凹印常见问题分析与解决
第二节凹印常见问题分析及解决
一、凹印问题的成因
二、凹印常见问题
（一）、堵版
在凹版印刷中，油墨从印版滚筒网穴中的转移率通常在50%-70%，大约还有1/2-1/3左右的油墨总是残留在印版滚筒网穴中。该残留率如果保持一定尚可，但在印刷过程中由于种种原因，网穴中的油墨残留率逐步提高，油墨的转移率也就随之下降，造成堵版故障。
发生堵版以后，会引起印刷图案和文字的模糊不清、印刷颜色的变化，严重时基至无法继续进行印刷。特别是浅网层次部位容易发生堵版。
1、赌版产生原因：
（1）、油墨干固于版面
印版滚筒网穴中油墨的转移率通常是由油墨的类型、粘度、印刷速度等因素决定的，总有1/2-1/3的油墨残留在网穴中。当这些残余油墨在某些因素影响下发生干固(粘度增高)后，印版滚筒再次进入油墨槽时其也难以完全溶解，油墨转移率随之降低。久而久之，网穴越来越浅，转移率越来越低，最后形成堵版。此类堵版故障当然与油墨类型、溶剂配比、干燥速度等因素有关，而且印刷机的构造也有很大影响。
（2）、油墨中混入杂质
在印刷时，印刷薄膜由于高速运行往往会产生静电，吸附周围的尘埃及基材碎屑等杂质并带人油墨中。
（3）、制版质量低下
在腐蚀或雕刻过程中网穴壁生成小毛刺，镀铬后表面不平滑; 研磨时产生的毛刺以及Ω型网穴等，对油墨的转移率也有一定的影响，情况严重时也往往造成转移率低下而成为堵版的原因。
（4）、油墨溶解不良（劣化）
油墨变质或溶剂平衡发生变化时引起溶解力下降，或者混入不同类型的油墨、误用溶剂等导致油墨溶解劣化，造成转移率低下，同时也会直接造成堵版。
（5）、化学变化
两液型油墨或反应型油墨随着印刷的进行会逐步发生交联等化学反应，流动性变差，粘度增高，转移率随之降低，也可能成为堵版的原因之一。
2、解决方法：
（1）、塑料凹印生产过程中发生堵版故障时，应使用溶剂或专用的清洗剂进行清洗，并针对发生堵版的原因加以解决。
（2）、调整适当的环境温湿度、选择与印刷速度、印刷环境相适应的溶剂配比。
（3）、刮刀与压印辊之间的距离尽可能缩短，防止干燥箱漏出的热风直吹版面。
（4）、混合使用慢干溶剂，适当提高印刷速度，降低工作墨粘度。
（5）、如果是由油果性能缺陷引起的堵版，应及时更换油墨（或与油墨供应商联系解决），尽量避免比重有显著差异的油墨组合。
（6）、油墨槽中的油墨要经常搅拌，使油墨保持良好的流动状态，及时加入新的油墨或更换新油墨，减少皮膜化现象的发生。
（7）、由网穴壁质量引起的堵版，应重新镀版或制版。
（8）、开车前或刚开车时用溶剂镇拭印版滚筒。印刷过程中尽量避免中途停车，长时间停车时一定要先把印版滚筒洗干净，或者把印版滚筒浸人油墨中连续空转。
（9）、在新鲜油墨中，由于温度差等原因，油墨中的添加剂、蜡类物质发生结晶析出时，可试着在使用前对油墨加温（温度控制在40-50度），使之溶解。
（10）、误用溶剂或油墨变质，混入异种油墨时，会显著影响油墨的再溶解性。所以应使用正规的专用稀释溶剂，更换油墨要在充分洗净墨槽和循环泵后进行。
（二）、反面粘连
粘连指印刷收卷后，印品互相粘在一起，印迹粘背。
1、产生原因
导致粘作的原因比较复杂，涉及到油墨、溶剂、承印物、工艺条件等多方面,在印刷、复合、分切，过程中都有可能发生。主要是由油墨发粘、温度太高、残留溶剂太多以及压力过大等因素引起的。
（1）、油墨中的树脂
①树脂软化点。连结料树脂的软化点离低直接影响着印刷墨层的性能。连结料树脂的软化点过低，会使印刷墨层在高温环境下呈微熔状态。从而使印刷产品收份后发生粘连，提离连结料树脂的软化点。显然有利于防止粘连，但软化点过高，印刷墨层的挠去性会变差，容易脆裂。
