激光共聚焦显微镜技术1讲解

激光共聚焦显微镜技术

The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy

激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史

1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。

1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜

激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史

?80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。

?近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。如双光子，FCS,FLIM ,STED等。

共焦显微镜的优点

人眼分辨率：0.2mm

光学显微镜分辨率：0.25μm

电子显微镜分辨率：0.2nm

共焦显微镜分辨率：μm

共焦显微镜的优点

?电子显微镜的缺陷：

1.只能观察固定样品

2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象

?荧光显微镜的缺陷:

1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。

2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。

3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。

4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。

共焦显微镜的优点

?共焦显微镜与传统显微镜的区别

1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像

激光扫描共焦显微镜技术

?共焦显微镜与传统显微镜的区别

2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片

激光扫描共焦显微镜技术

共焦显微镜与传统显微镜的区别

3. 增加侧向分辨率

激光扫描共焦显微镜技术

Fluorescent Microscope vs confocal

激光扫描共焦显微镜技术

激光扫描共焦显微镜技术

扫描方式

激光扫描共焦显微镜技术

原理小结:

Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的2

al convention confocal d d

扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。

激光扫描共焦显微镜技术

激光扫描共焦显微镜的设计特点:

1.点照明。

2.具有照明pinhole和探测pinhole。

3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。

4.具有扫描系统——逐点扫描成像。

5.具有多个（五个）荧光通道，可同时探测多个被标记物。

6.使用AOTF(Acousto-Optical Tunable Filter )进行激光波长和强度的选择，并以极超快速控制激光开和关，从而实现任意形状感兴趣区域扫描的功能,实现了实时快速检测。

7. AOBS(Acousto-Optical Beam Splitter)：更好的减少了激发光对发射荧光的干扰。

8.光谱检测器：任意选择接受光谱的波长和带宽。

AOBS(Acousto-Optical Beam Splitter)

AOBS的作用

?特定波长的激发光经过AOBS后发生偏转进入光路

?样品产生的荧光直接通过AOBS到达检测器，而反射回来的激发光经过AOBS后发生偏转不能到达检测器。

?优点：与传统的二色光分光镜相比，增大了荧光的接受率。

?更好的阻止了激发光对发射荧光的干扰。

光谱检测器

棱镜分光，光谱检测

激光扫描共焦显微镜技术

?分辨率

1. 光学分辨率

只与物镜的数值孔径NA和检测波长有关

xy分辨率比传统显微镜小1.4x

传统显微镜: Rxy=0.61λ/NA （0.25 μm )

Confocal: Rxy=0.4λ/NA（0.18 μm )

2. 采样分辨率

固定物镜倍率下，Zoom相同时，无论采样密度大

小，采样面积是固定的。

理论上，固定面积下，采样密度越高，即采样点越

多，图像越细腻。但是，采样密度越高，扫描一幅

图像的速度越慢，荧光强度越低，样品也越容易被

淬灭。

激光扫描共焦显微镜技术

?图像亮度

1.与物镜NA有关。

物镜镜像亮度与数值孔径的平方呈正比，与总放大率的

平方呈反比。

L = NA 2/ M 2 , NA 大小相同，倍率越高，镜像亮度越低

2. 与pinhole 大小有关。 M 2 = ( M 1 × M 2) 2

Pinhole 大小的选择

理论上，最佳Pinhole ＝Airy Disk ＝1

实际上，应根据样品标记的实际情况来选择Pinhole 的大小

3. 与激发光强度有关。

4. 与接受发射荧光波长的带宽有关

激光扫描共焦显微镜技术

?光切厚度和光切步距

光学切片厚度

取决于: 物镜的NA 、针孔大小、发射波长等

光学切片厚度＝光切步距(Step Size)

?dz=

Z 轴的最小移动步距: 40nm ，15 nm ，3 nm

理论Z 轴分辨率：dz=0.35μm

激光扫描共焦显微镜技术

?样品的最大厚度:大约1- 2mm(10X/0.4物镜)

取决于: 物镜的NA 、物镜的工作距离

激光的穿透力、样品的透明度

Z 轴的最大移动范围(SP2 166μm 、Z-wide,8mm)

(sp5 500/1500 μm, -11mm/2mm,15nm stepsize ）

在观察较厚的样品，如脑片时，应该选用怎样的物镜？

激光扫描共焦显微镜技术

?技术指标（Leica TCS ) :

1. xy 分辨率比传统显微镜小1.4x

传统显微镜: Rxy=0.61λ/NA （0.25 μm )

Confocal: Rxy=0.4λ/NA （0.18 μm )

2. 样品的最大厚度:大约1- 2mm(10X/0.4物镜)

取决于: 物镜的NA 、物镜的工作距离

激光的穿透力、样品的透明度

Z 轴的最大移动范围(166μm 、Z-wide 8mm sp2)

