乙肝表面抗原定量测定的方法学验证分析

乙肝表面抗原的 ELISA 法定量分析

方法学验证

姓名

Z P

学号

0925400072

班级

09 级医学检验本科二班

指导老师

沈 富 兵

二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）

【摘要】目的用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面

抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。方法运用ELLISA法定量测定乙

肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml 的2 倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准

曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果HBsAg 线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。结论ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病

毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。

【关键词】乙肝表面抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA

病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。

我们采用对已知抗体浓度的样品进行E LISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂盒

乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。

1.1.2 仪器及酶标板

酶标仪：Bio-Rad680；洗板机：Bio-Rad1575；超纯水系统：Millipore Elix；电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。

1.1.3 溶液配制

⑴0.01M pH7.4的PBS 缓冲液：

称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4, 溶于800ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。

⑵质控品：

用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml 三个质控品，每质控品

1ml。首先取450μl的8ng/ml 的标准品到C1号EP管中再向其中加入150μl的PBS 缓冲液，即配制成了6ng/ml 的质控品，再取300μl C1 号EP 管内的溶液到C2 号EP管内，再向C2号管内加入300μl的缓冲液混匀。即配制成了3ng/ml 的质控品。接着取300μl C2 号管内的液体到C3 号EP管内，再加入300μl的缓冲液混匀，即配制成了1.5ng/ml的质控品。具体方法如下图1

C1

6ng/ml

1.2 检测方法

1.2.1 标准曲线各浓度的配制

C2

3ng/ml

图1

C3

1.5ng/ml

⑴用PBS缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。

⑵先取6个EP管分别标记为对应的浓度。

⑶取400μl标准品于标记为①的EP管中，再取200μl①号管内液体于②号管内再向②号管中加入200μl的缓冲液混匀，即配制成了浓度为4ng/ml 的标准品。

⑷再从②号管内取200μl的液体到③号管内，接着取200μl的缓冲液到③号管内混匀，即配制成了2ng/ml 的标准品。

⑸从③号管内取200μl的标准品到④号管内，再向④号管内加入200μl的缓冲液混匀，即配制成了1ng/ml 的标准品。

⑹用同样的方法，配制好浓度分别为0.5ng/ml、0.25ng/ml.的标准品体积分别为200μl、200μl、400μl备用。具体方法如下图2

S1 8ng/ml

S2

4ng/ml

S3

2ng/ml

S4

1ng/ml

S5

0.5ng/

S6

0.25ng/

ml ml

图2

1.2.2测定方法

⑴取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，在相应孔中加入已配制好的系 列标准品、质控品及空白对照；

图 3

注：双线框区域为标准品,浓度依次为 8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml ，三线框区域为质控品，浓度依次为 6、3、1.5ng/ml ，粗框区域为空白对照加入的是 PBS 缓冲液，每个孔内加入的均是 50μl 。

⑵37℃温育 30min ，洗板 4 次；

⑶加入酶标抗体，生物素二抗，50μl/孔；

⑷37℃温育 30min ，洗板 4 次；

⑸加入 A 、B 液，50μl/孔，37℃温育 15 分钟； ⑹加入终止液，50μl/孔。 1.3 标准曲线制作及结果计算

⑴酶标板放入酶标仪，盖上盖子；

⑵在电脑上打开 Microplate Manager 5.2 软件；

⑶选择 450nm 波长（参照波长 630nm ），设置 LAYOUT 和报告模式，测定 各孔吸收值；

⑷输入标准品各浓度值，以双对数法制备标准曲线，获取各孔的浓度值， 打印标准曲线图和计算结果。 1.4 统计学方法

○- 4 6 1.5 ○- ○-

○- ○- ○-

○-

8 8 6 3 1.5 3 4 1.5 3 6 2 2 ○- 1 1.5 ○- 3 6 1 0.5 0.5 3

6

1.5

○- 0.25

0.25

○-

○- ○- ○-

用 Microsoft Excel 处理实验数据。

2 结果

2.1 测得的

OD 值如下表

图 4

注：图 4 与图 3 相对应

2.2 标准曲线

图 5

由上图可得出如下结论：

标准曲线以浓度为横坐标，以测得的 OD 值为纵坐标。由对应浓度和 OD 值得出的散点连成一条直线后，散点基本都在直线上，说明散点的线性非常好。 在以后检测乙肝表面抗原浓度的时候可以根据测出的 OD 值在标准曲线上找出

1.7390

1.6380 1.0850 0.6920 0.3380 0.0150 0.8840 0.8880 1.2170 0.6740 0.3530 0.0090 0.5360 0.5090 1.2180 0.6560 0.3380 0.0100 0.2720 0.2600 1.2330 0.6740 0.3470 0.0090 0.1490 0.1380 1.2480 0.6960 0.3430 0.0120

0.0620 0.0710

0.0090

0.0120 0.0020 0.0090 0.0090

0.0110 0.0090 0.0110 0.0100

对应的浓度。

2.3 准确度（回收率）计算

各质控品高中低三个浓度平均回收率分别为92.59%、100.887%、93.68% 都在正常范围内如表1 所示。

ELISA法检测VEGFR2-Fc的回收率

准确度（回收

率）计算测定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率SD(%)

VEGFR2-Fc

(ng/ml)

64.998 83.3

65.637 93.95

6 5.642 94.033

6 5.715 95.25

6 5.78

7 96.45

3 3.093 103.1

3 3.005 100.167

32.918 97.267

33.005 100.167

3 3.112 103.733

1.5 1.377 91.8

1.5 1.450 96.667

1.5 1.377 91.8

1.5 1.421 94.733

1.5 1.401 93.4

表1 2.4 精密度计算

2.4.1 板内精密度RR(%)

