糖基转移酶的研究概述

糖基转移酶的研究概述

邓传怀

（河北大学生命科学学院２０１２生物技术中国保定０７１０００）

摘要糖基转移酶在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂上，糖基化的产物具有很多生物学功能并具有高度的底物专一性。本文综述了糖基转移酶的种类、功能、特性及其在组合生物合成中的应用与研究前景。

关键词糖基转移酶结构功能应用

Outline about research of

glycosyltransferases

Deng Chuanhuai

( College of Life Sciences , Biotechnology 2012, Hebei University ,

Baoding )

Abstract Glycosyltransferase catalyzing the biosynthesis of the sugar attached to different activated receptor molecules, such as proteins, nucleic acids, oligosaccharides, the lipid glycosylation product has many biological functions with a high degree of substrate specificity[1]. In glycosylation project, carried out by enzymatic protein glycosylation and important means of natural glycosylated glycoproteins to study the structure and function of glycoproteins[2].This article provides anoverview of the categories, functions, characteristics of Gtfs, their app lications in combinatorial biosynthesis, and the p rospects for research.

Key Words Glycosyltransferase Structure and Function Application

糖基转移酶是广泛存在于内质网和高尔基体内的一大类酶类[3]，参与体内重要的活性物质如糖蛋白和糖脂中糖链的合成。其作用是把相应的活性供体(通常是二磷酸核苷NDP-糖)

的单糖部分转移至糖、蛋白质、脂类和核酸等，完成后者的糖基化加工实现其生物学功能。

1 糖基转移酶的结构

在真核细胞中,绝大多数糖基转移酶都是位于内质网和高尔基体,除个别( 如合成G 寡糖的al,2甘露糖转移酶是I 型膜蛋白)外,它们都是Ⅱ型膜蛋白, 都有着相似的域结构。首先是一段短的留在胞质的N一末端肽端, 接着是跨膜结构域(TMD), 然后是一段所谓的“茎”(stem)区,余下则是一段很长的球形催化结构域。其中跨膜域在糖基转移酶的高尔基体膜定位中起着关键作用,而胞质尾端“茎”区的毗邻跨膜域的部分氨基酸则起着辅助作用。肤链的“茎”区氨基酸对某些蛋白水解酶敏感,易被水解,使催化结构域游离溶解出来,这在糖基转移酶的可溶化和提纯有重要意义。最近的一项研究表明ST6GalI的“茎”区域在糖蛋白受体的选择有一定作用, 可能是因为“茎”区域影响催化域的三维结构, 对这一区域意义的阐明还有待更多的研究.长期以来,人们对糖基化反应的分子机制一直不甚清楚, 最重要的原因的就是缺乏对糖基转移酶的三维结构的认识。1994年,Virelink 等利用X射线晶体衍射技术率先完成了对噬菌体T4的β-GlcT ( BGT)的3 D结构的测定。1999年至今, 人们又相继完成了另外12 种糖基转移酶的3D结构的测定结果发现这13 种糖基转移酶都是α∕β蛋白, 而且只采用了两种折叠模式GT一A 折叠和GT一B折叠( 即上文所提的两个超家族), 通过穿针引线分析(threadinganalysis)发现其余大多数糖基转移酶都采用这两种折叠模式中的一个。

核酸法测定蛋白质一级结构的迅速发展和广泛使用, 也为糖基转移酶的结构研究提供了有用的方法。因为大多数糖基转移酶是膜结合蛋白, 量很少, 不足以用经典的蛋白质化学方法测定它们的整个结构．目前认为仅是参与糖蛋白和糖脂中糖链合成的糖基转移酶就有上百种, 被克隆的哺乳动物来源的糖基转移酶只有十几种，这些糖基转移酶的cDNA的序列已被测定。它们大多有相似的域结构闭, 即：一段短的末端的肤段尾巴在细胞质中, 接着是１６－２０个残基组成的穿透膜的肤段, 然后是一段长度尚未确定的所谓的“颈”部, 余下的是很长的有催化活性的结构域, 后者在高尔基体的腔内。肽链中的“颈”部对某些蛋白水解酶敏感, 原来的膜酶经水解后成了可溶性的酶。后者比前者更为容易分离纯化, 为此多数糖基转移酶的结构研究, 是以水解得到的可溶性酶作起始材料, 得到了它们的ｃＤＮＡ后就能进一步测得酶的其它部分。兔肝ＧｎＴ１就是一个例子。在制备此酶时, 仅能得到少量纯化的酶, 大量是不吸附在分离柱上不能进一步纯化的酶克隆了编码此酶的基因,由2.5kb

cDNA的序列测定得到了此酶的蛋白质一级结构, 由４４７个残基组成。穿透膜的疏水肤段含有２５个残基, 可形成α螺旋。“颈”部的酶解点在45位残基, 在这切点和催化结构域之间的肤段中有异常多的脯氨酸。其它一些糖基转移酶也有这样高脯氨酸含量的“颈”部,这提示了糖基转移酶的“颈”部在高尔基体腔内糖基化过程中有特定的作用,例如有利于糖基化蛋白的移动。

2 糖基转移酶的分类

糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转移的单糖分类, 如半乳糖转移酶, 唾液酸转移酶等; 国际生物化学和分子生物学学会推荐的分类方法是根据底物及产物立体化学异构性分类分为反向型(Inveritgn) 和保留型(Eratinign)这些分类方法存在一个明显的不足, 即不能揭示糖基转移酶的内在结构特征, 彼此同源性极低, 即使同一类糖基转移酶序列相似性也很低。1997年Campbell 等提出一种新的分类方法, 根据序列同源性、底物/ 产物立体化学异构性以及供体糖进行分类到目前为止，依据这种分类方法糖基转移酶被分为66家族及一个未分类族，出人意料的是如此众多的家族却只采用了两种折叠方式, 从而形成两种超家族, 分别命名为GT-A超家族和GT-B超家族。这两个超家族之间无论折叠方式, 活性位点还是催化机制都各不相同, 为如何完成糖基化反应这一问题提供了两种不同的答案.

