基因定点突变

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

定点突变技术——从单点突变到多点突变

定点突变技术——从单点突变到多点突变 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。 对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli 中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过 8Kb的质粒。后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质

定点诱变技术解析

第三章DNA突变技术

?基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。 ?根据其特点可将基因突变技术分两大类： 1.位点特异性突变定点突变 2.随机突变表型筛选

?随机突变 易错PCR法(Error-prone PCR) ?降低一种dNTP的量（降至5％-10％）?加入dITP来代替被减少的dNTP ?缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ DNA Shuffling ?外显子、单基因和基因家族的重组装?随机引物延伸法 ?交错延伸法 ?定点突变 点突变——碱基删除、增补和替换

易错PCR(epPCR)

How DNA shuffling is done in the tube ?Random fragmentation of a pool of related genes; ?Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers); ? PCR amplification with primers of reassembled products How DNA shuffling works

Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . ... .. ... ..Single gene shuffling library of point mutants Family gene shuffling library of chimeras Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences 一、单基因和基因家族的重组装

基因突变发现及其机理研究与应用

附件 中国人群血液肿瘤患者IDH1、IDH2、DNMT3A 基因突变发现及其机理研究与应用 一、项目基本情况 提名单位：昆明医科大学第一附属医院 主要完成人：曾云，张登峰，杨金荣，于明，邹阳，向国强，王燕梅 完成单位：昆明医科大学第一附属医院、中国科学院昆明动物 研究所、昆明医科大学 项目所属学科：医疗卫生 任务来源：国家自然科学基金委员会、云南省科技厅 学科分类名称：血液病学代码:320.2430. 所属国民经济行业：卫生和社会工作 计划名称和编号： 1.国家自然科学基金地区项目《血液肿瘤患者IDH1基因的突变及其致病机理研究》（81060046） 2.云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项项目《DNMT3A在IDH1致急性髓系白血病基因组高甲基化中的作用》（2014FB027） 项目研究起止时间：2011年至 2017年 成果最早应用时间：2013年 推广应用单位：全国省内外十三所医疗单位 二、项目简介

血液肿瘤在病因学、病理学以及临床表现上都存在差异，是一大类异质性疾病，这为患者临床确诊和对症治疗带来许多难题。血液肿瘤的发病机制是复杂的，其中遗传因素对血液肿瘤的发病起着重要的作用。该项目在国家自然科学基金等项目，共35万元科研经费支持下，通过在中国西南群体中完成“中国人群血液肿瘤患者IDH1、IDH2、DNMT3A基因突变发现及其机理研究与应用”的系列工作，发现IDH1、IDH2、DNMT3A基因突变主要发生在急性髓系白血病(AML)患者，尤其是复发难治AML患者，其他恶性血液病中罕见突变；在机理研究中发现IDH1参与的传统通路HIF-1α信号和细胞内ROS可能没有参与IDH1 突变致血液肿瘤的过程，而DNMT3A可能参与介导IDH1/2突变所致的基因组高甲基化。同时，该项目研究中取得了国际领先的“四个科学发现”，为这一类血液肿瘤患者的治疗提供新思路。该研究在国际上率先发现如下： 1.IDH1 p.I99M 与 IDH2 p.R140Q 突变同时出现在1例骨髓增生异常综合征(MDS) 转化而来的AML患者中，且该患者预后极差。 2.国际首次在NK/T淋巴瘤（鼻型）和外周T细胞淋巴瘤（非特异型）患者中检测到IDH1基因突变p.R132G、p.R132H，两例患者预后极差，提示IDH1的基因突变可能参与了部分非霍奇金淋巴瘤(NHL)病人的发病，可能是其预后不良的一个指标。该研究发现为这类患者的治疗提供了新思路和方向。 3.在复发难治的Ph+的B-ALL患者中可检测到DNMT3A基因突变，且该患者预后极差。为这类患者的治疗提供了新思路，为可能的药物开发提供了新的靶点。 4.DNMT3A参与介导IDH1/2突变所致的基因组高甲基化。该研究将两种重要的血液肿瘤致病基因在功能上进行了关联，为下一步开