②连结料树脂对溶剂的释放性。为了适应印侧的要或考虑到经济性。印刷时在油墨中常常要加人混合溶剂。每一种连结料都有自己的真溶剂、次溶剂、非溶剂，溶解性越好，就表示连结料树脂与溶剂分子之间的亲和力越大；而溶剂对树脂的溶解性越好，树脂对溶剂的释放性，也就越差，释放性差，残留溶剂多。所以，在配制混合溶剂时，溶剂应该控制在一定的圈，既要考虑到油墨的印刷适性要求。同时还要考虑到溶剂的综合释放性。常用油墨连接料树脂所匹配的溶剂的情况见表。
对于同一种类型的连结料树脂来说。树脂的软化点越低，也就愈味着树脂越容易溶解，树脂的脱溶剂性就会越差。从这一方面考虑，也应该相应地提高连结料树脂的软化点。
③研磨时间与研磨温度。在加工油墨时，如果研磨时间过长，研磨产生的温度就会过高，导致连结树脂部分变性，也会给粘连带来一定的影响。
（2）、印剧墨层的附粉牢度差。
（3）、印剧速度过快，通风不好。
（4）、收卷压力过大。
2、解决方法：
（1）、控制慢干溶剂的使用和残留溶剂等。
（2）、尽量提高干燥箱的性能，以便能供给充分的热量和风量。
（3）、使冷却辊平滑转动，重卷时，注意纸管和辊的滑动所引起的温度异常上升。
（4）、印刷时或重卷检验时，对于PET等很薄的薄膜要特别注意。在运输和搬运过程中，要使印刷完收好卷的薄膜保持直立，不要放倒，否则会造成膜卷的局部压力过大而导致粘连。
（5）、对于多色印剐夹说.在进行图案设计时就应考虑不能叠色太多，可能的话，可以使用专色里印刷，以防止局部墨层过厚。在塑料薄膜上的印刷图案偏向一侧的情况下。收卷起来的薄膜上有印刷图案的一侧所受到的压力肯定比较大，非常容易造成粘连。因
此，对于这种印刷品尤其注意不要卷得太紧。
（6）、采取相应的措施提高墨层的附着牢度。
（7）、在塑料薄膜凹印中，含有金属粉的油墨，其墨层凝聚力较弱，附着性差，在很小的压力下就很容易引起枯连。必须充分注意。
（8）、玻璃纸、尼龙或两面都经过电晕处理的薄膜收卷后其背面与墨层相接触时亲和性很强，发生枯连的危险性大，所以，在印刷之前就应该采取适当的对策，当只进行单面印刷时，应调整电晕处理装置，只进行单面处理。
（9）、减慢印刷速度。
（10）、提高干操箱的温度时，印刷后的薄膜必须通过冷却辊充分冷却后再收卷。对于聚烯烃类薄膜一类容易拉伸的薄膜，尤其注意不要卷得太紧。印刷品要在阴凉处保管，在贮存过程中要保持通风干燥，保存时间也不宜过长。并应避免在日光直接照射下或在热源附近贮存收卷的印刷品。库房在气候炎热时应采取通风降温措施。
（三）、印品刀线(印刷带道)
印品刀线（印刷带道）是指版面上非图文部分的油墨未被刮干净，转移到承印物上，产生线条状污染。
1、产生原因：
刀线是凹印过程中经常遇到的问题。其产生的原因比较复杂，有环境因素，有工艺因素，有刮刀使用和刀片质量的因素，有印版滚筒质量因素。所以，正确分析刀线产生的原因,才能找出解决问题的正确方法。
（1）、明显的连续宽刀线
明显的连续宽刀线一般是印版滚筒受到外力的作用，铬层表面被破坏或报伤。翘起的铬层碰伤刮刀，并随刮刀的摆动形成与刮刀摆动围宽度一致的宽刀线。此类刀线对印版滚筒的危害极大，如未及时发现并采取措施，将可能使印版滚筒报废。印版滚筒铬层损伤的原因主要是搅墨棒磁铁吸附的砂粒、金属硬物以及油墨中的异物等造成的。另外，薄膜塑化不良的晶状物也是造成印版滚筒损伤的因素之一。
（2）、明显或不明显的细刀线
细刀线一般在印刷过程中不易被发现，但对产品质量影响很大产生细刀线的主要原因有以下儿点。
①印版滚筒网穴雕很深，而铜层较软，造成部分网墙处有毛刺，电镀后虽经抛光，但对刮刀仍有碰伤，造成印刷时不断出现小细道。
②印刷环境较脏，灰尘等异物对油墨污染严重，导致油墨中杂质太多，出现细刀线。
③印版滚筒网穴雕刻太深，油墨粘度过高，刮刀不易刮干净。
④油墨本身质量不好，主要是油墨颗粒较粗。
（3）、较粗的颗粒道
较粗的颗粒道是因为油墨中混入的一些杂质在油墨槽中形成絮状物，粘在刮刀刃部，将刮刀刀刃项起造成刀线。另外，碎膜、纸屑也可能造成此种墨道。
