大鼠肝微粒体的制备

2.1.3 大鼠肝微粒体的制备

大鼠肝微粒体制备全过程：

1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。合格证号：0055706

2．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg2kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并

固定。结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土

黄色。

3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mM

EDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。

4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。

5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。

6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。

7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。

8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应

后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。同

样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓

度。

9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3?0.5 mg/mL，取两份肝微

粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加

入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。

CYP450 (nmol/mg protein) = (A(450－490) ×1000)/(91 ×C) (2.1)

其中，A(450－490)为450 nm 和490 nm 处的吸光度之差，91 为CYP450-CO 结合物的摩尔消光系数，C 为肝微粒体样品的蛋白浓度（mg/mL。

实验五肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450

氧化酶活性测定

一、目的要求

1. 掌握肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450 氧化酶活性测定方法。

二、实验原理

外来化学物质在体内的生物转化主要靠肝细胞内滑面内质网上细胞色素P450 酶

（CYP450）系进行氧化、还原、水解等代谢。许多药物对细胞色素P450 酶系活性有抑制或诱导作用，当与其他需经CYP450 代谢的药物联合应用时，会影响这类药物的代谢，从而产生药物相互作用。制备肝细胞微粒体，并测定其内细胞色素P450 酶系的含量与活性，可为进一步研究外来化学物质物对肝微粒体细胞色素P450 酶系的影响提供依据。

肝微粒体细胞色素P450 酶系活性测定中，本实验首先应用Lowery 法测定肝微粒体蛋

白浓度，其显色原理为Flion酚试剂与蛋白质的酪氨酸和色氨酸残基反应所致。细胞色素P450 含量测定采用CO 还原差示光谱法，还原型细胞色素P450 可与一氧化碳结合，在波长450 nm 处出现最大吸收峰，因此可应用紫外分光光度计于波长450 nm 处进行测定，而氧化型细胞色素b5 经还原剂作用后转变成还原型细胞色素b5，在波长423 nm 处呈最大吸收，因此可通过测定还原型与氧化型细胞色素b5 的差示光谱来进行。

三、仪器与试剂

实验动物：Wistar 大鼠，雄性，体重212±13 g。

主要试剂：羧甲基纤维素钠，氨基吡啉，红霉素，7-乙氧基香豆素，NADPH，牛血清

白蛋白，甲醛。

实验仪器：紫外/可见光分光光度计，荧光分光光度计。

四、实验步骤

1. 给药：8 只雄性Wistar 大鼠，给予0.25%羧甲基纤维素钠1 ml，每日灌胃1 次，连续

7 d。d 7，禁食1 夜，次日断头处死。

2. 动物处理与肝微粒体蛋白的测定大鼠断头处死，尽量放出血液，迅速打开腹腔，

取出肝脏，用0.15 mol2L-1 KCL-0.2 mol2L-1 蔗糖（pH 7.5）洗净表面血污，用滤纸吸去表

面血液，称肝重。将肝脏剪碎，用上述缓冲液洗2 次，充分去除肝脏血液。按每克肝脏组织加3 ml 缓冲液的比例加入0.15 mol2L-1 KCL-0.2 mol2L-1 蔗糖，用内切式组织匀浆机在冰浴中制成匀浆；10 0003g，4℃离心20 min。取上清液转移至超速离心管内，105 0003g，4

℃离心60 min。弃上清，淡红色沉淀物即为肝微粒体。将肝微粒体沉淀取出后用0.05 mol2L-1 Tris-0.25 mol2L-1 蔗糖（pH 7.5）悬浮，经超声细胞粉碎仪混匀后，分装于冻存管中，干冰

速冻后，置-70℃冰箱保存。大鼠肝微粒体蛋白浓度测定：Lowery 法。

3. 牛血清白蛋白标准曲线制备在试管中分别加入0、25、50、100、150、200、250 mg2L-1 系列浓度的牛血清白蛋白溶液1 ml，然后加入5 ml Flion 酚试剂甲混匀，室温放置10 min 后加入0.5 ml Flion 酚试剂乙（1 mol2L-1），立即混匀，30 min 后，以不含蛋白质的试剂空