3 糖基转移酶的作用机制

根据产物的立体化学异构性，糖基转移酶的作用机制分两种：反向型和保留型糖基转移酶。反向型糖基转移酶的作用机理是双分子亲核取代反应。利用NDP-糖活化的C-1作为亲电子基团，亲核攻击捕获带有亲核受体原子的糖苷配基，经过一个氧络正碳离子-离子样的过渡态产生一个反向的异头构型，完成一个简单的取代反应；关于保留型糖基转移酶的反应机制目前还没有确切的答案。参照糖苷酶的反应机制，糖基转移酶很可能经历了二次取代反应，首先形成一种含有共价键的糖基-酶中间体，释放核苷二磷酸，二磷酸基团将受体的羟基受体活化，而后受体再进攻糖基-酶复合体，形成糖苷键。作为底物或者产物的磷酸盐作为一种碱性催化剂在许多文献中都被报道。目前以研究保留型糖苷酶催化机制的方法去研究各种转移酶的催化机制已经做了大量工作，但仍没有得出针对参与反应的催化性亲核试剂及动力学及催化学机制层面上成立的共价中间体的最终鉴定结果。这可能可以作为反驳在糖基转移酶中不存“双取代”机制的证据，但是还有一种可能就是用于研究糖苷酶的研究方法根本不适用于糖基转移酶，因为用于研究这两种酶的底物的性质存在着根本的不同。所有的糖基转移酶都有高度的底物专一性即对糖基的供体有专一性,而且对糖基的接受体也有专一性，大多数糖基的供体是不同类型的核苷二磷酸激活的单糖不同的单糖用不同的核苷二磷酸活化但同样是葡萄糖基转移酶, 因合成的产物结构不同或合成的部位不同,所用的供体上的核苷二磷酸也不同。

4 糖基转移酶的功能

2.2.1糖基转移酶在糖类合成中的应用

糖类药物在治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗病毒等方面都有其独特的功效。现在普遍使用的糖类合成方法有两种: 化学合成和酶促合成。化学合成近年来取得一些进展, 提出了一种全自动寡糖合成法, 但在天然复合产物中以一种糖代替另一种糖仍然困难。酶促合成凭借其高产量、产物的特异立体化学异构性而愈来愈受人们的青睐。本来人们以为糖基转移酶的高度底物专一性将会限制糖基转移酶的应用, 但事实并非如此。首先,GT一A 超家族的部分糖基转移酶有着相对宽松的底物专一性, 它们能用于合成一些非天然寡糖，而且根据糖基转移酶的结构比较能够找到决定其底物专一性的区域,通过改变这些区域的结构, 可以设计出新的糖基转移酶改变或增加其选择性范围。酶促合成的另一个难题就是糖基供体的获取上, 最近人们利用磷酸一1-己糖核苷转移酶不严格的底物专一性生成结构多样的ＴＤＰ一糖或ＵＤＰ一糖。另外有人提出一种新的方法可以原位重生核苷一糖供体, 减少了合成核苷一糖供体的花费。相信在不久的将来, 利用糖基转移酶和产生糖基供体的酶人们将建立糖聚合物数据库以供检索。

糖基转移酶与疾病

糖基转移酶的表达和活性的变化与许多疾病联系在一起, 并可作为某些疾病的诊断标志, 如α-1,3-半乳糖基转移酶活性在体内的再现会引发自身免疫反应, 导致类风湿, 并在器官异体移植中引起排斥反应; N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶、岩藻糖基转移酶等在成熟细胞中活性的明显升高被视为肿瘤发的重要标志, 并且被认为是肿瘤迁移恶化的重要原因. 因此设计合成糖基转移酶抑制剂, 对于寻找抗肿瘤、抗免疫系统等新药研究有重要意义.

α1一3 G T 的活性在人体内的重现会引发自身免疫反应.相反, 如果人体内βl一4 半乳糖基转移酶的活性下降, 致使正常的免疫球蛋白G（IgG )分子中的糖链半乳糖含量降低.IgG 是一种糖蛋白, 它的糖含量不高, 约5 % , 最主要的糖链是在ＣＨ一2 结构域中的Asn一297上的二分支复杂型的糖链, 即使是这样比较简单的糖链也至少有30 种结构类似仅有极小差异的不同形式, 每种结构被称为一种糖型(glycoform).这种半乳糖缺少的异质体对正常机体而言也是异物, 因此, 它能诱导抗体的产生, 从而也会出现自身免疫, 其症状是类风湿.糖基转移酶的表达和细胞的周期密切有关.在细胞分化阶段, 许多糖基转移酶的基因是表达的, 为此出现了一系列糖类异质体作为分化抗原; 一旦发育成熟, 在细胞表面出现

了另一些糖链异质体.如果糖基转移酶在成熟细胞中活性很高, 就会产生癌变, 同时出现了早期的分化抗原.在N一糖普键连接的糖链中多聚N一乙酞乳糖胺链的出现被看成是肿瘤的重要标志, 这类糖链可以降低细胞和基质间的粘着,有利于癌细胞的进一步的入侵.