基因定点突变 (1)

基因定点突变 一、定点突变的目的 把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。 二、定点突变的原理 通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。 三、引物设计原则 引物设计的一般原则不再重复。 突变引物设计的特殊原则： （1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。 （2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。 （3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。 （4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。 （5）最好使用经过纯化的引物。 Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5 注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。 四、引物设计实例 以G CG→A CG为例： 5’-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’ （1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。 Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’ Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’

四、基因突变的作用机理

基因突变的作用机理 基因突变是由于DNA 分子中核苷酸序列的改变，随之基因作用改变，最后导致个体表型的改变。引起基因突变的理化因素很多，但每种诱变因素的诱变机理各有其特异性。 （一）紫外线诱变机理 紫外线的波长范围是136?390nm ,其中对诱变有效的范围是200? 300nm ，而260nm 效果最好，它能使原子中的内层电子提高能量，而成为活化分子，由于紫外线带有大约3?5ER 的能量（能量很少，穿透力弱不足以引起物质的电离，属非电离射线），它足以引起一个分子中某些化学键发生断裂、交联而产生化学变化，其主要效应是形成胸腺嘧啶二聚体。 DNA 中嘧啶对紫外线诱变的敏感性要比嘌呤大10 倍左右，常见T—T 二聚体以共价键在相邻的二个碱基间联结而成的嘧啶二聚体，是发生在DNA 的同一条链上的两个相邻的胸腺嘧啶残基间形成TT 聚体，也可形成TC 或CC 二聚体。大剂量的紫外线照射，能引起DNA 双螺旋的局部变性，可使两条互补链上的两个嘧啶残基互相靠近而形成二聚体，从而引起交联。当DNA 复制时，两链间的交联会阻碍双链的分开与复制，同一条链上相邻胸腺嘧啶之间二聚体的形成，则会阻碍碱基的正常配对，这样，不是导致复制的突然停止，就是导致在新形成的链上诱发一个改变了基因序列。 （二）X 射线的诱变机理 人体接受的辐射中，X 射线能将原子中的电子激发而形成正离子，它属于电离辐射，经X 射线处理后的DNA 分子，发现有核酸碱基的化学变化，氢键的断裂，单链或双链的断裂，双链之间的交联，不同DNA 分子之间的交联，以及DNA 和蛋白质之间的交联而诱发突变，同时电离辐射的能量被水分子所吸收，水分子失去电子变成正离子，电子若被另一个水分子捕获，这个水分子就变成水的负分子： NO+e f H2O 刚形成而不稳定的离子立刻分解，形成H。和OH。自由基，当这些自由基和细胞中溶解的氧发生反应后，生成过氧基HO° 2 ，这种氧化物质转移到核苷酸双链中去，能引起DNA 分子结构形式的改变，形成碱基类似物，导致碱基置换发生突变。 一般来说，辐射所含的能量愈大，可使原子轨道上的电子变化以及分子共振态的改变也愈强，因而诱变的效率更高。除X射线外，丫射线也是能量极高的辐射，能使轨道上的电子完全离开原子，而造成电离。 三）热的作用机理

基因定点突变全攻略

基因定点突变全攻略 一、定点突变的目的 把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。 二、定点突变的原理 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也 可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点 突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重 点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸 序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关 系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋 白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基 酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原 来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领 域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面。 通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就 行了。 三、引物设计原则 引物设计的一般原则不再重复。 突变引物设计的特殊原则： （1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的 碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可 能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。 （2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC 含量应大于40%）。 （3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。 （4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

