GAPDH内参抗体,抗GAPDH单抗,GAPDH小鼠源单克隆抗体

https://www.sodocs.net/doc/166212207.html, GAPDH内参抗体，抗GAPDH单抗，GAPDH小鼠源单克隆抗体

Anti-GAPDH Mouse Monoclonal Antibody （ 2B5）

在Western Bloting实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确，或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参，比如内参GAPDH的含量来进行校正。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。 GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。

应用类型：WB（1:1000-1:10,000）、IHC（1:100-1:800）

Fig.Western blot analysis (1:10,000) of GAPDH expression in Rat brain (lane A), HeLa cell lysate (lane B), Mouse brain (lane C), Rabbit muscle (lane D), Chicken muscle (lane E) and Pig heart (lane F) with Anti-GAPDH mouse monoclonal antibody (2B5).

https://www.sodocs.net/doc/166212207.html, 免疫原：KLH偶联的GAPDH部分多肽序列

来源宿主：小鼠

反应性：该GAPDH内参抗体可识别人、小鼠、兔、大鼠、猴、狗、鸡、猪和绵羊等种属的GAPDH蛋白。

保存建议：能在-20℃保存1年。为最大限度的避免损失，请在打开管盖之前融化抗体并离心。建议使用前分装以避免反复冻融，分装后可在4℃保存1个月。

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH 作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。

如何选择合适的GAPDH抗体？

内参抗体虽然选择较多，但是也需要遵循一定的原则，并契合实际的应用要求。首先，需要考虑目的蛋白的大小，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参，由于GAPDH的检测分子量大约在36kD，因此该内参抗体不是很适合用于检测30kD-40kD大小目标蛋白的WB实验中。另外，不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。

western内参GAPDH

刚开始接触western，看了很多和内参有关的资料，越来越迷惑。 请教园子里的高手：1 内参的主要作用是什么，是必须的吗? 2 内参是和样品一起加，还是单独加，抗体孵育时是分着加，还是一起，条件一致吗？3 单是证明是否样品中存在某蛋白，不用内参可以吗？ 请赐教！ 1、在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的 操作误差；这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的GAPDH 的含量来进行校正，所以一般的western实验都需要进行内参设置。具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH 含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。然后才进行样品与样品之间的比较。 所以有时候要用内参 2、和一抗一起加，按照内参的比例加 3、可以不用加内参 1.内参是样品中本身就有的，有其一定的分子量。一抗.二抗时得分开孵育。 2.只是定性的话不需要加内参 Western Blot除了能证明某样品中含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少。即为蛋白表达水平最直接的证据。 要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。内参的意义就是保证上样量的一致。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。如果内参的条带亮度基本一致，那么就可以认为上样量也基本一致。 常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。最近发现tubulin的表达水平比其它看家基因更加恒定。因此人们越来越多的使用tubulin做为内参。 在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有： 一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。 二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。 三、（也是我们实验室用的方法）当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。 很感谢大家的帮助，现在总算明白了一些

抗体纯化的方法有哪些

抗体纯化的方法有哪些？ 抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的 硫酸铵沉淀法： 基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。 适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白； 3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐； 4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含0.02%叠氮钠）缓冲液洗脱； 5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度； 6.抗体保存浓度在0.1-30 mg/mL适宜，-20℃保存不超过一个月，避免反复冻融。 亲和层析法 基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍：protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁，分子量42 kDa，由spa 基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域

protein A的各个结构域 protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，猕猴，鼠类IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主，表达产物仍含有五个Fc结合结构域。对其结构上的改造主要是为了增加与多孔性材料的偶联性能，也有的改造protein A含有四个或六个同型Fc结合结构域，另外结构域数目较少的protein A能得到更好的抗体纯化效果。 protein G分离自G Streptococcus的细胞壁，分子量65 kDa，由spg基因编码，可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点仅仅保留Fc结合结构域，其结合力较protein A更强。 protein G的B结构域 protein G的各个结构域 还有一种protein A/G蛋白，是基因工程改造产物，是将protein A的4个Fc结合结构域与protein G的2个Fc结合结构域融合表达得到的。protein A/G结合了二者的特性，能结合人和鼠的IgG所有亚型，不结合鼠的IgA、IgM。 ①proteinA亲和层析 适用于：人（IgG3除外）、兔、豚鼠、猪的抗体； 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.调节pH到8.0：腹水以10倍体积pH8.0 PBS稀释、培养上清用pH8.0 PBS透析或强氧化钠调节； 3.过proteinA琼脂糖凝胶柱，pH8.0 PBS洗杂； 4.柠檬酸缓冲液洗脱抗体（小鼠IgG1用pH6.5，IgG2a用pH4.5，IgG2b和IgG3用pH3.0），并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液； 5.用PBS透析；