白对照于紫外分光光度计760 nm 波长处扫描。以系列浓度的牛血清白蛋白为横坐标，OD 值为纵坐标，进行线性回归，求得牛血清白蛋白线性回归方程。

4. 样本中蛋白浓度测定将待测大鼠肝微粒体样本稀释50 倍，加入稀释后样本1 ml，

其余同标准曲线操作步骤。依据线性回归方程计算待测样本中蛋白含量。

5. 细胞色素P450 含量测定采用CO 还原差示光谱法。吸取0.05 mol2L-1 Tris-0.25

17

mol2L-1 蔗糖溶液5.5 ml，加入稀释为5 mg2ml-1 的待测微粒体悬液0.5 ml 及10%连二亚硫酸钠0.04 ml，立即混匀。等量分装到两个比色杯中，分别作为对照和样本，于样本池中比

色杯充一氧化碳30 s，紫外分光光度计450 nm 向490 nm 扫描。计算公式如下：

nmol2mg-1 蛋白=ΔOD（450 nm-490 nm）31000913稀释后蛋白浓度（mg2ml-1）__

HLM Preparation.

To allow for sufficient microsomes to perform all assays, three livers were prepared for each of the three experiments (the force of the first centrifugation, homogenization buffer, and homogenizing strokes). Approximately 10 g of liver per experimental treatment was allowed to thaw in a room temperature homogenization buffer (0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.125 M potassium chloride and 1.0 mM EDTA). After transfer to 25 ml of chilled homogenization buffer (plus or minus 0.25 M sucrose in the buffer experiment), livers were minced thoroughly with scissors and homogenized with 10 strokes (6, 8, or 10 strokes in the strokes experiment) using a Teflon-glass homogenizer (870 rpm). Strokes were even and steady, lasting approximately 15 s for passage, except for the first two strokes where greater pressure and time were spent on material on the bottom of the glass tube. The tube was submersed in a small bucket of ice and water during all homogenization. The homogenate was diluted to 4 volumes of sample weight (approximately 40 ml). The samples then were centrifuged at 12,000g (9,000, 10,500, or 12,000gin the force experiment) in a Sorvall RC-5B with a Sorvall SA-600 rotor for 20 min (Sorvall, Newton, CT). The supernatant from the first centrifugation was removed, the mitochondrial pellet was resuspended in 25 ml, and the centrifugation was repeated. The supernatants were combined and centrifuged at 138,000g in a Sorvall Ultra Pro 80 with a Sorvall T-1270 rotor for 60 min. The upper lipid layer was removed and the cytosolic supernatant collected. The microsomal pellet was resuspended in 0.125 M KCl, 0.1 M Tris (pH 7.4) with three homogenization strokes, and the 138,000gcentrifugation for 60 min was repeated. The microsomal pellet was resuspended in incubation buffer with six strokes and brought to a final volume of 26 ml. Samples were stored at ?70°C.

线粒体的分离

线粒体的分离

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实验三线粒体的分离、超活染色与观察 一、实验目的 1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。 2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 3、学习细胞器的超活染色技术。 二、实验原理 利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 三、实验材料与方法 1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。 2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。 四、实验方法 （一）大鼠肝线粒体的分离 1、制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组

APJ拮抗剂Apelin13(F13A)对肝纤维化大鼠肝脏Beclin1、LC3和p62表达的影响

APJ拮抗剂Apelinl3 ( F13A)对肝纤维化大鼠肝脏 Beclin 1. LC3和p62表达的影响 刘明;曾斌;肖婷筑王珊;姚梦娜 【期刊名称】《医学信息》 【年(卷)，期】2015(000)025 【摘要】目的观察血管紧张素受体ATI相关的受体蛋白(APJ)拮抗剂Apelinl3(F13A)对肝纤维化大鼠肝脏中自噬相关基因Beclin 1、LC3和p62表达的影响。方法30只雄性SD大鼠随机分为对照组、肝纤维化模型组和Apelinl3(F13A)(100pg/kg)处理组。采用四氯化碳(CCI4)诱导大鼠肝纤维化模型。Apelinl3(F13A)通过腹腔注射给药。取肝左叶同一部位,苏木精-伊红(HE) 染色观察肝脏的病理形态学变化。Western blot检测肝脏中自噬相关基因Beclin 1、LC3和p62的表达。结果对照组大鼠肝脏的肝小叶结构完整，肝索排列整齐,结构完整,肝细胞排列整齐，没有发现明显的胶原纤维增生，纤维化程度分级为0级；肝纤维化模型组大鼠肝小叶结构破坏严重,肝细胞排列紊乱,汇管区发现明显的坏死细胞和炎性细胞，可见大量胶原纤维增生,形成纤维纵隔，纤维化程度分级为多为3-4级；与模型组比较,Apelinl3(F13A)组大鼠肝脏组织肝细胞变性和坏死明显减少，纤维化程度明显减轻,纤维化程度分级多为1-2级。与对照组t出交，肝纤维化大鼠Beclin 1和LC3的表达显著增加，而p62的表达显著降低(均＜0.05)。与肝纤维化模型组大鼠比较，Apelinl3(F13A)降低了Beclin 1和LC3的表达,而增加了p62的表达(均＜ 0.05)。结论APJ拮抗剂Apelinl3(F13A)抑制了CCI4诱导的大鼠肝纤维化，其机制可能与Apelinl3(F13A)抑制细胞自噬有关。

