两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则

两种定量分析方法的比较及Taqman 探针、引物设计原则

遗传物质DNA 首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA （mRNA ）,携带遗传信息的mRNA 从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA 携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA 完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA 的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA 含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。

定量PCR 仪是在普通PCR 仪的基础上加装了荧光激发装臵和荧光检测装臵，PCR 扩增和检测同时进行；在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems 公司推出，由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

定量PCR 常用的三个常用概念

扩增曲线、荧光阈值、Ct 值

扩增曲线：反映PCR 循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR 仪每次轮PCR 扩增都会自动记录

荧光强度的变化

荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设臵的原则要大于样本的荧光背

景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保

证回归系数大于0.99。

CT 值： PCR 扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

扩增曲线 阈值及CT 值

荧光定量PCR 的数学原理

理想的PCR 反应：

X=X0*2n

非理想的PCR 反应：

X=X0* (1+Ex)n

（n ：扩增反应的循环次数；X ：第n 次循环后的产物量；X0：初始模板量；Ex ：扩增效率） 在扩增产物达到阈值线时

: C(t) value

XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1)

XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M

方程式(1)两边同时取对数得:

log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)

整理方程式(2)得:

log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3)

由此可见，log X0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的该基因的初始模板量。

Sample

利用相对定量的方法分析目的基因的表达

研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。基因表达调控研究中，由于RNA纯化后得率不同、RNA 反转录为cDNA 的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了

品初始浓度不同而造成的差异。所谓的看家基因即内参基因，是指在各生理阶段表达量恒定的基因，也称奢侈基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作参照，常用的内参基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。

假定在1生理时期，X基因的表达量为X1；其内参基因表达量为Y1；X1/Y1就将1生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；同样在2生理时期，X2/Y2就将2生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1）/（X2/Y2），所得的值就能就能较为真实的反应在1、2生理时期，X基因的变化情况。

常用的相对定量方法主要有两种，双标准曲线法和Delta-delta Ct法。

一、双标准曲线法

所谓的双标准曲线法就是对内参基因和所研究的目的基因都做绝对定量，然后将各生理阶段的目的基因的量和内参基因的量相除，得出一个比值；最后再将不同生理阶段所得的比值相除，最终得出目的基因在不同生理阶段的表达变化。

公式如下：

双标准曲线法的特点：

1、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率，最大限度的避免了误

差；

2、思路直观、条理清晰、应用简便，无需像Delta-delta CT法那样对实验进行严格的优

化；

3、其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲线；

4、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。

二、2 -△△CT法

公式如下：

1、2 - △△ CT 方法的推导

PCR 指数扩增的公式是：

Xn 是第 n 个循环后目标分子数；X 0 是初始目标分子数；Ex 是目标分子扩增效率；n 是循环数；C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数

因此：

X T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数；C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数；Kx 是一个常数；对于内参反应而言，也有同样的公式：

用X T 除以R T 得到：

对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言，X T 和R T 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K 并不一定等于 1 。

假设目标序列与内参序列扩增效率相同：

或：

X N 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△C T 表示目标基因和内标基因 C T 值的差异（C T,X -C T,R ）

整理上式得：

最后用任一样本 q 的X N 除以参照因子（ calibrator ， cb ）的X N 得到：

在这里

对于一个少于 150bp 的扩增片断而言，如果 Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于 1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：

2、方法的假设和应用

要使△△ C T 计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等或相差小于0.1。

2 -△△CT法的特点：

1、由Delta-delta Ct的公式可以看出，该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同

时默认两个基因扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。

2、用Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看

家基因做两组标准曲线。看两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。

3、当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而

只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。

4、这种方法对于样品量少，但研究的基因数目较多的实验特别有用，因为一旦条件优化好

之后就无需再做标准曲线，节约了试剂和样品量，实验操作也相对简单。

Taqman探针、引物设计原则

与普通PCR反应相比，荧光定量PCR在反应中加入了荧光物质，用以实时显示反应的进程，Taqman探针法在普通PCR反应体系中加入了与扩增片段互补的一段带荧光标记的核酸序列，SybrGreen法加入了能与双链核酸结合的荧光染料，这些荧光物质都能影响Taq酶的活性进而影响PCR反应的效率。