（4）、流星状间断墨道
流星状间断墨道由于是间断出现的，不易被发现，所以危害性很大，特别是在生产卷材产品时，往往是发现时已构成批量损失。造成流星状间断墨道的主要原因，是油墨本身活性太强，随着刮刀和印版滚筒不断摩擦，磨损后的铬离子和油里中的活性粒子不断形成絮状颗粒，粘在印版滚简上产生墨道。此种墨道中间是空心的且较粗，两端较细，常出现在印版滚筒作图文部位.而且主要集中在蓝色相油墨上。随着印量的增加。墨道出现频率加快。二是印版滚筒磨报比较严重，易产生墨道。三是刮刀角度过小，压力过大时易产生墨道。
（5）、图文部位的缺墨道
图文部位的缺墨道主要是油里中的杂质、纸展，干墨皮等柔性物央在了刮刀和印版滚筒之间，使本应充满油墨的网穴没有存上油墨。
（6）、刮刀丝、刀丝
印刷刮刀丝主要是因为印版滚筒表面粗糙，或雕刻制版时因铜层软，电雕产生毛刺造成的。其现象多为刚换新刀片时，刮刀刮墨效果很均匀，印刷完500-600米后图文部分便出现刀丝，而非图文部分不出现刀丝，加大刮刀压力后情况稍有好转，但持续一段时间后又会出现。
刀丝产生的主要原因是工艺的因，主要集中在深浅渐变的层次部位或实地与浅网共存的印版滚筒。由于实地和浅网部分对油墨粘度和溶剂配比的要求不一样，在确保实地均匀的情况下，对于浅网部分而言，油墨的粘度显然偏高，造成刮刀对浅网或渐变部位的不适应。形成了一组组的刀丝。另外，油墨本身质量不好也是造成刀丝的主要原因。
2、解决方法：
（1）、明显的宽刀线的解决方法
①将印版滚筒冲洗干净，并抛光。
②研磨或更换刮刀片。
③将搅墨榜磁铁部位吸附的金属砂粒清除干净。
④检查基材有无塑化不良的晶状物，若有应更换基材。
⑤用120目金属网过滤油墨。
（2）、明显或不明显的细刀线的解决方法
①和制版厂联系，重新制版，注意印版滚筒网穴不要雕得过深。
②改善印剧工作环境，增加湿度。每天用120目金属网过滤油墨。
③正常生产时，油墨粘度不能过高，实地版印刷时油墨粘度尽量控制在22秒(3"察恩杯)以下。
④更换其他品牌的油墨。
（3）、较粗的颗粒道的解决办法
将油墨槽清空，擦干净后更换新油墨。将旧油墨用120目金属网过滤后，以30%的比例与新油墨混合使用。
（4）、流星状间断墨道的解决方法
①更换其它厂家的油墨。
②将印版滚筒重新镶铬。
③调整刮刀高度或更换新的刮刀。
（5）、图文部位的缺墨道
①将油墨彻底清出井用120目金属网过滤油墨。
②将油墨槽彻底清洗干净。
③将印版滚筒重新镀铬。
（6）、刮刀丝、刀丝的解决方法
①重新镀铬或重新制版。
②用800-1000目的水砂纸对印版滚筒抛光。
③研磨或更换新的刮刀片。
④设计稿件时，尽避免将浅网和实地图案制在同一根印版滚筒上。
⑤合理调配溶剂，增加油墨适性。
⑥将刮刀位，向压印点移近，尽量减少刀丝。
⑦更换更高档的油墨。
（四）、反套印（咬色、印品嘬色）
反套印（咬色、印品嘬色）是指在凹印过程中，前一色印刷的油墨在和后一色套印时反粘到后一色的印版滚简商，致使前一色印刷图案部分被浸蚀下来，随印刷时间的推移，后一色的油墨发生变色，可以看到前一色的颜色，同时印品色相及质量受到严重影响。
1、产生原因：
（1）、印刷过程中，溶剂配比和实际印刷速度不匹配。
（2）、印刷过程中前一单元干燥温度太高，进风量太小，造成油墨“假干”，即印品在进入前一单元的干燥箱后，油墨表面迅速形成墨膜而层未干燥透。在和后一色套印时，后一色的印版滚筒网穴所含的溶剂将墨膜破坏，这样前一色未干透的幽默曾就部分转移到后一色的印版滚筒上，形成咬色。
（3）、有时相邻色的油墨相容性差时也会出现这种情况。
（4）、印刷速度太慢或后一色印刷压力太大。
（5）、印版滚筒雕刻工艺不良和印版滚筒状态不良。
2、解决方法：
（1）、降低压辊压力。
（2）、提高印刷速度。