肝脏P450还原酶特异性敲除小鼠模型在毒理学中的应用

肝脏P450还原酶特异性敲除小鼠模型在毒理学中的应用1 Application of Liver-specific Cytochrome P450 Reductase knockout mice in Toxicology 肖瑛，武元峰，薛翔，顾军，任进* Xiao Ying, Wu Yuanfeng, Xue Xiang, Gu Jun, Ren Jin 中国科学院上海药物研究所，新药研究国家重点实验室,上海201203 State Key Laboratory for New Drug Research，Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 201203 关键词: NADPH-细胞色素P450酶还原酶，基因敲除，器官毒性 Key Word: NADPH-P450 Cytochrome Reductase, Knockout, Organ Toxicity 1.引言 微粒体细胞色素P450单加氧酶（P450，CYP）在内源与外源性化合物的生物转化中起着重要的作用。P450酶蛋白种类的多样性及其底物的重叠性使P450酶系可以催化多种类型的反应，不仅对许多外来物质如杀虫剂及环境有毒物质具有代谢作用，还参与一些起重要生理功能的内源性物质如激素、脂肪酸的代谢。P450酶的功能与生物学作用的重要性，使其研究具有广阔的应用前景。通过调控其表达和活性，可望改变生物体内外源性化合物尤其是药物的代谢，对于药物的研究和开发也有重要的意义。由于P450酶系的生物学重要性，自其发现以来，该酶系的研究一直是药理学和毒理学中一个十分引人注目的领域。 P450酶基因的多态性使其有多种亚型且多具有类似的功能和相似的组织分布特征，使在一个特异组织中很难去区别单个P450酶亚型的功能。目前已有多个P450酶亚型敲除（knockout，KO）小鼠模型，这些模型已被广泛用来研究特异性P450酶亚型在外源性化合物的代谢和毒性中的作用[[1]]。然而这些KO模 1基金项目：国家重点基础研究发展计划973项目（编号：2006CB504700） 作者简介：肖瑛（1981-），女，博士研究生，研究方向为药物毒理学。 *通讯作者：任进，Email: CDSER_SIMM@mail. https://www.sodocs.net/doc/084280142.html, Tel & Fax：（021）50806600-2207

大鼠肝微粒体的制备

2.1.3 大鼠肝微粒体的制备 大鼠肝微粒体制备全过程： 1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。合格证号：0055706 2．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg2kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并 固定。结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土 黄色。 3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mM EDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。 4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。 5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。 6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。 7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。 8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应 后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。同 样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓 度。 9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3?0.5 mg/mL，取两份肝微 粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加 入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。 CYP450 (nmol/mg protein) = (A(450－490) ×1000)/(91 ×C) (2.1) 其中，A(450－490)为450 nm 和490 nm 处的吸光度之差，91 为CYP450-CO 结合物的摩尔消光系数，C 为肝微粒体样品的蛋白浓度（mg/mL。 实验五肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450 氧化酶活性测定 一、目的要求

微粒体制备

微粒体制备 一、工作原理 微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构,这些小囊泡的直径大约100nm左右, 是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微粒体能够在不同的离心速度之下，从其他的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并分离，而P450、内质网碎片及其他可溶性酵素则保留在上清中。取上清在更快速的100,000g离心旋转之下，P450、内质网会沉淀成粒状或块状，而可溶性酵素则保留在上清中，将沉淀重悬即可得到微粒体。因此，微粒体在细胞生物学中定义为从内质网的碎片所得到的小型囊泡。微粒体含有细胞色素P450 (CYP)，由于P450中的辅助因子、血基质含有铁元素，微粒体常呈现红褐色。肝（或其他组织）微粒体体外温孵实验是采用从肝脏（或其他组织）中提取的微粒体，加入还原型辅酶II(NADPH)再生系统，在体外模拟生理环境下进行代谢反应，采用高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)等测定方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢的实验方法. 二、实验准备 以制备肝微粒体为例： 1、器材：匀浆机、大剪刀（断头）、手术剪、眼科剪3个、眼科镊3个、头皮针、注射器20ml、烧杯（500ml）4个、冰盒、冰板、匀浆管（5/10ml）、离心管（生科院借）、冻存管N个、培养皿N个。 2、试剂：冰生理盐水 PBS 缓冲液：1000ml缓冲液中含磷酸钾缓冲盐0.1mol·L-1、KCl 0.15 mol·L-1和1mmol·L-1EDTA,即1000ml超纯水中含K2HPO4 (228.23)18.304g、KH2PO4 (136.09)2.695g、KCl(74.55) 11.2g和EDTA0.372g，分装，4℃保存。 含20%甘油的PBS缓冲液200ml：40ml甘油+160ml上述PBS（存争议）三、实验步骤