基因突变的诱发原理

第六节基因突变的诱发 内容： 一、物理因素诱变 二、化学因素诱变 一、物理因素诱变 只限于各种电离辐射和非电离辐射 1.电离辐射诱变 ●包括α射线、β射线和中子等粒子辐射，还包括r射线和χ射线等电磁波辐射。中子的诱变效果最好。根据辐射（照射）的方法，可分为“内”和“外”照射。 ○外照射 即辐射源与接受照射的物体之间要保持一定的距离，让射线从物体之外透入物体之内，在体内诱发基因突变。χ射线、r射线和中子都适用于“外照射”。 ○内照射 即用浸泡或注射的方法，使其渗入生物体内，在体内放出β射线进行诱变。 α和β射线的穿透力很弱，故只能用“内照射”。实际应用时，一般不用α射线，只用β射线。β射线常用辐射源是P32和S35，尤以P32使用较多。 ●电离辐射致变的机理 这主要是因为它们能使构成基因的化学物质直接发生电离作用。这些物质的分子都是由原子构成的，原子又由数量相等的质子和电子构成。当电离辐射的射线碰控制基因任何分子时，照射的能量使原子外围的电子脱离轨道，原子从中性变为带正电荷的离子，产生“D的发电离”。射线进一步照射，在形成大量离子对的过程中所产生的电子，多数尚有较大的能量，能引起第二次电离，即“次维电离”，“次级电离”轻则造成基因分子结构改组，产生新基因，重则使染色体结构变异（断裂等）。辐射剂量越大，原发电离数就越多，→次级电离就越重→基因突变率就越高。 ●辐射剂量及表示方法 ○定义：单位质量被照射的物质所吸收的能量数值，称为辐射剂量。 ○χ射线和r射线：用“伦琴”（r）表示，即在1克空气中吸收83尔格（erg）辐射的能量。 ○中子：单位是“积分流量”。即每平方厘米的截面上通过的中子数（n/cm2）。 ○β射线：用“微居里”表示。具体是每克物质吸收多少“微居里”（μcu）的放射性同位素。 微居里是放射强度单位，表示每秒钟有3-7×104个原子核发生蜕度。

基因突变分析技术综述

基因突变分析技术综述 湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室　(长沙　410087) 阮庆国　陆春叶综述　夏家辉审校 提要　基因突变分析是确定某一未知基因与某遗传病之间关系的关键步骤,也是临床上对病人进行基因诊断的重要手段,本文对19种基因突变分析技术进行了分类综述,特别对近几年发展起来的几种新技术进行了详细介绍,并讨论了毛细管电泳在基因突变检测中的应用。 于1990年10月正式启动的人类基因组计划到今年已正式实施了八年,该计划的目标可概括为两点,即: 人类3×109bp的全序列分析; 全部基因的识别及功能分析。据估算人类基因组中约包括5～10万个基因,它们分布在24个不同染色体和线粒体上,到1998年1月为止,已克隆的人类功能基因达到5052个,但确定与某一特定遗传病相关的基因只有821个,目前已被认定的孟德尔遗传病有1402种,这些病都至少与一个或几个基因的突变相关。研究人类的全部基因,特别是与疾病相关的基因的结构、功能以及各种基因突变与疾病的关系,是人类认识遗传病的发病机理,并最终达到对遗传病进行基因诊断和基因治疗的重要环节。从20世纪80年代开始,一系列寻找新基因的方法得以应用,如消减杂交,mRNA差异显示,外显子捕获等,基因克隆的策略也从最初的功能克隆法,候选基因法发展到今天的定位克隆法以及定位候选克隆法,并且染色体上已定位和测序的cDN A越来越多,表达图谱的内容越来越丰富,这就给发现新的未知基因,了解各基因的功能及其突变导致的疾病创造了极为有利的条件,从而大大加快了人类遗传病致病基因克隆的步伐。但是在找到了一系列的候选基因之后,要确定哪一个基因是该病的致病基因,还需在相应的病人中进行突变检测。在过去的十几年中,虽然已有19种突变分析的技术得到发展,但总的来说,寻找一种快速、高效而又经济的方法仍然是很多科研工作者的研究目标。本文对突变分析的种种方法进行了分类综述,特别对近期出现的几种新技术进行了详细的讨论。 突变分析技术按其研究对象主要分为两大类,即: 对未知突变进行分析,即确定某一未知基因与某遗传病的关系; 对已知突变进行分析,即在临床上对致病基因已克隆的遗传病进行基因诊断。在实际应用中许多检测未知突变的方法也可用来对已知突变进行检测。 一、对未知突变进行分析的方法 1.RNA酶A切割(Rnase A cleavage) 在一定条件下,异源双链核酸分子RNA: RN A或RNA:DN A中的错配碱基可被RNase A切割,切割产物可通过跑变性胶得到分离。RN A探针可通过将相应的DNA片段克隆至含有SP6或T7启动子的载体中得到,当RNA 探针上错配的碱基为嘌呤时,RNase A在错配处的切割效率很低甚至不切割,而当错配碱基为嘧啶时,则其切割效率较高。所以如果仅分析被检DNA的一条链,其突变检出率只有30%,而如果同时分析被检DNA的正义链和反义链,则有效率可达到70%[1]。尽管RNase A切割法有其局限性,如需使用同位素,需将PCR 产物克隆至表达载体上,从而增加了操作的复杂度,但由于它能对1～2kb的片段进行检测,并能确定突变位置,且无需使用有害化学试剂,故仍被频繁使用。 2.变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradi-ent Gel Electro phoreris,DGGE) 该方法的原理是:双链DNA分子在一定变性剂浓度的凝胶上电泳时,会在一定的时间 ? 225 ?