（3）、改进前一色油墨的附着性，提高干燥速度(使用快干溶剂)。
（4）、降低后一色油墨的粘度。
（5）、调整前一单元干燥箱温度、风速。使印品在每个单元彻底干燥。
（6）、将后一色油墨的稀释剂改用不溶解前一色的成分。
（7）、更换后一色油墨。
（8）、重新制作或修镀印版滚筒。
（五）、印刷品残留臭味
1、产生原因
当印刷品作为包装材料来包装食品之类的物品时，如果有臭味就成为很大的问题。有时这种臭味甚至会被容物吸收，问题就会更为严重。特别是玻璃纸，聚烯烃薄膜等材料具有易吸收溶剂的特征，所以在印刷时需特别注意。当包装容物为食品时，对甲苯的臭味最为敏感。该臭味不仅是由于残留溶剂造成的，有时与包装材料本身的臭味（如聚烯烃的氧化臭味等）相混，造成不易解决的问题。国家标准对此也做了相应的规定，
即使不用于食品包装，也应从环保的角度出发，生产符合国家标准的产品。
2、解决方法：
（1）、不使用臭味强的展色料和添加剂。
（2）、调整油墨干燥速度，减少残留溶剂。
（3）、使用残臭少的溶剂（混入高沸点等不纯的溶剂，容易造成残臭现象）。
（4）、降低印刷速度，充分进行通风，减少溶剂残留。
（5）、合理选择印后加工条件。
（6）、选定印刷品的保管场所时，要特别注意有机溶剂的浓度并远离强烈异味刺激源。
（六）、光泽不足
墨层表观发暗，光泽性差。
1、产生原因：
（1）、由于白化现象所致。
（2）、油墨中树脂含量不足。
（3）、油墨中颜料或添加剂的颗粒粗。
（4）、使用无相容性的树脂时也会发生此类问题
（5）、使用已失去溶剂平衡的剩余油。
（6）、油墨干燥过快。
（7）、刮刀压力太大或刮刀角度太大。
2、解决方法：
（1）、调整湿度，进行加热干燥。
（2）、添加调墨油等。
（3）、尽量细化颜料及添加剂。
（4）、使用旧墨印刷时，应添加一些新调制的油墨。
（5）、降低油里干燥速度。
（6）、调整刮刀压力或刮刀角度。
（七）、版污
印版滚筒的非图文部分留有刮刀未刮干净的油墨，印刷时转移到薄膜上，形成成片的油墨污点。版污是呈雾化的、面状发生的，黑墨较易出现这种现象。
1、产生原因：
（1）、刮刀磨损或研磨不良降低了刮墨效率。
（2）、印版滚筒的镀铬质最不良或发生磨损造成的表面损坏.
（3）、油墨中的不纯物、粗粒子等顶起了刮刀。
（4）、油墨对印版滚筒的附着性过强或油墨的刮刀适性不良（润滑适性不良）。
2、解决办法：
（1）、加大刮刀压力，调整刮刀位置和角度等。
（2）、更换或重新研磨刮刀。
（3）、属于印版滚筒表面粗糙原因引起的版污，应对印版滚筒进行抛光处理。
（4）、降低印刷油墨粘度或浓度。
（5）、降低印速或向印版滚筒的非图文部分吹凤，使未刮干净的油墨迅速干燥，无法转移到薄膜上。
（6）、更换油墨。
（八）、白化现象
印刷油墨皮膜变白，又可分为溶剂白化现象和树脂白化现象两种。
1、产生原因
（1）、溶剂白化
这种白化现象多见于醇溶性油墨，当湿度高时，由于溶剂的蒸发潜热现象，油墨皮膜附近会被冷却，使水滴混入其中，造成油墨皮膜白化。当然，使用蒸发潜热高的溶剂时，这种现象更容易出现。下表列出了
部分溶剂的蒸发潜热。
部分溶剂的蒸发潜热(卡/克)
（2）树脂自化
油墨中的溶剂平衡性差，真溶剂先挥发，而稀释剂残存在油墨中，会使油墨中的树脂析出沉淀，引起白化现象。
2、解决方法：
（1）、溶剂白化解决方法
①尽量加大环境湿度。
②降低油墨干燥速度。
③印刷的同时进行加热干燥。
（2）、树脂自化解决方法：
①更换油墨，或者添加一些挥发速度较慢的真溶剂。
②更换溶剂的配方成分。
（九）、油墨层附着牢度差
1、产生原因：
（1）、印刷基材的适性不良，表面力低下。
（2）、印刷薄膜中的添加剂（增塑剂、表面活性剂、爽滑剂等）形成析出层，影响墨层附着牢度。
（3）、印刷基材自身吸湿。
（4）、油墨的性能不佳，油墨选用不当或异种油墨的混合.
