脂肪酶的微生物生产技术综述
脂肪酶的微生物生产技术综述
By 夏远川
脂肪酶是一种普遍存在于动植物和微生物体内的酶，也是最早研究的酶类之一，早在1834年就有关于兔胰腺脂肪酶活性的报道。[1]
脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，一般用于催化水解和合成反应，在油水界面上，它催化三酰甘油的酯键的水解，生成甘油一酯、甘油二酯或直接生成甘油和脂肪酸。[2]脂肪酶还可催化酯类化合物的醇解、酯化、酯交换等反应，且不需要辅酶，在工业生产和研究工作中均有广泛应用。[3]
脂肪酶按作用时的适应温度可分为高温脂肪酶、中温脂肪酶、低温脂肪酶；按适宜pH可分为碱性脂肪酶、中性脂肪酶、酸性脂肪酶。
脂肪酶的主要工业应用方向：
1、洗涤工业：在洗涤剂中添加脂肪酶可使洗涤剂对脂质类污渍的去除效果大大提高，并可减少表面活性剂及无机助剂（尤其是三聚磷酸钠）的用量，大大减少洗涤剂带来的环境污染。用于洗涤剂的脂肪酶为碱性脂肪酶，在碱性范围内有活性、活性不受表面活性剂影响、对氧系漂白剂稳定、热稳定性好，并且由于大多数加酶洗涤剂都适当配有蛋白酶，因此用于洗涤剂的脂肪酶还应具抗蛋白酶降解的能力。[4]
1988年，丹麦NOVO公司将碱性脂肪酶应用于洗涤剂中并推向市场。1992
年，这家公司构建了商业上第一株产脂肪酶菌株。[1]
2、食品工业：油脂改性是食品加工过程中的一个重要环节，脂肪酶可通过催化酯交换、酯转移、水解等反应，改变油脂的的物理化学性质，使便宜的、营养价值低的油脂升级为昂贵的、营养价值高的油脂；此外脂肪酶还可用于合成广泛应用于食品工业的糖酯类产品、合成不带副产物或毒性物质的芳香味酯类化合物、合成抗坏血酸酯类抗氧化剂如异抗坏血酸等。[5]
3、造纸工业：使用脂肪酶处理纸浆可减少胶黏物（绝大多数胶黏物都含有大量酯键）对造纸毛毯网间空隙的堵塞，提高纸机的运行效率和成纸品质，并降低环境污染，减少废水处理的负荷。
此外脂肪酶脱墨技术在废纸利用方面也起到非常大的作用，与传统脱墨技术相比脱墨效果更好环境污染更低，具有很大的优势。[6]
4、皮革生产：脂肪酶应用于制革和毛皮加工过程中的脱脂，相对于传统的脱脂方法具有脱脂均匀、脱脂废液中的油脂更易分离回收、减少甚至不使用表面活性剂、降低生产成本、提高成品质量等诸多优点，将碱性脂肪酶与脱脂剂在碱性条件下进行毛革两用皮革的脱脂，可大大提高脱脂效果。[7]
此外脂肪酶在饲料工业、生物表面活性剂、化妆品、生物传感、聚合物合成、手性化合物拆分、生物柴油等方面都具有重要的应用前景。
由于微生物生长繁殖快、所产脂肪酶种类多、微生物脂肪酶具有比动植物来源的脂肪酶更广的作用条件范围，且多为胞外酶，更适合于工业规模生产和获得高纯度产品，因此成为工业用脂肪酶的主要来源。[7]上世纪初，微生物学家
Eijjkmann发现了微生物脂肪酶并报道了一些能够产生和分泌脂肪酶的细菌，从此拉开了微生物脂肪酶研究的序幕，80年代后期至今，非水解酶学与界面酶学的理论研究及工业应用取得了突破性进展，极大促进了微生物脂肪酶的开发利用。[1]
产脂肪酶的微生物在自然界中分布广泛，如植物油处理加工厂、工业废水、牛奶厂及被油污染的环境中均可以筛选到产脂肪酶的微生物，国内外研究较多的有根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶、青霉脂肪酶、毛霉脂肪酶、地酶脂肪酶和细菌脂肪酶。[8]在不同条件下进行菌种选育可得到适宜不同生产条件的脂肪酶的生产菌种。
一、菌种的分离筛选
（一）采样
应从富含油脂的环境中采取样品进行筛选，常见的有：
1、食堂餐厅和小餐馆排污处、户外烧烤摊、厨房、油脂化工厂排污池等
长期被油脂污染的土壤、油垢、污水。
2、小笼包蒸屉垫等经常接触油脂的家居用品。
3、产油作物如菜籽等。
4、如需筛选能生产在特殊条件下保持活性的脂肪酶的菌种，则需相应改
变取样范围。例：付建红等人[9]在2009年公开的专利中，筛选低温条
件下保持活性的脂肪酶的生产菌时采取的样本为新疆高寒地区的含油
冻土样本。
（二）富集培养
用于筛选脂肪酶生产菌的富集培养基含有酯类物质，通常为橄榄油或聚乙烯醇橄榄油乳化液，根据所需脂肪酶的不同调节pH和培养温度。
刘瑞娟等人[10]在2009年发表的文章中，低温碱性脂肪酶产生菌筛选时使用了pH值为9.5的富集培养基。[10]
（三）分离鉴定
初筛通常使用平板指示剂法，根据所使用指示剂不同有以下几种常用方法：
1、维多利亚蓝B指示剂染料法：
通过在含酯类的培养基中加入维多利亚蓝B来筛选脂肪酶产生菌，
能产生脂肪酶的菌落会在平板上形成蓝色增色圈。[11]
2、三丁酸甘油酯琼脂平板透明圈法：
在培养基中添加三丁酸甘油酯乳化液，对待分离样本进行培养，根
据菌株是否生长及菌株透明圈的大小对菌株进行性质分类，圈大且清
晰的为优良的生产菌株。[12]
3、罗丹明B平板测定法：
在含酯类的培养基中添加罗丹明B来筛选脂肪酶产生菌，产脂肪酶
的菌株会在平板上形成红色水解圈，在350nm的紫外光下，水解圈具
有橘黄色荧光。[13]
4、溴甲酚紫显色培养基测定法：
在含酯类的培养基中添加溴甲酚紫，产脂肪酶的菌株会在平板上形成黄色的水解圈。[14]
复筛时除使用平板法外还可使用摇瓶法：
在发酵培养基中培养菌株，离心后测定脂肪酶活性，筛选出产脂肪酶能力更强的菌株，多次重复即可筛选出样本中产脂肪酶能力最强的菌株。如王莎莉等人[15]在2016年使用添加有橄榄油和曲拉通的复筛/发酵培养基，筛选得到单位酶活为2.14U/mL的高产脂肪酶菌株。
摇瓶法与平板法的不同在于其在测定菌株是否产脂肪酶的基础上测定了菌株产脂肪酶的能力，因此比平板法更适用于复筛阶段。
摇瓶法的核心在于测定酶活，常用的脂肪酶活性检测方法有碱滴定法、对硝基苯酚法和铜皂法[16]：
1、碱滴定法：
以橄榄油作为底物，酚酞作为指示剂，使用NaOH标准溶液进行滴定，滴定时的空白对照组采用95%乙醇使脂肪酶样品失活。
此法脂肪酶酶活力单位定义为：在一定条件下，1min释放出1mol 脂肪酸的酶量定义为一个脂肪酶活力单位（U）。
碱滴定法稳定性较差，易产生误差，但耗时较短，可用于粗略的测
定。
2、对硝基苯酚法：
以对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物，加入样品酶反应一定时间后以乙醇或丙酮终止反应，在405nm测定吸光度并根据对硝基苯酚的吸光度-浓度曲线计算生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。
此法脂肪酶酶活力单位定义为：在一定条件下，1min释放出1mol 对硝基苯酚的酶量定义为一个脂肪酶活力单位（U）。
江慧芳等人[16]在2007年发表的文章中将终止反应的乙醇或丙酮改为三氯乙酸，使反应终止方法更有效，相对碱滴定法而言结果更稳定、重复性更好，且比铜皂法用时更短，是进行大量脂肪酶活力的快速测定的较好选择。
3、铜皂法：
铜皂法通过在脂肪酸中加入Cu+化合物作为显色剂，形成绿色络合物后测定吸光度为原理。通常采用橄榄油为底物，与样品酶反应后采用苯或甲苯萃取生成的脂肪酸，加入显色剂后在710nm下测定吸光度，并根据油酸标准溶液吸光度工作曲线计算生成的脂肪酸量，进而计算出酶活力。
此法脂肪酶酶活力单位定义为：在一定条件下，1min释放出1mol 脂肪酸的酶量定义为一个脂肪酶活力单位（U）。
铜皂法结果稳定重复性好但用时较长，适用于脂肪酶活力的精确测
量。
以上三种常用的脂肪酶活测定方法中，碱滴定法属于滴定分析法，对氨基苯酚法和铜皂法属于光谱法；此外还有许多利用脂肪酶的水解特性来测定脂肪酶活性的方法[1]：色谱法、放射性、界面张力测量学、比浊法、电导分析法、免疫法、显微镜观察法等。
根据轻工业联合会提出的GB/T 23535-2009脂肪酶制剂国家标准中，测定脂肪酶（以淀粉质（或糖质）为原料，经微生物发酵、提纯制得的中性脂肪酶制剂）酶活的方法为碱滴定法。[17]
二、菌种的改良
（一）自然选育：
不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。