实验四 线粒体的分离与观察

实验八线粒体的分离与观察 实验目的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I．鸡肝线粒体的分离 实验用品 一、材料 鸡肝脏 二、试剂 1. 生理盐水 2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：

四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型改良的研究_邵佳亮

收稿日期:2011-05-18 基金项目:国家自然科学基金(30760230) 作者简介:邵佳亮(1980-),男,硕士,住院医师,主要从事肝纤维化的研究。 通信作者:胡国信,副教授,E -mail:hug uo x in8228@sina.co m 。 四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型改良的研究 邵佳亮,万赞燕,胡国信 (南昌大学第一附属医院感染科,南昌330006) 摘要:目的 构建肝纤维化大鼠模型,并对经典四氯化碳(CCl 4)复制模型方法进行适当改进。方法 取Sprague -Daw ley(SD)大鼠40只,雌雄各半,按随机数字表法分为A 组10只、B 组14只和C 组16只。B 组给予大鼠腹腔注射40%CCl 4花生油溶液2mL kg -1,2次 周-1,同时给予普通全价饲料喂养(改良方法);A 组为正常对照组,给予等量花生油腹腔注射,2次 周-1,同时给予普通全价饲料喂养;C 组给予大鼠腹腔注射40%CCl 4花生油溶液5mL kg -1,2次 周-1,同时给予添加10%猪油及2%胆固醇的饲料喂养(经典方法)。实验第8周末处死各组剩余大鼠:采用酶联免疫吸附法检测血清肝功能(A L T 、AST 、A L B 、T P 、A/G)水平;H E 及M asson 染色观察大鼠肝组织病理学变化。结果 实验第8周B 、C 组均可见明显肝功能损害表现。B 组可见部分标本肝脏假小叶形成,达到早期肝硬化,肝细胞少量脂肪变性,死亡率28.6%。C 组均已形成明显肝硬化,弥漫性肝细胞脂肪变性,死亡率43.7%。结论 低剂量CCl 4诱导并给予普通饲料喂养可成功建立大鼠肝纤维化模型,并明显降低大鼠死亡率,提高了模型质量及实验效率。 关键词:四氯化碳;肝纤维化模型;改良;动物,实验;大鼠 中图分类号:R-332 文献标志码:A 文章编号:1000-2294(2011)07-0040-03 Improved Rat Model of Liver Fibrosis induced by CCl 4 SHAO Jia -liang,WAN Zan -yan,HU Guo -xin (Dep ar tment of I nf ectious Diseases ,the First A f f iliated H osp ital of N anchang Univ ersity , N anchang 330006,China) ABSTRACT:Objective To establish a rat m odel of liver fibrosis,and to improv e the classical CCl 4induction method.Methods Forty SD r ats (20female and 20male)w ere r ando mly divided into three gro ups.Gro up B (n =14)w as given intraperitoneal injection of 2mL kg -1of 40%CCl 4solution (a mix ture of CCl 4and peanut oil)tw ice a w eek and the feeding of no rmal complete diet.Gro up A (n =10)w as given intraperitoneal injection of 2mL kg -1of peanut oil tw ice a w eek and the feeding of nor mal com plete diet.Gro up C (n =16)w as given intr aper ito neal injec -tion of 5mL kg -1of 40%CCl 4solution tw ice a w eek and the feeding of diet containing 10%lar d and 2%cholesterol.Rats w ere killed at the end of 8w eeks,and the levels o f ser um ALT ,AST ,Alb,T P and A/G w ere determined by ELISA.The patho logical changes in liver tissue w ere ob -served by H E and M asso n staining.Results Liv er function w as damag ed apparently by CCl 4in -jectio n.Some specimens in g roup B pro duced false flo cculus and achieved the ear ly stage of liver fibro sis,w ith fatty deg ener ation in a few liver cells.A ll specimens in gr oup C had cirrhosis w ith diffuse hepatic steato sis.The m ortality w as 28.6%and 43.7%in gro up B and g roup C,respec -tively.Conclusion Liv er fibrosis can be induced by injection o f low do ses of CCl 4and feeding of norm al co mplete diet in rats.In addition,the improved m ethod can reduce the mortality and im -40南昌大学学报(医学版)2011年第51卷第7期 Jou rnal of Nanch ang University(M edical Science)2011,Vol.51No.7

