乙肝表面抗原检测作业指导书

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证分析

乙肝表面抗原的 ELISA 法定量分析 方法学验证 姓名 Z P 学号 0925400072 班级 09 级医学检验本科二班 指导老师 沈 富 兵 二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证 作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500） 【摘要】目的用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面 抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。方法运用ELLISA法定量测定乙 肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml 的2 倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准 曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果HBsAg 线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。结论ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病 毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。 【关键词】乙肝表面抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA 病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。 我们采用对已知抗体浓度的样品进行E LISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。 1.1.2 仪器及酶标板 酶标仪：Bio-Rad680；洗板机：Bio-Rad1575；超纯水系统：Millipore Elix；电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。 1.1.3 溶液配制 ⑴0.01M pH7.4的PBS 缓冲液： 称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4, 溶于800ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析 方法学验证 姓名 Z P 学号 0925400072 班级 09级医学检验本科二班 指导老师沈富兵 二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500） 【摘要】目的用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。方法运用ELLISA法定量测定乙肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml的2倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果HBsAg线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。结论ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。 【关键词】乙肝表面抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA 病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。 我们采用对已知抗体浓度的样品进行ELISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。 1.1.2 仪器及酶标板 酶标仪：Bio-Rad 680；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix； 电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。 1.1.3 溶液配制 ⑴0.01M pH7.4的PBS缓冲液： 称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4, 溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。 ⑵质控品： 用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。

乙肝表面抗原检测操作规程

乙型肝炎病毒表面抗原检测（ELISA） 1原理： 在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（HbsAb-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。2试剂： 2.1试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法） 2.2试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司 2.3包装规格：96Test/Kit 2.4试剂盒组成：HbsAb预包被微孔板（包被HbsAb），HbsAg 酶标抗体（含HRP标记HbsAb）, HbsAg阳性对照（含基因工程HbsAg），HbsAg阴性对照（正常人血清），HbsAg样品稀释液（含BSA缓冲液），浓缩洗涤液（PBS-T缓冲液），底物A（含H2O2），底物B（含TMB），终止液（含H2SO4），封板膜，自封袋，说明书。 2.5试剂储存条件及有效期：2~8℃避光保存，有效12个月。 3样本采集： 取静脉血3-4ml于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于4℃冰箱保存，如长期保存需置于-15至-20℃冻存，并避免样本反复冻融。高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。 4所需仪器

4.1全自动酶免分析仪 4.2新鲜蒸馏水或去离子水 4.3酶标仪（单波长450nm或双波长450nm/630nm） 4.4微量移液器 4.5 37℃恒温箱或水浴箱 4.6洗板机或洗瓶 5检验方法 5.1平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。 5.2配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按1：19稀释后使用。 5.3编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。 5.4稀释：每孔加入20ul样品稀释液。 5.5加样：分别在相应孔中加入100ul阴、阳性对照血清或待测样本。 5.6温育：置37℃温育60min。 5.7加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul。 5.8温育：置37℃温育30min。 5.9洗涤：用洗涤液充分洗涤5次、洗涤后扣干（每次应保持30~60s的浸泡时间）。 5.10显色：每孔加入底物A、B各50ul，轻拍混匀，37℃暗置30min。 5.11终止：每孔加入终止液50ul，混匀。 5.12测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)

乙型肝炎表面抗原（HBsAg） 1、原理：采用抗-HBs包被反应板，加入待测样本，经孵育后，加入抗-HBs-HRP,当样本中存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗-HBs结合并与抗- HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。 2、标本采集与处理? 2.1 受检者准备：对于体检对象抽血前保持平时的饮食习惯，采血前应禁食4-6小时。 2.2静脉采血：除非是卧床病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响测定水平。故在采血前至少应静坐５分钟。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过１分钟，穿刺成功后立即松开止血带。 2.3采血管：一般采用血清做检验，可以用一般洁净的塑料管或玻璃试管作为容器。 2.4标本处理：血清：采血后，室温下自然放置1-2小时，待血液凝固、血块收缩后，在于3000转每分钟离心15分钟，吸出血清待用。血浆：采血后，样本和抗凝剂轻轻颠倒混匀6-8次后，充分离心，将血浆与血细胞分离后，吸出血浆待用。 2.5标本接收：接收标本时应检查标本是否符合要求(要求密封、无溶血、无杂物)、所用试管是否正确、试管是否填写完整、并问讯采血日期，对不合格标本应退回重采，并填写记录。