在Taqman探针法中，Taq酶除了5’-3’聚合酶作用之外，还要5’-3’外切酶的活性来切断探针链产生荧光，普通PCR的延伸温度为72℃，此温度为Taq酶聚合作用的最佳温度；Taqman探针法反应中，在要求Taq酶5’-3’聚合酶活性的同时，还需要Taq酶5’-3’外切酶的活性来切断探针链产生荧光，Taq酶5’-3’外切酶活性的最佳温度为60℃，所以Taqman PCR反应的一般采用两步法，即95℃变性，60℃复性延伸。与普通PCR反应相比，Taqman探针法PCR反应效率有所降低或对PCR产物扩增长度、Mg2+浓度等其他条件更加敏感。

理想的实时扩增曲线

不同扩增效率的差异

对于Taqman探针法来说，引物及探针的设计必须围绕着保证PCR反应的最大效率这一中心，这样才能保证各个样品间反应效率的一致性，才能最大限度的减少误差。

探针设计原则：

1、先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针；

2、探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性；

3、检测探针的DNA折叠和二级结构；尽量避开二级结构；

3、Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），以确保在退火过程中探针

先于引物与目的片段结合，GC含量在40%－70%；

4、探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来

还会存在淬灭作用；

5、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就

应选择配对的另一条链作为探针；

6、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特

异性互补区，建议重新设计引物探针。

引物设计原则：

1、序列选取应在基因的保守区段；

2、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡

结构；

3、典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于

非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量；

4、 Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%；

5、引物之间的TM相差避免超过2℃；

6、引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；

7、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；

8、 Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；

9、引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +

Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光

引物设计原则(必看)

mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能

结构设计常识及规范

第一章材料 SPCC 一般用钢板，表面需电镀或涂装处理 SECC 镀锌钢板，表面已做烙酸盐处理及防指纹处理 SUS 301 弹性不锈钢 SUS304 不锈钢 镀锌钢板表面的化学组成------基材（钢铁），镀锌层或镀镍锌合金层，烙酸盐层和有机化学薄膜层. 有机化学薄膜层能表面抗指纹和白锈，抗腐蚀及有较佳的烤漆性. SECC的镀锌方法 热浸镀锌法: 连续镀锌法（成卷的钢板连续浸在溶解有锌的镀槽中 板片镀锌法(剪切好的钢板浸在镀槽中，镀好后会有锌花. 电镀法: 电化学电镀，镀槽中有硫酸锌溶液，以锌为阳极，原材质钢板为阴极. 1-2产品种类介绍 1.品名介绍 材料规格后处理镀层厚度 S A B C＊D＊E S for Steel A: EG （Electro Galvanized Steel）电气镀锌钢板---电镀锌 一般通称JIS 镀纯锌EG SECC （1） 铅和镍合金合金EG SECC （2） GI (Galvanized Steel) 溶融镀锌钢板------热浸镀锌 非合金化GI，LG SGCC （3） 铅和镍合金GA，ALLOY SGCC （4） 裸露处耐蚀性2>3>4>1 熔接性2>4>1>3 涂漆性4>2>1>3 加工性1>2>3>4