核与线粒体分离提取方案

线虫细胞核和线粒体提取 N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。初步计划收集10个皿线虫。 1.细胞核分离 细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。 方法如下： 1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合 2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。吸出PBS。 3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。 4.以10000rpm短暂离心5-10秒。 5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中 6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次 7.用棉布过滤匀浆 8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。丢弃上清液。用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。4℃ 600g 离心10分钟。丢弃上清液。 10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。 11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。 12.翻转管子去除蔗糖。从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。 核在这个阶段保留其膜。要卸下膜，请执行步骤13。 13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。在4℃下以600g离心10分钟。重复该过程。最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。 14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。 分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。 2.线粒体提取 查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下： 1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。 2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。 3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。 4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。 5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。 6.小心地清除上清液 7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。细胞使用钝头针头和注射器进行破

四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化机理研究

四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化 机理研究 【摘要】目的观察四氯化碳腹腔注射制作大鼠肝纤维化模型时相关细胞因子 的变化，初步探讨四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化的机理。方法以四氯化碳腹腔注射的方法[四氯化碳 mL (用花生油1∶6稀释)/次，每周3次，共14周]制作大鼠肝纤维化模型，设立正常、溶剂对照组，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原含量;ELISA法检测转化生因子ββ1)、肿瘤坏死因子α);化学法检测血清氧化亚 氮(NO)。肝行HE和Masson胶原染色，光镜下观察病改变，并按SSS计分系统进行评分。免疫组化染色观察肝组织血小板源生长因子的变化，专业像分析进行图像分析。结果与正常对照组、溶剂对照组比较，模型组血清ALT、AST、HA、LN、、NO、β1 、α明显升高

()，大鼠肝组织肝纤维化评分明显升高()，肝组织表达明显增多()。结论促进相关细胞因子的表达可能是四氯化碳腹 腔注射致大鼠肝纤维化的机理之一。 【关键词】四氯化碳;肝纤维化;细胞因子 Abstract:Objective To investigate the variation of correlated cytokine when the rat models of hepatic fibrosis were induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride,and to the relevant molecular mechanism. Methods Rat models of hepatic fibrosis were made by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride at mL(diluted 1∶6 with peanut oil),three times a week,a total of 14 weeks. The normal and dissolvent groups were prepared as controls. Serum β1 and α were detected by ELISA method. Serum levels of NO were detected by

实验六.肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定

院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定 1 实验目的 本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。 2 实验原理 研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液3mL ，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。 细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。 3 实验材料 3.1实验动物 大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h） 3.2实验器材与试剂 器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等 试剂：1.17% KCl 溶液 Tris-HCl缓冲液： Tris 6.05 g ；蔗糖 68.4 g； 水 500 ml；浓盐酸调 pH 7.4；补水至 1000 ml 4.实验方法 4.1动物处理与匀浆制备 断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl 溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆

3种方法测定大鼠肝微粒体蛋白含量的比较

万方数据

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3种方法测定大鼠肝微粒体蛋白含量的比较 作者：简暾昱， 徐帆， 廖春龙， 徐贵丽， Jian Tunyu， Xu Fan， Liao Chunlong， Xu Guili 作者单位：简暾昱,Jian Tunyu(昆明医学院成都军区昆明总医院第一临床学院,昆明,650032)， 徐帆,徐贵丽,Xu Fan,Xu Guili(成都军区昆明总医院)， 廖春龙,Liao Chunlong(大理学院) 刊名： 中国药师 英文刊名：CHINA PHARMACIST 年，卷(期)：2011,14(3) 参考文献(5条) 1.金科涛;王宇光;徐彭HPLC测定大鼠肝微粒体P450活性方法学研究进展[期刊论文]-药物分析杂志 2006(03) 2.孙忠实;朱珠药物代谢性相互作用研究进展 2000(01) 3.李海玲;彭书明;李凛4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志 2008(04) 4.许家喜蛋白质的检测方法与乳制晶中蛋白含量测定[期刊论文]-大学化学 2009(01) 5.Cinti DL;Moldeua P;Schenkman JB Kinetic parametera of drug-metabolizing enzymes in Ca2+-sedimented microsomea from rat liver[外文期刊] 1972(24) 本文读者也读过(1条) 1.LI Hai-ling.彭书明.LI Lin.张雪梅.LI Hai-ling.PENG Shu-ming.LI Lin.ZHANG Xue-mei4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志2008,29(4) 本文链接：https://www.sodocs.net/doc/084280142.html,/Periodical_zgys201103012.aspx