（5）、油墨性能改变(变质、白化)。
（6）、油墨干燥不良，残留溶剂多.
2、解决办法：
（1）、检测印刷基材的表面力。如不合格则需更换基材。经电晕处理的薄膜.其处理度最重要。处理是否合格、是否发生衰退等均要通过表面力测定液进行测定。
（2）、如出现薄膜表面析出层影响油墨附着牢度的现象，则需要更换印刷基材或与油墨制造商商洽进行适当的处置。初次使用某种薄膜时，在事前要尽可能地详细调查其性质，特点等，以便选择合适的油墨。
（3）、更换油墨或检测油墨的附着牢度适性。凹印油墨大多是为特定的用途而生产的，应当避免与其他用途的油墨或异种油墨混合。而且为了防止误用，对剩余油墨要明确记录相关容、日期等，以备再使用。
（4）、解决油墨的变质、白化问题。
（5）、调整干燥条件。解决残留溶剂问题或将残留溶剂降到规定限度。
（6）、实施印刷现场的湿度控制。对干易吸湿的维尼纶、玻璃纸、尼龙等基材及其印刷品要妥善保管，防止受潮。
（十）、静电须及静电斑纹
静电须是指印品图案的边缘发生向外伸出的无规则的丝状墨条，如同胡须。静电斑纹是指在大面积图案部分形成的一些行状不定的斑纹，主要在印刷聚烯烃薄膜式出现。
1、产生原因：
（1）、塑料薄膜是电的不良导体，在印刷过程中因摩擦、接触、剥离而产生较多的静电。油墨本身如缺乏抗静电剂，在长时间工作后也会产生静电。
（2）、油墨粘度太低。
（3）、静电消除装置失去作用(如粘上油墨等)。
（4）、印版滚筒网穴过深或胶辊压力过大。
2、解决方法：
（1）、一般事先在油墨中加人抗静电剂或添加极性溶剂。防止静电墨斑或滋墨故障。
（2）、控制环境湿度，在印刷现场洒水或放入水蒸气，降低印刷现场温度，加大湿度。
（3）、检查静电消除器是否良好，保证及时消除塑料薄膜在印刷过程中产生的静电；对机器上的导辊亦采取接地措施，防止由于它与轴承部分的润滑油接触而绝缘。
（4）、在使用网穴较深的印版滚筒印刷时，要使油墨保持较高的粘度，同时胶辊的压力要适当，防止将油墨挤出网穴。
（十一）、气泡
印刷过程中油墨槽中的油墨产生大量气泡，这些气泡附着在印版滚筒上。使图案上的部分网点消失，印品上就会出现白点。
1、产生原因：
（1）、油墨的表面力较强，受油墨中使用的树脂和溶剂的影响较大。有时油墨的粘度大，也容易产生气泡。
（2）、油墨槽或循环装置有缺陷。大量气泡是由于油墨槽或循环泵中的油墨流动状态不好而引起的。使用墨泵循环油墨时，油墨从油墨槽流到循环桶时，由于落差及印版滚简高速运转时的搅动作用，就会在油墨中形成气泡。
（3）、直接供墨的印刷机上，磁性搅墨棒弯曲，在油墨槽里跳动，引起气泡。
2、解决方法：
（1）、保持适宜的油墨粘度。有时降低粘度后，产生的气泡可以自行破碎。
（2）、改进油墨循环装置，防止混入空气。
（3）、油墨从油墨槽中落下时的落差不要太大.距离尽量减小，减少液体冲力搅拌引起的气泡。
（4）、使用搅墨棒或充气的塑料薄膜泡管。
（5）、与油墨制造商联系，添加消泡剂。虽有专用的消泡剂，但大多对油墨性质产生不良影响，使用不当反而会引起气泡，所以不能多用。
（十二）、实地专色版印刷不匀
印品印刷不匀在凹印中是经常出现的质量问题。严重影响着产品的外观质量。目前，许多包装印刷企业根据客户的要求，在产品包装设计上过于强调专色的防伪功能，导致专色在印品设计中越来越多的使用。而目前80%的印品不匀问题发生在实地专色版面上。
实地专色版印刷不匀是印刷不匀中最常见的问题，表现为水纹状不匀和橘皮状不匀两种。专色一般由两种或两种以上颜色的油墨调配而成。有时在同一根实地专色版上单独使用原色油墨时并不出现印刷不匀现象，而使用调配而成的专色油里时却会出现印刷不匀现象。有时通过调整印刷工艺条件可以解决这种故障，有时却难以解决。
1、产生原因
（1）、水纹状不匀主要是因为印版滚筒网穴雕刻太深，而油墨的粘度偏低造成的。
（2）、橘皮状不匀产生的主要原因：一是是油墨中加人了过量的极性溶剂，如丁酮等；二是油墨的粘度过高，导致流平性不好；三是压印胶辊质量不高（胶层颗粒密度不一致），导致印刷时压印胶辊施加给印辊质量不高（胶层城粒密度不一致），版滚筒的压力不均匀。
2、解决办法：
（1）、与制版企业联系。先制作一根测试版对使用的油墨和溶剂按常规工艺条件进行测试。油墨主要测试常用的专色墨，如浅绿、草绿、群青、咖啡色、酱色、中蓝、土黄、朱红等。通过测试找出印版滚筒、油墨、印刷条件的最佳匹配结果，制版企业以此为基础确定适宜
的制版工艺参数。经过此过程制成的凹印版滚筒在解决实地专色版印刷不匀方面其有较强的适应性。
（2）、在接到新活件时，及时和客户沟通，尽最避免将专色版雕得太深。如果印版滚筒网穴雕得较深，可在保证油墨流平性的基础上适当提高油墨的工作粘度。
（3）、对于橘皮状不匀现象，第一可适当降低油墨粘度；第二可适当降低压印胶辊的压力；第三尽量提
(免费共享)SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析
常见问题及分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1) 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构 象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2) 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保 护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3) 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min， 未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
引物设计基本方法
Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：
DNA合成常见问题解答
DNA合成常见问题解答 1.DNA合成粗产物中含有什么杂质 DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后，其中除了含有所需的目的DNA片段(n)以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段(n-1,n-2,…)以及脱保护基团产生的铵盐。需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。 2.如何进行合成产物的纯化 目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种： A) C18柱脱盐，这是一种活性炭柱子，有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5' 端一个或两个或多个碱基的产物，却一般不会对普通PCR反应产生影响。但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别，以免后患无穷。 B) OPC柱纯化，OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5' 端最后一个碱基上的Dmt，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有Dmt 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有Dmt的片段吸附能力弱， 被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA这种方法的优点是快速，简易。但是其专一性吸附Dmt能力有限， 不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于25 碱基以上的片段纯化效果不好。 C) HPLC纯化，这是国外厂家常常使用的办法。它是依据不同大小的片段带有的净 电荷多少来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的 净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。 先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。它的优点是自动化程度高、省人