B: 所使用的底材 C (Cold rolled) : 冷轧 H (Hot rolled): 热轧 C: 底材的种类 C: 一般用 D: 抽模用 E: 深抽用 H: 一般硬质用 D: 后处理 M: 无处理 C: 普通烙酸处理---耐蚀性良好，颜色白色化 D: 厚烙酸处理---耐蚀性更好，颜色黄色化 P: 磷酸处理---涂装性良好 U: 有机耐指纹树脂处理(普通烙酸处理)--- ---耐蚀性良好，颜色白色化，耐指纹性很好A: 有机耐指纹树脂处理(厚烙酸处理)---颜色黄色化，耐蚀性更好 FX: 无机耐指纹树脂处理---导电性 FS: 润滑性树脂处理---免用冲床油 E: 镀层厚 1-4物理特性 膜厚---含镀锌层，烙酸盐层及有机化学薄膜层，最小之膜厚需0.00356mm以上. 测试方法有磁性测试(ASTM B499), 电量分析(ASTM B504), 显微镜观察（ASTM B487） 表面抗电阻---一般应该小于0.1欧姆/平方公分. 1- 5 盐雾试验----试片尺寸100mmX150mmX1.2mm, 试片需冲整捆或整叠铁材中取下，必须在镀烙酸盐后24小时，但不可超过72小时才可以用于测试，使用5%的盐水，用含盐的水汽充满箱子，试片垂直倒挂在箱子中48小时。 测试后试片的镀锌层不可全部流失，也不能看到底材或底材生锈，但是离切断层面6mm范围有生锈情况可以忽略。

引物探针设计简介

引物探针设计简介 已有2993 次阅读2009-1-1 20:48|个人分类:课堂集锦|系统分类:科研笔记 1．寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量计算。通过对成千种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。因此通过计算机软件选择的引物的总体“质量”（由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出的引物。需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5'端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍PCR反应，而会在以后使用扩增子时发挥作用。 2．基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。②引物的二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3'末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于

引物设计原则(含Realtime引物)

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm 值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析） 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价

real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价 一、实时荧光Taqman 探针设计 总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。 在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。 若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。 另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。 二、探针的设计 探针设计的基本原则： 1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。 2．探针长度

Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm 值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。 3．探针的名称 应标记探针在基因组的位置及长度。 4．探针Tm值计算 用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。 5．探针的评价 用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name” 中输入探针的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primer self dimer”,分析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dime r，并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“p rimer hairpins”,分析探针的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins，并对此探针的h airpins进行评价。多重荧光PCR时，要对多条探针进行“pair dimer”进行分析。 6．探针的5’端不能为G 因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 7．Taqman探针与引物之间的位置

荧光定量PCR引物设计原则.

1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域 内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。 2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。 3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。 4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。 5.碱基要随机分布，尽量均匀。 6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8.引物5′端可以修饰。 9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。 10. 引物3′端要避开密码子的第3位。 11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。 可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。 12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp. 13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。 14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。 15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长 度相似。 16.TM值在58-62度之间。 17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： ①引物长度 一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃ 另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

qPCR引物设计原则及具体操作步骤

qPCR引物设计原则及具体操作步骤 1.找基因（DNA） 1)通过英文名称查找 通过查看文献或者百度搜索查找到对应基因的准确的英文名称 →进入NCBI官网 →点击网页右下角GenBank，进入GenBank界面 →在搜索框中输入准确的英文名称，点击Search搜索即可 2)通过序列号查找 通过查找文献，找到相应基因在GenBank上的登录号，直接输入上面的搜索框进行查找即可。 例如：犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)基因保守片段序列号为KT222978。 3)通过引物查找 通过查找文献，找到别人用过的对应的引物 →在NCBI官网右下角点击Primer-BLAST →输入正、反向引物序列 →设置对应参数 →点击“Get Primers”进行搜索即可 4)找到对应的基因后点击“FASTA”，进入相应界面，再点击“Send to”选择相应格式，保存 序列。