李扬等人[18]从小笼包蒸屉垫中筛选得到了两株脂肪酶高产菌株J2和J3，分别属于出芽短梗霉属的两个变体，以对硝基苯酚法测得J2和J33发酵上清液中的脂肪酶酶活分别为10.61U/mL和14.43U/mL。
（二）诱变育种：
诱变育种即利用人为添加的诱变剂处理微生物细胞以提高基因突变频率，
再通过适当的筛选方法获得所需要的高产菌种的育种方法。
常用的诱变剂包括物理、化学和生物三大类。
1、物理诱变剂：
常用的物理诱变剂有：紫外线、快中子、X射线、β射线、γ射线、激光。
袁强等人[19]采用紫外诱变的方法对产脂肪酶的细菌菌株进行诱变和筛选，得到诱变株命名为U12，脂肪酶酶活（60.25U/mL）比原始相对出发菌株酶活提高220%，经五次传代实验平均酶活为58.63U/mL，相对诱变原菌降低2.69%。
周延等人[20]研究了从土壤中筛选的脂肪酶产生菌，利用紫外线、快中子、快中子和磁场复合、γ射线、γ射线和磁场复合进行诱变育种，得到一株酶活为396.22U/mL的诱变株，比出发菌株高92倍。在后续研究中初步探讨了快中子、γ射线及磁场复合处理在脂肪酶产生菌中诱变的作用，认为三种方法中，在产脂肪酶的诱变中，快中子诱变更为有效。
郑敏等人[21]利用XeCl准分子紫外激光照射少根根霉孢囊孢子，筛选到8株脂肪酶活提高幅度10%以上的菌株，其中包括一株酶活较出发菌株提高55.1%的突变株。
2、化学诱变剂：
可用于产脂肪酶的菌种选育的化学诱变剂有硫酸二乙酯（DES）、LiCl、亚硝基胍、盐酸羟胺等。化学诱变剂一般不单独使用。
李忠英等人[22]以紫外线（UV）与硫酸二乙酯（DES）复合诱变处理，筛选
出酶活为14.85U/mL的突变菌，比出发菌株提高48.2%。
苗长林等人[23]采用微博-亚硝基胍复合诱变法处理米黑根毛霉，筛选出一株酶活比出发菌提高105%的突变株。
3、生物诱变剂：常见的生物诱变剂有噬菌体和转座子，中文期刊中鲜少有此类方法对脂肪酶产生菌进行诱变育种的报道。
（三）杂交育种
杂交育种是将不同菌株的遗传物质进行交换重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中。
杂交法局限大，杂交率低，因此利用此法选育脂肪酶高产菌株的报道很少。但有与基因工程相结合的同源高效表达技术的研究。如华中科技大学硕士研究生郭道义[24]通过运用PCR方法从高产脂肪酶的洋葱假单胞菌G63克隆了脂肪酶基因及其伴侣基因，将其克隆岛广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上，构建质粒pBBR-LipAB,通过三亲杂交，在辅助质粒pRK2013的帮助下，使该基因在原始菌株中高效表达，所构建的工程菌较原始菌株酶活提高3.6倍。
（四）原生质体融合
原生质体融合技术是将两个已经去细胞壁处理释放出原生质的细胞释放在高渗环境中，在助融剂或电场作用下使之发生细胞融合，实现遗传重组。原生质体融合技术提供了充分利用遗传重组杂交的方法。
段学辉等[25]进行了假丝酵母和白地霉的原生质体融合研究，选育获得一株融
合株CG16，其表型遗传性状和发酵性能稳定，产酶活力好，固态发酵脂肪水解酶活达到82.22U/g干物质，比亲本假丝酵母和白地霉的产酶活力分别提高了32%和171%。
（五）低能离子注入技术
生物离子注入技术的基本原理是利用低能离子与生物体作用产生辐射损伤，从而诱导产生可遗传变异，因此也属于辐射生物技术。但它与γ射线及宇宙射线育种等有一定的区别。低能离子注入技术在诱变过程中，除离子束的能量对生物体具有作用外，离子本身最终会留在生物体内，对其变异产生影响。低能离子注入技术具有生理损伤小，、突变谱广、突变频率高等优点，并具有一定的重复性和方向性。[26]
冀颐之等人[27]将出发菌株（根霉）单孢子悬浮液涂于N+离子注入载体硅片上，无菌风吹干后将其装入低能加速器（离子注入机）靶室中进行注入诱变，该实验获得的高产脂肪酶突变株N103，在摇瓶发酵条件下，测得脂肪酶水解酶活为175U/mL，为出发菌株的165%，且有较好的遗传稳定性。
三、菌种保藏
四、培养基
（一）培养基的组成
1、定义：
培养基是应科研或生产的需要，由人工配制的，适合与不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质（混合养料）。发酵培养基一般包括碳源、氮源、无机盐及微量元素、水和其他成分（如诱导剂等）。
2、科研用培养基的组成：
对于脂肪酶生产菌来说，科研用培养基有初筛及富集培养常用的各类平板培养基、复筛常用的摇瓶法使用的液体培养基。科研用培养基一般采用由纯度较高的试剂如橄榄油、聚乙烯醇橄榄油乳化液、三丁酸甘油酯乳化液等配制的合成或半合成培养基。
3、工业用培养基：
工业上生产脂肪酶则多选用天然培养基。
（1）水
（2）碳源：
常见碳源包括油脂、葡萄糖、玉米粉、小麦粉等；速效碳源如葡萄糖、蔗糖等有利于细菌脂肪酶的形成，而缓效碳源如玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成。[28]
如付建红等人[9]在2009年公开的专利中，所筛选的低温碱性脂肪酶生产菌（白地霉G.candidum ch-3）在以可溶性淀粉为碳源时最有利于产酶，而以葡萄糖为碳源时，发酵产生较低的酶活。程兴[1]在进行假单胞菌的产酶条件优化时则发现其最佳碳源为麦芽糖。
在脂肪酶的生产中，油脂不仅可作碳源，同时也起到诱导物的作用。大多数微生物只有在诱导物存在时才能产生脂肪酶，诱导物包括甘油三酯、长链脂肪酸、脂肪酸酯等[28]。例：付建红等人[9]在2009年公开的专利中，所筛选的低温碱性脂肪酶生产菌（白地霉G.candidum ch-3）在以不同油脂诱导情况下研究，发现豆油是其最好的诱导物，而猪油和菜籽油则对该菌产酶有一定的抑制作用。也有一些菌种既能产脂肪酶又能产油脂，曹茜（浙江大学）[29]在2016年发表的博士论文中在对一种能产油脂的脂肪酶生产菌的产酶条件研究中发现，在无诱导油的情况下该菌种仍具有一定的产脂肪酶能力。
（3）氮源：
常用氮源包括无机氮源如硫酸铵、尿素等，有机氮源如大豆粉、玉米浆等；一般认为复合氮源更有利于微生物生长及产酶，有机氮源比无机氮源要好，蛋白胨和酵母膏在细菌脂肪酶的生产中应用十分广泛。[28]
例：王蕾[30]等人于2017年分离出的热泉菌Bacillus sp.BI-3在筛选最佳氮源时显示的结果为：以蛋白胨为氮源时，菌体的生长和脂肪酶的酶活都是最高，以草酸铵为氮源则很低。
（4）无机盐与微量元素：
无机盐作为微生物生命活动所不可缺少的物质，参与构成菌体成分；作为酶活性基因的组成部分或辅酶（基）；调节渗透压、pH值、氧化还原电位等生理生化因素；还可作为自养菌的能源物质。
不同离子对同种菌产酶的影响不同，同种离子对不同菌种产酶能力的影响也不同。付建红等人[9]在2009年公开的专利中，所筛选的低温碱性脂肪酶生产菌（白地霉G.candidum ch-3）产脂肪酶受Fe2+、Cu2+、Mn2+促进，Zn2+、Na+、K+、Mg2+对该菌产酶有不同程度的抑制作用，而段盈伊等人[31]所筛选的脂肪酶高产菌产酶则受Ca2+、Mg2+促进，受Fe2+、Zn2+抑制。（5）生长因子：
一类微生物生长不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等。有机氮源是生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和其他一些生长因子，因此在实际生产过程中一般不需要额外添加生长因子，未见这方面的研究报道。
（6）产物促进剂：
产物促进剂指那些既非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后能提高产量的添加剂。
表面活性剂如Tween 80、Triton X-100、SDS、PEG等主要通过增加细胞通透性使脂肪酶易于分泌到胞外来促进产酶。[28]但许多文献显示SDS对酶活性具有抑制作用。这方面的例子有：DAI Da-zhang[32]等在2008年进行的研究中发现，所使用的脂肪酶生产菌P.expansum PED-03所产脂肪酶为胞外酶，适宜的表面活性剂能改变细胞膜透性，有助于打破细胞中酶合成的“反馈平衡”并促进脂肪酶分泌到胞外，因而能提高酶的产率。研究中发现，Tween 80对产酶有较强促进作用（加入0.05%Tween 80，产酶能力提高55%，
