RT-PCR实验步骤

RT-PCR实验步骤

一、总RNA提取

1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4. 12000×g，4℃离心，15min。

5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀

8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。

9. 7500×g，4℃离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280

12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。

二、逆转录合成cDNA第一链

反应体系如下

混匀快速离心一次反应条件如下

-20℃ 冰箱冻存三、PCR反应

混匀快速离心一次反应条件如下

PCR产物-20℃冰箱保存

取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。

RT-PCR实验方法总结1,2

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。

要求：

1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2. RT按要求做，一般不会出太大问题。

3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须

在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？https://www.sodocs.net/doc/1d10627894.html,

问题：

在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）

从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！

解答：

1.RT-PCR有两种做法：

条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR 的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。

2.RT-PCR应具备的条件

高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应

考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。

3.RACE

我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无

RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。

有关内参：

RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。

问：我曾经作过同一管的PCR，内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？

答：it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.

在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。

关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。

有关内参的建议：

一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的

电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR 管和taq。

关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单*改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了，再开始的

时候酸的是切线，这图我在*** 帖过。

关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。

引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。

我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？

18s 的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA 为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。18s除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。

PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。

正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。

有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？

原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。

我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。

记得我开始我的ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制

请问：

1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？

2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？

3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？

一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.

20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.

如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA 制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。

在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA 酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

一、防止RNA酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。

4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

二、常用的RNA酶抑制剂

1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA 酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

mRNA的分离与纯化

真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly （A+）表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

一、总RNA提取

1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4. 12000×g，4℃离心，15min。

5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀

8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。

9. 7500×g，4℃离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD

260/OD

280

12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。

二、逆转录合成cDNA第一链

反应体系如下

混匀快速离心一次

反应条件如下

-20℃ 冰箱冻存

三、PCR反应

混匀快速离心一次

反应条件如下

PCR产物-20℃冰箱保存

取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。

化学实验室常见仪器的名称及功能

一、常见仪器的分类 一般根据仪器的主要用途的不同，可将常见化学实验仪器分为下列8类： （一）计量类 用于量度质量、体积、温度、密度等的仪器。这类仪器中多为玻璃量器。主要有滴定管、移液管、量筒、量杯等。 （二）反应类 用于发生化学反应的仪器，也包括一部分可加热的仪器。这类仪器中多为玻璃或瓷质烧器。主要有试管、烧瓶、蒸发皿、坩埚等。（三）容器类 用于盛装或贮存固体、液体、气体等各种化学试剂的试剂瓶等。（四）分离类 用于进行过滤、分液、萃取、蒸发、灼烧、结晶、分馏等分离提纯操作的仪器。主要有漏斗、分液漏斗、蒸发皿、烧瓶、冷凝器、坩埚、烧杯等。 （五）固体夹持类 用于固定、夹持各种仪器的用品或仪器。主要有铁夹、铁圈、铁架台、漏斗架等。 （六）加热类 用于加热的用品或仪器。主要有试管、烧杯、烧瓶、蒸发皿、坩埚等。 （七）配套类

用于组装、连接仪器时所用的玻璃管、玻璃阀、橡胶管、橡胶塞等用品或仪器。 （八）其它类 不便归属上述各类的其它仪器或用品。 二、中学化学常见仪器的名称和使用 （一）计量仪器 1．量杯 量杯属量出式（符号Ex）量器，它用于量度从量器中排出液体的体积。排出液体的体积为该液体在量器内时从刻度值读取的体积数。 量杯有2种型式。面对分度表时，量杯倾液嘴向右，便于左手操作，称为左执式量杯。倾液嘴向左，则称为右执式量杯。250 mL以内的量杯均为左执式，500 mL以上者，则属于右执式。 2．温度计 温度计是用于测量温度的仪器。其种类很多，有数码式温度计，热敏温度计痔。而实验室中常用为玻璃液体温度。 温度计可根据用途和测量精度分为标准温度计和实用温度计2类。标准温度汁的精度高，它主要用于校正其它温度计。实用温度计是指所供实际测温用的温度计，主要有实验用温度计、工业温度计、气象温度计、医用温度计等。中学常用棒式工业温度汁。其中酒精温度计的量程为100℃，水银温度计用200℃和360℃2种量程规格。 使用注意事项