92.59 5.30 100.887 2.60 93.68 2.07

板内精密度质控品各浓度组的RSD都小于15%，精密度良好，如表2所示。

板内精密度

VEGFR2-Fc （ng/ml）测定值

1

测定值

2

测定值

3

测定值

4

测定值

5

X S

RSD(%)

6 4.998 5.63

7 5.642 5.715 5.787 5.694±0.31

8 5.585 3 3.093 3.005 2.918 3.005 3.112 3.027±0.078 2.577

1.5 1.377 1.450 1.377 1.421 1.401 1.405±0.031

2.210

表2

2.4.2 板间精密度

板间各组浓度质控品RSD都小于15%，说明板间精密度达到标准。如表3所示。

板间精密度

测定值测定值测定值测定值测定值X S RSD(%) VEGFR2-Fc

（ng/ml）

64.998 5.637 5.642 5.715 5.787 5.694±0.318 5.585

65.471 5.423 5.674 5.323 5.746 5.5274±0.177 3.202

6 5.773 5.674 5.782 5.54

7 5.667 5.689±0.096 1.687

3 3.093 3.005 2.918 3.005 3.112 3.027±0.078 2.577

3 2.815 3.335 3.187 3.221 2.933 3.098±0.216 6.972

3 2.886 3.34

4 3.118 3.234 2.997 3.116±0.182 5.841

1.5 1.377 1.450 1.377 1.421 1.401 1.405±0.031

2.210

1.5 1.226 1.257 1.227 1.564 1.334 1.322±0.142 10.741

1.5 1.665 1.243 1.236 1.541 1.320 1.401±0.192 13.704

表3

2.5 检测限（LOD）计算：

取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。

空白孔的OD值的均数=0.0098

空白孔的OD值的标准差=0.0028

LOD=0.0098+2*0.0028=0.0154

3 讨论

通过图4、图5和表1、表2、表3可知本次实验的准确度、板内精密度、板间精密度、LOD值都复合实际，且各数据都趋于理想，对此我们做出分析：HBsAg是乙肝病毒感染后最早出现的血清标志物之一，因此HBsAg的检测是诊断肝炎病毒感染的重要依据。而针对这项检测的检测方法的灵敏度与高特异性的高低以及二者的结合程度是影响检验结果的重要因素，直接关系到临床诊断和用药，所以对HBsAg的检测方法的建立和方法的验证是实验成败的关键所在。

本实验以HBsAg 测定为例，为了对乙肝表面抗原ELISA 法定量进行分析的方法学建立与验证，以确认ELISA法定量检测HBsAg能否较准确、快速地

反映体内乙肝病毒复制情况。按试剂说明书严格操作的同时做标准曲线。本实验用的试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP 标记的检测抗体，经过温浴并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。本实验严格按试剂说明书操作的同时运用计算机软件和酶标仪，测得了OD值且绘制出了标准曲线。

本实验采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA），通过倍比稀释来完

成其定量检测。其中，标准品的浓度依次为：8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，每

个浓度设置两个孔，共十二个孔；质控品的浓度依次为:6、3、1.5ng/ml，每个

浓度设置五个孔，共十五个孔。往标准品、质控品依次加入标本、标准品、HRP 标记的检测抗体，而阴性对照加入等量PBS,经过温浴并彻底洗涤。用底物TMB 显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成

最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算质控品的准确度、板内精密度、板间精密度、LOD值。

本实验是设计精密，操作简便、快捷。主要是通过对质控品的准确度、板内精密度、板间精密度、LOD值的计算和根据标准品的OD值得出的标准曲线，

以确认ELISA法定量检测HBsAg 能否较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况。

如图5所示，标准曲线相关系数为0.9985，接近于1，即相关性良好。方法准确度(accuracy)，一般用相对回收率表示，表明用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度，由表1可得出相对回收率符合参考值85%～115%，所以该测定方法比较准确。

方法精密度(precision)，一般用RSD表示，对于ng／ml级水平的RSD一般应≤15％。由表2 板内精密度和表3 板间精密度可知，板内精密度完全符合要求，板间精密度基本符合要求。

检测限LOD，又称方法的灵敏度，由计算得LOD=0.0154，说明本分析方

法对于低浓度样品的检测灵敏度高。

根据流行病学调查, 我国人群乙型病毒肝炎感染率达10% 左右,乙肝的实验诊断对于其治疗及预防有重要参考意义。ELLISA适用于乙肝表面抗原的定量测定, 其优点是快速、方便、操作简单, 且灵敏度相对于其他方法较高, 自20 世纪70年代以来, 许多高灵敏度的测定方法应用于临床免疫学检测, 特别是酶联免疫法( ELLISA法)应用最广，其解决了低浓度HBsAg的定量检测问题, 能够及时有效的测定出乙肝表面抗原含量，对临床诊断和用药提供有力的依据。

综上所述，通过实验对HBsAg的准确度、板内精密度、板间精密度、LOD 值的评价和分析，证实该定量检测方法，具有高灵敏度和高特异性，能够满足临床检测和教学的要求。

参考文献

[1] 李金明，王露楠，徐锡霞，等．室内质量控制对乙型肝炎表面抗原准确的影响[J]．中

华检验医学杂志，2001，24(4)：255．

[2] 施纪文，徐简华，温惠萍．ELISA法和胶体金免疫层析法检测乙肝表面抗原的比较[J].