(500um/1500um/3nm , Z-wide 13mm Sp5) ( 0.88λem)

2 ( n ?√2 Ph )2 NA n -(n 2-NA 2)1/2 +

3. 样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为40nm,SP2）

取决于: 物镜的NA、针孔大小、发射波长等

Z轴的最小移动步距: 40nm

Z轴的分辨率: 0.35 μm

激光扫描共焦显微镜技术

?Pinhole（探测针孔）大小影响:

1) 图像的亮度

2) 光学切片的厚度

?Pinhole大小的选择

理论上，最佳Pinhole＝Airy Disk＝1

实际上，应根据样品标记的实际情况来选择Ph的大小。

激光扫描共焦显微镜技术

4. 激光器

Ar激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm

GreNe : 543nm; HeNe: 633nm

Ar激光器(UV): 351nm, 361nm

固体激光器：561nm,405nm

?激光器的特点:

1) 方向性好: 激光基本延直线传播

2) 单色性好:?λ=10-8nm

3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度

集中的。

4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合。

5)光谱的不连续性。

激光扫描共焦显微镜技术

5. 五个荧光通道, 一个透射光通道

即除了可同时采集多标记荧光图像外

还可以同时采集透射光图像，但透射光

图像为非共焦图像。

注：对未标记的标本，可采集反射光图像。

激光扫描共焦显微镜技术

?扫描速度:

CONVENTIONAL 2800 lines/s 512?512 5/S Resonant 16000 lines/s 512?512 25/S ?扫描密度:

64?64

128?128

512?512，512?64，512?32

1024?1024

2048?2048 SP5 8192 ?8192 4096 ?4096

?扫描方式：xyz, xyt, xzt, xt，xyzt, xyλ, xλ,xzλ, xzy, xyzλ,

激光扫描共焦显微镜技术

?共焦显微镜的类型：

1.点(慢)扫描共焦显微镜:

分辨率高, 图像清晰; 噪音低; 采集图像速度慢;

目镜中观察不到共焦图像

2.线(狭缝)扫描共焦显微镜(video rate)

分辨率低; 噪音高; 扫描速度快240幅/秒; 目

镜中可观察到共焦图像

3.Nipkov转盘式扫描共焦显微镜

性能介于上述两者之间

Spinning disk confocal

Spinning disk confocal

Spinning disk confocal

??每个视场约1000个激光点，总计约20000个针孔

??针孔尺寸固定在50μm，适合100x/1.4 油镜

??针孔间的空隙可避免信号相互干扰

??约有70%的激发光到达样品

?? 盘转速1500到10000转/秒，成像速度300到2000帧/ 秒?? 激发光谱400-650nm 检测光谱420-750nm

Spinning disk confocal

?采用双转盘,微透镜

?EM CCD 作为探测器

?采样速度快，300－2000/s

?适合于记录活细胞样品的快速变化

?没有电子放大，不适合观察细胞内的微细结构。

?发射波长使用滤片选择。

激光扫描共焦显微镜

技术的应用

?The application of Confocal Laser Scanning Microscopy

激光扫描共焦显微镜

技术的应用

?Confocal基本应用

?FRET、FRAP 和FLIP应用

?与Confocal相关技术的进展

激光扫描共焦显微镜

技术的应用

功能.

1.多重荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集

2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”

3.真正的三维重组

4.假三维图的显示

5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切

6.定量分析

7.时间序列扫描: xyt 、xyzt 和xt 扫描

8.图像处理

9. 旋转扫描

10.感兴趣区域扫描

11.光谱扫描－光谱拆分

?荧光强度的测量

荧光强度＝荧光效率×激发光强度

?测量原理(Boehm 1861)

?I=I0Q(1-10-kcd )＝I0Q(1-1/10kcd )

?I0: 激发光强度；I: 发射光强度

?Q: 荧光量子产率，对于特定荧光物质，该值为常数。

?当c较小时，I C

?若用计算机采集荧光图像，计算机灰度级可直接代表荧光强度。

?旋转扫描

除用于xy平面旋转以调整样品的方位之外，主要用于xt线扫描方式。由于只沿x方向扫描一条线(相当与在x方向的512个点)，已经丢失了很多空间信息，如果这时所被扫描的细胞长轴与x方向不一致，将更进一步丢失空间信息。为此，需进行旋转扫描，旋转扫描即可以使扫描方向旋转到与细胞长轴一致，然后沿细胞长轴方向进行扫描。

激光扫描共焦显微镜

技术的应用

?感兴趣区域扫描

一般情况下，激光扫描共焦显微镜系统扫描的区域形状通常是固定的方形或长方形，如果x方向和y方向的采样点数相同，如：512×512，256×256，128×128，则扫描区域的形