婴幼田鼠肾细胞(BHK) 被Rous肉瘤病毒感染后,GnTV的活性升高２．５倍;一些有转移倾向的肿瘤细胞和非转移的细胞相比,GnTV 的活性高出3一10 倍.岩藻糖基转移酶的活性在肿瘤细胞中也明显升高.糖基转移酶的研究还处于起步阶段, 仅知道一些酶的结构还是远远不够的.更为重要的是了解这些糖基转移酶在多酶系统中是如何协调的, 以及这些酶的表达是受那些因素调控的.这是糖基转移酶今后研究的方向。

2.2.3糖基转移酶在抗生素方面的应用

抗生素糖苷在临床上主要用于抗菌和抗肿瘤, 在抗生素生物合成基因簇中已经发现了很多编码糖基转移酶的基因[1 ] , 但人们对抗生素糖基转移酶(antibioticglycosyltransferases, Gtfs) 的特异性和催化机制了解不多。糖基与不同配基的结合能大大增加天然产物的结构多样性, 在功能上, 这些糖组分通常参与目的细胞的分子识别, 影响化合物的生物活性。目前, 随着抗生素的广泛使用, 耐药菌也在逐年增加, 迫切需要寻找新的抗生素来与之抗衡。通过糖基化增加抗生素种类和改变抗生素活性是一条很有前景的途径, 探讨糖苷类抗生素的产生机制和糖基转移酶的催化特征, 有望为发现和改造新活性的抗生素奠定基础。

很多糖苷类抗生素在生物合成中经过了立体和区域选择性的糖基化, 在这一生物反应中, 糖基转移酶催化其结构中的糖基以单糖、双糖和寡糖链的形式结合到配基上从而形成特定的C2、N 2和O2苷(F ig. 1)。糖苷类抗生素的生物合成途径中, 糖基化通常是后修饰的最后一步, 如万古霉素( vancomycin )、替考拉宁( teicop lanin) 的糖链都是在生物合成的最后引入的[3 ]。糖苷类抗生素的作用机制主要有两类, 一类是通过抑制革兰阳性菌肽聚糖的合成, 如雷莫拉宁( ramop2lanin）; 另一类是抑制DNA 促旋酶的活性, 如新生霉素(novobiocin) [5 ]。

糖基化的作用和意义主要体现在以下三个方面:第一, 增加化合物的水溶性。己糖衍生物结合到抗生素糖苷配基上, 增加了抗生素的亲水性利于药效的发挥,典型的有替考拉宁环七肽上的N -乙酰葡萄糖胺(N-acetyl-glucosam ine, GlcNA c) 和雷莫拉宁骨架上的甘露糖链;第二, 利于分泌。A 40926 生物合成途径中的甘露糖基转移酶(mannosyltransferase) 特异识

manno2syl2PP2C作为糖供体, 使糖基化的抗生素利于分泌。第三, 糖基化是产生菌的一种自我保护机制。在竹桃霉素(oleandomycin) 的产生过程中, 糖基转移酶O leD 使中间态抗生素糖基化, 造成其在胞内短暂失活, 抗生素分泌后, 再由糖苷酶水解去除糖基, 使其恢复活性[7 ]。

该机制在大环内酯类抗生素中比较常见, 类似功能的酶还有M gtA。

2.2.4 糖基转移酶在组合生物合成的应用

应用遗传学方法生产新型聚酮和多肽类化合物日益得到人们的重视, 表面上看重组生物合成糖基化的化合物和聚酮、多肽一样复杂, 但是和聚酮、多肽合成酶的复杂性相比, 由于催化去氧糖产生的酶及其反应机制比较保守, 因此重组合成糖基化的化合物更有实践意义。西班牙的Salas 研究组已经建立了成功的基因克隆和表达系统用来生产活化的去氧糖, 目的基因处于操纵子的下游, 通过启动子的控制可以在链霉菌中表达。在链霉菌S trep tom y ces albus 中整合糖基转移酶基因oleGI I , 导入合成L 2夹竹桃糖(L 2oleandrose) 的质粒后, 合成红霉素内酯B (eryth ronolide B) , 而整合糖基转移酶基因elm GT 后再导入生物合成L 2橄榄糖(L 2o2livose) 的质粒pOLV 可以成功生产特曲霉素( tetracenomycin C)Staurosporine (十字孢碱) 类化合物的结构是由一个糖分子和一个杂环的吲哚卡唑单元组成, 通过化学手段较难得到, 通过在一个生物体内共表达rebecca2mycin 和其它staurosporine 类化合物生物合成基因,分离鉴定了大约产生了30 种staurosporine 类衍生物。通过遗传学方法改变Gtfs 的特异性有一定难度, Salas 研究组通过共表达糖基生物合成基因盒、Gtfs 基因(staN 和staG) 和staurosporine 的生物合成基因成功地替代了天然附加在吲哚卡唑基团上的糖基, 为糖基转移酶在重组生物合成中的应用奠定了基础, 证明重组生物合成在生产新的糖基化产物中较药用化学更有利。