2.6标本储存：一般该标本应随到随做，血清和血浆标本在2-8o c 保存。如需长期保存，可在-20℃保存，并避免反复冻融。 3、试剂与仪器： 3.1测定试剂： 3.1.1生产厂商：英科新创（厦门）科技有限公司 3.1.2批准文号：国药准字S1******* 3.1.3包装：48T×1、96T×1 3.1.3试剂配置： 25倍浓缩稀释液 40ml×1瓶 HBsAg微孔反应板 96孔 HBsAg酶结合物 6.2 ml×1瓶 HBsAg阳性对照 1.0 ml×1瓶 HBsAg阴性对照 1.0 ml×1瓶 显色液A、B液各8.0 ml×1瓶 终止液 7 ml×1瓶 封板纸 5片 说明书 1份3．2测定仪器： 3.2.1酶标仪：上海安泰 MODEL MT-858 3.2.2洗扳机： ANALYTECH828 4、操作步骤： 4．1配液：配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释）

乙肝五项的检查及临床意义

乙肝五项的检查及临床意义 乙肝两对半即乙肝五项，是确诊和了解乙肝(又称B型肝炎)病情的重要依据。包括：乙肝表面抗原HBsAg、乙肝表面抗体HBsAb、乙肝e抗原 HBeAg、乙肝e抗体HBeAb、乙肝核心抗体HbcAb。正常情况下五项指标全部阴性或乙肝表面抗体HbsAb阳性。其中乙肝两对半检查中的“乙肝大三阳、乙肝小三阳”是了解乙肝(又称B型肝炎)病情最为重要的综合性指标。 一、乙肝两对半（包括了乙肝大三阳、乙肝小三阳）的检查及临床意义 HBV（乙肝病毒）感染后病毒产生的蛋白释放入血导致相应的血清标志物，主要有三对，即即表面抗原（HBsAg）和表面抗体（抗HBs或HBsAb）、e 抗原（HBeAg）和e抗体（抗HBe 或HBeAb）、核心抗原（HBcAg）和核心抗体（抗HBc或HBcAb），但核心抗原在血清中一般不易检出，仅其余两对半在血液中可检测出。 1、乙肝两对半（乙肝五项）的简要临床意义 2、乙肝五项各指标的常见变化与简要临床意义：

以上简单罗列了感染乙肝（B型肝炎）病毒后两对半的常见的一些表现形式，针对个体，可能仍存在其它不同的表现组合，或在转归中。所以碰到不典型的组合，不必担心，建议过段时间再次复检，一般不典型的情况不会持续太久。 3、乙肝两对半检测中乙肝大三阳、小三阳以及部分指标的临床意义及对策 （１）乙肝大三阳（乙肝五项135阳性）--是指两对半检查中，表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAb）为阳性。乙肝大三阳，说明乙型肝炎病毒在人体内复制活跃，传染性较强．这类患者体内的血液、唾液、精液、乳汁、宫颈分泌液都可有传染性，如果同时有转氨酶增高者，首先就应注意隔离，在家庭内患者的碗筷等餐具可单独与家人分开，定期消毒。 ★ 专家对策：患者应到专科医院就诊采用抗病毒，提高机体免疫力和对症降酶保肝措施。建议做肝功能和肝B超检查。如果都正常，不要乱治疗，定期每半年做一次肝功能和肝B超检查。可以服用中草药，比较安全有效，服用中草药调节肝脏免疫功能，促进肝细胞修复再生，增强肝的抵抗力，阻止肝脏纤维化。抗HBV-免疫疗法辩证治疗“大三阳”>>> （２）乙肝小三阳（乙肝五项145阳性）--是指在乙肝（又称B型肝炎）的“两对半”检查的五项指标中，表面抗原(HBsAg)、E抗体(HBeAb)和核心抗体(HBcAb)检测均是阳性。提示急性或慢性乙型肝炎，体内病毒复制，为乙型肝炎病毒复制状态。乙肝小三阳通常是由“乙肝大三阳”转变而来，是人体针对E抗原产生了一定程度的免疫力。 ★ 专家对策：乙肝小三阳（乙肝五项145阳性）应检查HBV-DNA及肝功能，根据具体情况进行综合分析。如果HBV-DNA（+）且肝功能异常，说明病毒复制，传染性强，应该采