RT-PCR的实验原理与操作步骤复习课程

R T-P C R的实验原理与 操作步骤

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 (一) 反转录酶的选择 1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和 SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。 (二) 合成cDNA引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA 在数量和复杂性方面均要小。 3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。生物科研https://www.sodocs.net/doc/1d10627894.html, 二、实验耗材与试剂 1．RNA提取" target="_blank" >RNA取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒

qPCR实验操作流程

Q-PCR实验流程 一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打 开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。 二、总RNA抽提 1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min； 组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称） 2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致） 3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层） 4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min； 5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清； 6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不

RT-PCR实验方法总结大全.

RT-PCR实验方法总结大全 RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。 要求: 1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng 或1ug。 2. RT按要求做,一般不会出太大问题。 3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA 存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须 在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和c:特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理论上,还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢?https://www.sodocs.net/doc/1d10627894.html,问题: 在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢?请高手指教! 解答: 1.RT-PCR有两种做法:

条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。(promega。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE;引物的(最好产物短点;若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样;体系的均一性等。 3.RACE 我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico,但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法,而另一个基因的3’UTR 却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故,我都快绿了,有无 RT-PCR的常用内标b-actin 和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。 有关内参: RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些,最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。 问:我曾经作过同一管的PCR,内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍。请教mxbdna2003 ,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度? 答: it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just

QPCR原理及应用

QPCR原理及应用 由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman 技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR

化学实验室功能简介

化学实验教学中心功能 根据学校教务处和设备处等相关部门的指导性意见，配合学院发展的需要，原材料科学与化学工程学院的中心实验室更名为化学实验教学中心，并设立三个分实验室：基础化学实验室、专业化学实验室、理化检测中心，共同承担了教学、科研、地方服务的任务。各分实验室的主要功能分述如下： 基础化学实验室： 本分室主要承担校级公共平台（生命、环境、医学等专业）化学实验类课程、院内化学专业和应用化学专业的基础化学实验类课程的教学工作，包含大学化学、普通化学、无机及分析化学、无机化学、分析化学、有机化学、物理化学、仪器分析等实验课程。 其中，大学化学实验课程面向07年学校大类平台招生改革而设置，给自然科学大类的一年级学生开设。普通化学实验课程为工科类一年级学生开设。无机及分析化学实验、有机化学实验为生命类和医学类一年级学生开设。这四门实验课程所开设的实验项目以无机化学和分析化学相关的基础项目为主，包含少量的简易综合性和趣味性实验，以培养学生宽基础的知识体系和实验能力，并辅以激发学生的学习兴趣。 无机化学、分析化学、有机化学、物理化学的实验课程为学院内本科生的基础课程。同时承担基础实验教学、开放实验和学生毕业论文设计实验，其开出的实验项目分为基础性、综合性和设计性三个层次，部分包含选做实验，根据不同的教学情况进行选择。分述如下：无机化学实验是化学专业学生的第一门必修的、独立的基础实验课。它是以实验为手段来研究无机化学中的重要理论、典型元素及其化合物的变化规律，以及相应的仪器、装置、基本操作的一门课程。着力于培养学生具有宽广的基础知识和熟练的基本技能、能够适应未来社会发展需要的专业人才。教学内容着眼于为学生今后的学习发展奠定基础。学生在学习无机化学专业理论知识的同时，通过实验研究活动，学习和掌握无机化学专业的基本实验技术，研究元素的单质及其化合物的重要性质，熟悉重要无机化合物的制备方法；加深理解和掌握无机化学基本理论和基础知识；比较牢固地掌握化学实验的基本知识和操作技能；培养学生严谨的科学态度；培养学生准确观察化学反应现象，处理实验数据的能力，达到训练学生基本理论知识的综合应用能力；培养学生分离、分析与鉴别物质，合成、制备物质及将所学知识与生产实际结合起来的能力。 通过分析化学实验的学习，学生可以掌握定量化学分析及可见吸光光度分析和部分仪器分析实验的基本知识、基本操作和典型的分析方法；通过实验加深对有关理论的理解，并能灵活运用所学的理论知识指导实验设计与操作；确立“量”的概念、“相对误差”的概念和“有效数字”的概念；培养严谨的科学作风和良好的实验素养，激发实验兴趣和探索精神，提高分析问题和解决实际问题的能力。 有机化学实验是化学专业本科的一门基础实验课程。其主要目的是：通过有机化学实验验证、巩固和深入理解所学的有机化学理论知识；通过实验，使学生正确地掌握基础化学实验的基本操作方法和技能技巧，培养学生独立工作和独立思考的能力，养成严谨的科学态度和良好的科学思维方法。为后续课程的学习、为培养合格的化学教学工作者和化学化工技术人才打下扎实的基础。 通过物理化学实验课程的学习，使学生巩固物理化学理论课中所学习的基本概念、基本理论；掌握通用仪器的基本操作，掌握物理化学中常用的基本实验方法和实验技能，为学生今后做专业基础实验，专业实验和毕业论文打下坚实的基础。