DNA电泳常见问题分析
DNA电泳常见问题 凝胶电泳操作注意事项 1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。 3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。 4、样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA 中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 6、 DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。 7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。 8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。 9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。 10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。 11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。 12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量 DNA电泳常见问题分析之一 1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？ 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。 一个让PAGE胶很快聚合的方法： 不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。 2 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？ 1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm
引物设计原则(必看)
mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能
PCR常见问题分析报告及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低
6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物
的交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 假阳性 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
DNA凝胶电泳简介 一、实验原理 DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：
1、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。 2、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。 二、琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。 表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围 由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。 随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。（5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。
引物设计注意事项
引物设计 首先引物与模板的序列要紧密互补， 其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构， 再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同 的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 非配对结构最好出现在引物中间。 另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱 基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产 生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
引物的应用常识
引物的应用常识 引物的原理 引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 1. 不同实验要求的引物选择 在开始设计引物之前，必须弄清以下几点： （1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等） （2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA） （3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等） 2.引物设计的重要因素 有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus， ?引物长度和专一性 常见的引物长度为18-30个碱基。短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。 同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。 ?平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域 引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 ?3’-序列 3’端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它将提高PCR效率，因为引物-模板符合物的开放将达到最小。但是，超过3个G/C碱基将会具有负面效果，因为会 降低反应的专一性。 ?避免互补的引物序列
印刷糊版的原因及处理方法