三种方法检测乙肝表面抗原结果的比较

三种方法检测乙肝表面抗原结果的比较 发表时间：2012-02-02T14:50:30.183Z 来源：《中国健康月刊（学术版）》2011年第12期供稿作者：金大伟富宏然高莉莉[导读] 中国是乙型病毒肝炎的高发国家,根据流行病学调查, 人群发生率较高, 表面抗原携带率约为15% 金大伟富宏然高莉莉（黑龙江省牡丹江市红旗医院检验科黑龙江牡丹江157011）【摘要】目的：通过乙肝表面抗原，比较三种方法学的优缺点。方法：采用化学发光法检测乙肝，然后对阳性标本分别用酶联免疫吸附试验和金标方法复检。结果：总数为13207份标本，化学发光方法检测表面抗原阳性的标本为1524份，ELISA方法复检后阳性标本数为1415，金标方法复检后阳性标本数为1241。结论：灵敏度化学发光方法最高、ELISA方法居中、金标方法最差；操作金标方法最简单、ELISA居中、化学发光方法稍难；金标方法假阴性假阳性率最高。因此，金标方法只能进行筛检，阳性或阴性都不能定诊。【关键词】乙肝表面抗原；化学发光法；ELISA；金标法 【中图分类号】R156.3【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)12-0156-01 中国是乙型病毒肝炎的高发国家,根据流行病学调查, 人群发生率较高, 表面抗原携带率约为15%［1］。乙肝的实验诊断对于其治疗及预防有重要参考意义。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是由Dane颗粒的外壳和直径22 nm的球型颗粒和管型颗粒所组成［1］。HBsAg是HBV感染后第一个出现的血清学标志物,也是诊断的重要指标之一。HBsAg阳性见于急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。值得注意的是在急性感染的恢复期,存在核心窗口期现象,即该时期HBsAg消失,抗- HBs还未出现的,此期可短至数天或长达数月。 目前检测乙肝有三种比较常用的方法学，即酶联免疫吸附试验(ELISA)、金标法、化学发光法。中国大多数临床实验室都采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法来检测HBsAg。但对于HBsAg低浓度的标本,检测时常因方法学的原因造成灵敏度较低,导致临床出现漏检,给病人带来损失,尤其是需要临床输血的病人。；金标法(Goldimmnnochromatography，GICA)是在ELISA基础上发展起来的一种检测技术，由于其具有操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点，也广泛应用于HBsAg的初筛；缺点式是此种方法灵敏度比ELISA更低，而且假阳性率、假阴性率都很高。近年来发展起来的化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)是灵敏度非常高的方法。解决了低浓度HBsAg的检测问题。现将三种种方法对乙肝表面抗原的检测作一比较。 1资料和方法 1.1 标本来源：收集牡丹江医学院红旗医院检验科免疫室2010年全年常规做乙肝“二对半”标本13207份，用半自动化学发光方法筛出乙肝表面抗原阳性的标本1515份进行复检，并通过金标法和酶联方法进行比较。 1.2 方法：半自动化学发光方法原理：采用酶促化学发光，双抗体夹心方法，用辣根过氧化物酶作为标记酶，催化鲁米诺发光，并在化学发光仪上读出发光值并计算含量，此种方法为定量方法。 金标方法原理：试剂条以胶体金为指示标记包被特异的抗体,应用免疫层析双抗体夹心原理检测样本中的乙肝表面抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)法原理：采用双抗体夹心方法，用辣根过氧化物酶作为标记酶，催化TMB和过氧化氢产生有色物质，加入酸性终止液后用酶标仪读取光密度值进行计算并判断阴阳性，此种方法未定性方法。 2试剂与仪器 半自动化学发光仪器为GloRunner型半自动化学发光仪，配套试剂为北京科美化学发光试剂。金标试剂为广州万孚乙肝二对半金标板。ELISA试剂为上海科华试剂，酶标仪为Bio-Tek ELX800，洗板机为ELx50洗板机。 3检测 所有标本先由半自动化学发光仪进行表面抗原检测，阳性标本再用ELISA和金表方法进行检测。所有检测严格按照标准SOP操作文件进行操作，质控品由黑龙江省临检中心提供。 4结果 总数为13207份标本，半自动化学发光方法表面抗原阳性的标本为1524份，ELISA方法复检后阳性标本数为1415，金标方法复检后阳性标本数为1241。 5讨论 从以上结果来看，半自动化学发光法阳性率最高，ELISA方法较化学发光法阳性率低，金标方法阳性率最低。化学发光方法要比ELISA方法敏感，化学发光方法检测弱阳性标本用ELISA方法检测呈现阴性，同样ELISA方法检测弱阳性的标本用金标方法同样也呈现阴性。ELISA方法是国内主要检测乙肝的方法，是一种操作步骤比较简单，灵敏度表较高的方法，所用仪器酶标仪的价格也不是很高，甚至目测也可以报结果。金标法操作最为简单，不需要任何仪器，很适合快速的筛检，但是此种方法的缺点也很明显，检测的灵敏度不高，存在一定假阳性率的问题，金标方法检测的结果，阴形可能存在假阴性，阳性也需要进行复检。在实际工作中，曾经有过金标表面抗原强阳性，但是经过化学发光和酶联免疫方法测定，变为阴性。因此金标方法检测的结果不能作为定诊的依据，必须经过其他的方法进行验证，只能作为乙肝的筛检，其结果还必须进行确认。化学发光法是近年发展比较快的检测方法学，我们所用的半自动化学发光方法采用的是酶促化学发光法，其基本的检测操作与ELISA方法一致，只有最后进行检测的时候加入的酶促底物不一样，ELISA加入的是TMB和双氧水，而酶促化学发光加入的是鲁米诺和双氧水。ELISA用酶标仪检测或根据检测孔的颜色进行目测判断结果；而酶促化学发光方法必须用化学发光仪进行定性或定量分析检测。化学发光方法检测灵敏度要高于ELISA，对于ELISA方法检测弱阳性的标本可以用化学发光方法进行复检并且进行定诊。酶促化学发光方法与ELISA方法操作步骤相当，敏感度却高很多。缺点是酶促化学发光方法检测必须依靠机器，不可以用肉眼观察结果。另外，加入酶促底物后，发光值会随着时间的延长而进行性衰减，因此化学发光法进行读取数据时必须在规定的时间内读取。经过我们监测发现，化学发光读取发光值时即使在规定的读取时间内，每隔1分钟检测一次发光值，同一孔在不同的时间点上的发光只相差很多，因此化学发光对于发光值的读取最好在加入底物后同一时间进行读取，这一点对于定量检测比较好。参考文献 ［1］化学发光微粒子免疫分析法与酶联免疫法测定乙肝表面抗原的比较［2］刘秀琴,傅杭州,张晓俐《海南医学》2010年第21卷第8期