现代检验医学杂志，2005，20（5）：49．

[3] 章敏，万唐，彭慧中，等．前S2、前S1抗原与乙肝病毒标志物的相关性探讨[J]．实验

与检验医学，2009，27(6)：609．

[4] 陈慧英，张锦锋，岑小鹏，等.．ELISA检测乙型肝炎HBsAg 室内质控血清的试剂和使用[J].上海医学检验杂志，2000，15（4）：203-205．

[5] 周小辉,周元平,姚春平．血清HBV DNA 复制与慢性乙型炎肝脏损伤程度的研究[J]．中国现代医学杂志,2000,13(4)：133-135．

[6] 梅小平,李健,曾跃．乙型肝炎病毒DNA 水平与临床的关性分析[J]．中华肝脏病杂志, 2004,16(5)：19-21．

[7] 赵公之．乙型肝炎病毒DNA检测与临床[J]．中国实用医药,2006,9(4)：87-88．

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证分析

乙肝表面抗原的 ELISA 法定量分析 方法学验证 姓名 Z P 学号 0925400072 班级 09 级医学检验本科二班 指导老师 沈 富 兵 二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证 作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500） 【摘要】目的用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面 抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。方法运用ELLISA法定量测定乙 肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml 的2 倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准 曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果HBsAg 线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。结论ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病 毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。 【关键词】乙肝表面抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA 病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。 我们采用对已知抗体浓度的样品进行E LISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。 1.1.2 仪器及酶标板 酶标仪：Bio-Rad680；洗板机：Bio-Rad1575；超纯水系统：Millipore Elix；电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。 1.1.3 溶液配制 ⑴0.01M pH7.4的PBS 缓冲液： 称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4, 溶于800ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。

生物样品定量分析方法验证指导原则

9012 生物样品定量分析方法验证指导原则
1. 范围
准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和 制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动 学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和 记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实 际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。 应该在相应的生物样品分析中遵守 GLP 原则或 GCP 原则。
2. 生物分析方法验证
2.1 分析方法的完整验证
分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析 物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每 个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质 替代，但要说明理由。
一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范 围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液 中储存和处理全过程中的稳定性。
有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一 个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和 分析的原则适用于所有涉及的分析物。
对照标准物质 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质 中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用 性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。 对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质 不产生干扰。 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内 标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结 果的偏差。
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乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析 方法学验证 姓名 Z P 学号 0925400072 班级 09级医学检验本科二班 指导老师沈富兵 二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500） 【摘要】目的用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。方法运用ELLISA法定量测定乙肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml的2倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果HBsAg线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。结论ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。 【关键词】乙肝表面抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA 病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。 我们采用对已知抗体浓度的样品进行ELISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。 1.1.2 仪器及酶标板 酶标仪：Bio-Rad 680；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix； 电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。 1.1.3 溶液配制 ⑴0.01M pH7.4的PBS缓冲液： 称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4, 溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。 ⑵质控品： 用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证

毕业论文 题目：乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证姓名： 学号： 专业： 指导教师： 教师职称： 研究起止日期： 研究提交日期： 二○一三年十一月

目录 中文摘要 (1) 英文摘要 (1) 前言 (2) 1.材料与方法 (3) 1.1试剂盒 (3) 1.2仪器 (3) 1.3方法 (3) 1.3.1 溶液配制 (4) 1.3.2 铺板方案 (4) 1.3.3 加样步骤 (5) 2. 结果 (6) 2.1 标准曲线与线性范 (6) 2.2 准确度（回收率）的验证 (6) 2.3 精密度的验证 (7) 2.3.1 板内精密度的验证 (7) 2.3.2 板间精密度的验证 (8) 2.4 检测限（LOD）计算 (10) 3. 讨论 (10) 3.1 乙肝表面抗原定量分析的意义 (10) 3.2 常用定量分析方法 (11)

3.3 方法概述 (11) 3.4 方法学验证内容 (12) 3.5 结果分析及应用评价 (13) 参考文献 (14) 综述 (15) 致谢 (18)

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 中文摘要 目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。方法：ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。结果：标准曲线R2=0.997，准确度97.07%，1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml 级水平的RSD一般应<15%的要求，检测限LOD为0.172ng/ml， 低浓度样品（<1.5ng/ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。结论：该HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。 关键词：乙肝表面抗原ELISA 定量分析方法学验证

乙肝表面抗原检测操作规程

乙型肝炎病毒表面抗原检测（ELISA） 1原理： 在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（HbsAb-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。2试剂： 2.1试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法） 2.2试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司 2.3包装规格：96Test/Kit 2.4试剂盒组成：HbsAb预包被微孔板（包被HbsAb），HbsAg 酶标抗体（含HRP标记HbsAb）, HbsAg阳性对照（含基因工程HbsAg），HbsAg阴性对照（正常人血清），HbsAg样品稀释液（含BSA缓冲液），浓缩洗涤液（PBS-T缓冲液），底物A（含H2O2），底物B（含TMB），终止液（含H2SO4），封板膜，自封袋，说明书。 2.5试剂储存条件及有效期：2~8℃避光保存，有效12个月。 3样本采集： 取静脉血3-4ml于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于4℃冰箱保存，如长期保存需置于-15至-20℃冻存，并避免样本反复冻融。高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。 4所需仪器

4.1全自动酶免分析仪 4.2新鲜蒸馏水或去离子水 4.3酶标仪（单波长450nm或双波长450nm/630nm） 4.4微量移液器 4.5 37℃恒温箱或水浴箱 4.6洗板机或洗瓶 5检验方法 5.1平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。 5.2配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按1：19稀释后使用。 5.3编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。 5.4稀释：每孔加入20ul样品稀释液。 5.5加样：分别在相应孔中加入100ul阴、阳性对照血清或待测样本。 5.6温育：置37℃温育60min。 5.7加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul。 5.8温育：置37℃温育30min。 5.9洗涤：用洗涤液充分洗涤5次、洗涤后扣干（每次应保持30~60s的浸泡时间）。 5.10显色：每孔加入底物A、B各50ul，轻拍混匀，37℃暗置30min。 5.11终止：每孔加入终止液50ul，混匀。 5.12测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)