达850U.mL-1），而SDS则对产酶有较强抑制作用。陈巍等[33]对黑曲霉产脂肪酶的研究中也显示SDS对该脂肪酶活有强烈的抑制作用。
一些有机溶剂能提高酶活性，如卢亚萍[34]在2010进行的研究中发现，所筛选的菌株产脂肪酶在常见的有机溶剂如甲醇、甘油、正己烷、正丁醇、甲苯和乙酸乙酯中都具有良好的稳定性，其中乙酯、正丁醇和正己烷能提高酶的活性。
（二）培养基的设计与优化
实验室选育的菌株要应用于工业生产就必须进行生物过程的优化，发酵培养基的设计和优化是其中重要的一环。
1、培养基的设计
培养基的粗略设计可采取两种方式：一是模拟所培养菌的天然生活环境和生态条件，设计天然培养基；二是查阅、分析文献，调查前人工作资料，借鉴经验，完成培养基的初步设计。
2、培养基的优化
初步设计的培养基往往不能使菌株的生长繁殖和产酶能力达到最佳水平，因此还需要进行一系列优化改造，才能在实际应用中发挥较好的作用。由于发酵过程往往受多种因素影响，因此培养基优化过程中除了使用传统的单因子法、正交设计法外，响应面法、均匀设计法、人工神经网络、模糊逻辑控制、专家系统、遗传算法、化学计量法、最陡爬坡试验等新方法也逐步得到推广利用，
其中响应面法应用最广，一般可将脂肪酶产量提高1~10倍。[28]
（1）单因子实验
单因子实验是在假设各因素间不存在相互影响的前提下，一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定，对各因素单独进行考察的实验方法。单因子实验简单、容易，培养基组分的个体效应能从图表上直观明显地看出来，不需要做统计分析。但这种方法忽略了组分间的交互作用也不能考察各因素的影响力主次关系，并且在考察的实验因素较多是，需要大量实验和较长的实验周期。
单因子实验很少单独应用，一般是为后续其他实验方法提供一个数据基础。
（2）正交实验设计
利用正交表安排多因素多水平试验与分析实验结果的方法，简称正交实验法。虽然仍旧不能体现出各组分间的交互作用，但正交实验设计能减少试验次数并辨别出哪些因素是主要的，哪些是次要的，以及所考察因素的最适水平和指标在各因素不同水平时的变化规律。
PIackett-Burman设计法是一种两水平的试验设计方法，常用于从众多考察因素中快速有效地筛选出影响力最大的几个因素，这几个因素是后续响应面法所考察的因素，其他次要因素则通常选用单因素试验中得到的最佳水平。PIackett-Burman设计一般使用统计软件来进行实验设计，如SAS软件、Design-Expert软件。
（3）响应面法
响应面分析方法以回归方法作为函数运算的工具，把各因素与实验结果（即响应值）的关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因素与响应值之间，各因素间的相互关系，并进行优化。
以上三种方法是目前使用广泛的发酵条件优化方式，它们之间是循序渐进的关系。下面以一个案例进行具体分析。
王莎莉等人[15]2016年发表于《食品与生物技术学报》的文章：《脂肪酶生产菌株的筛选及其发酵条件优化》中，研究者在培养条件优化上依次使用了：单因子实验、PIackett-Burman设计、最陡爬坡试验、中心复合试验、响应面方差分析。
单因子实验单独考察每一个因素对培养结果的影响，共考察了包括酵母膏用量、玉米油用量、PVA用量、培养温度在内的10个单因子并得出了各因素的最佳水平。单因素试验为后续主要影响因素优化过程中提供次要研究因素的用量数据。
然后研究者进行了PIackett-Burman设计试验（使用Design-Expert软件）从所发表文章的PB设计与结果图表来看研究者使用了8个实际因素（而不是单因素试验中的10个影响因素）、3个用以估计误差的虚构变量进行
PIackett-Burman设计试验，得出了12个酶活数据，再对这些数据进行分析后得出影响力最大的3个因素是酵母膏、玉米油和初始pH。
后续最陡爬坡试验、中心复合试验、响应面方差分析都是为了探究酵母膏、玉米油和初始pH对培养结果的综合影响，其中最陡爬坡试验是将3个因素一起改变，这样会得到一个使酶活达到爬坡过程中最大值的组合，但由于每一次
取值改变都是3个因素一起改变，因此还不能保证所得组合为最优的发酵条件。
在此基础上进行以最陡爬坡试验最大值作为各因素的中心点水平进行中
心复合试验，研究者使用Design-Expert软件设计得到一个CDD矩阵，并进行相应实验操作得到不同条件下的酶活。
然后进行响应面方差分析，得出二次回归方程，对回归方程进行响应面分析，对3个因素分别求导，即可得出最佳发酵条件组合。
这个研究所用优化的方法比较典型，先对单因素影响做分析，再考察重要因素的交互作用。存有疑问的地方是PIackett-Burman设计过程中只考察了单因素试验10个因素中的8个，并且没有说明未考察的是哪两个因素。
除了这三个常用的优化方法外，近年来一些新的优化方法也在发展兴起。（4）人工神经网络
人工神经网络是由众多的神经元经可调的连接权值连接而成。具有大规模并行处理、分布式信息储存、良好的自组织自适应性，并具有很强的学习能力。
[35]人工神经网络作为一种非线性模型，预测能力大大优于多元线性回归模型，在生物领域尤其是生物信息学方面受到了越来越多的应用和重视。[36]郝建华[37]等以海洋酵母Bohaisea-9145发酵生产脂肪酶为例，利用人工神经网络控制方法建立批式发酵模型，以该模型模拟的葡萄糖流加补料策略为方案，脂肪酶发酵活力比批式发酵提高了3.45倍。
（5）均匀设计法
均匀设计法是一种试验设计方法，旨在用最少的试验次数建立实验数据的回归模型，用回归模型来估计因素的主效应及交互效应。与正交试验设计相比，均匀设计法不能用方差分析估计出主效应及交互效应，失去了整齐可比性，但在选点方面比正交设计有更大的灵活性，也就是说它更注重均匀性，可以选到偏差更小的点，此外在研究因素较多的情况下均匀设计的试验次数大大减少，能够极大降低试验成本。[38]
均匀设计法通常不单独使用。如唐春红等人[39]于2006年提出将均匀设计与正交实验设计联用的实验设计方法，该方法具有均匀设计适用于多因素水平和实验次数少的特点，回避了均匀设计只能用计算机分析软件才能对数据进行分析的不足，同时保留了正交实验设计应用面广，可对实验结果进行简单直观分析的特点，适用于生物医学工程学的研究；谭泗桥[40]等人于2015年提出的均匀设计结合支持向量回归优化微生物发酵培养基的方法。
林仙菊等人[41]于2017年使用单因素试验和均匀设计法对从海鳗肠道内容物中筛选获得的洋葱伯克霍尔德菌ZF-16产脂肪酶的条件进行了优化，优化后的脂肪酶活力较优化前提高了4.71倍。
五、代谢调控
微生物自身对产酶量具有严密、精确、灵敏的代谢调节机制，天然状态下，微生物细胞处于平衡生长状态，不会有过多的脂肪酶产生。而工业发酵需要微生物大量生产脂肪酶，因此需要人为对微生物的代谢进行调控。代谢调控在实际生产的每一环节中都有体现，如在选育生产菌种时筛选营养缺陷型菌株或在设计培
养基时添加诱导物等，前文已作说明。
进行代谢调控前往往需要对产物代谢途径有一定的了解。与真菌脂肪酶相比，细菌脂肪酶在水相、有机相中催化反应的类型更多、活性更高、稳定性更好，因此对脂肪酶产生菌的研究也更侧重于细菌。但这方面的研究仍然十分有限，人们已克隆了大量细菌脂肪酶基因，但涉及表达调控机制的研究报道少并且信息零散。目前可知的是细菌脂肪酶基因的表达主要受到双组份系统、群体感应系统、Gac/Rsm信号转导系统等的调控[42]。
参考文献：
[1]程兴.耐热中性脂肪酶产生菌Pseudomonas sp.ZBCl的筛选及发酵条件的优化
[D].合肥.安徽大学.2012
[2]李宇辉,刘成江,王俊刚,等.微生物脂肪酶的性质及应用研究现状[J].食品工业.2013,34(9):162-165
[3]张开平,惠明,田青,等.微生物脂肪酶的应用领域及研究进展[J].河南工业大学学报(自然科学版).2012,33(1):90-94