5糖基转移酶的研究前景

最近, 在糖肽的生物合成系统中得到了Gtfs 的晶体, 结构测定表明这类Gtfs 家族有两个共同的结构域。NDP2糖结合到C2端, 糖苷配基结合到N2端(A GVgGtfB,DVVgGtfA ) 。这个两裂的结构仅仅由两个肽连接到一起, 提示混合和匹配各自的结构域是可以实现的。因此,DNA shuffling 或相关酶定向进化可以构建看似荒诞的Gtfs, 改变其对己糖单元和配基的底物特异性, 大大提高糖苷类化合物的结构多样性, 为筛选到新活性糖苷类抗生素奠定基础。总之, 在生物合成中研究糖基化模式的多样性需要满足三个要求。

(1)建立糖基转移酶库通过重组生物合成生产新的抗生素糖苷, 必须建立糖基转移酶的基因库, 才能使之在工业上得到深入应用。随着更多基因簇的序列测定, Gtfs 的数目也会逐年增加, 发现具有混合和匹配的N2或C2端的Gtfs 区域用于构建杂合催化体系, 改变配基和去氧糖的识别, 可以为特定的去氧糖单元寻找新结合位点[34]。(2)建立配基的化合物

库这些化合物包括简单的氨基香豆素类骨架(am inocoum arin scaffolds)、非核糖体肽(NRP)以及芳香化的聚酮配基[25]。但是, 由相似酶催化进行C2N , C2C 糖基化还有待于进一步的研究。

(3)建立糖供体的化合物库糖供体要包括很多UDP 或TDP 活化的糖和去氧糖。天然去氧糖附加到配基上以后, 赋予了配基新的活性。去氧糖的氨甲酰化在很多类型的化合物如聚酮(新生霉素)、非核糖体肽(如替考拉宁) 等抗生素中都存在, 因此所有TDP2D2 和TDP2L2去氧己糖衍生物在库中都值得准备．

迄今为止已经发现了很多与抗生素生物合成相关的糖基转移酶, 但现有的研究还不深入, 对糖基化生物学意义、糖基转移酶结构和功能关系、催化机制、糖苷的活化形式以及组合生物合成的应用等有待进一步探讨。沈月毛研究组发现糖苷化与微生物的生长条件有关, 同一个菌株在平板培养时产生的糖基化产物在液体培养时却检测不到．催化三种不同类型糖苷形成的糖基转移酶之间在其作用机制及底物选择性方面到底存在那些异同, 都有赖于不同类型糖基转移酶高级结构的阐明, 离实用化、产业化还有很长的一段路要走。

参考文献：

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王克夷.糖基转移酶的研究进展.生物化学与生物物理进展.1994；21（1）.

杨清香,曹军卫,黄国锦.糖基转移酶和去糖基化酶, Amino Acids & Biotic Resources 1997, 19 ( 2) : 38～43

代焕琴,王浩鑫,沈月毛.抗生素糖基转移酶研究进展.中国抗生素杂志 2007 年 5 月第 32 卷第 5 期·257.

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[3] Beyer TA,Sadler J E,Rearick J I.Advances Enzymol，1981,；52:23.

糖基转移酶的研究概述

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糖生物学_植物糖基转移酶研究进展

期末考核 课程：Glycobiology 植物糖基转移酶研究进展 ：*** 学号：*** 班级：*** 时间：****

植物糖基转移酶研究进展 摘要:糖基转移酶一类是能够催化糖基从激活的供体转移到特定的受体分子上的一类酶，在生物体中普遍存在并形成了超基因家族。糖基转移酶广泛参与植物生命活动的各种生物学过程。本文综述了近年来的研究报道，综述了糖基转移酶的分类、分离鉴定方法及在生物学功能方面的研究进展，期望为相关研究工作提供参考。 关键词:植物糖基转移酶，分类，分离鉴定，生物学功能 糖基转移酶（Glycosyltransferases，GT，EC 2.4.x.y）是一类催化糖基转移的酶，通过产生糖苷键将供体糖分子或相关基团转移至特异的受体上。糖基转移酶几乎存在于所有的生物体中，其所催化的糖基化反应是最重要的生物学反应之一，直接参与二糖、单糖苷、聚糖苷等的生物合成。糖基供体分子包括双糖、多糖、1-磷酸糖、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，植物中最常见的供体为UDP-Glc。受体可以是糖类、脂类、蛋白质、抗生素和核酸。糖基转移酶催化供体-受体形成α、β两种糖苷键，产物为多糖、糖蛋白、糖脂以及糖苷化合物等。全基因组测序发现真核生物中约1%的基因编码糖基转酶。 1糖基转移酶的分类 目前，对糖基转移酶的分类主要根据Campbell等提出的GT Family 分类系统（数据收录在CAZy数据库中）。糖基转移酶作为高度分歧的多源基因家族，根据蛋白氨基酸序列的一致性、催化特性以及保守序列对其进行分类。因此，一特定的糖基转移酶既可以通过生物化学的方法鉴定其底物，也可以通过生物信息学方法研究其与已知酶基因或酶蛋白氨基酸序列的同源性对其进行分类。目前，依据这种分类方法，糖基转移酶被分为94个家族。根据其的折叠方式可将绝大多数酶分为两个超家族，GT-A超家族和GT-B超家族（图1）。根据催化反应机制、产物的立体化学异构性，在这两个超家族中糖基转移酶又分为反向型和保留型两大类（图2）。 GT-A型折叠的空间结构有两个紧密相连的β/α/β类Rossmann折叠区域。GT-A家族成员需要一个D-X-D基序用来结合二价金金属离子（多为Mn2+），这有助于UDP-糖供体的PPi在酶活性位点上的固定，对于催化反应是不可或缺的。GT-A难以识别UDP-糖供体以外的供体，所以受体的多样性较低。GT-B型折叠的空间含有两个正对的β/α/β类Rossmann折叠区域，连接方式灵活。GT-B成员无需二价金属离子维持活性，这是GT-B与GT-A家族成员的一个显著区别。此外，通过结构分析和PSI-BLAST发现了由跨膜GT组成GT-C超家族，其折叠方式全为反向型，活性位点位于长环部，一般含有8-13个跨膜螺旋。