状为方形。如果x方向和y方向的采样点数不同，如：512×64，则扫描区域的形状为长方形。而感兴趣区域扫描是使用者可以根据实际情况，用鼠标勾画任意形状感兴趣的区域进行扫描。感兴趣区域扫描还可以用于荧光漂白恢复测量及荧光能量共振转移时淬灭区域的选择。

激光扫描共焦显微镜

技术的应用

光谱拆分

如果两种荧光标记物光谱在同一个检测通道接受的波长范围内具有高度重叠时，往往两种荧光信号同时进入同一个检测器，此时从所采集的图像中完全无法区分两种荧光标记物，如：FITC与GFP，FITC与Fluo3在500～530nm范围内高度重叠，或者植物细胞中自发荧光与任何一种荧光标记物在每一个检测通道光谱的高度重叠时，需要利用光谱拆分的功能将两种荧光标记物区分开。因每一种荧光标记物都有自己独特的光谱特性，如同每一个人都有自己的指纹。通过光谱扫描（或指纹分析）可以将同一通道的一副混合图像拆分成两种不同的荧光物质标记的图像。

光纤通信技术概述解析

3.3 光纤通信技术 一、光纤通信系统概述及基本结构 光纤通信系统是以光纤为传输媒介, 光波为载波的通信系统。主要由光发送机、光纤光缆、中继器和光接收机组成, 其基本结构原理如图所示。 系统中还包含了一些互联和光信号处理部件, 如光纤连接器、隔离器、光开关等。图中电端机和光端机均包括发送和接收两部分, 两者合起来构成发送器和接收器。其中发送光端机是将电信号变换成光信号,接收光端机则是将光信号转换成电信号。 1、发送器 发送器由发送光端机和电端机构成, 其核心是一个光源。光源的主要功能就是将一个信息信号从电子格式转换为光格式。今天的光纤通信系统采用发光二极管或激光二极管作为光源。两者都是小型的半导体

设备, 可以有效地将电信号转换为光信号。LD 输出的光功率较大, 谱线窄, 一般适合长距离、大容量的通信系统, 但其寿命较短, 价格高; LED 光源发出的光功率较小, 光谱线较宽, 调制速率较低, 输出线性好, 寿命长, 成本低, 适用于短距离和中小容量的系统。它们需要与电源相连并且需要调制电路。 2、光纤 光纤通信系统中的传输介质是光纤。光纤通信系统中发送器端的光信息信号就是通过光纤传送到接收器端的。实际上, 同任何其他通信链路一样, 光纤提供发送器和接收器间的连接。同时, 光纤对光信号进行传导, 就像铜线和同轴线传导电信号一样。它大概和人的头发的粗细相同, 为了保护非常脆弱的光纤, 使其不受恶劣的外部环境和机械的损害, 通常将光纤封装在特定的结构中。裸露的光纤包上保护膜后封装到其他几层中, 所有这些就构成了光纤光缆。 3、接收器 接收器由接收光端机和电端机构成。接收光端机的主要部分包括光检测器、放大器、均衡器、判决器、自动增益控制电路和时钟电路。其中光检测器是接收光端机的核心, 光检测器的主要功能就是把光信息信号转换回电信号( 光电流) 。光纤通信系统中的光检测器主要有PIN 二极管、雪崩光电二极管( APD) 。APD 比PIN 更灵敏, 而且对外部放大功能要求更低。A PD 的缺点是具有相对较长的渡越时间以及由于雪崩放大造成的附加内部噪声。 4、光中继器

德国Zeiss 激光共聚焦显微镜 快速操作手册

德国Zeiss 激光共聚焦显微镜快速操作手册德国 Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作: 光学仪器(上海)制作:Zeiss 光学仪器(上海)国际贸易有限公司孙凯 2009 年 6 月目录:目录:1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明实物照片说明2 系统的使用2.1 开机顺序软件的快速使用说明2.2 软件的快速使用说明快速使用显微镜的2.3 显微镜的触摸屏控制2.4 关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。系统组成及光路示意图:系统组成及光路示意图: 组成及光路示意图电动荧光显微镜扫描检测单元激光器电脑工作站实物照片说明:实物照片说明: 电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用2.1 开机顺序 )打开稳压电源(绿色按钮)(1)打开稳压电源(绿色按钮) 等待 2 分钟(电压稳定)后，再开其它开关) “ ”(2)主开关 MAIN SWITC H “ON” “ ”电脑系统SYSTEMS/PC “ON” “ ”扫描硬件系统COMPONENTS “ON” )(3)打开电动显微镜开关打开荧光灯开关 (注:具有 5 档光强调节旋钮) ) 离子激光器主开关”(4)Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约分钟，预热等待约 15 分钟，”将激光器扳钮由“Standby”扳至”状态，“Laser run”状态，即可正常使用 ) ，(5)打开电脑开关，进入操作系统注:键盘上也具有电脑开关 2.2 软件的快速使用说明(1)电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件 ZEN 图标(2)进入 ZEN 界面，弹出对话框: ”——“Start System”——初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件，用于已”存图像数据的处理、分析。(3)软件界面: 功能界面切换:扫描取图( ) 图像处理( 、图像处