[4]郑毅,施巧琴,吴松刚.碱性脂肪酶与表面活性剂相互作用的研究[J].工业微生物.2006,30(2):4-7
[5]魏雪,孙丽超,李淑英,等.脂肪酶的固定化及其在食品领域的应用[N].生物技术通
报：综述与专论,2016,32(11):59-64
[6]王洪振.脂肪酶等在造纸过程中的应用及机理研究[D].济南:齐鲁工业大学.2011
[7].王玉增,刘彦.脂肪酶的发展概况及在制革中的应用[J].中国皮革.2014,43(17):36-41
[8]黄璜,李宗军,王远亮,等.各类微生物脂肪酶酶学性质及应用的研究进展[J].食品粮油科技.2014,22(1)：109-118
[9]付建红,姚斌,石玉瑚,等.一种低温中性脂肪酶及产生该酶的白地霉[P].中国专利.200710100487.0.2007,10,24
[10]刘瑞娟,王海宽,路福平,戚薇.低温碱性脂肪酶产生菌的筛选及产酶培养基的优化[N].天津科技大学学报, 2009, 24(1):6-10
[11]周杰,刘雅琴,龚洪兵,等.低温碱性脂肪酶产生菌的分离筛选及酶学性质[J].江苏农业科学.2013,41(4):325-327
[12]王琰,张志敏,王斌,万一.耐酸性脂肪酶产生菌的筛选及酶学性质研究[J].饲料工业.2011.32（10）：29-33
[13]乔红群,徐虹,付闪雷,欧阳平凯.脂肪酶产生菌的筛选及其酶性质[N].南京工业大学学报:自然科学版, 1998, 20(1):15-19
[14]欧阳敏,孙晗笑,莫雪梅,等.一株脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件优化研究[J].生物科技通报.2012(3):111-116
[15]王莎莉,朱胜杰,夏海锋.脂肪酶生产菌株的筛选及其发酵条件优化[J].食品与生
脂肪酶的概述及应用
脂肪酶的概述与应用 一脂肪酶概述、 脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。 脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。 脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。 酶是一种活性蛋白质。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
脂肪酶拆分外消旋_苯乙胺的研究进展
the formation of flavour components in cider[J].J I Brewing,1988,94 (6):391-395. [26]MANGAS J J,GONZALEZ M P,RODRIGUZE R,et al.Solid-phase extraction and determination of trace aroma and flavour components in cider by GC-MS[J].Chromatographia,1996,42:101-105. [27]WILLIAMS A A,MAY H V.Examination of an extract of cider volatiles using both electron impact and chemical ionization gas chro-matography-mass spectrometry[J].J I Brewing,1981,87:372-375. [28]POLLARD A,KIESER M E,STEVENS P M,et al.Fusel oils in ciders and perries[J].J Sci Food Agr,1965,16:384-389. [29]龙明华.以浓缩苹果汁酿造的苹果酒挥发性香气成分分析[J].酿酒 科技，2006（6）：94-95. [30]彭帮柱，岳田利，袁亚宏，等.气相色谱-质谱联用法分析苹果酒香气 成分的研究[J].西北农林科技大学学报，2006，31（1）：71-74. [31]岳田利，彭帮柱，袁亚宏.基于主成分分析法的苹果酒香气质量评价 模型的构建[J].农业工程学报，2007，23（6）：223-227. [32]林巧，杨永美，孙小波，等.苹果酒发酵条件的控制与研究[J].中国 酿造，2008（10）：60-63. 手性是自然界化合物的普遍特征。构成自然界物质的一些手性分子虽然从化学式组成来看是一模一样，但其空间结构完全不同，其性质也是不同的[1]。如DL-（±）-合霉素的治疗效果仅为D-（-）-氯霉素的一半；20世纪50年代欧洲发生的“海豹儿”出生的灾难性事故，正是由于“反应停”是一种外消旋的手性药物，其（R）型异构体具有镇静作用，而（S）型却具有致畸作用。因此，如何将物质纯化为光学纯级别是目前化学工业的重要研究目标。α-苯乙胺（DL-α-Phenylethylamine）是一种有着良好应用前景的化工中间体原料，由于α-苯乙胺分子中含有一个手性中心，可分为（R）和（S）2种对映异构体及外消旋α-苯乙胺，其中（R）、（S）这2种单一对映体既可以作为某些外消旋有机酸或醇类物质的手性拆分试剂，又可以作为不对称合成的手性原料，因此是一种重要的手性中间体[2]。目前光学纯级别化合物的获得方法主要有手性合成和外消旋体拆分2种。本文主要阐述利用脂肪酶对外消旋α-苯乙胺的拆分研究进展。 1脂肪酶拆分机理 分子模拟研究表明，对映体在Candida Antarctica脂肪酶B活性中心以不同的方式定向[3]。手性底物的对映体以不同方式定向和结合到酶活性中心，这一事实可以作为改变对映体选择性的依据。目前被普遍接受的是“立体特异性口袋”理论：在酶的立体结构中存在着一个氧负离子空洞，称为“活性口袋”，这个活性口袋是由几个氢键供体构成的，主要为酶骨架及其侧链中酰胺的质子。而决定脂肪酶底物选择性的最重要因素正是活性口袋的空间限制和疏水性质以及四面体中间体的稳定性。JENSEN R G等[4]通过研究Candida Antarctica脂肪酶B与2-己酸辛酯的过度态结构对该脂肪酶的立体选择性进行了分析，从结构来看，酶活性部位是由一个丝氨酸、一个组氨酸和一个天冬氨酸的残基（Ser-His-Asp）组成的“催化三联体”，并且活性部位呈“手性”构象，具有高度选择的特征。脂肪酶在催化过程中将这种特征传递给手性底物，使反应具有内在的选择性，即优先催化底物中的某些组分，客观上表现为不同竞争性底物反应速度的差异[5]。 2脂肪酶的选择 酶法拆分手性物质主要是利用酶的立体选择性，整个反应过程就是外消旋底物的2个对映体竞争酶的活性 脂肪酶拆分外消旋α-苯乙胺的研究进展 吴华昌，由耀辉，邓静，马钦远 （四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000） 摘要：利用脂肪酶拆分外消旋α-苯乙胺是目前生产光学纯α-苯乙胺的重要方法之一，文中主要从脂肪酶拆分机理、脂肪酶的选择、酰化剂的选择及反应体系溶剂的确定等方面，阐述近年来国内外研究状况。 关键词：脂肪酶；光学纯；酰化剂；溶剂 中图分类号：Q556文献标识码：A文章编号：0254-5071（2010）05-0023-03 Chiral resolution of racemicα-phenylethylamine by lipase WU Huachang,YOU Yaohui,DENG Jing,MA Qinyuan (Department of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong643000,China) Abstract:Chiral resolution by lipase is an important way for production of optically pureα-Phenylethylamine.Mechanism of chiral resolution by lipase,choice of lipases and acylation agents,and selection of reaction solvent was reviewed in the paper. Key words:lipase;optical purity;acylation agent;solvent 收稿日期：2009-12-11 作者简介：吴华昌（1970-），男，四川隆昌人，副教授，主要从事非水相酶催化应用研究工作。 ααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααα
微生物酶
微生物酶 微生物酶是指起着催化作生物体系中特定反应的、由微生物活细胞产生的蛋白质。作为催化剂的微生物酶，它可以加速三种反应：水解反应、氧化反应和合成反应。微生物酶可以在活细胞内进行催化作用，也可以透过细胞作用细胞外的物质；前者称内酶，后者称外酶。酶具有专一性酶的催化过程是一个两步反应： E(酶) + S（基质）→ ES（复合物）→ E（酶） + P（底物） 酶的活性受环境条件的影响十分显著，主要的物理环境条件有：温 度、需氧。量和pH值，这些条件是废水生物处理过程中的最重要因素。 在特定的条件下，微生物细胞才会产生大量的活性酶，即微生物酶。在生成过程中，控制环境条件是很重要的，以使决大部分活性酶能完整保存下来。当微生物细胞生成活性酶后，它们会钝化，并和酶一起保留下来，以不同的方式，分几个阶段使酶净化。目前，还没有科学的名称来对用于制造酶的微生物体命名。但那些含酶物质中酶活性是能够保证的。为了最佳利用酶的催化功能，我们必须熟悉一些影响酶活性和稳定性的基本原则。因为酶是一种生物化合物，且由大量蛋白质组成，所以要受到外界环境的影响。以下原则对用于化学方面的大多数生物酶来说，都是适合的。环境的 PH 值对酶的活性和稳定性有显著的影响。最佳活性会因不同酶的 PH 值的变化而变化。在 PH 值变化时，不同酶的活性有差异。另一个主要因素是温度。因为酶是生物催化剂，至少部分地由蛋白质组成的，所以它们对温度的变化十分敏感。环境温度升高会使酶的活性成倍增强。当达到最佳温度时，温度在高就会引起酶的迅速退化，活性也就会降低。然而，不同种类的酶对温度的抵抗力和敏感程度有很大的差异。例如：从枯草菌素中提取的细菌酶对热的敏感度就比从米谷蛋白中提取的真菌酶低。一些由某类细菌发酵而来的淀粉酶甚至能在沸水中短暂保持稳定性，并在 70-80 摄氏度之间达到最佳活性。我们的实验室已经发现大约 85% 从地衣类物质和淀粉酶中提取的酶能在高温中保持活性，但米谷蛋白酶在此高温中就要失去大于 90% 的活性。当经发酵的、含酶的微生物体保持干燥时，这种物质就比湿的更能抵御外界环境温度的变化。事实上，大多数酶在标准状况下不大会出现稳定性问题。采用生物酶技术处理有机废物时，如何利用酶特性是十分重要的，包括它们怎样起作用，在什么条件下起作用，以及如何保持它们的活性等等 因为动、植物来源有限，且受季节、气候和地域的限制，而微生物不仅不受这些因素的影响，而且种类繁多、生长速度快、加工提纯容易、加工成本相对比较低，充分显示了微生物生产酶制剂的优越性。现在除少数几种酶仍从动、植物中提取外，绝大部分是用微生物来生产的。
脂肪酶的微生物生产技术综述
脂肪酶的微生物生产技术综述 By 夏远川 脂肪酶是一种普遍存在于动植物和微生物体内的酶，也是最早研究的酶类之一，早在1834年就有关于兔胰腺脂肪酶活性的报道。[1] 脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，一般用于催化水解和合成反应，在油水界面上，它催化三酰甘油的酯键的水解，生成甘油一酯、甘油二酯或直接生成甘油和脂肪酸。[2]脂肪酶还可催化酯类化合物的醇解、酯化、酯交换等反应，且不需要辅酶，在工业生产和研究工作中均有广泛应用。[3] 脂肪酶按作用时的适应温度可分为高温脂肪酶、中温脂肪酶、低温脂肪酶；按适宜pH可分为碱性脂肪酶、中性脂肪酶、酸性脂肪酶。 脂肪酶的主要工业应用方向： 1、洗涤工业：在洗涤剂中添加脂肪酶可使洗涤剂对脂质类污渍的去除效果大大提高，并可减少表面活性剂及无机助剂（尤其是三聚磷酸钠）的用量，大大减少洗涤剂带来的环境污染。用于洗涤剂的脂肪酶为碱性脂肪酶，在碱性范围内有活性、活性不受表面活性剂影响、对氧系漂白剂稳定、热稳定性好，并且由于大多数加酶洗涤剂都适当配有蛋白酶，因此用于洗涤剂的脂肪酶还应具抗蛋白酶降解的能力。[4] 1988年，丹麦NOVO公司将碱性脂肪酶应用于洗涤剂中并推向市场。1992
年，这家公司构建了商业上第一株产脂肪酶菌株。[1] 2、食品工业：油脂改性是食品加工过程中的一个重要环节，脂肪酶可通过催化酯交换、酯转移、水解等反应，改变油脂的的物理化学性质，使便宜的、营养价值低的油脂升级为昂贵的、营养价值高的油脂；此外脂肪酶还可用于合成广泛应用于食品工业的糖酯类产品、合成不带副产物或毒性物质的芳香味酯类化合物、合成抗坏血酸酯类抗氧化剂如异抗坏血酸等。[5] 3、造纸工业：使用脂肪酶处理纸浆可减少胶黏物（绝大多数胶黏物都含有大量酯键）对造纸毛毯网间空隙的堵塞，提高纸机的运行效率和成纸品质，并降低环境污染，减少废水处理的负荷。 此外脂肪酶脱墨技术在废纸利用方面也起到非常大的作用，与传统脱墨技术相比脱墨效果更好环境污染更低，具有很大的优势。[6] 4、皮革生产：脂肪酶应用于制革和毛皮加工过程中的脱脂，相对于传统的脱脂方法具有脱脂均匀、脱脂废液中的油脂更易分离回收、减少甚至不使用表面活性剂、降低生产成本、提高成品质量等诸多优点，将碱性脂肪酶与脱脂剂在碱性条件下进行毛革两用皮革的脱脂，可大大提高脱脂效果。[7] 此外脂肪酶在饲料工业、生物表面活性剂、化妆品、生物传感、聚合物合成、手性化合物拆分、生物柴油等方面都具有重要的应用前景。 由于微生物生长繁殖快、所产脂肪酶种类多、微生物脂肪酶具有比动植物来源的脂肪酶更广的作用条件范围，且多为胞外酶，更适合于工业规模生产和获得高纯度产品，因此成为工业用脂肪酶的主要来源。[7]上世纪初，微生物学家
脂肪酶
第一章概述 脂肪酶(Lipase，E C．3.1.1.3)是指分解或合成高级脂肪酸与丙三醇形成甘油三酸酯酯键的酶。198年,Klibanov A M 等用脂肪酶粉或其固定化酶在有机溶剂体系中成功地催化合成了一系列有机物, 开始了脂肪酶非水相酶学的研究[1]。随着研究的深入, 发现脂肪酶具有良好的醇解、胺解、酯化和转酯等特性, 可被广泛地应用于有机合成、精细化工、药物中间体合成、手性化合物拆分以及生物能源等诸多领域。近年来,通过对界面酶学和非水相酶学的研究，从而进一步拓展了脂肪酶的应用领域，利用脂肪酶在有机相催化的各种反应可以合成大量高价值的产物，此外，脂肪酶在食品、医药、皮革和洗涤剂等许多工业领域中也有广泛的应用，充分显示了其巨大的应用潜力。 产脂肪酶的微生物种类很多，大约65个属微生物可产脂肪酶，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，而实际上可能更多。脂肪酶产生菌中得到深入研究的主要集中在根霉、曲霉、青霉、毛霉、假单胞菌等具有工业应用价值的菌种以及与医学相关的金黄色葡萄球菌、钩端螺旋体、粉刺状杆菌等。脂肪酶的筛选方法着眼于快速、简捷、准确、选择性强及易于自动化。脂肪酶产生菌主要从自然界中寻找，而脂肪酶高产菌的筛选通常采用含甘油三酯的琼脂平板法，并通过在培养基中添加指示剂如罗丹明B、溴甲酚紫、维多利亚蓝等作为筛选标记，然后采用不同的方法对培养条件进行优化。其筛选的一般过程是：样品分离→富集培养→平板初筛→摇瓶复筛。不同微生物合成脂肪酶的能力不同，因此，要达到工业用脂肪酶生产微生物的要求，首先要筛选和诱导出与所需酶学性质相符的高产菌株，或者构建高表达量的重组基因工程株。
脂肪酶
脂肪酶的应用进展综述 09生物技术0902021040 陈莹莹 摘要：脂肪酶被认为是工业中很重要的一利酶。本文概述了当前研究中广泛使用的脂肪酶及其固定化产品的应用途径, 包括在食品加工、饲料、纺织、医药、生物柴油和传感器等领域中的应用。脂肪酶应用的主要障碍是其成本高。但技术进步尤其是基因技术的发展有望使成本降低, 脂肪酶在药物合成中的应用在本文中也作了展望。 关键词：脂肪酶；性质；生产；来源，应用 脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 一、脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 二、脂肪酶的性质 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(V eeraragavan等)。总