大鼠肝纤维化模型的制备

中文摘要 目的本文通过对SD大鼠腹腔注射四氯化碳以诱导大鼠肝纤维化动物模型。 方法取15只SD大鼠，180—220g，分为A组10只，B组5只，A组为模型组：40%CCL4橄榄油混合液按0.12ml/100g腹腔注射，一周两次，共八周。B组为对照组：纯橄榄油按0.12ml/100g腹腔注射，一周两次，共八周，八周后，禁食12小时处死全部大鼠，解剖取肝组织。病理学检测：HE染色，MASSON染色,PAS染色。基因学检测：1.3.4型胶原蛋白 结果八周试验期间B组大鼠全部存活，肝组织标本结构清晰，无异常情况；A组大鼠出现明显的病态，肝组织标本均已达到肝纤维化S3以上，多数标本可见小叶被纤维结构分割包围，假小叶形成，干细胞可见脂肪变性； 结论该方法肝损伤明显，死亡率低，周期短，能够成功作为慢性肝损伤，肝纤维化的模型。 关键词肝纤维化，四氯化碳，动物模型 Abstract Objective: Established animal model of hepatic fibrosis in rats induced by carbon tetrachloride. Methods: Take 15 SD rats,180-220g, divided into 10 group A, group B 5 只, A group of model group: 40% CCL4 0.12ml/100g by abdominal injection of a mixture of olive oil, twice a week, a total of eight weeks. Group B was the control group: pure olive oil press 0.12ml/100g abdominal injection twice a week, a total of eight weeks, eight weeks later, all rats were fasted for 12 hours were sacrificed, dissected liver tissue. Pathology: HE staining, MASSON staining, PAS staining. Genetics testing: 1.3.4 collagen Results: During the eight-week test group B rats survived, liver tissue specimens clear structure, no exceptions; significant morbidity A rat liver tissue fibrosis S3 have reached above, the majority of samples are split fiber structure visible lobular surrounded pseudo lobule formation, stem cell degeneration visible fat. Conclusion: This method obviously liver injury mortality, the period is short, to be successful as chronic liver damage, liver fibrosis model. Key words: Fibrosis, carbon tetrachloride, animal model 前言

组织线粒体分离试剂盒

组织线粒体分离试剂盒 简介： 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 组织线粒体分离试剂盒(Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离动物组织中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。该试剂盒可用于从动物软组织(如脑、肝脏)和硬组织(心肌、骨骼肌)中提取线粒体，对于采用该试剂盒提取硬组织线粒体效果不佳者，建议采用Leagene 硬组织线粒体分离试剂盒。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 低温离心机、匀浆器 2、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：取新鲜组织(不宜采用冻存的组织)，迅速称重，用预冷的PBS 清洗1次，冰上剪成3mm 2大小的组织碎片。 2、匀浆裂解：加入Mitochondria Lysis buffer(如需获得细胞浆蛋白，应提前加入PMSF ，至PMSF 浓度为1×)，置于冰浴上Dounce 匀浆器中，匀浆10～20次。 不同组织或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 3、离心以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。注：如需获得纯度更高的线粒体，可 编号 名称 CS0010 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(C): Protein Stock buffer (5×) 10ml RT 试剂(D): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份