乙肝表面抗原检测操作规程

乙型肝炎病毒表面抗原检测（ ELISA） 1原理： 在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（ HbsAb-HRP）及 TMB 等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。 2试剂： 2.1试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法） 2.2试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司 2.3包装规格： 96Test/Kit 2.4试剂盒组成：HbsAb预包被微孔板（包被 HbsAb），HbsAg 酶标抗体（含 HRP标记 HbsAb）, HbsAg 阳性对照（含基因工程 HbsAg），HbsAg 阴性对照（正常人血清），HbsAg样品稀释液（含 BSA缓冲液），浓缩洗涤液（ PBS-T 缓冲液），底物 A（含 H2O2），底物 B（含 TMB），终止液（含 H2SO4），封板膜，自封袋，说明书。 2.5试剂储存条件及有效期： 2~8 ℃避光保存，有效 12 个月。 3样本采集： 取静脉血 3-4ml 于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于 4℃冰箱保存，如长期保存需置于 -15 至-20 ℃冻存，并避免样本反复冻融。高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。 4所需仪器

4.1全自动酶免分析仪 4.2新鲜蒸馏水或去离子水 4.3酶标仪（单波长 450nm或双波长 450nm/630nm） 4.4微量移液器 4.537 ℃恒温箱或水浴箱 4.6洗板机或洗瓶 5检验方法 5.1平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温 （ 18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。 5.2配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按 1：19 稀释后使用。 5.3编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。 5.4稀释：每孔加入 20ul 样品稀释液。 5.5加样：分别在相应孔中加入 100ul 阴、阳性对照血清或待测样本。 5.6温育：置 37℃温育 60min 。 5.7加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体 50ul 。 5.8温育：置 37℃温育 30min 。 5.9洗涤：用洗涤液充分洗涤 5 次、洗涤后扣干（每次应 保持 30~60s 的浸泡时间）。 5.10显色：每孔加入底物 A、B 各 50ul ，轻拍混匀， 37℃ 暗置 30min 。 5.11终止：每孔加入终止液 50ul ，混匀。 5.12测定：用酶标仪单波长 450nm 或双波长 450nm/630nm 测