PCR扩增实验操作步骤

PCR扩增反应 一、实验原理 PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。 PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝。 变性 退火 延伸 图反应历程

二、实验材料 1·模板：细菌DNA 2·TsgDNA聚合酶3·dNTP混合液 4·10倍浓度PCR缓冲液5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂 三、操作步骤 1．细菌染色体DNA的提取（见上一组） 3·反应程序： 将RAPD反应试剂加入EP管中 轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子 打开PCR反应仪输入以下反应数据 ●94 摄氏度预变性5min ●94摄氏度变性40s ●40摄氏度退火40s ●72摄氏度延伸1min 将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min 仪器为Model MyGene 25 Plus 三、注意事项 1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性 及全部放入反应体系中。 2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂 时都要换新的灭菌Tip尖。 3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。 4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。 5.引物条件首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚 体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

化学实验室实验室简介

民勤县第三中学化学实验室简介 民勤三中现有化学实验室1个，其中仪器室1个，准备室一个，学生实验室2个。各室的水电到位，布局合理，有防火、防盗、换气设备，双人双锁管理，仪器设备按省级标准配置齐全。实验室完全达到两名学生一组进行分组实验的条件。 实验室设有演示台，供电到位，实验室的演示台和学生实验桌采用防酸碱阻燃面板，长、宽、高及材质符合要求。教师演示台有电源总控制设备，集中控制学生实验电源，配有触电保护器。化学实验室演示台和学生实验桌旁设置水槽，实验室内悬挂有名言警句。仪器室与实验室毗邻设置，配备满足仪器存放的仪器橱。对危险品和毒品有完整的管理和领用制度，配有准备台、工具箱（常用类）等。所有仪器按配备标准顺序上架、入柜。教学演示实验及学生分组实验能全部开出。此外，学校还经常及时增补教学实验材料及仪器设备，满足教师演示及学生分组实验的需求。所有实验室采光良好，灯管垂直黑板安装；保持自然通风。 实验室实物流水账、管理明细账记录规范；仪器存放、分类、编号、贴签入柜，摆放科学有序，存取方便；药品、仪器分室存放。 实验教学坚持做到期初有计划、期末有总结，各项制度、实验员工作职责都张贴在墙上，以便经常对照学习。实验的周计划，每学期初就公布上墙，做到合理安排，一周工作早知道。学生进入实验室必须遵守学生实验规则，实验结束要填好实验记录单。仪器损坏按有关制度赔偿。各室登记台帐，既有电子台账，又有纸质台账，做到帐、