印刷糊版的原因及处理方法 糊版一词常解释为脏版、堵版或染色，不同的印刷形式会出现不同的糊版。近年来，糊版在透明油墨印刷和复合油墨印刷中屡屡出现。如胶印糊版，往往因水墨不平衡(药水与油墨酸碱度pH值的差距)造成的。而凹印糊版则多数是因刮刀刮不净造成的，而且多出现在气温高的夏季。在我们围绕这一故障进行探讨时不难发现：印刷油墨的墨性决定了这一现象的产生。笼统地判定为是何种原因何种情况是不切实际的，这有碍于我们在印刷实际操作中以极短的时间去补救和排除。 一、凸版的糊版 该印刷现象最明显的如“品”、“日”、“口”等被油墨填满成实地状，甚至网点连成一块，因此常被称为堵版。(1)其原因是油墨的干性太大，使印墨提早干结或粘性太大，造成纸或塑料上的墨层小点或纸、塑碎屑集中在版上或网点部分；(2)油墨干得太快，墨斗中的油墨结皮或有干硬颗粒；(3)油墨太稀，在印刷压力下油墨被挤出来；(4)纸或塑料吸收连结料太多，导致油墨中颜料含量过多；(5)辊子有弊病或不通心；(6)印刷的凸版不平实或过高；(7)在胶板纸上或光滑的塑料上(尤其是塑料编织袋)用了太稠的油墨；(8)给墨量太多或干性太慢。 排除的方法是：(1)采用干性合理而又较稠的油墨；(2)高调部位或网点部位减轻印压；(3)重新过滤油墨15～25μｍ)；(4)在印刷上侧以原纸、塑料隔开或改换承印物；(5)在稠油墨里添加稀释油墨的助剂，以提高油墨的流动率；(6)补加快干性油墨或溶剂；(7)染料型油墨应减少树脂的含量；(8)减少供墨量或添加减慢的油墨抑制剂；(9)不要使干燥装置上的风吹到版上；(10)在油墨里添加TM3或硅油。 二、平版(印)的糊版 1.平版(印)起油(腻)其表现的形式是：图文线条铺开扩大而不清晰完整，在空白 区则有油墨轻重不等的脏迹，尤其是橡皮布上也粘上了一片片油墨。其原因是：(1)印版上的吸水部分形成了吸墨中心，导致纸或塑料墨层中的表面活性剂迁移到吸水区。(2油墨与水的pH值差太大(即常讲的水墨不平衡)，导致印版的金属被药水中的酸溶解而出现印版不干净。(3)在使用含有铅的浆状燥油时，尤其是用量过多时，燥油被酸性很强的药水破坏，从而被薄薄的墨层所覆盖(往往还会导致整块版面的
PCR常见问题分析及对策
. PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低
. 6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数
问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物 的交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
电泳常见问题
Marker 参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象 琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的? 参考见解：DNA带模糊??： 1、DNA降解??避免核酸酶污染。 2、DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。 3、所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 4、DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 5、有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。 6、DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。好象没跑出来，是怎么回事？ 参考见解： 1、根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5％左右，也不一定。 2、紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。
3、最好加一个marker孔，尤其你第一次跑胶时。 4、电泳时间可能过长，一般75v×30min左右，但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。 怎样根据目测条带亮度来判断DNA浓度？ 参考见解： 1、跑胶时候marker 可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker，按说明书的量上样电泳，如加500ng量的DNA marker，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER 条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。因为marker的各条带都已知所含的DNA浓度（说明书中详细注明），因此根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。 2、在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。5、2、4、6，因为，如果质粒的量很浓的话，通过简单的对一条条带的目测产生的结果误差是很大的或者利用marker(推荐DL 2000),再用软件做半定量分析。 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？ 参考见解： 1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm即可。 2、电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。 3、上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。 跑出的DNA带模糊？ 参考见解： 1、DNA降解：避免核酸酶污染。 2、电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。 3、所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 4、DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。 5、DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 6、有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。 7、DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 有不规则DNA带迁移? 参考见解： 1、对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。 2、电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液。 3、DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。 跑出的DNA条带带弱或无DNA带？ 参考见解： 1、DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。 2、DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。
引物设计常见问题
引物设计常见问题与解答(二) 17. 长链引物为什么出错的几率非常高 答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。 18. 如果测序发现突变，该如何处理 答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。 19. 如果测序发现引物突变，是否有补偿 答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%.您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。 20. 引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入 答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。 21. 为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高