糖生物学论文 糖基转移酶与糖基转移酶抑制剂

糖基转移酶与糖基转移酶抑制剂 摘要：糖基转移酶在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。其是糖蛋白、糖脂中糖链生物合成的关键酶之一。与此同时，对糖基化抑制剂的研究也是必要的。两者在治疗一些因为糖基转移酶非正常表达引起的疾病有很大作用。 关键词：糖基转移酶；糖基化；糖基化抑制剂 前言：糖基转移酶是广泛存在于内质网和高尔基体内的一大类酶，参与体内重要生物活性物质如糖蛋白和糖脂中糖链的合成，其作用是把相应的活性供体(通常是二磷酸核苷NDP-糖)的单糖部分转移至糖、蛋白质、脂类和核酸等，完成后者的糖基化加工，实现其生物学功能。因此糖基转移酶的表达和活性的变化与许多疾病联系在一起，并可作为某些疾病的诊断标志，如α-1,3-半乳糖基转移酶活性在体内的再现会引发自身免疫反应，导致类风湿，并在器官异体移植中引起排斥反应；N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶、岩藻糖基转移酶等在成熟细胞中活性的明显升高被视为肿瘤发生的重要标志，并且被认为是肿瘤迁移恶化的重要原因。因此设计合成糖基转移酶抑制剂，对于寻找抗肿瘤、抗免疫系统等新药研究有重要意义。 1 糖基转移酶的存在 糖蛋白是通过蛋白质的糖基化组装实现的，而糖基化过程则通过多种糖基转移酶完成——在肽链合成的同时或合成后，在糖基转移酶的催化下，糖链被连接到肽链的特定糖基化位点上。糖基转移酶具有高度的底物专一性，即同时对糖基的供体和受体具有专一性。对糖基转移酶进行研究，是糖基化研究的第1步。目前已对多种糖基转移酶的结构以及编码它们的基因研究清楚,并认为糖链的合成没有特定的模板，而是通过糖基转移酶将糖基由其供体转移到受体上。糖链可以认为是基因的次级产物,一个基因编码一个糖基转移酶,一个糖基转移酶专一地催化一个糖苷键的合成；这样一条糖链的合成就需要一个多酶系统,也就对应了一个基因组。下文简要介绍几类重要的糖基转移酶。 1.1 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosa-minyl-transferase,Gnt) 糖蛋白中糖链通过还原端的N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键与蛋白质肽链上Asn-XXX-Ser/Thr序列(XXX为除脯氨酸以外的氨基酸)中Asn残基上的氨基(-NH2)相连，被称为N-糖链。真核细胞中N-糖链的合成途径高度保守，其第1步合成由GnT完成。1999年, Strasser等依据动物GnT保守区序列设计简并引物，从烟草文库中分离到编码GnT的基因GnTI，这也是植物中第1个被鉴定的GnT基因。随后利用同样的方法从拟南芥、马铃薯中分离和鉴定出一系列GnT基因, 这些基因与动物GnT基因均有较高的序列相似性。后续研究发现

常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂

表1 常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂 诱导剂与抑制剂靶细胞诱导剂 激素地塞米松T细胞 细胞因子IL—2 胸腺细胞 TGF—β肝细胞、上皮细胞、慢性B淋巴瘤细胞 IL—10 髓样白血病细胞 IFN—Υ前B细胞、T细胞抗体抗IgM抗体B细胞 抗IgD抗体B细胞 抗HLA—II抗体静止B细胞 超抗原SPE CD4+T细胞 胞内信号分子调节 剂 放线菌酮T细胞 PKC激活剂胸腺细胞 其他DNA拓扑异构酶抑制 剂 白血病细胞放射线淋巴样细胞 抑制剂 细胞因子IL—2 T H1细胞 IL—4 T H2细胞 IL—10 B、T细胞 IFN—ΥT细胞 IL—4 B细胞 黏附分子LFA—1、ICAM—1 B细胞 VLA—4、VCAM—1 B细胞 胞内信号分子调节 剂 PKC激活剂T、B细胞 细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。1972年，英国教授Kerr首先提出凋亡的概念。近十余年来，细胞凋亡现象引起了广泛重视，有关的研究工作取得重要进展，并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。 细胞凋亡与组织器官的发育、肌体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切的关系。