物、卡相符，并及时做好新增仪器的登记和仪器的报损工作。实验室工作以教学为中心，以提高教学质量为目的，加强实验教学环节。保证紧密配合教学工作。服务教学一线，结合新课程要求，开足开齐演示实验、学生实验和探究性实验，演示实验开出率达100%，分组实验的开出率达85%以上。

实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul

(待分)rtpcr原理和实验步骤

原理与实验步骤 一、知识背景： 、基因表达： 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因个丝心蛋白（每个存活，可以合成个丝心蛋白）共合成个丝心蛋白。因此单拷贝基因的表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 、技术( )：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促反应，其特异性由两我工合成的引物序列决定。反应分三步： .变性：通过加热使双螺旋的氢键断裂，形成单链。 .退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 .延伸：在聚合酶和及＋存在下，退火引物沿’’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 、逆转录酶和 逆转录酶（）是存在于病毒体内的依赖的聚合酶，至少具有以下三种活性： 、依赖的聚合酶活性：以为模板合成第一条链。 、水解活性：水解杂合体中的。 、依赖的聚合酶活性：以第一条链为模板合成互补的双链. 二、的准备： .引物的设计及其原则： ) 引物的特异性决定反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的剪切方式以及可能存在的对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 ) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括 : 、引物长度:一般为～，引物太短会影响的特异性，引物太长的最适延伸温度会超过酶的最适温度，也影响反应的特异性。 、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现个以上的单一碱基。含量（值）：％～％，扩增的复性温度一般是较低值减去～度。 、’端要求：’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是时错配的引发效率最低，、居中间，因此引物的’端最好选用、、而尽可能避免连续出现两个以上的。 、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于个连续碱基互补，’端不应超过个。、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续个的互补碱基存在。 、’端无严格限制：’末端碱基可以游离，但最好是或，使产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如，等对于这些条件都可以自行设置。 、耗材：

RT-PCR实验步骤

RT-PCR实验步骤 一、总RNA提取 1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。 2. 震荡30s。 3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。 4. 12000×g，4℃离心，15min。 5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。 6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。 7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀 8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。 9. 7500×g，4℃离心，10min。 10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。 11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280 12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。 二、逆转录合成cDNA第一链 反应体系如下

混匀快速离心一次反应条件如下 -20℃ 冰箱冻存三、PCR反应 混匀快速离心一次反应条件如下

PCR产物-20℃冰箱保存 取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。 100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。 RT-PCR实验方法总结1,2 RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须 在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？https://www.sodocs.net/doc/1d10627894.html, 问题： 在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来） 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！ 解答： 1.RT-PCR有两种做法： 条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR 的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应

RT-PCR的实验原理与操作步骤

提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 （一）反转录酶的选择 1. Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活 性相对较弱。最适作用温度为37 C。 2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。 最适作用温度为42 C。 3. Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录 酶：在Mn2存在下，允许高温反转录 RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript U。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一 特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。 （二）合成 cDNA 引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝 其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。 用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源 于 rRNA。 2. Oligo(dT) ：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有

化学实验室常见仪器的名称及功能

一、常见仪器得分类 一般根据仪器得主要用途得不同,可将常见化学实验仪器分为下列8类: （一)计量类 用于量度质量、体积、温度、密度等得仪器。这类仪器中多为玻璃量器。主要有滴定管、移液管、量筒、量杯等． (二)反应类 用于发生化学反应得仪器,也包括一部分可加热得仪器。这类仪器中多为玻璃或瓷质烧器.主要有试管、烧瓶、蒸发皿、坩埚等。（三）容器类 用于盛装或贮存固体、液体、气体等各种化学试剂得试剂瓶等。 （四）分离类 用于进行过滤、分液、萃取、蒸发、灼烧、结晶、分馏等分离提纯操作得仪器.主要有漏斗、分液漏斗、蒸发皿、烧瓶、冷凝器、坩埚、烧杯等。 （五)固体夹持类 用于固定、夹持各种仪器得用品或仪器。主要有铁夹、铁圈、铁架台、漏斗架等. (六)加热类 用于加热得用品或仪器。主要有试管、烧杯、烧瓶、蒸发皿、坩埚等。