乙型肝炎表面抗原（HBsAg） 1、原理：采用抗-HBs包被反应板，加入待测样本，经孵育后，加入抗-HBs-HRP,当样本中存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗-HBs结合并与抗- HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。 2、标本采集与处理? 2.1 受检者准备：对于体检对象抽血前保持平时的饮食习惯，采血前应禁食4-6小时。 2.2静脉采血：除非是卧床病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响测定水平。故在采血前至少应静坐５分钟。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过１分钟，穿刺成功后立即松开止血带。 2.3采血管：一般采用血清做检验，可以用一般洁净的塑料管或玻璃试管作为容器。 2.4标本处理：血清：采血后，室温下自然放置1-2小时，待血液凝固、血块收缩后，在于3000转每分钟离心15分钟，吸出血清待用。血浆：采血后，样本和抗凝剂轻轻颠倒混匀6-8次后，充分离心，将血浆与血细胞分离后，吸出血浆待用。 2.5标本接收：接收标本时应检查标本是否符合要求(要求密封、无溶血、无杂物)、所用试管是否正确、试管是否填写完整、并问讯采血日期，对不合格标本应退回重采，并填写记录。

2.6标本储存：一般该标本应随到随做，血清和血浆标本在2-8o c 保存。如需长期保存，可在-20℃保存，并避免反复冻融。 3、试剂与仪器： 3.1测定试剂： 3.1.1生产厂商：英科新创（厦门）科技有限公司 3.1.2批准文号：国药准字S1******* 3.1.3包装：48T×1、96T×1 3.1.3试剂配置： 25倍浓缩稀释液 40ml×1瓶 HBsAg微孔反应板 96孔 HBsAg酶结合物 6.2 ml×1瓶 HBsAg阳性对照 1.0 ml×1瓶 HBsAg阴性对照 1.0 ml×1瓶 显色液A、B液各8.0 ml×1瓶 终止液 7 ml×1瓶 封板纸 5片 说明书 1份3．2测定仪器： 3.2.1酶标仪：上海安泰 MODEL MT-858 3.2.2洗扳机： ANALYTECH828 4、操作步骤： 4．1配液：配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释）

药物非临床药代动力学研究技术指导原则

附件5 药物非临床药代动力学研究技术指导原则 一、概述 非临床药代动力学研究是通过体外和动物体内的研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本药代动力学参数，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄（Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, 简称ADME）的过程和特征。 非临床药代动力学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要 作用。在药物制剂学研究中，非临床药代动力学研究结果是评价药物制剂特性和质量的重要依据。在药效学和毒理学评价中，药代动力学特征可进一步深入阐明药物作用机制，同时也是药效和毒理研究动物选择的依据之一；药物或活性代谢产物浓度数据及其相关药代动力学参数是产生、决定或阐明药效或毒性大小的基础，可提供药物对靶器官效应（药效或毒性）的依据。在临床试验中，非临床药代动力学研究结果能为设计和优化临床试验给药方案提供有关参考信息。 本指导原则是供中药、天然药物和化学药物新药的非临床药代动力学研究的参考。研究者可根据不同药物的特点，参考本指导原则，科学合理地进行试验设计，并对试验结果进行综合评价。 本指导原则的主要内容包括进行药物非临床药代动力学研究的 基本原则、试验设计的总体要求、生物样品的测定方法、研究项目（血

药浓度-时间曲线、吸收、分布、排泄、血浆蛋白结合、生物转化、对药物代谢酶活性及转运体的影响）、数据处理与分析、结果与评价等，并对研究中其他一些需要关注的问题进行了分析。附录中描述了生物样品分析和放射性同位素标记技术的相关方法和要求，供研究者参考。 二、基本原则 进行非临床药代动力学研究，要遵循以下基本原则： （一）试验目的明确； （二）试验设计合理； （三）分析方法可靠； （四）所得参数全面，满足评价要求； （五）对试验结果进行综合分析与评价； （六）具体问题具体分析。 三、试验设计 （一）总体要求 1. 受试物 中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。当给药时间较

乙肝五项的检查及临床意义

乙肝五项的检查及临床意义 乙肝两对半即乙肝五项，是确诊和了解乙肝(又称B型肝炎)病情的重要依据。包括：乙肝表面抗原HBsAg、乙肝表面抗体HBsAb、乙肝e抗原 HBeAg、乙肝e抗体HBeAb、乙肝核心抗体HbcAb。正常情况下五项指标全部阴性或乙肝表面抗体HbsAb阳性。其中乙肝两对半检查中的“乙肝大三阳、乙肝小三阳”是了解乙肝(又称B型肝炎)病情最为重要的综合性指标。 一、乙肝两对半（包括了乙肝大三阳、乙肝小三阳）的检查及临床意义 HBV（乙肝病毒）感染后病毒产生的蛋白释放入血导致相应的血清标志物，主要有三对，即即表面抗原（HBsAg）和表面抗体（抗HBs或HBsAb）、e 抗原（HBeAg）和e抗体（抗HBe 或HBeAb）、核心抗原（HBcAg）和核心抗体（抗HBc或HBcAb），但核心抗原在血清中一般不易检出，仅其余两对半在血液中可检测出。 1、乙肝两对半（乙肝五项）的简要临床意义 2、乙肝五项各指标的常见变化与简要临床意义：