高中生物基因突变知识点总结

高中生物基因突变知识点总结 下面由为大家提供关于高中生物基因突变知识点总结，希望对大家有帮助!高中生物基因突变第一节一、生物变异的类型1、不可遗传的变异(仅由环境变化引起)2、可遗传的变异(由遗传物质的变化引起)，包括：基因突变;基因重组;染色体变异二、可遗传的变异(一)基因突变1、概念：DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变，叫做基因突变。 2、原因：物理因素：X射线、紫外线、r射线等;化学因素：亚硝酸盐，碱基类似物等;生物因素：病毒、细菌等。 3、特点：(1)普遍性(2)随机性(基因突变可以发生在生物个体发育的任何时期;基因突变可以发生在细胞内的不同的DNA分子上或同一DNA分子的不同部位上)(3)低频性(4)多数有害性(5)不定向性【注】体细胞的突变不能直接传给后代，生殖细胞的则可能 4、意义：它是新基因产生的途径;是生物变异的根本来源;是生物进化的原始材料。 (二)基因重组1、概念：是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组合。 2、类型：(1)非同源染色体上的非等位基因自由组合(2)四分体时期非姐妹染色单体的交叉互换高中生物基因突变第二节一、染色体结构变异：实例：猫叫综合征(5号染色体部分缺失)类型：缺失、重复、倒位、易位(看书并理解)二、染色体数目的变异 (3)染色体组数的判断：① 染色体组数= 细胞中形态相同的染色

体有几条，则含几个染色体组例：以下各图中，各有几个染色体组?② 染色体组数= 基因型中控制同一性状的基因个数例：以下基因型，所代表的生物染色体组数分别是多少?(1)Aa ______(2)AaBb _______(3)AAa _______(4)AaaBbb _______(5)AAAaBBbb _______(6)ABCD ______答案：2 2 3 3 4 13、单倍体、二倍体和多倍体单倍体：由配子发育成的个体。 几倍体：由受精卵发育成的个体，体细胞中含几个染色体组就叫几倍体，如含两个染色体组就叫二倍体，含三个染色体组就叫三倍体，以此类推。 体细胞中含三个或三个以上染色体组的个体叫多倍体。 三、染色体变异在育种上的应用1、多倍体育种：方法：用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗。 (能够抑制纺锤体的形成,导致染色体不分离,从而引起细胞内染色体数目加倍)原理：染色体变异实例：三倍体无子西瓜的培育优缺点：培育出的植物器官大，产量高，营养丰富，但结实率低，成熟迟。 现有纯合矮杆不抗病水稻ddrr和纯合高杆抗病水稻DDRR两个品种,要想得到能够稳定遗传的矮杆抗病水稻ddRR ，应该怎么做?优缺点：后代都是纯合子，明显缩短育种年限，但技术较复杂。 【附】育种方法小结诱变育种杂交育种多倍体育种单倍体育种方法用射线、激光、化学药品等处理生物杂交用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗花药(粉)离体培养原理基因突变基因重组染色体变异染色体