人源化抗体

人源化抗体 人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体通过基因克隆及DNA重组技术等进行改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，同时又降低了其异源性，有利应用于人体。然而，即使通过嵌合抗体技术把C区替换，人源化抗体V区的互补决定区（CDR）和框架区（FR）也仍有可能诱导相当强的抗体反应。因此，研究者开始着手将部分CDR和FR区也改造为人抗体序列，以便能进一步提高抗体的人源化程度，降低药物抗体反应发生的可能。经过数年的研究和改进，人们已经创建并完善了以重构抗体、表面重塑抗体、去免疫化抗体和链替换抗体等为代表的多种人源化抗体技术。 人源化抗体技术 重构抗体 重构抗体是由异源抗体中和抗原结合相关的残基与人抗体重新剪接构建的抗体，包括互补决定区移植、部分互补决定区移植和特定决定区转移。构建重构抗体的流程：①克隆分析亲本鼠单抗的V区基因，确定CDR和FR区；②通过数据库检索比对及辅助计算机分子模拟等，找出有最大同源性的人FR 区模板；③确定需要保留和改变的关键残基，经基因合成、真核表达、检测实际结合效果后，对需要保留和改变的关键残基进行相应的修正；④最终获得高亲和力的、具有与亲本鼠单抗相同抗原结合表位的人源化抗体。 表面重塑抗体 表面重塑抗体是通过对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造而获得的人源化抗体。表面重塑抗体的库构建流程：①首先在结构数据库中寻找鼠源的最大同源性蛋白，利用相应的软件并采用分子三维结构分析的方式确定表面残基的位置；②在公用数据库中寻找最大同源性的人抗体序列，在相应的表面残基位置上尝试替换为相应的人抗体残基（替换中要兼顾考虑被替换残基的侧链匹配情况和与CDR是否在空间上紧邻）；③确定替换后的残基种类，即可采用定点突变或基因合成等方法获得

Western Blotting中使用内参

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定*分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳*啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活*的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定*的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。 内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。 内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确*。 在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限*，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比*。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting 实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。 在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。

抗体纯化

一、抗体纯化部分 1、腹水/血清的亚型测定完成后，IgG亚型的腹水/血清使用Protein G 抗体纯化柱纯化；IgM 亚型的腹水/血清则使用饱和硫酸铵沉淀法沉淀。 1.1 Protein G 抗体纯化步骤： （1）新柱子先用DDW 5ml过柱； （2）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （3）抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上； （4）继续10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （5）5倍柱体积甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入Tris-HCI(pH 9.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性； （6）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （7）5倍柱体积20%乙醇溶液过柱，于4℃条件下保存纯化小柱； （8）将洗脱的抗体用聚乙二醇浓缩并透析，以彻底去除不相干离子。 其中所用试剂配方： DDW：超纯水 Binding Buffer（100ml）：A液，0.2M磷酸氢二钠61ml B液，0.2M磷酸二氢钠39ml 磷酸氢二钠4.37g 磷酸二氢钠1.22g 甘氨酸-盐酸缓冲液：0.1M甘氨酸溶液加浓盐酸调pH 2.7 Tris-HCL缓冲液：1M Tris溶液加浓盐酸调pH 9.0 1.2 饱和硫酸铵沉淀法步骤： （1）配制饱和硫酸铵溶液，再用氨水调节pH至8.5 （2）沉淀：a、腹水/血清离心去除细胞碎片，保留上清液并测定体积； b、边搅拌边逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋白充分沉淀； c、上述蛋白质溶液经过离心弃上清取沉淀，并用PBS溶液（pH 7.0）溶解； d、继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋 白充分沉淀； e、继续离心沉淀弃上清去沉淀，用PBS溶液（pH 7.0）溶解； （3）透析：每隔3-6小时换一次透析液，以彻底去除硫酸铵。 其中所用试剂配方： PBS缓冲液（1L pH 7.0）：氯化钾0.2g 磷酸二氢钾0.2g 磷酸氢二钠3.35g 氯化钠8g