以上简单罗列了感染乙肝（B型肝炎）病毒后两对半的常见的一些表现形式，针对个体，可能仍存在其它不同的表现组合，或在转归中。所以碰到不典型的组合，不必担心，建议过段时间再次复检，一般不典型的情况不会持续太久。 3、乙肝两对半检测中乙肝大三阳、小三阳以及部分指标的临床意义及对策 （１）乙肝大三阳（乙肝五项135阳性）--是指两对半检查中，表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAb）为阳性。乙肝大三阳，说明乙型肝炎病毒在人体内复制活跃，传染性较强．这类患者体内的血液、唾液、精液、乳汁、宫颈分泌液都可有传染性，如果同时有转氨酶增高者，首先就应注意隔离，在家庭内患者的碗筷等餐具可单独与家人分开，定期消毒。 ★ 专家对策：患者应到专科医院就诊采用抗病毒，提高机体免疫力和对症降酶保肝措施。建议做肝功能和肝B超检查。如果都正常，不要乱治疗，定期每半年做一次肝功能和肝B超检查。可以服用中草药，比较安全有效，服用中草药调节肝脏免疫功能，促进肝细胞修复再生，增强肝的抵抗力，阻止肝脏纤维化。抗HBV-免疫疗法辩证治疗“大三阳”>>> （２）乙肝小三阳（乙肝五项145阳性）--是指在乙肝（又称B型肝炎）的“两对半”检查的五项指标中，表面抗原(HBsAg)、E抗体(HBeAb)和核心抗体(HBcAb)检测均是阳性。提示急性或慢性乙型肝炎，体内病毒复制，为乙型肝炎病毒复制状态。乙肝小三阳通常是由“乙肝大三阳”转变而来，是人体针对E抗原产生了一定程度的免疫力。 ★ 专家对策：乙肝小三阳（乙肝五项145阳性）应检查HBV-DNA及肝功能，根据具体情况进行综合分析。如果HBV-DNA（+）且肝功能异常，说明病毒复制，传染性强，应该采

9012生物样品定量分析方法验证指导原则

中国药典2015年版 9012生物样品定置分析方法验证 指导原则 一、范围 准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。 本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法。 生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守 G L P原则或GC P原则。 二、生物分析方法验证 (一）分析方法的完整验证 分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个新分析方法和新分析物进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。 一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。 有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。 对照标准物质 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加人到空白生物基质中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质不产生干扰。 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结果的偏差。 1.选择性 该分析方法应该能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中其他组分。应该使用至少6个受试者的适宜的空白基质来证明选择性（动物空白基质可以不同批次混 9012生物样品定量分析方法验证指导原则 合），它们被分别分析并评价干扰。当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%,并低于内标响应的5%时，通常即可以接受0 应该考察药物代谢物、经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物引起干扰的程度。在适当情况下，也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性。 2.残留 应该在方法建立中考察残留并使之最小。残留可能不影响准确度和精密度。应通过在注射高浓度样品或校正标样后，注射空白样品来估计残留。高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%，并且不超过内标的5%。如果残留不可避免，应考虑特殊措施，在方法验证时检验并在试验样品分析时应用这些措施，以确保不影响准确度和精密度。这可能包括在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试验样品。 3.定量下限 定量下限是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。定量下限是标准曲线的最低点，应适用于预期的浓度和试验目的。 4.标准曲线 应该在指定的浓度范围内评价仪器对分析物的响应，获得标准曲线。通过加人已知浓度的分析物（和内标）到空白基质中，制备各浓度的校正标样，其基质应该与目标试验样品基质相同。方法验证中研究的每种分析物和每一分析批，都应该有一条标准曲线。 在进行分析方法验证之前，最好应该了解预期的浓度范围。标准曲线范围应该尽量覆盖预期浓度范围，由定量下限和定量上限(校正标样的最髙浓度）来决定。该范围应该足够描述分析物的药动学。 应该使用至少6个校正浓度水平，不包括空白样品（不含分析物和内标的处理过的基质样品）和零浓度样品（含内标的处理过的基质〉。每个校正标样可以被多次处理和分析。 应该使用简单且足够描述仪器对分析物浓度响应的关系式。空白和零浓度样品结果不应参与计算标准曲线参数。 应该提交标准曲线参数，测定校正标样后回算得出的浓度应一并提交。在方法验证中，至少应该评价3条标准曲线。 校正标样回算的浓度一般应该在标示值的:t l5%以内，定量下限处应该在±20%内。至少75%校正标样，含最少6个有效浓度，应满足上述标准。如果某个校正标样结果不符合这些标准，应该拒绝这一标样，不含这一标样的标准曲线应被重新评价，包括回归分析^ 最好使用新鲜配制的样品建立标准曲线，但如果有稳定性数据支持，也可以使用预先配制并储存的校正标样。 5.准确度 分析方法的准确度描述该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度，表示为：（测得值/真实值)x l00?^应采用加人已知 ? 363

抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则(中文版)

抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则 摘要： 几乎所有的生物制药产品都会引起一定的抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）反应，抗药抗体反应可能会降低药物疗效或导致严重的不良反应。在人体内，抗药抗体通常不会引起明显的临床反应。但是对于某些治疗性蛋白质，抗药抗体反应能引起各种临床的不良反应，包括温和事件及严重不良事件。临床前研究表明，抗药抗体能对药物暴露、药物毒性作用、药物代谢动力学、药物效应动力学等造成影响。因此治疗性蛋白质的免疫原性引起了临床医生、药企及监管机构的注意。为了评估生物药物分子的免疫原性，以及将实验结果与临床事件联系起来，在临床前研究和临床研究中，很有必要开发可靠的能够有效评估抗药抗体反应的实验方法。这里方法学验证显得尤为重要，并且方法学验证是药物上市申请必不可少的。现行的监管文件对于免疫分析方法的验证的指导相当有限，特别是缺乏有关免疫原性分析方法的验证的指导。因此，本文对抗药抗体免疫分析方法的验证提供科学的建议。在现有的关于生物分析的规范性文件的基础上加入独特的性能验证。笔者建议采用实验和统计学的方法进行免疫分析的方法学验证。这些建议被视为最佳的例子，旨在促进整个医药行业形成一个更加统一的抗体检测方法。 1．简介： 生物制药产品包括氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸，一般通过人细胞系、哺乳动物细胞或细菌进行表达，比常规的小分子药物更大（一般大于1~3KD）。由于以上特性，生物制药产品引起免疫反应的潜力更大。生物制药的免疫原性与产品的内在因素（种属特异性表位、外源性、糖基化程度、聚合或变性程度、杂质和制剂）、外在因素（给药途径、慢性或急性给药、药代动力学及内源性当量）、患者因素（自身免疫性疾病、免疫抑制、和替代疗法）相关。 抗药抗体反应可能会导致严重的临床症状，包括过敏、自身免疫和不同的药代动力学特征（例如，药物中和、生物分布异常和药物清除率增强等均可能会使