(七)配套类 用于组装、连接仪器时所用得玻璃管、玻璃阀、橡胶管、橡胶塞等用品或仪器。 (八)其它类 不便归属上述各类得其它仪器或用品。 二、中学化学常见仪器得名称与使用 (一)计量仪器 1。量杯 量杯属量出式(符号Ex）量器,它用于量度从量器中排出液体得体积．排出液体得体积为该液体在量器内时从刻度值读取得体积数。量杯有2种型式。面对分度表时,量杯倾液嘴向右,便于左手操作，称为左执式量杯。倾液嘴向左，则称为右执式量杯。250 mＬ以内得量杯均为左执式,500mL以上者，则属于右执式。 2。温度计 温度计就是用于测量温度得仪器。其种类很多,有数码式温度计，热敏温度计痔。而实验室中常用为玻璃液体温度。 温度计可根据用途与测量精度分为标准温度计与实用温度计2类.标准温度汁得精度高，它主要用于校正其它温度计。实用温度计就是指所供实际测温用得温度计,主要有实验用温度计、工业温度计、气象温度计、医用温度计等。中学常用棒式工业温度汁。其中酒精温度计得量程为100℃,水银温度计用２00℃与3６0℃２种量程规格。 使用注意事项

定量PCR的实验步骤。

定量PCR的实验步骤 一、标准曲线的标准DNA样品准备 1.将目的片段进行克隆，对克隆得到的阳性菌落进行质粒DNA的提取和纯化（试剂盒），纯化后的质粒DNA纯度用DO260/DO280的比值来鉴定，纯的DNA比值应该在1.8-1.9之间，如果比值大于1.9的时候表示有RNA污染，小于1.6的时候表示有蛋白质的污染（DO260的1OD值相当于50ng/ul的双链DNA 或33ng/ul的单链DNA或40ng/ul的RNA）； 2.采用紫外分光光度法（DO260 nm）测定质粒DNA的吸光度DO260值为A，（B=1DO260=50 ng/ul），由于载体质粒序列和插入的目标片段的序列都是已知的，这样通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出单个质粒DNA （阳性质粒）的分子量C (ng/mol)，进而计算标准品的拷贝数D(copy/uL)： 拷贝数D=A×B C ×6.02×1023(copy/ul) 3.将2步骤中计算出来的已知拷贝数的质粒DNA以10倍为梯度进行稀释，稀释7个系列（各个梯度的浓度一般为101～107），作为标准曲线的DNA模板； 二、未知样品的定量标定 模板质粒DNA每个梯度设置3个平行样。未知样品设置2个平行样，同时设置一个没有质粒DNA的阴性对照。（定量实验，误差是不可避免的，设立平行样，对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小，以满足小样本统计的要求；确保数据的有效性，排除假阳性的干扰，必须设置阴性对照，阳性对照有标准样品就做，没有标准样品就可以省略不做）； 2.按照下面的程序进行荧光定量PCR反应： 95℃ 3 min 95℃10 s 58℃20 s 40个循环 72℃20 s