2.qPCR引物和TaqMan探针的设计 1)引物设计注意事项 a)引物长度17bp-25bp为佳。太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出 现引物高级结构的几率增加。两者都会干扰定量结果的准确性 b)扩增片段长度为：90-150 bp（最低不能超过70，最高不能超过180） c)引物的Tm值为：最小57℃，最大63℃，最适为60℃，两条引物之间退火温度得差距 不超过1℃，推荐使用Primer Premier 5进行Tm值计算； d)引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其 是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域。 e)引物设计时请尽量避开TC或者AG的连续结构。 f)3’端不能超过3个以上碱基互补，自互补碱基数不超过3；3’端最后一个碱基绝对不能 搭上 g)特异性要有保证，与非特异模板3’端互搭碱基数不超过3，不连续出现4个及以上的 GC互搭 h)引物3’端最后五个碱基不能包含超过2个以上的G或者C i)引物的GC含量控制在40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间 j)正向或者反向引物应尽量接近探针序列但是不能和探针序列有重合区域 k)在Primer-BLAST设计时，在Organism 处选择相应物种 l)需跨外显子设计，避免基因组污染 2)TaqMan探针设计指南 a)探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；一般相隔1~5个 碱基（一般10个以内，最好是1个碱基）。 b)应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免GGGG或者更多的连续G出现。 c)探针5’端应避免使用碱基G，因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存 在淬灭作用 d)3’端应避免使用碱基A

甲基化引物探针设计方法

本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。

首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用https://www.sodocs.net/doc/1510879808.html,/methprimer/，较为简单直观。

直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图： 以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。

关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议： Primer设计的基本原则： a)引物长度一般在18-35mer。 b)G-C含量控制在40-60%左右。 c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 g)退火温度Tm控制在58-60C左右。 h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 T aqMan 探针设计的基本原则： a)T aqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 b)长度一般为18-40mer 。 c)G-C含量控制在40-80%左右。 d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 e)在引物的5’端避免使用G。 f)选用比较多的碱基C。 g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。 另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。

两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则

两种定量分析方法的比较及Taqman 探针、引物设计原则 遗传物质DNA 首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA （mRNA ）,携带遗传信息的mRNA 从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA 携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA 完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA 的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA 含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。 定量PCR 仪是在普通PCR 仪的基础上加装了荧光激发装臵和荧光检测装臵，PCR 扩增和检测同时进行；在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems 公司推出，由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 定量PCR 常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct 值 扩增曲线：反映PCR 循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR 仪每次轮PCR 扩增都会自动记录 荧光强度的变化 荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设臵的原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保 证回归系数大于0.99。 CT 值： PCR 扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 扩增曲线 阈值及CT 值 荧光定量PCR 的数学原理 理想的PCR 反应： X=X0*2n 非理想的PCR 反应： X=X0* (1+Ex)n （n ：扩增反应的循环次数；X ：第n 次循环后的产物量；X0：初始模板量；Ex ：扩增效率） 在扩增产物达到阈值线时 : C(t) value

PCR引物设计原则

PCR引物设计原则 引物(Primer)是人工合成的两段寡核苷酸序列。 1、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、G十C含量：应在40%-60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm 值引物的Tm值减去5-10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4(G十C)十2(A十T)。 3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发. 4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构. 5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。引物3’端最好选T，错配的几率与A 相比大大的降低了。G、C之间错配的概率小于A、T. 6、引物的5’端可以修饰，而3’端不能进行修饰。5’端的修饰包括：加酶切位点，标记生物素，荧光，地高辛、Eu3+等，引入蛋白质结合的DNA序列，引入点突变，插入突变、缺失突变序列、引入启动子序列。因为引物的延伸是从3’端开始的，因而3’端不能进行任何修饰，另外3’端也不能有形成任何二

级结构的可能。 如何设计引物 不同的核苷酸序列表达的氨基酸氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。 引物最好在模板cDNA的保守区域内设计（DNA的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对（Alignment）,各基因相同的序列就是该基因的保守区）。 PCR引物设计 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。 引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）* vOligo6 （引物评价） vVector NTI Suit vDNAsis vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在线服务）

探针的设计原则

实时荧光Taqman 探针设计的几个要点 实验室很多同学都要做Real time PCR实验，实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见，不过也有实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、 引物的设计及评价。 荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信 标Molecular Beacon。 广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号 的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 (请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T 的模板可以区分得更为理想。 Taqman探针法已经得到广泛使用，不过有人认为这种技术利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，难 于做质控检测。 Real time PCR Taqman探针设计、实时多重PCR探针的选择和引物的设计及评价 一、实时荧光Taqman探针设计 总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的 片段是保守的。