三种方法检测乙肝表面抗原结果的比较

三种方法检测乙肝表面抗原结果的比较 发表时间：2012-02-02T14:50:30.183Z 来源：《中国健康月刊（学术版）》2011年第12期供稿作者：金大伟富宏然高莉莉[导读] 中国是乙型病毒肝炎的高发国家,根据流行病学调查, 人群发生率较高, 表面抗原携带率约为15% 金大伟富宏然高莉莉（黑龙江省牡丹江市红旗医院检验科黑龙江牡丹江157011）【摘要】目的：通过乙肝表面抗原，比较三种方法学的优缺点。方法：采用化学发光法检测乙肝，然后对阳性标本分别用酶联免疫吸附试验和金标方法复检。结果：总数为13207份标本，化学发光方法检测表面抗原阳性的标本为1524份，ELISA方法复检后阳性标本数为1415，金标方法复检后阳性标本数为1241。结论：灵敏度化学发光方法最高、ELISA方法居中、金标方法最差；操作金标方法最简单、ELISA居中、化学发光方法稍难；金标方法假阴性假阳性率最高。因此，金标方法只能进行筛检，阳性或阴性都不能定诊。【关键词】乙肝表面抗原；化学发光法；ELISA；金标法 【中图分类号】R156.3【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)12-0156-01 中国是乙型病毒肝炎的高发国家,根据流行病学调查, 人群发生率较高, 表面抗原携带率约为15%［1］。乙肝的实验诊断对于其治疗及预防有重要参考意义。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是由Dane颗粒的外壳和直径22 nm的球型颗粒和管型颗粒所组成［1］。HBsAg是HBV感染后第一个出现的血清学标志物,也是诊断的重要指标之一。HBsAg阳性见于急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。值得注意的是在急性感染的恢复期,存在核心窗口期现象,即该时期HBsAg消失,抗- HBs还未出现的,此期可短至数天或长达数月。 目前检测乙肝有三种比较常用的方法学，即酶联免疫吸附试验(ELISA)、金标法、化学发光法。中国大多数临床实验室都采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法来检测HBsAg。但对于HBsAg低浓度的标本,检测时常因方法学的原因造成灵敏度较低,导致临床出现漏检,给病人带来损失,尤其是需要临床输血的病人。；金标法(Goldimmnnochromatography，GICA)是在ELISA基础上发展起来的一种检测技术，由于其具有操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点，也广泛应用于HBsAg的初筛；缺点式是此种方法灵敏度比ELISA更低，而且假阳性率、假阴性率都很高。近年来发展起来的化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)是灵敏度非常高的方法。解决了低浓度HBsAg的检测问题。现将三种种方法对乙肝表面抗原的检测作一比较。 1资料和方法 1.1 标本来源：收集牡丹江医学院红旗医院检验科免疫室2010年全年常规做乙肝“二对半”标本13207份，用半自动化学发光方法筛出乙肝表面抗原阳性的标本1515份进行复检，并通过金标法和酶联方法进行比较。 1.2 方法：半自动化学发光方法原理：采用酶促化学发光，双抗体夹心方法，用辣根过氧化物酶作为标记酶，催化鲁米诺发光，并在化学发光仪上读出发光值并计算含量，此种方法为定量方法。 金标方法原理：试剂条以胶体金为指示标记包被特异的抗体,应用免疫层析双抗体夹心原理检测样本中的乙肝表面抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)法原理：采用双抗体夹心方法，用辣根过氧化物酶作为标记酶，催化TMB和过氧化氢产生有色物质，加入酸性终止液后用酶标仪读取光密度值进行计算并判断阴阳性，此种方法未定性方法。 2试剂与仪器 半自动化学发光仪器为GloRunner型半自动化学发光仪，配套试剂为北京科美化学发光试剂。金标试剂为广州万孚乙肝二对半金标板。ELISA试剂为上海科华试剂，酶标仪为Bio-Tek ELX800，洗板机为ELx50洗板机。 3检测 所有标本先由半自动化学发光仪进行表面抗原检测，阳性标本再用ELISA和金表方法进行检测。所有检测严格按照标准SOP操作文件进行操作，质控品由黑龙江省临检中心提供。 4结果 总数为13207份标本，半自动化学发光方法表面抗原阳性的标本为1524份，ELISA方法复检后阳性标本数为1415，金标方法复检后阳性标本数为1241。 5讨论 从以上结果来看，半自动化学发光法阳性率最高，ELISA方法较化学发光法阳性率低，金标方法阳性率最低。化学发光方法要比ELISA方法敏感，化学发光方法检测弱阳性标本用ELISA方法检测呈现阴性，同样ELISA方法检测弱阳性的标本用金标方法同样也呈现阴性。ELISA方法是国内主要检测乙肝的方法，是一种操作步骤比较简单，灵敏度表较高的方法，所用仪器酶标仪的价格也不是很高，甚至目测也可以报结果。金标法操作最为简单，不需要任何仪器，很适合快速的筛检，但是此种方法的缺点也很明显，检测的灵敏度不高，存在一定假阳性率的问题，金标方法检测的结果，阴形可能存在假阴性，阳性也需要进行复检。在实际工作中，曾经有过金标表面抗原强阳性，但是经过化学发光和酶联免疫方法测定，变为阴性。因此金标方法检测的结果不能作为定诊的依据，必须经过其他的方法进行验证，只能作为乙肝的筛检，其结果还必须进行确认。化学发光法是近年发展比较快的检测方法学，我们所用的半自动化学发光方法采用的是酶促化学发光法，其基本的检测操作与ELISA方法一致，只有最后进行检测的时候加入的酶促底物不一样，ELISA加入的是TMB和双氧水，而酶促化学发光加入的是鲁米诺和双氧水。ELISA用酶标仪检测或根据检测孔的颜色进行目测判断结果；而酶促化学发光方法必须用化学发光仪进行定性或定量分析检测。化学发光方法检测灵敏度要高于ELISA，对于ELISA方法检测弱阳性的标本可以用化学发光方法进行复检并且进行定诊。酶促化学发光方法与ELISA方法操作步骤相当，敏感度却高很多。缺点是酶促化学发光方法检测必须依靠机器，不可以用肉眼观察结果。另外，加入酶促底物后，发光值会随着时间的延长而进行性衰减，因此化学发光法进行读取数据时必须在规定的时间内读取。经过我们监测发现，化学发光读取发光值时即使在规定的读取时间内，每隔1分钟检测一次发光值，同一孔在不同的时间点上的发光只相差很多，因此化学发光对于发光值的读取最好在加入底物后同一时间进行读取，这一点对于定量检测比较好。参考文献 ［1］化学发光微粒子免疫分析法与酶联免疫法测定乙肝表面抗原的比较［2］刘秀琴,傅杭州,张晓俐《海南医学》2010年第21卷第8期