常见化学实验室仪器的名称及功能1

常见化学实验仪器的名称及功能 实验仪器是进行化学实验的重要工具。“工欲善其事，必先利其器”，实验工具的齐备与否，直接影响到实验的成功与失败。根据不同的实验目的，应选择相应的实验方法，用不同的实验仪器才能进行实验。而实验仪器的构造和性能又决定了它特有的操作方法和不同的适用范围。所以必须对化学仪器的有关知识及功能有一个完整的了解，才能掌握它、正确地使用它，迸而在熟练基础上达到得心应手；完成好各种实验。 这里向大家介绍常见化学仪器的分类及各种仪器的名称、性能、规格和使用注意事项。 一、常见仪器的分类 一般根据仪器的主要用途的不同，可将常见化学实验仪器分为下列8类： （一）计量类 用于量度质量、体积、温度、密度等的仪器。这类仪器中多为玻璃量器。主要有滴定管、移液管、量筒、量杯等。 （二）反应类 用于发生化学反应的仪器，也包括一部分可加热的仪器。这类仪器中多为玻璃或瓷质烧器。主要有试管、烧瓶、蒸发皿、坩埚等。 （三）容器类 用于盛装或贮存固体、液体、气体等各种化学试剂的试剂瓶等。 （四）分离类 用于进行过滤、分液、萃取、蒸发、灼烧、结晶、分馏等分离提纯操作的仪器。主要有漏斗、分液漏斗、蒸发皿、烧瓶、冷凝器、坩埚、烧杯等。 （五）固体夹持类 用于固定、夹持各种仪器的用品或仪器。主要有铁夹、铁圈、铁架台、漏斗架等。 （六）加热类 用于加热的用品或仪器。主要有试管、烧杯、烧瓶、蒸发皿、坩埚等。 （七）配套类 用于组装、连接仪器时所用的玻璃管、玻璃阀、橡胶管、橡胶塞等用品或仪器。 （八）其它类 不便归属上述各类的其它仪器或用品。 二、中学化学常见仪器的名称和使用 （一）计量仪器 1．量杯 量杯属量出式（符号Ex）量器，它用于量度从量器中排出液体的体积。排出液体的体积为该液体在量器内时从刻度值读取的体积数。 量杯有2种型式。面对分度表时，量杯倾液嘴向右，便于左手操作，称为左执式量杯。倾液嘴向左，则称为右执式量杯。250 mL以内的量杯均为左执式，500 mL以上者，则属于右执式。 2．温度计

RT-PCR实验步骤

RT-PCR实验步骤

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须 在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？https://www.sodocs.net/doc/1d10627894.html, 问题： 在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另

一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来） 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！ 解答： 1.RT-PCR有两种做法： 条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。 3.RACE 我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无

Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手_生物吧

Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手 时间:2012-03-05 21:22来源:生物吧作者:刘浩点击: 13338 次 由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的 由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR 的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了 Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、 PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM 系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。 二、Real-time qPCR概述 1. Real-time qPCR原理 实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。 常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。 2. Real-time qPCR的数学原理 首先来看一个real-time qPCR中的重要参数Ct值（Ct value），阈值（threshold），和基线（baseline）。一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR

PCR实验步骤

qRT-PCR实验步骤 应用LightCycler?/LightCycler?480 System Real Time PCR扩增仪的操作方法 一、按下列组分配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行） 注意： 1、通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。 2、在20 μl的反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。另外，2 Step RT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。 二、进行Real Time PCR反应 LightCycler? 480 System： Stage 1：预变性 95℃30s（升温速率4.4℃/s） 1 Cycle Stage 2：PCR反应 分析模式：定量分析 95℃5s（升温速率4.4℃/s） 60℃30s (升温速率2.2℃/秒，Acquisition Mode : Single) 40 Cycles Stage 3：溶解 分析模式：溶解曲线 95℃5 秒钟(升温速率4.4℃/秒) 60℃1 分钟(升温速率2.2℃/秒) 95℃(升温速率0.11℃/秒, Acquisition Mode : Continuous, Acquisitions : 5 per℃) 1 cycle Stage 4：降温

40℃30 秒钟(升温速率2.2℃/秒) 1 cycle 三、实验结果分析 反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。