引物设计原则必看

mi引物设计原则 1、引物的长度一般为15-30 bp,常用的就是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其就是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。 3、引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其她3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。 4、引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T),在Oligo软件中使用的就是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6、ΔG值就是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低(绝对值不超过9),而5’端与中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7、引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4、5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8、对引物的修饰一般就是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都就是写成5-3方向的, Tm之间的差异最好控制在1度之内, 另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链就是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不

PCR引物设计原理及原则

PCR引物设计原理及原则 PCR引物设计原理 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。 让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。 ⑩引物3′端要避开密码子的第3位。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量

两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则

两种定量分析方法的比较及Taqman探针、引物设计原则 遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA（mRNA）,携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行；在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化 荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保 证回归系数大于0.99。 CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 C(t) value 扩增曲线阈值及CT值 荧光定量PCR 的数学原理

U6_5S_miRNA 引物探针设计

内参 1.RNU6 Homo sapiens RNA, U6 small nuclear 1 (RNU6-1), small nuclear RNA NR_004394.1 ORIGIN 1 gtgctcgcttcggcagcacatatactaaaattggaacgatacagagaagattagcatggc 61 ccctgcgcaaggatgacacgcaaattcgtgaagcgttccatatttt RNU6-F CTCGCTTCGGCAGCACA RNU6-R AACGCTTCACGAATTTGCGT 2.5S Homo sapiens RNA, 5S ribosomal 2 (RNA5S2), ribosomal RNA NR_023364.1 ORIGIN 1 gtctacggccataccaccctgaacgcgcccgatctcgtctgatctcggaagctaagcagg 61 gtcgggcctggttagtacttggatgggagaccgcctgggaataccgggtgctgtaggctt 121 t 5S-F TCTCGTCTGATCTCGGAAGCTA 5S-R GCGGTCTCCCATCCAAGTA

MiRNA 方案1 Universal Reverse primer TGGTGTCGTGGAGTCG 方案2 Universal Reverse primer GTGCAGGGTCCGAGG

1.hsa-miR-122 序列：uggagugugacaaugguguuug 长度：22 2.Hsa-miR-16 序列：uagcagcacguaaauauuggcg 长度：22 3.hsa-mir-93 序列：caaagugcuguucgugcagguag 长度：23

引物设计原则

引物设计原则： 引物的3’端决定着PCR反应产物的特异性，而5’端限定着PCR产物的长度。 （1）引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。 在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配，特别是3’ 端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。 （2）引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配，降低特异性，而太长也会降低特异性，并且影响PCR反应效率。 引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的 互补。 （3）引物的碱基应尽可能随机分布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量在40%~75%之间，且上下游引物序列GC含量的差异不要 太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或 C。DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减 （4）引物的内部应避免形成稳定的引物二聚体和发夹结构，特别是引物的末端应无回文结构。上下游引物不应有互补序列，特别是3’端应避免 互补，以免形成引物二聚体。 （5）如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。 而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。（6）5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物。 （7）引物3’端的头1~2个碱基会影响T aqDNA聚合酶的延伸效率，从而影响PCR反应的扩增效率及特异性。一般的PCR反应中，引物3’末端 的碱基最好选T、C、G而不选A，A错配时会影响合成效率。 （8）引物3’端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码子少的氨基酸如Met、Trp，且避免三联体密码第三个碱基的摆动未知位于引物的3’端。3’ 端不应终止于密码子的简并碱基。

定量PCR Taqman探针设计要领

定量PCR+Taqman探针设计要领 自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR 荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。 一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。 第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA 或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DN***段重叠的情况）内。 第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则： 总体原则 * 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 * 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。* 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。 * 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。 * 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G） * 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。 引物设计原则 * 序列选取应在基因的保守区段 * 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构 * 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 * Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% * 引物之间的TM相差避免超过2℃ * 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 * 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 * Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp