下十度。由 于切片机冷却到工作温度大约需两个小时，如关机后第二天有样品，应提前一天开机制冷，以免影响第二天的工作。

冰冻切片免疫荧光取材

2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。 2.1.5.1 标本制备 1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只， 麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)， 先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上）， 将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳； 2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。 3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水； 脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋； 4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用； 5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。 6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。 7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。 2.1.5.2 免疫荧光染色步骤 1) 取出冰冻切片，室温放置30min，PBS 洗10min×3 次； 2) 0.4%Triton-100 浸泡10min（1000ml PBS+4ml Triton-100）； 3) PBS 洗10min×3 次； 4) 抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）； 5) PBS 洗10min×3 次；用组化笔在距离组织2mm 处划圈； 6) 5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h； 7) 一抗：甩去多余血清，不洗。滴加PBS配置的一抗，4℃过夜。阴性对照用PBS替代一抗； 8) PBS 洗10min×3 次； 9) 二抗：滴加Alexa Fluor488 标记的驴抗羊荧光二抗（均为1：200配置），20~25℃室温避光孵育2h； 10) PBS 洗10min×3 次； 11) Hochest33342 复染核10~20min； 12) PBS 洗10min×3 次； 13)抗荧光衰减封片剂封片，置于避光盒内； 14) Olympus F1000 激光共聚焦显微镜用488nm 波长的激光器激发绿色，计算机进行数据采集和成像。

CM1950冷冻切片机性能指标

徕卡CM1950冰冻切片机性能指标 1. 自动和手动除霜功能 *2. 全封闭设计，冷冻箱和样本头各自独立的除霜设置 *3. 双压缩机制冷，两个独立的制冷系统 *4. 单独一个压缩机供给样本头制冷，保持切片过程中样本温度，样本头温度-10 到-50 ° C 任意设定，以1K 递进，速冻台可放15 个样品 5. 加热的滑窗可移动 *6. UV紫外灯杀菌 *7. 机器表面银离子，抑菌 8.温度实时指示 9.记忆功能 10.切片范围:1-60um,连续设定 11.最大样本:直径55mm 12.水平进样:25mm 13.垂直幅度:59mm 14.电动粗进, 0.8mm/sec，可进行修块 *15. 8度精确样本定位 *16. 专业冷冻消毒剂，无毒副作用，可在低温下有效杀毒 *17.最优化的空气循环系统，专利的技术CryoZoneTM ； *18.全新的CE 刀架可兼容宽刀片和窄刀片，集成的红色安全护手，带取刀辅助装置； *19 .根据不同器官组织的推荐温度表，可以在用户手册中找到。 20.手轮安全锁定； *21.温度实时指示，高效明了容易看懂的LED 示意显示和操作，无需用多级菜单进行显示； *22 选配真空负压辅助切片，防止切片打卷，并吸走废屑

CM1950是最新一代的临床冰冻切片机，和以往的冰冻切片机相比，在用户安全性、切片质量和工作流程优化几方面CM1950都有超乎寻常的出色表现。专利技术的箱体低温紫外线消毒技术可以杀灭或抑制绝大多数病原体，例如SARS，HIV，乙肝等多种病毒。且消毒的操作仅一键控制，可以随时开启或关闭。箱体探测器可以侦测滑窗状态，如果箱体未处于密闭状态，紫外灯可自动熄灭防止危害到人员。机器的面板和扶手上均带有专利的银离子涂层，有效抑菌，进一步保护操作者的安全。 主要功能 ?对患者的好处： ?样品可以迅速冷却到最适宜的温度，缩短切片时间。 ?优化的制冷效果，不仅提升切片速度更提高了切片的质量。 ?切片废屑处理系统可以同步除去切片碎屑，防止切片的污染。 详细介绍 Leica的双压缩技术在CM1950上得以传承，样品头和箱体温度的独立控制可以更好适应不同组织所需的理想切片温度，改良的样品头制冷系统可以让样品的温度下降更迅速。且改良的制冷技术确保冰冻切片机的工作区温度恒定。专利的负压展片功能，可以帮助操作人员得到高质量的切片。增大负压力度可以在每次工作结束后轻松吸走箱体内的废屑。改良的样品托设计可提高样品的制冷效果，并增强样品和样品头之间的贴附能力。在秉承徕卡切片机一贯出色表现的基础上，全新设计的刀架使切片效果更好，操作更符合人机工程学。电动切片功能不仅节省人力也保持切片质量的恒定。CM1950独有的最优化的空气循环系统CryoZoneTM，冷空气从蒸发器上直接向下吹到刀片架/刀架上。刀片架和防卷板得到“间接”制冷，且冷空气吹拂过样品的表面。这种目前独一无二的制冷技术可以确保切片的最佳质量。切片机箱体宽敞，内部部件的分配更合理。控制面板避免使用复杂的文字菜单而保持了徕卡传统的图形标识，按键位置更合理，使用者可以在最快时间熟悉并掌握机器的使用，更大程度上提高整个切片的效率，便于工作流程的合理分布。

冰冻切片

有关细胞和组织学技术 一、细胞和组织 免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十 （一）细胞标本的取材 目前，免疫组化技术已经应用于细胞学诊断，如鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。近年来，培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程度、研究均起到了积极作用。 细胞标本的取材有以下3种方法: 1．印片法主要应用于活组织检查标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，玻片上，立即浸入细胞固定液内5-10min，取出后自然干燥，低温保存备用。 优点是简便省时，细胞抗原保存较好。缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞重叠，影响标记效果。 2．穿刺吸取涂片法主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。用细针穿刺吸抹在载玻片上，力求细胞分布均匀。如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法：将穿刺液滴入盛有1-2ml Hanks液（低速离心5-10min后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（浓度约2×106细胞/ml），吸取1滴于载玻片上，轻轻涂 该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。洗涂法片虽可弥补 3．体液沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。体液采取后，必须量的多少选用不同的处理方法：①细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上。②细胞数量较少者，可将液体自离心10min，弃上清液，将沉淀涂片，略干后固定备用。 如用细胞离心涂片器(Cytospin )，可将标本用上述离心沉淀法制成2×106细胞/ml的细胞悬液，吸取50μl加入细胞分布在直径约6mm的小圆圈内，每个圆圈内的细胞数约105个(Danos,1976)。 培养细胞标本的取材可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些细胞有贴壁生长的特性，如纤维母细入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片法处理。 制备细胞涂片应注意：①标本反复离心洗涤，细胞的粘附性降低，在免疫组化染色过程中容易脱片，因此，试剂和便于镜下观察和记数，应将细胞集中到直径0.6-1.0cm的圆圈内，细胞总数以105个为宜。③粘液丰富的标宜作免疫组化标记。 （二）组织标本的取材 组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