人源化单克隆抗体的构建技术

人源化单克隆抗体的构建技术 摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。 关键词：人源化，单克隆抗体，构建 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1]，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。 1 嵌合抗体的构建 抗体分子与抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）。将小鼠单克隆

Western Blot内参选择

Western Blot内参选择 要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。 虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。 良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)、空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照)、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。 内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot 比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。

GAPDH内参抗体,抗GAPDH单抗,GAPDH小鼠源单克隆抗体

https://www.sodocs.net/doc/166212207.html, GAPDH内参抗体，抗GAPDH单抗，GAPDH小鼠源单克隆抗体 Anti-GAPDH Mouse Monoclonal Antibody （ 2B5） 在Western Bloting实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确，或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参，比如内参GAPDH的含量来进行校正。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。 GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。 应用类型：WB（1:1000-1:10,000）、IHC（1:100-1:800） Fig.Western blot analysis (1:10,000) of GAPDH expression in Rat brain (lane A), HeLa cell lysate (lane B), Mouse brain (lane C), Rabbit muscle (lane D), Chicken muscle (lane E) and Pig heart (lane F) with Anti-GAPDH mouse monoclonal antibody (2B5).

https://www.sodocs.net/doc/166212207.html, 免疫原：KLH偶联的GAPDH部分多肽序列 来源宿主：小鼠 反应性：该GAPDH内参抗体可识别人、小鼠、兔、大鼠、猴、狗、鸡、猪和绵羊等种属的GAPDH蛋白。 保存建议：能在-20℃保存1年。为最大限度的避免损失，请在打开管盖之前融化抗体并离心。建议使用前分装以避免反复冻融，分装后可在4℃保存1个月。 GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH 作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。 如何选择合适的GAPDH抗体？ 内参抗体虽然选择较多，但是也需要遵循一定的原则，并契合实际的应用要求。首先，需要考虑目的蛋白的大小，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参，由于GAPDH的检测分子量大约在36kD，因此该内参抗体不是很适合用于检测30kD-40kD大小目标蛋白的WB实验中。另外，不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。

HA标签抗体,抗HA单抗,HA小鼠源单克隆抗体

https://www.sodocs.net/doc/166212207.html, HA标签抗体，抗HA单抗，HA小鼠源单克隆抗体 Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody （ 4F6） HA标签系统利用一个HA (流感病毒血凝素，influenza hemagglutinin epitope: YPYDVPDYA)短肽肽融合到目标蛋白。HA标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于多种细胞类型，相应的HA标签抗体也被广泛应用。HA 标签抗体能特异识别C末端或N末端带有HA标签(HA-tagged)的融合蛋白，也可以用于检测和HA tag融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测HA tag融合表达蛋白等。 应用类型：WB（1:1,000-1:10,000）,IF（1:500-1:2,000）,IP（1:200-1:500）。 Fig.1.Immunofluorescence staining (1:2,000) of HA fusion protein in 293 cells with red and counterstained with DAPI.

Fig.2.IP (1:200) - WB (1:5,000) analysis of HA fusion protein expression in 293 cells. Untransfected 293 cell lysate (lane A), transfected 293 cell lysate with HA-tag protein (lane B); IP untransfected 293 cell lysate with Anti HA tag mAb (lane C); IP transfected 293 cell lysate with normal Mouse IgG (lane D), or with Anti HA tag mAb (lane E), and IP transfected 293 without both normal Mouse IgG and HA tag mAb (lane F). 免疫原：KLH偶联的HA标签YPYDVPDYA多肽序列 来源宿主：小鼠 反应性：该HA标签抗体可识别在细胞内表达的HA标记重组蛋白，包括HA位于氨基末端、中段以及羧基末端的重组蛋白。 保存建议：能在-20℃保存1年。为最大限度的避免损失，请在打开管盖之前融化抗体并离心。建议使用前分装以避免反复冻融，分装后可在4℃保存1个月 选择合适HA标签抗体需要考虑的因素 在选择一个标签抗体时，主要根据自己实验应用上的需要。这里需要考虑的因素包括，HA 抗体的应用检测类型、HA抗体的克隆性及制备来源等。比如该HA抗体是否能用于免疫荧光IF的检测？是否可以用于Western Bloting和免疫沉淀IP实验？是否需要特异性更好的单克隆HA标签抗体？还是一个兔来源的HA多抗更合适？ https://www.sodocs.net/doc/166212207.html,

常见内参基因

β-A c t i n Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、 β-Actin 移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletalmuscleactin，α-cardiacmuscleactin，α-smoothmuscleactin，和 γ-smoothmuscleactin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和 γ-non-muscleactin。不同的actin之间同源性大于90%，但在N-terminal同源性仅50%-60%，因此N-terminal常被用作actin的抗原。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。 β-Actin用途 β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是WesternBlot很好的内参指数。内参即是内部参照（InternalControl），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH （glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）等。因此β-Actin抗体、β-Tubulin抗体以及GAPDH抗体成为最常见的三个动物细胞内参抗体。β-Actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。Beta-actin 由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。 β-actin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微丝结构。在用作Western的参照时，Actin抗体和Tubulin抗体的主要不同之处在于两者所识别蛋白的分子量不同，这样可以选择合适的参照在同一块胶同一张膜上实现同时检测目标蛋白和参照蛋白。 GAPDH GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家（housekeeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提totalRNA，poly(A)+RNA，Westernblot等实验操作的标准化的内参。 GAPDH结构图

抗体纯化大全资料

抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵（NH4）SO4 ·饱和硫酸铵溶液（SAS） ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS） 将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25°C）； 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；

二、沉淀 1、样品（如腹水）20 000′g 离心30 min，除去细胞碎片； 2、保留上清液并测量体积； 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）； 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min（4°C）。弃上清保留沉淀； 2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)； 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）； 3、3000′g 离心30 min（4°C），保留上清液； 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨； 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的； 二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）； 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献 1、Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk. Hybridoma

核内参PCNA抗体

核内参PCNA抗体-用于细胞核内参的PCNA单抗 增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen简称PCNA）由Miyachi等于1978年在SLE（系统性红斑狼疮）患者的血清中首次发现并命名，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名。PCNA是一种分子量为36KD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶的辅助蛋白。由于其在细胞核内稳定表达，因此其抗体被广泛应用于细胞核蛋白的内参抗体。 如何选择合适的细胞核内参抗体？ 常用的细胞总蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等。对于一些植物的样本，则需要特别的植物Actin蛋白作为内参。当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用组蛋白H（Histone H），或者增殖细胞核抗原（PCNA）等为核内参抗体。除了这些，其它常见的核蛋白内参还有K70, K80, Lamin A和B，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c-Fos等都有使用。但是需要注意的问题是核蛋白内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。 另外，我们还需要根据目的蛋白的大小选择合适的核内参，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参。PCNA的检测分子量大约在28kD，而Histone H3的检测条带大约在18kD，因此PCNA比较适合用于检测目标蛋白在较大的WB实验，而Histone H3则不适合用于13kD-23kD大小的目的蛋白内参。另外，虽然PCNA是最合适的核内参抗体之一，但是在某些条件下，一些影响增殖的因素会导致样品间PCNA含量的变化，就不适合作为内参。

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抗体纯化大全

抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵（NH4）SO4 ·饱和硫酸铵溶液（SAS） ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS） 将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25°C）； 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；

二、沉淀 1、样品（如腹水）20 000′g 离心30 min，除去细胞碎片； 2、保留上清液并测量体积； 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）； 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min（4°C）。弃上清保留沉淀； 2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)； 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）； 3、3000′g 离心30 min（4°C），保留上清液； 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨； 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的； 二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）； 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献