三种方法检测乙肝表面抗原结果的比较

三种方法检测乙肝表面抗原结果的比较 摘要】目的：通过乙肝表面抗原，比较三种方法学的优缺点。方法：采用化学 发光法检测乙肝，然后对阳性标本分别用酶联免疫吸附试验和金标方法复检。结果：总数为13207份标本，化学发光方法检测表面抗原阳性的标本为1524份，ELISA方法复检后阳性标本数为1415，金标方法复检后阳性标本数为1241。结论：灵敏度化学发光方法最高、ELISA方法居中、金标方法最差；操作金标方法最简单、ELISA居中、化学发光方法稍难；金标方法假阴性假阳性率最高。因此，金 标方法只能进行筛检，阳性或阴性都不能定诊。 【关键词】乙肝表面抗原；化学发光法；ELISA；金标法 【中图分类号】R156.3【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)12-0156-01 中国是乙型病毒肝炎的高发国家,根据流行病学调查, 人群发生率较高, 表面抗 原携带率约为15%［1］。乙肝的实验诊断对于其治疗及预防有重要参考意义。 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是由Dane颗粒的外壳和直径22 nm的球型颗粒和 管型颗粒所组成［1］。HBsAg是HBV感染后第一个出现的血清学标志物,也是诊 断的重要指标之一。HBsAg阳性见于急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。值得 注意的是在急性感染的恢复期,存在核心窗口期现象,即该时期HBsAg消失,抗- HBs 还未出现的,此期可短至数天或长达数月。 目前检测乙肝有三种比较常用的方法学，即酶联免疫吸附试验(ELISA)、金标法、化学发光法。中国大多数临床实验室都采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法来检 测HBsAg。但对于HBsAg低浓度的标本,检测时常因方法学的原因造成灵敏度较低,导致临床出现漏检,给病人带来损失,尤其是需要临床输血的病人。；金标法(Goldimmnnochromatography，GICA)是在ELISA基础上发展起来的一种检测技术，由于其具有操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点，也 广泛应用于HBsAg的初筛；缺点式是此种方法灵敏度比ELISA更低，而且假阳性率、假阴性率都很高。近年来发展起来的化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)是灵 敏度非常高的方法。解决了低浓度HBsAg的检测问题。现将三种种方法对乙肝表 面抗原的检测作一比较。 1资料和方法 1.1 标本来源：收集牡丹江医学院红旗医院检验科免疫室2010年全年常规做 乙肝“二对半”标本13207份，用半自动化学发光方法筛出乙肝表面抗原阳性的标 本1515份进行复检，并通过金标法和酶联方法进行比较。 1.2 方法：半自动化学发光方法原理：采用酶促化学发光，双抗体夹心方法，用 辣根过氧化物酶作为标记酶，催化鲁米诺发光，并在化学发光仪上读出发光值并 计算含量，此种方法为定量方法。 金标方法原理：试剂条以胶体金为指示标记包被特异的抗体,应用免疫层析双 抗体夹心原理检测样本中的乙肝表面抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)法原理：采用 双抗体夹心方法，用辣根过氧化物酶作为标记酶，催化TMB和过氧化氢产生有色物质，加入酸性终止液后用酶标仪读取光密度值进行计算并判断阴阳性，此种方 法未定性方法。 2试剂与仪器 半自动化学发光仪器为GloRunner型半自动化学发光仪，配套试剂为北京科 美化学发光试剂。金标试剂为广州万孚乙肝二对半金标板。ELISA试剂为上海科 华试剂，酶标仪为Bio-Tek ELX800，洗板机为ELx50洗板机。

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 摘要 目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。方法：ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。结果：标准曲线R2=0.997，准确度97.07%，1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，检测限LOD为0.172ng/ml，低浓度样品（<1.5ng/ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。结论：该HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。 关键词：乙肝表面抗原 ELISA 定量分析方法学验证 前言 乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。随着免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义[1]。ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检测。目前临床上多倾向于做定量分析，若想知道检验结果是否可靠，实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证，本实验对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现报告如下。 1. 材料与方法

1.1 试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。 1.2 仪器 酶标仪：Bio-Rad 680 ；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix ；电热恒温培养箱(DNP-9052)上海精宏实验设备有限公司；振荡器（苏州管械，KJ-201A）；移液器；Tip头；EP管。 1.3 方法 1.3.1．溶液配置 1×PBS缓冲液的配置：称取8g NaCl、 0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。 标准品的配置：原始标准品浓度为8 ng/ml。。取6个2mlEP管，分别标记为S1-S6。50ul/well, 共1孔需50ul，每孔配置60ul备用，按照下表稀释方案进行稀释。 表1 标准品的稀释方案 质控品的配置：50ul/well, 共5复孔需250ul，配置300ul备用，取3个2 mlEP管，分别标记为C1，C2，C3，按照下表稀释方案进行稀释。表2 质控品的稀释方案 1.3.2．铺板方案

实验三 乙型肝炎病毒表面抗原检测

实验三乙型肝炎病毒表面抗原检测 一、目的 掌握ELISA原理和方法 二、实验原理 采用EIA双抗原夹心法检测人血清或血浆中的抗-HBs。并采用HBsAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP，进行孵育，当标本中存有抗-HBs 时，该抗-HBs与包被的HBsAg结合并与酶结合形成酶结合物HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP复合物，洗去反应物，加入显色剂后，将有明显的颜色变化；当标本中没有抗-HBs时，加入底物后没有或只有很轻微颜色变化。 三、试剂与器材 1.试剂 酶结合物、抗-HBs阳性对照，浓缩洗涤液、显色剂A、显色剂B、终止液（2mol/L H2SO4）、7号待测样品、8号待测样品 2.器材 预包被反应板（9孔）、封板胶条、移液枪、摇床 四、操作步骤 1.取7号待测样品分别填装到4孔中，每孔50μL。同样取8号待测样品分别 填装到4孔中，每孔50μL。剩余一孔装填50μL抗-HBs阳性对照。 2.加酶结合物，每孔50μL，并充分混匀，贴上标签纸，置于37℃孵育30min。 3.手工洗板：弃去孔中液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液350μL灌注每孔， 静置5-10秒，弃去孔内洗涤液拍干，如此反复五次。 4.加显色剂：先加显色剂A，每孔50μL；再加显色剂B，每孔50μL；充分混 匀，放置37℃避光孵育15,min。 5.终止反应：每孔加入终止液50μL，混匀。