乙肝五项定量检查正常值及临床意义

乙肝五项定量检查正常值及临床意义 乙肝五项乙肝五项定量检查正常值乙肝五项定量正常值如下：HBSAG 乙肝表面抗原定量(TRFIA)0-0.5ng/ml HBSAB 乙肝表面抗体定量(TRFIA)0-10miu/ml HBEAG 乙肝e抗原定量(TRFIA)0-0.5PEI U/ml HBEAB 乙肝e抗体定量（TRFIA)0-0.2PEI U/ml HBCAB 乙肝核心抗体定量（TRFIA）0-0.9PEI U/ml 乙肝五项检查临床意义 1、乙肝病毒表面抗原HBsAg 是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。 临床意义：为已经感染病毒的标志，并不反映病毒复制和传染性的强弱。2、乙肝病毒表面抗体HBsAb 一般简称表面抗体。当乙型肝炎病毒侵入人体后，刺激人的免疫系统产生免疫反应，人体免疫系统中的B淋巴细胞分泌出一种特异的免疫球蛋白G。它可以和表面抗原特异地结合，在体内与人体的其他免疫功能共同作用下，可把病毒清除掉，保护人体不再受乙肝病毒感染，故称表面抗体为保护性抗体。

临床意义：为中和性抗体标志，是否康复或是否有抵抗力的主要标志。 3、乙肝病毒e抗原HBeAg 一般通称e抗原。它源于乙型肝炎病毒的核心，是核心抗原的亚成分，或是核心抗原裂解后的产物。e抗原是可溶性蛋白。当核心抗原裂解时，可溶性蛋白部分（即e抗原）就溶于血清中，存在于血液循环中，若取血化验就可查出来。临床意义：为病毒复制标志，持续阳性3个月以上则有慢性化倾向。 4、乙肝病毒e抗体HBeAb-e e抗体是乙型肝炎e抗体的简称（抗-HBe），它是由e抗原刺激人体免疫系统产生出来的特异性抗体，这种特异性e抗体能够和e抗原结合。 临床意义：为病毒复制停止标志，病毒复制减少，传染性较弱但，抗-HBe和抗-HBs不同，e抗体不是保护性抗体，不代表患者有了免疫力。 乙肝病毒核心抗体HBcAb 核心抗原虽然在血清中查不出来（它在血中很快被裂解），但是它具有抗原性，能刺激身体的免疫系统产生出特性抗体，即核心抗体，故检测抗-HBc可以了解人体是否有过核心抗原的刺激，也就是说是否有过乙肝病毒的感染。所以抗-HBc是一项病毒感染的标志。 临床意义：曾感染或感染期出现的标志。核心抗体IGM是新近感染或病毒复制标志，核心抗体IgG是感染后就会产生的，对于辅助两对半检查有一定意义。正常情况下五项指标全部阴性或乙肝表面抗体（HbsAb）阳性。

乙肝表面抗原检测操作规程

乙型肝炎病毒表面抗原检测（ ELISA） 1原理： 在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（ HbsAb-HRP）及 TMB 等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。 2试剂： 2.1试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法） 2.2试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司 2.3包装规格： 96Test/Kit 2.4试剂盒组成：HbsAb预包被微孔板（包被 HbsAb），HbsAg 酶标抗体（含 HRP标记 HbsAb）, HbsAg 阳性对照（含基因工程 HbsAg），HbsAg 阴性对照（正常人血清），HbsAg样品稀释液（含 BSA缓冲液），浓缩洗涤液（ PBS-T 缓冲液），底物 A（含 H2O2），底物 B（含 TMB），终止液（含 H2SO4），封板膜，自封袋，说明书。 2.5试剂储存条件及有效期： 2~8 ℃避光保存，有效 12 个月。 3样本采集： 取静脉血 3-4ml 于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于 4℃冰箱保存，如长期保存需置于 -15 至-20 ℃冻存，并避免样本反复冻融。高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。 4所需仪器