1．形态学变化： 细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段： 1）胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小斑块。 2）染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分（胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜）形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。 3）凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。 上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。 2．细胞凋亡的生化改变： 1）胞内Ca2+浓度增高 所有细胞凋亡过程中均出现胞内Ca2+浓度增高，这可能是Ca2+内流所致。 2）内源性核酸内切酶激活 细胞发生凋亡时，由于内源性核酸内切酶被激活，DNA被从核小体连接处水解，形成180—200bp 或其整倍数的片段。 3）生物大分子的合成 凋亡过程的发生一般依赖于新的RNA和蛋白质的合成，如在激素、射线作用下，或由于去除生长因子等所引起的细胞凋亡中，情况均为如此。 常用的检测方法： 1．形态学方法 借助普通光学显微镜、荧光显微镜或透射电镜可对组织切片、切片涂片或细胞悬液进行形态学观察，凋亡细胞在组织中散在分布，表现为核致密浓染、核碎裂等。该方法简便、经济，可定性、定位。但在组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下，难以判断结果，也无法定量。 2．电泳法 对凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂凝胶电泳，由于存在180—200bp或其整倍数的片段，故电泳结果可见“梯状”（ladder）DNA条带。该法简便，可定性及定量，但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系。

糖苷酶及其抑制剂的研究

糖苷酶及其抑制剂的研 究 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998

糖苷酶及其抑制剂的研究 摘要：糖苷酶是生命体正常运转的关键性酶，糖苷酶抑制剂 可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，因此对一些 糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值。本 文研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶以及蔗 糖酶的抑制剂。重点研究了β－半乳糖苷酶的分子结构和活性 基团，并从结构出发筛选其抑制剂，发现此酶的抑制剂种类 较少且抑制活性较低。本实验采用混合交叉筛选法筛选了多 种金属离子和氨基酸对β－半乳糖苷酶的抑制作用，同时也筛 选了天然产物和合成化合物。 关键词：糖苷酶β－半乳糖苷酶β－葡萄糖苷酶蔗糖酶抑制剂的筛选混合交叉法 1、前言 糖苷酶和糖基转移酶不仅参与了体内碳水化合物的消化，而且是糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪酶，它对糖蛋白中寡糖链的形成极为重要；糖链的组成与结构是糖蛋白特异生物功能的识别

部位，因此糖苷酶活性对糖蛋白生物合成有关键作用，而后者又涉 及到免疫反应、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌的感染. 因此, 糖苷酶不仅是生命体正常运转的关键性酶,同时又是许多疾病的相关酶. 与病毒感染、癌症及一系列新陈代谢紊乱性疾病如 糖尿病、肥胖病有关。由于糖苷酶重要的生物学意义，糖苷酶抑制 剂的研究也引起了人们的极大兴趣。 糖苷酶抑制剂即是可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，抑制淀粉、麦芽糖、蔗糖转变成单糖；影响糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪；所以糖苷酶抑制剂不但对一些糖代谢紊乱性 疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值[1] ，而且可作为抗AIDS病毒[2]、抗鼠白血病毒[3]的潜在治疗试剂。 本论文重点研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶 β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）又称β－D－半乳糖苷水解酶，（β－D－galactosid- -e galacto-hydrolase ,EC.3.2.1.23）,商品名为乳糖酶（Lactase），它广泛存在于豆类及其他各种动植物体内和微生物中。它能够催化β－半乳糖苷化合物中的β－半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖苷的作用。由于它具有糖苷键结构特 异性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂[4,5]，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基.引起血型转化等生理功能[6,7]而受到人们广 泛关注，成为生物化学和酶催化化学的重要研究课题。

糖苷酶及其抑制剂的研究

糖苷酶及其抑制剂的研究 摘要：糖苷酶是生命体正常运转的关键性酶，糖苷酶抑制剂可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，因此对一些糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值。本文研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶以及蔗糖酶的抑制剂。重点研究了β－半乳糖苷酶的分子结构和活性基团，并从结构出发筛选其抑制剂，发现此酶的抑制剂种类较少且抑制活性较低。本实验采用混合交叉筛选法筛选了多种金属离子和氨基酸对β－半乳糖苷酶的抑制作用，同时也筛选了天然产物和合成化合物。 关键词：糖苷酶β－半乳糖苷酶β－葡萄糖苷酶蔗糖酶抑制剂的筛选混合交叉法 1、前言 糖苷酶和糖基转移酶不仅参与了体内碳水化合物的消化，而且是糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪酶，它对糖蛋白中寡糖链的形成极为重要；糖链的组成与结构是糖蛋白特异生物功能的识别部位，

因此糖苷酶活性对糖蛋白生物合成有关键作用，而后者又涉及到免疫反应、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌的感染. 因此, 糖苷酶不仅是生命体正常运转的关键性酶,同时又是许多疾病的相关酶. 与病毒感染、癌症及一系列新陈代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病有关。由于糖苷酶重要的生物学意义，糖苷酶抑制剂的研究也引起了人们的极大兴趣。 糖苷酶抑制剂即是可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，抑制淀粉、麦芽糖、蔗糖转变成单糖；影响糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪；所以糖苷酶抑制剂不但对一些糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值[1] ，而且可作为抗AIDS病毒[2]、抗鼠白血病毒[3]的潜在治疗试剂。 本论文重点研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶 β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）又称β－D－半乳糖苷水解酶，（β－D－galactosid- -e galacto-hydrolase ,EC.3.2.1.23）,商品名为乳糖酶（Lactase），它广泛存在于豆类及其他各种动植物体内和微生物中。它能够催化β－半乳糖苷化合物中的β－半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖苷的作用。由于它具有糖苷键结构特异性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂[4,5]，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基.引起血型转化等生理功能[6,7]而受到人们广泛关注，成为生物化学和酶催化化学的重要研究课题。 β－半乳糖苷酶的应用有着长远的历史，最初在食品工业中用来降解乳糖含量以满足乳糖不适症患者的需要，然而随着生物技术的发