肝纤维化大鼠模型的研究进展_王宪东

世界最新医学信息文摘 2016年 第16卷 第94期39 重视中医药在大肠癌治疗方面的研究，探索新思路，研讨新治法，增加新疗法，提高大肠癌患者生存率。 参考文献 ［１］　关彤．《金匮要略》理论在大肠癌防治中的运用［Ｊ］．中华中医药学刊，２００７，２５（２）：３７１－３７２． ［２］　余胜珠，杨光华，陈连生，付相建．补中益气汤联合四神丸加减治疗老年大肠癌术后腹泻１８例［Ｊ］．　中国药业，２０１３，２２（８）：９９－１００．［３］　王学中，季秀海．健脾补肾活血方改善大肠癌术后化疗毒副作用临床观察［Ｊ］．新中医，２０１５，４７（８）：２１０－２１１．［４］　薛建章，王瑞敏．中医药联合化疗对大肠癌根治术后复发、转移以及生存期的影响研究［Ｊ］．中国现代药物应用，２０１６，１０（５）：２５９－２６０． ［５］　黄耀，唐晓玲．熊墨年教授治疗大肠癌的临证经验初探［Ｊ］．江西省２　０　１　４年中医、中西医结合肿瘤学术交流会暨中医苗治疗肿瘤新进展培训班，１８４－１８７． ［６］　李晓琳，冯　妮．复方苦参注射液联合化疗治疗大肠癌术后３１９例患者的疗效分析［Ｊ］．中医中药，２０１５　，１３（１４）：１９９－２００．［７］　陈爱飞．清肠消癌方灌肠联合化疗治疗晚期大肠癌５６例观察实用［Ｊ］．中医药杂志，２０１１，２７（１２）：８４２－８４３． ?综述? 肝纤维化大鼠模型的研究进展 王宪东１，石安华２（导师），陈文玲３（通讯作者） （１．云南中医学院　基础医学院，云南 昆明 ６５０５００；２．云南中医学院　继续教育学院，云南 昆明 ６５００００； ３．云南中医学院　临床医学院，云南 昆明 ６５００００） 摘要：肝纤维化动物模型是研究肝纤维化发病机制的重要途径，本文对目前常用的肝纤维化大鼠模型进行阐述，主要综述了四氯化碳、二甲基亚硝胺、猪血清、刀豆蛋白、乙醇及胆管阻塞手术方等造模方法，同时探讨了每一种模型的造模方法和优缺点。 关键词：肝纤维化；动物模型；大鼠；机制 中图分类号：R657.3+1 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1671-3141.2016.94.028 0　引言 肝纤维化是肝脏内弥漫性纤维结缔组织沉积，机体对炎症组织损伤修复的反应［１］。肝纤维化是许多慢性肝病的中间环节，阻止延缓肝纤维化的发生发展是治疗的关键。肝纤维化动物模型的建立，既是研究肝纤维化发病机制的前提，也是研究肝纤维化治疗的先决条件。标准的肝纤维化动物模型应该具备如下条件：与人类的病变基本相似；肝纤维化的发生发展具有明显的分期的过程；动物的造模成功率高，死亡率低；造模方法简便，造模成本低廉，具有可重复性等。 1　四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠模型 四氯化碳（ＣＣＬ４）诱导的大鼠肝纤维化模型是应用最广泛的肝纤维化动物模型，其模型在临床上与人类的某些病理学变化极其相似。ＣＣＬ４经过灌胃或者腹腔注射后，通过门静脉流入肝脏，随着血液的循环由汇管区向中央静脉流动。在此过程中，ＣＣＬ４被肝细胞吸收，在肝细胞内经微粒体细胞色素氧化酶Ｐ４５０代谢生成大量的自由基，攻击肝细胞，使肝细胞发生凋亡或坏死。黄月红等［２］对大鼠腹腔注射生理盐水５０％与　ＣＣＬ４　蓖麻油混合液，剂量为２ｍｌ／ｋｇ，每周两次，共四周，结果显示ＣＣＬ４造模４周早期肝纤维化已形成。ＣＣＬ４诱导的大鼠肝纤维化模型具有操作简便，价格低廉，耗费时间短等优点，但是动物的死亡率较高，而且停止注射一段时间后，肝纤维化有愈合的趋势。 2　二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化动物模型 二甲基亚硝胺（ＤＮＭ）是一种半挥发性的有机化学品，小剂量接触可能致癌，具有较强的肝毒性作用。ＤＭＮ通过肝微粒体代谢其中间产物与核酸、蛋白质等结合导致肝细胞损伤，同时产生的活性甲基化产物使核酸、蛋白质甲基化导致肝坏死［３］。梁晋川等［４］对大鼠腹腔注射ＤＭＮ１０μｌ／ｋｇ，连续３ｄ／周，连续３￣６周；或８ｍｌ／ｋｇ，连续３ｄ／周，连续五周，在注射２￣５周后肝纤维化程度逐渐加重。ＤＭＮ诱导的大鼠肝纤维化模型具有周期短，可重复性好，纤维化的程度高，停止给药后不宜反复等特点，而且ＤＮＭ本身就是致癌物，与临床上肝癌的病变特点有相似之处。但对ＤＭＮ注射的量不易掌控，动物的死亡率较高，ＤＭＮ本身就为一级致癌物，在操作中也要注意个人防护，防止中毒。 3　猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型 猪血清是一种异种血清，血清中的白蛋白注入大鼠体内后变为异种抗原　，诱导机体产生抗体从而形成抗原与抗体的复合物，沉积于门脉区肝血管和间质组织中，通过免疫复合物介导的细胞毒性反应活化枯否氏细胞而导致肝血管和间质组织结构的改变，最终引发肝纤维化。张艳等［５］对大鼠采用腹腔注射猪血清０．５ｍｌ／ｋｇ，每周两次，经观察腹腔注射猪血清四周时，肝纤维化已初步形成，八周时模型就已经复制成功。猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型主要与免疫性肝纤维化的形成有关，与人类慢性肝炎中肝纤维化的发生相似。但其复制模型的周期较常长，动物肝脏的损伤常常具有自愈性，动物的死亡率也比较高。4　刀豆蛋白诱导肝纤维化的大鼠模型 刀豆蛋白Ａ（Ｃｏｎ　Ａ）是从刀豆中提取的凝集素，其具有沉淀多种糖类、区分某些正常的细胞和肿瘤并促进其分裂等。Ｃｏｎ　Ａ可以激活Ｔ细胞从而引起肝脏的损伤。梁洁等［６］经尾静脉注射１２．５　ｍｇ／ｋｇ剂量的Ｃｏｎ　Ａ，每周１次，连续注射八周后的大鼠ＡＬＴ、ＡＳＴ指标显著增高，肝脏体积增大，肝脏指数升高，提示肝纤维化形成。Ｃｏｎ　Ａ诱导肝纤维化大鼠模型，其病理过程与慢性肝炎的病理过程相似，可以更好的复制人类病毒性肝病的模型。Ｃｏｎ　Ａ诱导肝纤维化大鼠模型造模的成功率高，动物死亡率低，简便易行。 5　乙醇诱导的肝纤维化动物模型 酒精中毒是西方国家肝硬化发病的主要原因，在我国，随着生活水平的提高，酒精性肝病的比例也逐渐升高。酒精在进 （下转第３０页） 基金项目：云南省科技厅应用基础面上项目（NO. 2013FZ091） 作者简介：王宪东，男，汉族，籍贯：辽宁省大连市，现在职务或职称：研究生在读，学位：硕士学位，研究方向：中西医结合防治疾病机制研究。