6.观察颜色变化。 五、实验结果分析 从实验结果看出7、8号待测样品皆无明显的颜色变化，但是阳性对照组再加入显色剂A、B后立即显现蓝色，再加入终止液后立即显现黄色。表明7、8号待测样品皆无抗-HBs。 而反应显色原因为底物过氧化氢脲溶液和TMB，在HRP酶的作用下，产生蓝色的阳离子根；加入终止液后，一方面，硫酸破坏了HRP酶的活性，使酶的催化功能丧失，另一方面，pH降低，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌。但本实验并未用上酶标仪，故测定联苯醌的消光系数也无法进行。

乙肝表面抗原检查结果中COI和Uml的区别

乙肝表面抗原检查结果中COI和mIU/ml的区别？ 乙型肝炎表面抗原（Hapatitis B surface antigen，HBsAg）为乙型肝炎病毒表面的糖蛋白，感染HBV后，HBsAg为首先出现的病毒标志物。乙型肝炎表面抗原的检测，主要用于乙型肝炎的早期诊断、乙肝普查及明确乙肝相关类型。近来我科室多次接到咨询，咨询感染疾病筛查报告中“乙肝表面抗原”为何会出现 COI和m IU/ml两种单位。为什么会出现两种单位？两种单位的区别在哪里？原因还要从其检测方法说起。 目前HBsAg的检测方法，主要分以下几种： 一、定性-胶体金法：是一种定性检测，两条带是阳性，灵敏度不太高，临床医生用的比较少。目前我科室主要用于阳性标本的复合。 二、半定量法：报告能体现出数值，但这个数值是“比值”，是样本参数与对照参数的比值，所以只能称得上半定量。市面上常见的半定量法有两种，一种是ELISA法，一种是ECLIA法。 1.酶联免疫吸附法-ELISA法：报告上的数值是“S/CO值”或“OD/CO值”：S或OD代表被测样本吸光度，CO代表阴性对照平均吸光度，OD/CO大于1.判断为阳性。被测样本OD值越大，OD/CO值越大，HBsAg含量越高。 2.电化学发光免疫法-ECLIA法：这种方法的化验单给出的数值的单位是COI，即cut off index的缩写，和刚才提到的OD/CO值比较类似，也是一种“比值”，COI＜1视为阴性。 对于以上提到的不能完全定量的三种方法，大致认为ECLIA灵敏度大于ELISA大于胶体金法。 三、定量法： 定量检测方法不仅可以灵敏地检测出血中很微量的病毒抗原和抗体，而且可以准确地检测出乙肝表面抗原在血清中的量(IU/ml或mIU/ml)。目前表面抗原定量检测的方法有：微粒子化学发光法、时间分辨免疫荧光法和电化学发光法。 乙肝病毒携带者需要定期检查肝功能、HBVDNA定量、AFP和彩超等，有越来越多的临床证据和资料显示，定期检查乙肝表面抗原定量是很有必要的。其主要意义有一下几点： 1.评估疾病状态处于免疫耐受期的乙肝“大三阳”携带者，转氨酶持续正常，HBVDNA 复制活跃，大多数超过7次方拷贝，乙肝表面抗原精确定量的数值也往往很高，多数超过2万 IU/ml。一旦进入免疫清除期，谷丙转氨酶持续或者反复升高，HBVDNA定量的数值会出现比较大的波动，乙肝表面抗原定量往往也会出现明显的变化和起伏。小三阳或者小二阳的患者，经常检查乙肝表面抗原定量，联合肝功能和病毒量，可以更好地判断是携带者还是肝炎。 2..选择抗病毒方案一般来说，乙肝表面抗原定量的数值越高，干扰素治疗成功的概率就越低。抗病毒治疗前检测乙肝表面抗原定量，对于决定治疗方案意义很大。“小三阳”或者“小二阳”肝炎患者，医学上称之为HBeAg 阴性慢性乙肝，干扰素治疗的短期疗效较好，但是停药后复发率非常高。“小三阳”肝炎患者如果治疗前乙肝表面抗原定量低于 1500 IU/ml,选择干扰素治疗的复发率将大大降低，而且干扰素治疗后获得乙肝表面抗原清除的概率也比较高，此时就可以考虑尝试干扰素治疗。 3.判断治疗效果每三个月定期检查乙肝表面抗原定量水平，对于个体化制定干扰素治疗方案至关重要，是疗效不佳者决定提前终止干扰素治疗的关键性检查指标。 在使用核苷（酸）类似物治疗的患者中，疗效好的患者不但表现为HBVDNA定量明显降低，乙肝表面抗原定量的数值也会大幅度降低。抗病毒治疗后HBVDNA低于检测下限，定期检测乙肝表面抗原定量水平是判断疗效、预测乙肝表面抗原转阴的最重要的指标。 4.更好地把握停药时机核苷（酸）类似物治疗的时间很长，把握停药时机很重要。“小