StarMut超长基因定点突变试剂盒

StarMut XL Site-directed Mutagenesis Kit StarMut 超长基因定点突变试剂盒 【货号和规格】T113-01，10 rxn 【产品概述】 本试剂盒采用反向PCR (Inverse PCR) 技术，对含有目标基因的双链环状质粒进行扩增，直接导入突变序列，从而实现单个或多个邻近碱基的突变(mutation)、缺失(deletion)、或插入(insertion)。该技术的原理如右图所示。首先以甲基化的质粒DNA 为模板，使用人工合成含有目的突变碱基的引物进行扩增反应，然后用DpnI 限制性内切酶消化不含突变的质粒模板，再进行转化和筛选。 本试剂盒采用保真性能和扩增效率俱佳的StarMut XL Enzyme ，能够快速扩增15 kb 以下的质粒DNA (15~30 sec/1 kb)，最大限度地保持扩增质粒的保真性，大大缩短反应时间，是StarMut Site-directed Mutagenesis Kit (货号T111-01)的升级产品。该方法操作简单快捷，突变阳性率高，对引物设计的要求相对宽松、灵活。严格按说明书操作，6个以下连续碱基的突变率可达90%以上，最多可实现21个连续碱基的插入或删除。 对于非甲基化的质粒(例如从大肠杆菌JM110或SCS110菌株中提取的 质粒)，可通过转化dam ＋ 的大肠杆菌菌株(如DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue 等)，再抽提获得甲基化的质粒作为PCR 反应模板。 本试剂盒提供一个 4.5 kb 、含有突变的lacZ 基因的对照质粒(Control Plasmid)。质粒转化大肠杆菌后在含Amp 、IPTG 和X-gal 的琼脂平板上呈白色菌落；采用试剂盒提供的Control Primers 成功进行突变反应后，菌落呈现蓝色，可据此检测突变效率。 【产品组分】 * 使用前请先短暂离心；? 使用前请完全解冻并充分混匀 【保存条件】 ?20℃保存，有效期一年。 【操作步骤】 1．引物设计原则： (1) 正、反向突变引物各一条，长度约25~45个碱基，分别包含带有突变点的互补区和3' 端延伸区(见下图)； (2) 突变点分别位于正、反向引物的互补区，互补区应包含至少15个碱基； (3) 引物突变点的3' 端应包含10~15个与质粒模板互补的碱基； (4) 引物的3'端应包含至少一个G 或C 碱基，尽量避免三个以上的重复碱基，以免错配； (5) 尽量将引物的GC 含量控制在40~60％； (6) 请使用经过PAGE 或HPLC 纯化的引物，否则会降低突变阳性率。 引物设计举例： 互补区 延伸区 互补区 延伸区 Forward Primer ： 5'-GATTACGCCAAGCT T CTAAATTAACCG-3' 5'-CCAAGCT T CTAAATTAACCGTG-3' Reverse Primer ： 3'-GATACTGGTACTAATGCGGTTCGA A G-5' 3'-CTAATGCGGTTCGA A GATTTAATTG-5' 延伸区 互补区 延伸区 互补区 StarMut XL Enzyme * 8 μl 5 x StarMut XL Reaction Buffer ? 100 μl High-GC Additive * 30 μl dNTPs * 25 μl Dpn I (10 U/μl)* 12 μl Control Plasmid (5 ng/μl)* 10 μl Control Primers (10 μM of each)* 10 μl ddH 2O 1 ml 图1. StarMut 超长基因定点突变试剂盒原理和操作流程示意图 或 PCR 合成突变链 Dpn I 消化掉含有甲基化的DNA 质粒模板 转化至高效感受态细胞中 CH 3 CH 3 3CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3