糖苷酶与糖基转移酶催化转糖反应的特征与机理研究

题名: 糖苷酶与糖基转移酶催化转糖反应的特征与机理研究 作者: 周坤 答辩日期: 2013-1-23 中文摘要: 糖苷化合物的生物合成在合成领域中占有重要地位，然而目前报道的生物合成方法，无论是糖苷酶还是糖基转移酶，均无法实现效率与收益的双赢，因此寻找特异、有 效的糖苷类化合物的合成工具，并对其催化特性与催化机制的研究成为生物转糖的 一个重要方面。本文以生物转糖为研究对象，应用实验与计算结合的手段，进行了 生物转糖酶的筛选及其与底物识别结合等性质研究。基于所建立的快速有效的筛选 方法，对来自海洋的样品进行了筛选，首次从中国黄海海域筛选得到1株具有高效 转糖活性的菌株DL001。菌的形态学研究及16SrDNA序列分析表明，该菌为节杆 菌。对转糖产物的结构鉴定表明该菌能以α-1,4和α-1,6方式向底物转糖。采用四 步柱层析联用的方法，从DL001菌的发酵液上清中分离得到具有转糖活性的糖苷 酶AG-I。底物特异性分析表明该酶对水解底物和糖基供体的专一性高，但却能以葡 萄糖苷、木糖苷和烷基醇作为糖基受体。其中该酶对pNP-糖苷化合物的转糖效率 高达42-60%，并能进一步以转糖产物为受体继续发生糖基化反应，表明该酶可作 为一个有效的生物合成工具用于工业合成。我们以酵母来源的α-糖苷酶和羟基香豆 素类化合物为研究对象，组合应用对接方法、分子表面的静电势和轨道能分析等方 法，来阐明α-糖苷酶与其配体产生特异性结合的关键特征。结果表明，氢键、分子 静电势和分子轨道能量等特征对配体与α-糖苷酶特异性识别有重要作用，并且这些 特征作为一种推动力促使配体以最优构象与受体α-糖苷酶相互作用。我们建立了一 个糖基化位点的数据库，并基于此构建了一个基于先验概率的判别分析模型用于糖 基化位点的预测。进一步的特征分析表明位置R1上的氨基酸性质及所有位点中与 疏水性相关的氨基酸性质对糖基化影响较大，而糖基化位点C端的二级结构性质和 N端的的物化性质对糖基化的影响也不可忽略。这个模型不仅为糖基化位点的预测 提供了一个有效工具，并为深入理解糖基化的影响因素提供有效信息。考虑到我们 模型的公共可获得性，我们提供了一个可下载的程序供人们来预测糖基化位点。

糖基转移酶酶活测定方法

Analysis of glk 12，15 葡萄糖通过葡萄糖激酶的ATP依赖的磷酸化是由通过根据弗兰克尔和Horecker 的使用过量的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶监测细胞提取物中NADPH的形成。反应体系为 2 ml，50 mM Tris buffer pH7.65；10 mM MgCl2；50mM甘露糖；加入0.1mL酶。在反应中，NADP+被还原生成NADPH，其产量与样品GLK活性呈正相关，NADPH在340nm处有一吸收峰，因此测吸光度，每分钟记录一次直至吸光度不再变化，测出每分钟光密度的增加值。根据以下公式计算：酶活性=吸光度变化（min）/6.22（NADPH吸光系数） Analysis of manB 中文 酶的测定原理是根D-甘露糖-l-磷酸作底物,反应后经酸水解无机磷的减少而测定。标准的反应溶液中,含有D-甘露糖-1-磷酸(0.5m mol/l) 、D-葡萄糖-2,6-二磷酸 ( 0.0 1mmo l/L),醋酸镁 (2.5m mol /L),组氨酸(5m mol /L),Tris -Hcl(10 mmol/ l,pH8.0 )的缓冲液和微克量的酶液。反应总体积为 50μL,在30 ℃下反应10分钟,然后加4.25 mL 0.74 mol /L H2SO4 .消化20 分钟,再加125 m1 钼酸铵和25 μL F -S试剂 ,在100℃水浴下煮沸7 -10分钟,冷却,在670 nm波长下测光密度。以酶液先消化后加底物经同样处理的样品作对照测光密度。以两者的光密度正差显示酶活性。 Analysis of gmd and wcaG 17 利用分光和色谱测定试验系统进行测量GDP-D-甘露糖4,6-脱水酶和GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖3,5-差向异构酶-4-还原酶的活性。GDP-D-甘露糖4,6-脱水酶标准测定体系含有50mM的Tris/盐酸缓冲液pH7.5，10mM的氯化镁，4mM的GDP-D-甘露糖，50μMNADPH+和GMD含粗提物终体积为100μL。该反应在37℃进行60分钟，每隔一段时间测量一次。最后加入1900μL 100mM NaOH终止反应并在37℃下孵育20min，然后在320nm下测吸光度。GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖3,5-差向异构酶-4-还原酶活性测量依靠加入在第一步骤中的反应，然后通过在340 nm和37℃下测量NADPH的消耗量测定。 Analysis of fuct 1-。。 标准测定混合物含有38nM寡糖受体，20mM的MnCl2，1％的Triton X-100，50mM的二甲胂-HCl缓冲液（pH值 5.8），0.37 μM GDP-岩藻糖（270.0 mCi/mmol），和酶（0.4 mg protein），100μL的终体积。温育在37℃，1h。终止反应用300μL氯仿/甲醇（2/1，v/v），然后将产物通过TLC，乙醇/吡啶/ 1-丁醇/水/乙酸(100/10/10/30/3, by vol)在下层相分离。掺入糖脂的放射性活度是用图像分析仪和并用液体闪烁计数器测定。