乙肝表面抗原阳性是什么意思

乙肝表面抗原阳性是什么意思 *导读：乙肝表面抗原阳性是很多人经常听到却不了解的病症，其实，如果一个人被检测出乙肝表面抗原阳性，证明其已经感染乙肝病毒。乙肝表面抗原常存在于乙肝患者的血液、唾液、乳汁、汗液等体液中，感染乙肝病毒6个月内一般可检测出阳性。 乙肝表面抗原阳性是很多人经常听到却不了解的词句，其实，如果一个人被检测出乙肝表面抗原阳性，证明其已经感染乙肝病毒。乙肝表面抗原常存在于乙肝患者的血液、唾液、乳汁、汗液等体液中，感染乙肝病毒6个月内一般可检测出阳性。 那么，当乙肝表面抗原呈阳性的时候，是否代表此人患上了乙肝呢？许多人在体检中被查出乙肝表面抗原阳性时，会误以为自己患上了乙肝，陷进忧虑和低落的情绪中，也害怕将乙肝传染给他人。其实当乙肝表面抗原呈阳性时，不一定是患上了乙肝，可能是以下几种情况：1.进入乙肝潜伏期。患者在乙肝发病前3周左右，乙肝表面抗原会呈阳性。2.乙肝表面抗原阳性可能意味者此人为乙肝病毒携带者，有些人发现乙肝表面抗原阳性时肝功能已经恢复正常，就不需要进行治疗。3.慢性乙肝，此类患者通常具有乙肝的症状的体征，此时患者体内的病毒正在繁殖，并且

损伤肝脏，必须及时进行治疗。 如果检查发现乙肝表面抗原阳性该怎么办？此时患者不必过于惊慌和忧郁，因为不一定意味着已经患上乙肝。所以这时应该首先到医院进行详细复查，进行肝功能和乙肝两对半等相关的五项指标检查，如果结果都为阴性，则并没有患上乙肝，此时可通过接种乙肝疫苗进一步预防乙肝的发生。若复查结果中某些指标呈阳性，可能说明患上了乙肝。同时，患者要经过检查，确定自己是属于乙型肝炎发病状态还是仅为乙肝病毒携带者。若检查结论为患上了乙肝，则需要用药治疗。常见的治疗方法为注射干扰素或服用核苷酸类药物，但是此类方法副作用大，很容易损伤身体。患者应根据医生指导进行进一步治疗。 若检测得出乙肝表面抗原阳性，不要过于惊慌，应调整饮食并保持良好的心态，在医生指导下进行进一步的检查与治疗。

乙型肝炎病毒表面抗原胶体金法说明书

【产品名称】 通用名称：乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)检测试剂盒（胶体金法） 英文名称：Diagnostic Kit for Hepatitis B Surface Antigen (Colloidal Gold) 【包装规格】 条型：25人份/盒（1人份/袋×25袋）、50人份/盒（1人份/袋×50袋）、100人份/盒（1人份/袋×100袋）、 100人份/盒（25人份/筒×4筒）。 卡型：20人份/盒（1人份/袋×20袋）、40人份/盒（1人份/袋×40袋）。 【预期用途】 本产品用于体外定性检测人血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。 本产品适用于乙型肝炎病毒感染的辅助诊断。乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种世界性传染疾病，该病主要通过血液、母婴和性接触进行传播。乙肝表面抗原是乙肝病毒的外壳蛋白，伴随乙肝 病毒感染出现在血液中，是乙肝病毒感染的主要标志。乙肝表面抗原检测是该病的主要检测方法之一。【检测原理】 本试剂应用双抗体夹心法免疫层析胶体金技术检测样本中的乙肝表面抗原。试剂在检测线（T线）包被有HBsAg-1抗体，质控线（C线）包被有羊抗鼠IgG，在胶体金垫上含有胶体金标记的HBsAg-2抗体。检测时，若为阳性样本，样本中的HBsAg先与胶体金垫上的抗体反应，形成抗原-金标抗体复合物，在NC膜上层析至检测线时，会与包被HBsAg-1抗体形成抗体-抗原-金标抗体复合物，并在检测线位置显示出色带。若样本中无HBsAg，则不能形成复合物，T线位置上不出现色带。C线在检测样本时均应出现色带，否则试验无效。本试剂具有使用简便，稳定性好，特异性强、灵敏度高的特点。 【主要组成成份】 检测条/卡：在检测线包被有抗乙型肝炎病毒表面抗原抗体1（小鼠来源），质控线包被有羊抗小鼠IgG抗体，在胶体金垫上含有胶体金标记的抗乙型肝炎病毒表面抗原抗体2（小鼠来源）；滴管：仅适用于卡型；干燥剂。 不同批号试剂中各组份不能互换。需要用户自备计时器，如钟表等。 【储存条件及有效期】 4-30℃干燥阴凉避光保存，有效期20个月。打开内包装后检测试剂会因吸湿失效，需在30分钟内使用。 【样本要求】 1. 可用于检测血清/血浆样本。