脂肪酶特性与应用
饲料研究FEED RESEARCH NO .6,2011 5 脂肪酶特性与应用 陈倩婷广州博仕奥集团 饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个大问题，在耕地和水资源严重紧缺的情况下，粮食产量很难提高。我国动物生产中饲料转化率低，猪、鸡和奶牛等的饲料转化率均比国际先进水平低0.3 %~0.6 %，使饲料资源不足的问题更加严峻。饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足，酶制剂在饲料工业中的有效应用使得饲料工业和养殖业安全、高效、环保和可持续发展成为可能。 目前研究较多的饲用酶制剂有蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶及植酸酶等。脂肪酶也是一种重要的酶制剂，它能够水解脂肪（三脂酰甘油或三酰甘油）为一酰甘油、二酰甘油和游离脂肪酸，最终产物是甘油和脂肪酸。 产物脂肪酸为动物体生长和繁殖提供能量，部分中链脂肪酸能抑制肠道有害微生物，改善肠道菌落环境，从而促进消化，起到类似抗生素的作用，脂肪酶在常温常压下反应，反应条件温和，转化率高，具有优良的立体选择性，不易产生副产物，避免因化学催化法而带来的有害物质，不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 1 脂肪酶的特性 1.1 脂肪酶的来源 脂肪酶按其来源主要分为3类：1）动物源性脂肪酶，如：猪和牛等胰脂肪酶提取物；2）植物源脂肪酶，如：蓖麻籽和油菜等；3）微生物源性脂肪酶。由于微生物种类多、繁殖快且易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，所以，微生物脂肪酶是主要的研究对象。产微生物脂肪酶菌种的研究主要集中在真 菌包括，根霉、黑曲霉、镰孢霉、红曲霉、黄曲霉、毛霉、犁头霉、须霉、白地霉、核盘菌、青霉和木霉；其次是细菌，如：假单胞菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌工程菌、无色杆菌、小球菌、发光杆菌、黏质赛氏杆菌、无色杆菌、非极端细菌和洋葱伯克霍尔德菌等；另外还有解酯假丝酵母和放线菌。1.2 特性1.2.1 催化特性 脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。其催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，对均匀分散的或水溶性底物不作用，反应在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。Macrae 等研究表明：在油水界面上油脂量决定脂肪酶活性，增加乳化剂量，可提高油水界面饱和度，从而提高脂肪酶活性，增加油水界面面积，可承载更多脂肪酶分子，也可增加催化反应速率。而在水体系中，大多数脂肪酶活性很低或没有活性。 由于脂肪酶在非均相体系中表现出的高催化活性，且在酶催化反应中不需要辅酶，所以可利用非水相中的脂肪酶催化完成各种有机合成及油脂改性反应，如：酯化、酸解、醇解、转酯、羟基化、甲基化、环氧化、氨解、酰基化、开环反应和聚合等反应。 1.2.2 底物特异性 不同来源脂肪酶对底物不同碳链长度和饱和度脂肪酸表现出不同反应性，圆弧青霉和金黄色葡萄球菌脂肪酶水解短链(低于C 8)脂肪酸所形成的三脂酰甘油，黑曲霉和根霉对中等长链(C 8~C 12)脂肪酸形成的三脂酰甘油有强烈特异性，猪葡萄球菌脂肪酶偏爱磷脂为底物，也可以水解脂肪酸链长短不一的各种油脂。解脂无色杆菌对饱和脂肪酸表现出 收稿日期：2011 - 05 - 09
脂肪酶综述
脂肪酶综述 摘要：脂肪酶是一类能够催化酯的水解反应以及在非水相体系中催化脂肪酸和醇类发生酯化反应的酶类。随着酶学技术的快速发展，微生物脂肪酶也受到了越来越多的关注作为生物催化剂，脂肪酶一直以来都是生物技术领域中最重要的一类酶。 关键字：脂肪酶，酶活测定，非水相，食品工业应用。 简介：脂肪酶(三酰甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3)，是一类广泛存在于多种微生物中的生物催化剂。脂肪酶最早被发现可追溯至1901年，其天然作用底物为三脂酰甘油酯，能够将酯键水解，释放甘油二酯甘油一酯甘油以及游离脂肪酸随着非水酶学的发展，研究者发现，脂肪酶在非水相中能够催化酯化。酯交换以及转酯化反应，并且具有高度的选择性和专一性，已广泛应用于食品、医药、洗涤剂等行业。特别是在食品行业中得到了大量的应用，并逐渐成为食品领域中应用最为广泛的酶类之一。但是，由于目前脂肪酶相对于传统的化学催化剂的生产成本仍然偏高，这是制约脂肪酶工业化应用的主要问题，因此，在了解脂肪酶催化特性的基础上，通过筛选高产菌株，或者改变脂肪酶催化环境等方法提高脂肪酶的产率和利用率，降低利用脂肪酶进行工业化生产的成本是目前急需解决的主要问题。 1、脂肪酶的结构特点 研究表明, 来源不同的脂肪酶,其氨基酸组成数目从270~ 641不等,其分子量为29 000~ 100 000。迄今为止,人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达,并利用X -衍射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数, 确定了组成脂肪酶活性中心的三元组( triad)结构。多数脂肪酶都是单链蛋白, 比如CCL( A) 含有534个氨基酸残基, 其组成3 个小的和11个大的β-折叠及10个α-螺旋。其催化活性三元组由Ser-209、His-449和Glu341组成, Ser-209处于超二级结构折叠-螺旋[β-折叠( 202~208)-α -螺旋( 210~220) ]的转角处。多数成熟的天然蛋白还含有糖类组分, 如CCL( A) 含有4. 2%葡萄糖、甘露糖和木糖等,所以实际测得的分子量比理论分子量偏大[157 223(理论) , 60 000(实测)]。 脂肪酶通过与水/底物界面的相互作用来获得不同的构象状态。在关闭构象状态时“盖子”覆盖在酶的活性位点上。酶难以靠近底物分子而转变到开放构象状态时，催化通道入口打开. 近年来发现“盖子”的作用不仅仅是调节底物靠近活性位点的大门。“盖子”是两性分子结构在关闭状态酶的结构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部，当酶转变到开放状态时疏水端会暴露出来隐藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域引起脂肪酶的构象改变增加了酶与脂类底物的亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活。 2、脂肪酶的来源 脂肪酶是一种普遍存在于生物体的酶类，具有重要的生理学意义，同时也具有工业化应用的潜在可能性脂肪酶能够催化三酰甘油酯水解成为甘油和游离脂肪酸，而在有机相中，脂肪酶则催化酯化酯交换以及转酯化反应。在真核生物体内，脂肪酶参与许多类脂化合物的代谢过程，包括脂肪的消化、吸收、利用以及脂蛋白的代谢，在植物中，脂肪酶存在于储存能量的组织中。脂肪酶在微生物界分布很广，大约65 个属微生物可产脂肪酶，其中细菌有28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，但实际上微生物脂肪酶分布远远超过这个数
2脂肪酶的概念
脂 肪 酶 脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3) 脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。 脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。 1 脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 2 脂肪酶的性质 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(Veeraragavan等)。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性(Schmid等；Kazlauskas等)。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda 和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述 摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。 关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术 1.脂肪酶概述 脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。 1.1脂肪酶的结构与性质 在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶
中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。 与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。 1.2产脂肪酶微生物 微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。 与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶具有许多优点:(一)微生物脂肪酶种类多、来源广、生长周期短；(二)具有比动植物脂肪酶更广的pH和作用温度适应范围以及更广的底物适应类型；(三)微生物脂肪酶便于进行工业化生产，同时容易制取高纯度制剂。 目前，工业生产脂肪酶菌株主要集中在根霉、曲霉、假丝酵母、青霉、毛霉、须霉以及假单胞菌等。
脂肪酶综述
脂肪酶综述 摘要：脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。本文着重介绍脂肪酶的特点及应用。 关键字：脂肪酶性质来源应用
一、脂肪酶简介 脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。它是分解脂肪的酶。在动植物体和微生物中普遍存在,是一类特殊的酯键水解酶,催化如下反应:甘油三酯+ 水= 甘油+ 游离脂肪酸。它的另一重要特征是只作用于异相系统,即在油(或脂) 一水界面上作用,对均匀分散的或水溶性底物无作用即使作用也极缓慢,因此脂肪酶也可说是专门在异相系统或水不溶性系统的油(脂) —水界面上水解酯的酶。 二、脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 三、脂肪酶的性质 1.脂肪酶的理化性质 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水 不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质 方面存在不同。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、
微生物脂肪酶应用及研究进展
微生物脂肪酶应用及研究进展 摘要微生物脂肪酶主要来源于真菌和细菌，它是一类能够催化酯的水解反应以及在非水相体系中催化脂肪酸和醇类发生酯化反应的酶类。因其具有高底物专一性、区域选择性和对映选择性，而被广泛应用。本文主要论述了脂肪酶的结构、脂肪酶的理化性质以及脂肪酶在食品行业、医药工业、纺织和化工工业方面的应用，并对其未来的发展进行了展望。 关键词脂肪酶，酯化，应用，研究进展 Progress in research and application of microbial lipase Abstract Microbial lipases are mainly derived from fungi and bacteria, it is a kind of can catalyze hydrolysis of ester and enzyme catalyzed esterification of fatty acids and alcohols in non aqueous system. Because of its high substrate selectivity, regioselectivity and enantioselectivity, and is widely used. This paper mainly discusses the structure, properties and application of lipase in food industry, medicine, industry, and the future of its development was prospected. Key words lipase, esterification, application, research progress of 脂肪酶( EC 3.1.1.3) 又称三酰基甘油酰基水解酶，广泛存在于动植物和微生物体内。脂肪酶不仅可水解三脂酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸（其中的二脂酰甘油可进一步被水解为一脂酰甘油、甘油和游离脂肪酸），并且能催化水解反应的逆反应——酯化反应(张数政，1984)。目前脂肪酶生产主要有提取法和微生物发酵法。由于微生物脂肪酶种类多，作用温度及范围比动植物脂肪酶广、底物专一性高，并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂，因此微生物脂肪酶已成为工业生产脂肪酶的主要来源，关于脂肪酶在工业应用的研究也越来
微生物酶学
东北师范大学研究生课程论文 论文题目微生物酶的分类、作用机理及来源课程名称微生物酶学 姓名学号 专业年级 院、所年月日 研究生课程论文评价标准 东北师范大学研究生院制
微生物酶的分类、作用机理及来源 1.1淀粉酶 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。 α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。 β-淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。 糖化酶又称淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖。此酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1，6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。 此酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉。 异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。 1.2蛋白酶 蛋白酶系催化分解蛋白质肽键的一群酶的总称，它作用于蛋白质，将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸。此酶种类繁多，广泛存在于所有生物体内，按其来源可分为植物蛋白酶、动物蛋白酶、微生物蛋白酶(又可分为细菌蛋白酶、放线菌蛋白酶、霉菌蛋白酶等)；按其作用形式可分为肽链内切酶、肽链外切酶；按所产蛋白酶性能分为酸性蛋白酶、霉菌蛋白酶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶。酸性蛋白酶(最适pH=2～5)产生菌主要是黑曲霉、米曲霉、根霉、微小毛霉、似青霉、青霉、血红色螺孔菌等的某些种；中性蛋白酶(最适pH=7～8)产生菌主要是枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、米曲霉、栖土曲霉、灰色链霉菌、微白色链霉菌、耐热性解蛋白质杆菌等；碱性蛋白酶(最适pH=9～11)主要产生