PARP家族及临床使用的PARP抑制剂

广东化工2019年第9期·134·https://www.sodocs.net/doc/273208280.html,第46卷总第395期PARP家族及临床使用的PARP抑制剂 王世瑞，薛晓文* (中国药科大学药学院，江苏南京211100) PARP Family and Clinically Used PARP Inhibitors Wang Shirui,Xue Xiaowen* (School of Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing211100,China) Abstract:Poly(ADP-ribose)polymerases(PARPs)are enzymes that transfer ADP-ribose groups to target proteins and thereby affect various nuclear and cytoplasmic processes，and they play an irreplaceable role in maintaining genomic stability and regulating signaling pathways.The recent progress in the subtypes and biological functions of PARP was reviewed in this paper,and the PARP inhibitors clinically used was described. Keywords:PARPs；ADP-ribosylation；PARP inhibitors ADP核糖基化(ADPr)是蛋白质的一种可逆的、进化保守的转录后修饰过程，参与调节体内多种生物过程，在维持基因的稳定性和细胞凋亡等方面发挥着重要的作用[1]。ADPr主要由ADP-核糖基转移酶(ART)蛋白超家族催化。目前，研究最多的ART家族是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶家族(PARPs)，依据与家族初始成员PARP1催化域结构的同源性，有17个在哺乳动物体内发现的蛋白质被命名为PARP1-17[2]。然而，需要说明的是，并不是所有的PARP家族成员都具有ADP核糖基转移酶活性，并且有一些成员的作用为单ADP核糖基转移酶而非聚ADP核糖基转移酶[3]。因此，Michae等人以这些蛋白催化的酶促反应类型和生物化学分类规则为依据，将PARP样ADP-核糖基转移酶重新系统命名为白喉毒素样ADP-核糖基转移酶(Diphtheria toxin-like ADP-ribosyltransferases,ARTDs)[4]，为了便于理解，本文仍将继续使用PARPs这一名称进行综述。 1PARP家族构成及分类 依据PARP家族成员各自的结构域和功能的特征可将其大致分为四种不同的类型：DNA依赖性PARPs，包括PARP1，PARP2，和PARP3；端锚聚合酶(Tankyrase)，包括PARP5a(Tankyrase1)，PARP5b(Tankyrase2)；CCCH(即Cys-Cys-Cys-His)PARPs，包括PARP7，PARP12，PARP13；macro PARPs，包括PARP9，PARP14，PARP15。其余的PARP家族成员如PARP4，PARP10等，则无法纳入这四种类型，因它们具有不同的域结构[5]。(见表1) 表1PARP家族成员的组成、分类和酶活性 Tab.1The organization,classification and enzymatic activities of PARP family members PARPs系统命名亚家族分类大小a关键功能模块和结构域b酶活性c PARP1ARTD1DNA-dependent1014WGR,ZF and BRCT P&B PARP2ARTD2DNA-dependent570WGR，SAP P&B PARP3ARTD3DNA-dependent540WGR，CBD M PARP4ARTD41724BRCT P PARP5a ARTD5Tankyrase1327ARD，SAM P&O PARP5b ARTD6Tankyrase1166ARD，SAM P&O PARP6ARTD17322M(pre) PARP7ARTD14CCCH PARP657ZF and WWE M PARP8ARTD16854M(pre) PARP9ARTD9macro PARP854Macrodomain/ PARP10ARTD101025M(pre) PARP11ARTD11331WWE M(pre) PARP12ARTD12CCCH PARP701ZF and WWE M(pre) PARP13ARTD13CCCH PARP902ZF and WWE/ PARP14ARTD8macro PARP1801Macrodomain and WWE M PARP15ARTD7macro PARP444Macrodomain M PARP16ARTD15630M(pre) a：在这里指氨基酸残基的个数；b：WGR：富含色氨酸(W)，甘氨酸(G)，精氨酸(R)，的结构域；BRCT：乳腺癌易感蛋白1(BRCA1)C端结构域；WWE：保守氨基酸残基色氨酸(W)-色氨酸(W)-谷氨酸(E)富含区域；ZF即锌指结构；ARD：即锚蛋白重复结构域；SAM即无效α基序；SAP即SAF或Acinus 或PIAS-DNA-连接域；c：目前已知的或者预测酶活性即进行单(M)，寡(B)，聚(P)或支化(B)-ADP核糖基化。 2PARP家族主要成员的结构和生物学功能2.1DNA依赖性PARPs 该类型包括PARP1、PARP2和PARP3，三者在催化域(CAT)的结构上有60%的相似性，但是氨基端的结构有所不同：PARP2和PARP3缺乏锌指(ZF)结构和BRCT结构域[6](图1)。 [收稿日期]2019-04-12 [作者简介]王世瑞(1992-)，男，邢台市人，硕士研究生，主要研究方向为药物化学。*为通讯作者。