4.1全自动酶免分析仪 4.2新鲜蒸馏水或去离子水 4.3酶标仪（单波长 450nm或双波长 450nm/630nm） 4.4微量移液器 4.537 ℃恒温箱或水浴箱 4.6洗板机或洗瓶 5检验方法 5.1平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温 （ 18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。 5.2配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按 1：19 稀释后使用。 5.3编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。 5.4稀释：每孔加入 20ul 样品稀释液。 5.5加样：分别在相应孔中加入 100ul 阴、阳性对照血清或待测样本。 5.6温育：置 37℃温育 60min 。 5.7加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体 50ul 。 5.8温育：置 37℃温育 30min 。 5.9洗涤：用洗涤液充分洗涤 5 次、洗涤后扣干（每次应 保持 30~60s 的浸泡时间）。 5.10显色：每孔加入底物 A、B 各 50ul ，轻拍混匀， 37℃ 暗置 30min 。 5.11终止：每孔加入终止液 50ul ，混匀。 5.12测定：用酶标仪单波长 450nm 或双波长 450nm/630nm 测

三种方法检测乙肝表面抗原结果的比较

三种方法检测乙肝表面抗原结果的比较 摘要】目的：通过乙肝表面抗原，比较三种方法学的优缺点。方法：采用化学 发光法检测乙肝，然后对阳性标本分别用酶联免疫吸附试验和金标方法复检。结果：总数为13207份标本，化学发光方法检测表面抗原阳性的标本为1524份，ELISA方法复检后阳性标本数为1415，金标方法复检后阳性标本数为1241。结论：灵敏度化学发光方法最高、ELISA方法居中、金标方法最差；操作金标方法最简单、ELISA居中、化学发光方法稍难；金标方法假阴性假阳性率最高。因此，金 标方法只能进行筛检，阳性或阴性都不能定诊。 【关键词】乙肝表面抗原；化学发光法；ELISA；金标法 【中图分类号】R156.3【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)12-0156-01 中国是乙型病毒肝炎的高发国家,根据流行病学调查, 人群发生率较高, 表面抗 原携带率约为15%［1］。乙肝的实验诊断对于其治疗及预防有重要参考意义。 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是由Dane颗粒的外壳和直径22 nm的球型颗粒和 管型颗粒所组成［1］。HBsAg是HBV感染后第一个出现的血清学标志物,也是诊 断的重要指标之一。HBsAg阳性见于急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。值得 注意的是在急性感染的恢复期,存在核心窗口期现象,即该时期HBsAg消失,抗- HBs 还未出现的,此期可短至数天或长达数月。 目前检测乙肝有三种比较常用的方法学，即酶联免疫吸附试验(ELISA)、金标法、化学发光法。中国大多数临床实验室都采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法来检 测HBsAg。但对于HBsAg低浓度的标本,检测时常因方法学的原因造成灵敏度较低,导致临床出现漏检,给病人带来损失,尤其是需要临床输血的病人。；金标法(Goldimmnnochromatography，GICA)是在ELISA基础上发展起来的一种检测技术，由于其具有操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点，也 广泛应用于HBsAg的初筛；缺点式是此种方法灵敏度比ELISA更低，而且假阳性率、假阴性率都很高。近年来发展起来的化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)是灵 敏度非常高的方法。解决了低浓度HBsAg的检测问题。现将三种种方法对乙肝表 面抗原的检测作一比较。 1资料和方法 1.1 标本来源：收集牡丹江医学院红旗医院检验科免疫室2010年全年常规做 乙肝“二对半”标本13207份，用半自动化学发光方法筛出乙肝表面抗原阳性的标 本1515份进行复检，并通过金标法和酶联方法进行比较。 1.2 方法：半自动化学发光方法原理：采用酶促化学发光，双抗体夹心方法，用 辣根过氧化物酶作为标记酶，催化鲁米诺发光，并在化学发光仪上读出发光值并 计算含量，此种方法为定量方法。 金标方法原理：试剂条以胶体金为指示标记包被特异的抗体,应用免疫层析双 抗体夹心原理检测样本中的乙肝表面抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)法原理：采用 双抗体夹心方法，用辣根过氧化物酶作为标记酶，催化TMB和过氧化氢产生有色物质，加入酸性终止液后用酶标仪读取光密度值进行计算并判断阴阳性，此种方 法未定性方法。 2试剂与仪器 半自动化学发光仪器为GloRunner型半自动化学发光仪，配套试剂为北京科 美化学发光试剂。金标试剂为广州万孚乙肝二对半金标板。ELISA试剂为上海科 华试剂，酶标仪为Bio-Tek ELX800，洗板机为ELx50洗板机。

方法学验证指导原则

一、准确度 准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（％)表示。准确度应在规定的范围内测定。 1.化学药含量测定方法的准确度 原料药采用对照品进行测定，或用本法所得结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较。制剂可在处方量空白辅料中，加入已知量被测物对照品进行测定。如不能得到制剂辅料的全部组分，可向待测制剂中加人已知量的被测物对照品进行测定，或用所建立方法的测定结果与已知准确度的另一种方法测定结果进行比较。准确度也可由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。 2.化学药杂质定量测定的准确度 可向原料药或制剂处方量空白辅料中加人已知量杂质进行测定。如不能得到杂质或降解产物对照品，可用所建立方法测定的结果与另一成熟的方法进行比较，如药典标准方法或经过验证的方法。在不能测得杂质或降解产物的校正因子或不能测得对主成分的相对校正因子的情况下，可用不加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量。应明确表明单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（％) 或面积比（％ )。 3.中药化学成分测定方法的准确度 可用对照品进行加样回收率测定，即向已知被测成分含量的供试品中再精密加人一定量的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。在加样回收试验中须注意对照品的加人量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。 回收率：％= (C - A ) /S X 100% 式中：A为供试品所含被测成分量；B 为加入对照品量； C 为实测值。 4.校正因子的准确度 对色谱方法而言，绝对（或定量）校正因子是指单位面积的色谱峰代表的待测物质的量。待测定物质与所选定的参照物质的绝对校正因子之比，即为相对校正因子。相对校正因子计算法常应用于化学药有关物质的测定、中药材及其复方制剂中多指标成分的测定。校正因子的表示方法很多，本指导原则中的校正因