代谢稳定性研究中肝微粒体与肝细胞的差异

代谢稳定性作为化合物重要的ADME性质，其影响着化合物在机体内的清除率、半衰期和口服生物利用度。由此，代谢稳定性研究常作为早 期化合物筛选的重要环节，其对于优势化合物的筛选、指导结构修饰、预测体内清除率、构建IVIVC和预估剂量等具有重要意义。目前常用 于代谢稳定性研究的高通量方法主要包括肝微粒体、肝细胞和肝S9，其中肝微粒体代谢稳定性（LMS）和肝细胞代谢稳定性（HMS）最为常见。而化合物在LMS和HMS中结果存在差异的现象时有发生，那么针 对这种情况，我们难免会产生一些疑问，导致差异存在的内在因素是 什么？找到差异的原因是否可以对化合物结构改造有利？选择哪个数 据作为评价化合物的标准值？该采用哪个数据去预测人体清除率？下 文将带着这些疑问进行阐述。 1 肝微粒体与肝细胞的差别 要想弄清楚化合物LMS和HMS的差异，首先我们必须要了解肝微粒体和肝细胞本身。肝脏组织匀浆后高速离心上清液即为S9，再经超高速离心后底部沉淀重悬即为微粒体，肝微粒体酶主要源于肝细胞内质网，包含CYP、水解酶和UGT。由肝微粒体的制备过程可知肝微粒体失去了细胞完整结构，药物可直接暴露于代谢酶中。另外肝细胞胞质中还存在部分肝微粒体缺失的代谢酶，如醛氧化酶（AO）、黄嘌呤氧化酶（XO）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等，下表附有各类药物代谢酶在肝细胞中的定位。此外，由于肝细胞完整的细胞结构，其细胞膜表面表达有各类药物相关转运体蛋白，如OATP1B1、OATP1B3、

OATP2B1、BCRP、BSEP等摄入或外排转运体，下图附有肝细胞中转运体表达情况。 (摘至《Donglu Zhang,Sekhar Surapaneni - ADME-Enabling Technologies in Drug Design and Development》一书)