油墨印刷故障及处理方法!
一、照相凹版油墨概述 照相凹版油墨的粘度比较小，又较稀薄，在储存和静置过程中，由于其中固体成分的重力关系，总是要发生下沉现象的。从未搅动的油墨桶的上层倒出的墨，粘度可能低，颜色浓度和遮盖力可能差一些；从其下层取出的墨，粘度就会大一些，颜料对成膜物的比例也会高一些，粘附力将会差一些。所以，使用前对桶中的油墨要充分搅拌，这一点是不应忽视的，也是不能不强调的。首先，为了求得均匀一致，颜色前后一样，粘度前后无悬殊的差别和良好的流动性、使用性，要求在使用前，用清洁的木棒或金属棒，将其搅动。一般至少须搅动3~5 min，使其上下均匀一致，如油墨储存时间较久，则需要更长的搅动时间。为使下部沉积悬浮起来，还需比较大的力量。 其次，要查证所用油墨是不是和印刷对象的性质相符。因为目前凹版（照相凹版）油墨大体分纸印油墨，塑料薄膜油墨等，不能将印纸用墨拿来印刷塑料薄膜产品。同时，印纸用油墨又有印一般纸用墨和糖果等食品包装纸墨；印塑料薄膜用油墨又有印聚乙烯薄膜的，印聚丙烯薄膜的，印聚氯乙烯的和供复合印刷的等等。须分辨清楚。 在查证类型的同时，还有一个调节粘度、干性所用溶剂的问题。制作照相凹版油墨时，根据树脂的可溶解性以及防毒害方面的要求所用溶剂是不同的。如果是苯类型溶剂就可以用甲苯、二甲苯；若是汽油型的，则可以用特定沸程的汽油；如果是水溶性的则可以用无离子水；若是醇型的则可用乙醇、丁醇、醋酸乙酯等，如印塑料薄膜的油墨，若是苯醇混合溶剂型，则可用二甲苯，异丙醇或酯类；还有酮酯型的，则可用甲乙酮，醋酸丁酯等。只有具有和油墨性质相一致的溶剂，才能进行合意的调整。而且要检查油墨的颜色、粘度、干性等质量指标，是否适合印刷机的要求，是否符合印刷图案的要求。否则，须调节和调配。 再次，由于这类油墨的极易挥发性，使用中要对容器及时加盖密封，以防损失和干结。 由于印刷机上采用刮刀除墨，特别要防止杂物混入或有干固结块物，否则，将使刮刀受损、印刷难以顺利行。由于这类油墨含大量溶剂（特别是苯类、酮类等）有毒且可燃，因此，储存时应有通风、防爆的设施，并避免过冷过热的环境，更要有防火的严格措施。不能日晒、雨淋、进水使包装生锈，造成损失。对于剩余墨的管理尤为重要，因为油墨中含沸点不同的溶剂，尤其是低沸点溶剂，在印刷中，在剩墨存放中不停地挥发，溶剂混合平衡破坏，造成干结，性质恶化，甚至空气中的水分也要被极度凉下来的溶剂汽带入墨中，静电也可将周围的灰尘吸附进油墨。经过使用，所剩油墨粘度已经很低了，容易分离、沉淀、结块，这样将会给使用造成许多故障。因此，注意剩墨密闭，做好标记，保存在阴凉处，使用时过滤、搅拌就很有必要。这一点人们不大注意，实际上，大部分故障与此有关。 照相凹版印刷中出现的问题，和胶印、凸版印刷中一样，不外以下三种原因。一是油墨本身所引起的，二是印刷机部件（含版）和印刷对象的状况所引起的，三是操作者的熟练程度、操作技术水平高低所引起的。这三方面决定了印刷作业成功或失败，顺利或曲折。所以，当问题发生时，必须从这三方面进行详细的分析。对溶剂型油墨来讲，在分析条件变化时，要考虑机械、材料，尤其是要注意气候的变化，包括温度、湿度、通风、热量等，因为是靠溶剂挥发性干燥的油墨。做到弄清情况、确定原因、采取对策。本文的内容，大部分也适用橡皮凸版油墨使用中参考。 二、凹版油墨在印刷中的故障原因分析及解决办法 1.糊版（埋版、堵版） 故障现象：印品图文或小字印不出来，甚至于印品上有一层墨迹，而图案模糊。 原因：①油墨干燥速度太快，使油墨干结在网纹网穴内。或者图案网穴早被干结块堵住，新墨上去不能完全复溶，成大面积堆在印品上，涂花图案文字；印刷机速度太慢，刮刀除去非图纹部分油墨后，在到达压印点前，墨已成干固态不转移。凹印网穴中的墨一般转移率为1/2，也就是说还有1/2留在印版上，油墨粘度大，干得快，即使辊筒再复入墨斗中，也很
DNA电泳常见问题分析
D N A电泳常见问题分析The final revision was on November 23, 2020
DNA电泳常见问题 凝胶电泳操作注意事项 1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。 3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。 4、 样品加入量：一般情况下，宽的梳子可加μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。5、DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。6、DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。 7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。 8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。 9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。 10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。
PCR引物设计原则
PCR引物设计原则 引物(Primer)是人工合成的两段寡核苷酸序列。 1、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、G十C含量：应在40%-60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm 值引物的Tm值减去5-10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4(G十C)十2(A十T)。 3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发. 4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构. 5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。引物3’端最好选T，错配的几率与A 相比大大的降低了。G、C之间错配的概率小于A、T. 6、引物的5’端可以修饰，而3’端不能进行修饰。5’端的修饰包括：加酶切位点，标记生物素，荧光，地高辛、Eu3+等，引入蛋白质结合的DNA序列，引入点突变，插入突变、缺失突变序列、引入启动子序列。因为引物的延伸是从3’端开始的，因而3’端不能进行任何修饰，另外3’端也不能有形成任何二
级结构的可能。 如何设计引物 不同的核苷酸序列表达的氨基酸氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。 引物最好在模板cDNA的保守区域内设计（DNA的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对（Alignment）,各基因相同的序列就是该基因的保守区）。 PCR引物设计 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。 引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）* vOligo6 （引物评价） vVector NTI Suit vDNAsis vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在线服务）