定点突变

1.1.1 基因定点突变 简介（INTRODUCTION ） 定点突变（site-directed mutagenesis ）是指通过聚合酶链式反应（PCR ）等方法向目的DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。定点突变能迅速、高效的提高DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR ）2. 一步法（全质粒PCR ） ? 搭桥法（重叠PCR ）定点突变 搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR ，其中前两次PCR 可同时完成，原理如图一所示：两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。 PCR1：以primer F 和 primer Rm 为引物对扩增 PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增 实验步骤（PROCEDURE ） 1. 两对引物的Tm 值都应相当。两端PCR 引物参照普通引物设计并无特殊要求。所需引入突 变包含在中间引物互补区域内 （需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。 2. 对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补， 也可是部分互补。但两引物间互补部分的Tm 值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。 搭桥法定点突变

一对中间位置的点突变引物设计 3. PCR ：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为 引物对扩增。两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。（注意前两次不能使用taq 聚合酶，因为taq 在产物3’ 端多加一个A ，导致后续的PCR3出现移码突变） 4. 克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。 ? 一步法定点突变 一步法是以质粒为模板，考虑扩增效率需将正向引物和反向引物分开扩增，避免二聚体的产生。原理如图 实验步骤（PROCEDURE ） 5. 引物设计：设计一对含有目标突变的引物，除所需要引入的突变位点外，其余序列与质粒模 5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’ 完全互补 5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’ 部分互补 5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’ 部分互补

基因定点突变技术描述

基因定点突变step by step" 本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉 上： 在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。 实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况 下我们会有几种可能使我们需要这样去做： 第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后 暴昏。 大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不 讨论了。 第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思 路吧。 对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。 对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。 接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行 了。 大家马上就会想到几个问题了： 第一：引物怎么设计呢？ 第二：模板怎么去掉呢？ 第三：怎么拿到质粒呢？

基因定点突变技术简介-sill

基因定点突变技术简介： 一般来说，基因突变是不定向的，是随机的，且突变频率非常低。而通过定点突变技术，可以按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，因此基因定点突变技术是蛋白质工程研究中的重要工具。基因定点突变主要有以下三种方法： 1.寡核苷酸介导的定点突变 该方法以M13噬菌体的DNA为载体，在操作时，首先利用转基因技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体的正链DNA上，制备含有目的基因的单链DNA。再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分，将其转入细胞后，经过不断复制，可获得突变的DNA分子。 Stratagene公司研制了QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit即是在此 种方法上进行改良的：以含目的DNA的质粒为 模板，在要突变处设计一对反向互补的引物， 用高保真酶进行扩增，再用dpnI消化掉质粒模 板，将已经形成环状的PCR产物转化进大肠杆 菌就可以。 2．盒式定点突变 该方法是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷 酸片段，取代野生型基因中相应序列。这种突变的寡 核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当其退火时，按设计 要求产生克隆需要的黏性末端。由于不存在异源双链的 中间体，因此重组质粒全部是突变体。但这种方法需要 在靶DNA区段的两侧存在一对限制酶单切点，限制了该 方法的使用。

3.PCR介导的定点突变 经典PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应(见图2)。头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA 片段经变性和退火可以形成具有3’凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA。

基因突变

基因突变 　基因突变发生的时期： 1．生物个体发育的任何时期中均可发生突变，即体细胞和性细胞均能发生突变。 2．性细胞的突变率高于体细胞：性细胞在减数分裂末期对外界环境条件的敏感性较大；性细胞发生的突变可以通过受精过程直接传递给后代。 3．突变后的体细胞常竞争不过正常细胞，会受到抑制或最终消失 需及时与母体分离 无性繁殖 经有性繁殖传递给后代。 许多植物的“芽变”就是体细胞突变的结果：发现性状优良的芽变 及时扦插、压条、嫁接或组织培养 繁殖和保留。 芽变在农业生产上有着重要意义，不少果树新品种就是由芽变选育成功的，如：温州密桔 温州早桔。 但芽变一般只涉及某一性状，很少同时涉及很多性状。 4．基因突变通常独立发生：某一基因位点的一个等位基因发生突变时，不影响另一个等位基因，即等位基因中两个基因不会同时发生突变(AA，aa)。 三、基因突变的一般特征： ㈠、突变的重演性和可逆性: 1.重演性：同一生物不同个体间可以多次发生同样的突变。 2.可逆性：显性基因A通过正突变(u) 形成的隐性基因a 又可经过反突变 (v) 又形成显性基因A。 3．多方向性：基因突变的方向不定，可多方向发生： 如A