金标法乙肝表面抗原检测方法学探讨(一)

金标法乙肝表面抗原检测方法学探讨(一) 【摘要】通过从灵敏度、特异性、准确性及稳定性等四个方面对金标乙肝表面抗原检测法进行方法学探讨，并分别用金标法及酶免疫法对1200例体检及临床标本进行检测，发现金标法检测血清中乙肝表面抗原特异性强，灵敏度高，与酶免疫法符合率为99.0%，且无需特殊仪器设备，简便快速，具有广泛应用价值。 【关键词】金标法；乙肝表面抗原 乙肝表面抗原（HBsAg）是乙型肝炎病毒外壳蛋白中的主要成分阳性是感染乙肝病毒的标志，是检查乙肝血清标志物中较重要的一项〔1〕。近年来发展的金标法检测HBsAg，与传统的酶免疫法（EIA）相比，具有简便、快速、准确，不需要仪器设备等优点，能满足临床急诊快速出结果的需要，且较适合使用于流行病学调查，应用前景非常宽广。 1材料与方法 1.1材料（1）金标试纸条：上海洪泰生物技术发展有限公司产品。（2）HBsAg灵敏度标准参比品：中国药品生物制品检定所产品。（3）HBsAg酶免疫诊断试剂盒，HBsAg、HBcAg、HBeAg 阳性对照血清：中外合资上海实业科华生物技术有限公司产品。（4）血清标本：1200份体检及临床血清标本，其中乙型肝炎患者血清172份，健康人血清1028份。 1.2方法（1）5ng/ml标准参比品用生理盐水分别稀释成4ng/ml,3ng/ml,2ng/ml,1ng/ml几种浓度，各取0.1～0.2ml置于洁净试管中，用金标法试纸条进行检测，严格按照说明书所述，将测试条有金标抗体端插入血清内，放置一定时间后观察结果。（2）HBsAg、HBcAg、HBeAg 阳性对照血清各取3份，每份为0.1～0.2ml加入已备好洁净试管中，用金标法对各份血清进行检测。（3）分别用金标法、EIA法对1200份体检及临床血清标本进行检测。（4）将金标试纸条各10条分置于37℃、室温（25℃）保存5天，做热稳定试验。 2结果 （1）用金标法对5种浓度的HBsAg阳性标准参比品进行检测。结果确定时间：强阳性参比品（4～5ng/ml）在2min内即可在检测线见到红色胶体金颗粒聚集；阳性参比品（3mg/ml）在5min内即可出现两条紫红色线条，弱阳性标本（1～2ng/ml）约需20min确定结果。说明了金标法敏感性较强，灵敏度可达1ng/ml，可以满足临床要求。（2）将金标试纸条分别插入HBsAg、HBcAg、HBeAg阳性对照血清各3份中，结果只有HBsAg阳性对照血清管中试纸条出现两条红色线，说明该试纸条只与HBsAg有特异性反应，特异性强，不易出现假阳性。（3）分别用金标法、EIA法对1200份体检及临床血清标本进行检测，所得结果显示：金标法与EIA法所做结果有162例阳性结果一致，有1026例阴性结果一致，有12份血清两法检测结果不符，比较两法检测HBsAg的一致性，符合率为99.0%。12份两法结果不符的血清中，有5例（乙肝组3份，健康组2份）金标法呈弱阳性，而EIA阴性，但这5份血清EIA吸光度值均接近临界值。另7例（均为乙肝组血清）金标法阴性，EIA为HBsAg弱阳性。通过计算，可得出金标法临床灵敏度为95.9%，临床特异性为99.8%，临床准确度为99.2%，阳性预测率为98.8%。（4）将金标法试纸于37℃、25℃各10条放置5天后，测定10份不同血清标本（乙肝组与健康组各5例），所得结果与放置4℃的试纸检测结果无明显差别。说明金标法试纸条性质较稳定，易保存。

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证

乙肝表面抗原的E L I S A 法定量分析方法学验证标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 摘要 目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。方法：ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsA g标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，ml 3个浓度梯度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。结果：标准曲线R2=，准确度%，m l的RSD为%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，检测限LOD为ml，低浓度样品（