微生物酶分类
1 微生物酶的分类、作用机理及来源 1.1淀粉酶。 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。 α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。 β-淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。 糖化酶又称淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖。此酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1，6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉。 异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。 1.2蛋白酶。 蛋白酶系催化分解蛋白质肽键的一群酶的总称，它作用于蛋白质，将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸。此酶种类繁多，广泛存在于所有生物体内，按其来源可分为植物蛋白酶、动物蛋白酶、微生物蛋白酶(又可分为细菌蛋白酶、放线菌蛋白酶、霉菌蛋白酶等)；按其作用形式可分为肽链内切酶、肽链外切酶；按所产蛋白酶性能分为酸性蛋白酶、霉菌蛋白酶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶。 酸性蛋白酶(最适pH=2～5)产生菌主要是黑曲霉、米曲霉、根霉、微小毛霉、似青霉、青霉、血红色螺孔菌等的某些种；中性蛋白酶(最适pH=7～8)产生菌主要是枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、米曲霉、栖土曲霉、灰色链霉菌、微白色链霉菌、耐热性解蛋白质杆菌等；碱性蛋白酶(最适pH=9～11)主要产生菌为枯草杆菌、腊状芽孢杆菌、米曲霉、栖土曲霉、灰色链霉菌、镰刀菌等。 微生物产生的蛋白酶大多是几种酶的混合物，只不过是主次之分而已。另外，改变培养基的组成或者菌种经诱变，可以改变产酶的性能，例如，据报道，黑曲霉的变株可生产碱性蛋白酶，米曲霉的变株可生产酸性蛋白酶。 1.3纤维素酶。 纤维素酶是降解纤维素β-1，4-葡萄糖苷键的一类酶的总称，因此纤维素酶又有纤维素酶复合物之称。通常认为主要包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶。C1酶主要作用天然纤维素，将其转变成水合非结晶纤维素；CX酶又可分为CX1酶和CX2酶，CX1酶是内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-1，4-糖苷键，生成纤维糊精和纤维二糖，CX2酶为外断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子的非还原性末端作用于β-葡萄糖苷酶又称纤维二糖酶，它作用于纤维二糖，生成葡萄糖。这些酶协同作用可将纤维素彻底降解为还原糖-葡萄糖。纤维素酶可破解富含纤维的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时又可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率。产生纤维素酶的微生物研究较多的是真菌，对细菌和放线菌研究很少。当前用来生产纤维素酶的微生物主要是木菌、黑曲霉、青霉和根霉，此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产黄纤维单孢菌、侧孢菌、粘细菌、梭状芽孢杆菌等也能产生纤维素酶。 由于纤维素酶难以提纯，实际应用的纤维素酶(尤其在饲料工业中)一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶如果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等。 1.4半纤维素酶。 半纤维素酶是分解半纤维素(包括各种降戊糖与聚己糖)的一类酶的总称，主要包括β-葡聚糖酶、半乳聚
脂肪酶的技术开发及其应用
脂肪酶的技术开发及其应用 一.脂肪酶 脂肪酶(LipaseEC3．1．1．3甘油水解酶)是一类特殊的酰基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。同时还催化其他一些水性酯类的水解(Hydrolyze)、醇解(Alchoholysis)、氨解(Aminolysis)、酯化(Esterification)、转酯化(Transesterification)以及酯类逆向合成反应。 (1)水解反应： RCOOR’+H20¨RCOOH-4-R’OH (2)合成反应： A 酯化：RCOOH+R’OH----RCOOR’+H20 B 酯交换：RCOOR'+R”COOR----RCOOR+R”COOR’ C 醇解：RCOOR’+R”OH---- RCOOR7’+R’0H D 酸解：RCOOR％R”COOH----R”COOR“RCOOH 脂肪酶广泛存在于动植物与微生物当中。动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织等。而植物中含脂肪酶较多的是油料作物种子。 目前脂肪酶的生产方法有提取法和微生物发酵法。 由于微生物脂肪酶具有种类多、比动物脂肪酶具有更广的作用pH和作用温度范围、便于进行工业生产和获取高纯度制剂等优点而得到广泛应用，特别是在油脂化工和有机合成工业中，酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点。尤其是l，3专一脂肪酶可用于特殊脂肪酸、单甘酯的合成及立体选择性化学合成和拆分，具有巨大应用潜力。因此微生物脂肪酶已经成为生产脂肪酶的主要来源，关于微生物脂肪酶在工业上的生产也越来越多。 二．微生物脂肪酶 微生物脂肪酶的生产： 以微生物为来源生产脂肪酶较动植物更具有巨大的潜力和优势。目前，国内外微生物脂肪酶的研究、生产和应用都取得很大的进展。 产脂肪酶的微生物共65个属，其中纲菌28个属，放线菌4个属，酵母菌10个属，其他真菌23个属(Jaeger 1994)。随着发现范圈的不断扩大，脂肪酶获得和制备的手段也产生了显著变化，从动植物提取到微生物纯种培养再到目前新兴的体外设计，重组表达。 经近20年来的深入研究，能应用于工业生产的微生物脂肪酶种类不断增加，目前已遍及细菌、酵母及霉菌各大类中，最近公布的36种不同来源的商业化脂肪酶中有19种来源于真菌，8种来源于细菌。我国微生物脂肪酶的生产，就目前而言，碱性脂肪酶仅绿微康独家生产，假丝酵母产中性脂肪酶也仅l、2家，绿微康碱性脂肪酶罐上发酵单位可稳定在6000u／ml左右，产品酶活可由几千吨到几万吨，甚至更高。我国微生物脂肪酶已实现产业化，虽然目前生产量还低，但已在诸多产业中逐步推广使用。由于价低质优，在国际市场中极具竞争力，绿微康已首次实现我国碱性脂肪酶的出口，而且份额正在逐步扩大之中． 三．提高脂肪酶产量 要提高脂肪酶的产量的途径主要有两个：育种改良和发酵工艺优化。 (1)育种改良 育种改良主要途径有：育种驯化、诱变育种和基因工程菌改造等。