a，可以A a1、a2、a3、…都是隐性。 a1，a2，a3，… 对A来说都是对性关系，但其之间的生理功能与性状表现各不相同。 4．复等位基因：指位于同一基因位点上各个等位基因的总体。 复等位基因并不存在于同一个体中(同源多倍体除外)，而是存在于同一生物群内。如人类血型ABO系统。 复等位基因的出现 增加生物多样性 提高生物的适应性 提供育种工作更丰富的资源 使人们在分子水平上进一步了解基因内部结构。 1．突变的有害性： 多数突变对生物的生长和发育往往是有害的。 某一基因发生突变 长期自然选择进化形成的平衡关系就会被打破或削弱 进而打乱代谢关系 引起程度不同的有害后果 一般表现为生育反常或导致死亡。 2．致死突变：即导致个体死亡的突变。 致死基因（lethal alleles）：指可以导致个体死亡的基因，包括隐性致死基因（recessive lethal alleles）和显性致死基因（dominant lethal alleles）。 1)．植物：最常见的为隐性白化突变。 (2)．动物： ①. 纯合显性致死(小鼠毛色遗传)：黑色 黄色，但无黄色纯合体。 ②．杂合显性致死突变：显性致死突变在杂合状态时即可死亡。不会产生纯合体。

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。 突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适

四、基因突变的作用机理

基因突变的作用机理 基因突变是由于DNA分子中核苷酸序列的改变，随之基因作用改变，最后导致个体表型的改变。引起基因突变的理化因素很多，但每种诱变因素的诱变机理各有其特异性。 （一）紫外线诱变机理 紫外线的波长范围是136～390nm，其中对诱变有效的范围是200～300nm，而260nm效果最好，它能使原子中的内层电子提高能量，而成为活化分子，由于紫外线带有大约3～5ER的能量（能量很少，穿透力弱不足以引起物质的电离，属非电离射线），它足以引起一个分子中某些化学键发生断裂、交联而产生化学变化，其主要效应是形成胸腺嘧啶二聚体。 DNA中嘧啶对紫外线诱变的敏感性要比嘌呤大10倍左右，常见T—T二聚体以共价键在相邻的二个碱基间联结而成的嘧啶二聚体，是发生在DNA的同一条链上的两个相邻的胸腺嘧啶残基间形成TT聚体，也可形成TC或CC二聚体。大剂量的紫外线照射，能引起DNA双螺旋的局部变性，可使两条互补链上的两个嘧啶残基互相靠近而形成二聚体，从而引起交联。当DNA复制时，两链间的交联会阻碍双链的分开与复制，同一条链上相邻胸腺嘧啶之间二聚体的形成，则会阻碍碱基的正常配对，这样，不是导致复制的突然停止，就是导致在新形成的链上诱发一个改变了基因序列。 （二）X射线的诱变机理 人体接受的辐射中，X射线能将原子中的电子激发而形成正离子，它属于电离辐射，经X射线处理后的DNA分子，发现有核酸碱基的化学变化，氢键的断裂，单链或双链的断裂，双链之间的交联，不同DNA分子之间的交联，以及DNA和蛋白质之间的交联而诱发突变，同时电离辐射的能量被水分子所吸收，水分子失去电子变成正离子，电子若被另一个水分子捕获，这个水分子就变成水的负分子： H2O+e-→H2O- 刚形成而不稳定的离子立刻分解，形成H°和OH°自由基，当这些自由基和细胞中溶解的氧发生反应后，生成过氧基HO°2，这种氧化物质转移到核苷酸双链中去，能引起DNA分子结构形式的改变，形成碱基类似物，导致碱基置换发生突变。 一般来说，辐射所含的能量愈大，可使原子轨道上的电子变化以及分子共振态的改变也愈强，因而诱变的效率更高。除X射线外，γ射线也是能量极高的辐射，能使轨道上的电子完全离开原子，而造成电离。