人源化单克隆抗体的研究进展

论人源化单克隆抗体的研究进展 *** （生物工程一班生命科学学院 ***大学哈尔滨 150080） 摘要：自从单克隆抗体问世至今已广泛应用与临床治疗，然而鼠源性单克隆抗体在临床治疗中会产生人抗鼠抗体反应，从而使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制。随着基因工程技术和抗体工程技术的迅速发展，人源性单克隆抗体开始快速发展而逐渐代替鼠源性单克隆抗体。本文将就人源化单克隆抗体的构建以及其在临床治疗方面的应用进行综述。 关键词：单克隆抗体人源化临床治疗 Theory humanized monoclonal antibody research progress *** (The 1st class of Bioengineering , College of Life Science, *** University, Harbin, 150080) Abstract: Since the advent of monoclonal antibody has been widely applied in clinical treatment, but the mouse source sex monoclonal antibodies in clinical treatment will produce people resistance to mouse antibody response, so that the rat source sex monoclonal antibody application are highly limited. Along with the genetic engineering technology and the rapid development of antibody engineering technology, humanized sex monoclonal antibody began to rapid development and gradually replaces the rat source sex monoclonal antibody. This paper will review humanized monoclonal antibody construction and the application of clinical treatment in this article. Keywords: monoclonal antibody humanized clinical treatment 1975年。Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞机能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术[1]，此后单抗药物开始迅速发展并广泛应用于临床。1982年，Philip Karr 将第一株抗独特型单抗(anti- ld) 应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功[2]，使得治疗性抗体的研究很快成为生物医药的热点，许多以单克隆抗体为研究对象的公司相继成立。然而，鼠源性单克隆抗体应用于人类有较强的免疫原性，能诱发人抗鼠抗体( Human ant-i mouse antibody, HAMA) 反应，引起强烈的免疫排斥反应[3]，而且鼠源性单克隆抗体不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用。这使研究学者意识到研制鼠源性单克隆抗体人源化或完全的人源性抗体才有可能减少或避免HAMA反应并提高疗效。然而反复实验证明, 杂交瘤技术不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。直到80年代末期，随着分子生物学研究的深入，在抗体基因工程研究领域相继出现了一

PH1498 Western Blot一抗二抗去除液实验使用方法与步骤

PH1498|Western Blot一抗二抗去除液（中性） Western Blot Stripping Buffer（Neutral） Catalog No：PH1498Size：?250mL Store at4℃ 去除液简介 Western Blot一抗二抗去除液（Stripping buffer）可以充分去除结合在印迹膜上的一抗和二抗，使同一张膜可进行多次抗体检测，无需反复电泳和转膜，节省样品和时间，适用于使用NC或PVDF膜进行Western Blot检测时条件的优化或同一样品不同蛋白的检测。 本品经过多个抗体的检测试验，通常可以重复利用3次，每次大约只需15-30min，并且在室温条件下就可以进行。 本类型Western一抗二抗去除液主要在去除结合的一抗二抗的原理方面略有不同。分别依靠去垢剂、酸性、碱性、还原剂、螯合剂、盐浓度以及一些特殊试剂等的不同组合来解除一抗二抗的结合，同时又不会导致转移到膜上的蛋白的损失。 试剂保存 4℃保存，一年有效，如长期不用请放置-20℃保存。 使用参考 1.在完成Western化学发光检测后，用蒸馏水或TBST缓冲液漂洗5-10min。 2.弃蒸馏水，加入适量的Western一抗二抗去除液（中性），至少需把膜完全覆盖。在摇床上室温缓慢漂洗25min左右（漂洗时间应根据不同的目的蛋白来调整：比如内参抗体等表达量较高的蛋白，可以延长漂洗时间至30min）。 3.弃Western一抗二抗去除液，用蒸馏水或TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，室温振摇。 4.剥脱后的膜加入封闭液进行封闭，进行下一轮的WB实验。 注意事项 1、用辣根过氧化物酶(HRP)，任何一次封闭(blocking)都应当使用5%脱脂牛奶，如果使用碱性磷酸酯酶，任何一次封闭都应当使用酪蛋白(casein)。 2、本Western一抗二抗去除液仅适用于PVDF膜。用于硝酸纤维素膜时会导致转移到膜上的蛋白有非常显著的损失。 3、使用ECL等类似的化学发光试剂进行的Western检测适用本试剂。使用非化学发光试剂进行的Western检测，例如DAB，NBT/BCIP，不适用于本试剂。 4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 孵育内参抗体GAPDH后用ECL发光液曝光20s。用本试剂剥脱25min后孵育内参抗体β-actin,ECL发光液曝光20s

Western blot内参问题

Western blot内参 要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小）、空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot 往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。 然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