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图 二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地

进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 （一）细胞的三维重建 普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。（二）静态结构检测 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡 检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白

激光无线通信光发射与接收电路的设计解析

第２７卷第３期２００７年５月 ＪＯＵＲＮＡＬ 孝感学院学报 ＯＦ ＸＩＡＯＧＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＶＯＬ．２７Ｎ０．３ ＭＡＹ．２００７ 激光无线通信光发射与接收电路的设计 鲁德初，吕 昊，吴迪 （孝感学院物理与电子信息工程学院，湖北孝感４３２０００） 摘要：提出了一种为半导体激光器的调制驱动电路，能够在大气激光通讯中稳定工作。还研究了大气信道的特点，并讨论了大气信道对信号的吸收、散射和湍流影响，给出了衰减的因子。结合信道编码定理，讨论了适于在大气中传输的码型，特别是Ｒｓ码，得出了适合大气信道的编码码长和码率的选择依据。 关键词：无线激光通信；大气信道；码型分析中图分类号：ＴＮ９２９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１—２５４４（２００７）０３—００３８—０４

激光无线通信又称为自由空间光通信（ＦＳＯ），它以大气作为传输介质进行通讯¨也１，与传统的通信方式相比，有着许多优势，如传输速率高，光束方向性好，保密性高，不需无线电频率使用许可，不影响市政建设，成本低，结构轻巧，通信频带宽，尤其是激光特性中具有高度的定向性，发射波束纤细，在短时间内能够传输大量数据，通信时间短，具有高度的保密性和抗干扰性，能有效地防止窃听和侦测¨“ｏ。 ． １．１激光器的直接调制电路 图２是数字式直接调制电路图，图中晶体管ＢＧ２和ＢＧ３为发射极耦合对，组成非饱和电流选择开关。当ＢＧ：基极电位高于ＢＧ３基极电位时，ＢＧ２导通，恒流源的驱动电流Ｉ。全部流过ＢＧ：，故流过ＬＤ的电流为零；反之，当ＢＧ２基极电位低于ＢＧ３基极电位时，ＢＧ３导通，所有驱动电流都通过ＬＤ。电流开关的转换过程由输人数字信号转换成ＥＣＬ电平来控制，ＥＣＬ电平为“ｌ”码时，输出为一１．８Ｖ，为“０”码时，输出为＋０．８Ｖ，经过ＢＧｌ和Ｄ１电平移动后加到ＢＧ２基极，而ＢＧ３基极电平固定在一２．６Ｖ，它由温度补偿的参考电平Ｖｂｂ经ＢＧ。和Ｄ２电平移动得到。Ｖｂｂ＝一１．３ｌ是“ｌ”码和“０”码电平的中间值。 选择适当的输入电压，使晶体管不驱动到饱和状态，就能起到快速开关作用，同时恒流源可使开关噪声很小。１．２调制发射电路 图３是调制驱动电路图，主要由ＭＡＸＩＭ公司的１５５ＭＨｚ的ＭＡＸ３２６３芯片和内部带有监视二极管的激光器ＬＤ构成。ＭＡＸ３２６３内部的主偏置电源提供温度补偿偏置和参考电压输出Ｖｒｅｆｌ和Ｖｒｅｆ２，通过电阻Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７和Ｒ２８对内部的高速调制驱动电路、激光器和监视二极管进行编程。ＭＡＸ３２６３的输出电流都被内部的镜像电流 Ｖ

激光扫描共聚焦显微镜_图文讲解

激光扫描共聚焦显微镜 吴旭 2008.10.14 高级显微镜原理 正置、倒置显微镜 细胞遗传工作站 活细胞工作站 激光显微分离系统激光共聚焦显微镜 概述 激光扫描共聚焦显微镜 （Laser scanning confocalmicroscope ，LSCM ）生物医学领域的主要应用 通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究 高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测……

Conventional fluorescence microscope Confocal microscope 历史

1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。 1967年，Egger 和Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。 1977年，Sheppard 和Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。 1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。 1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。 Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987 Zeiss 、Leica 、Meridian 、Olympus

Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜

Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜 操作手册

Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册 目录: 1 系统得组成 系统组成及光路示意图 实物照片说明 2 系统得使用 2、1 开机顺序 2、2 软件得快速使用说明 2、3 显微镜得触摸屏控制 2、4 关机顺序 3 系统得维护 1 系统得组成 激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。 系统组成及光路示意图: 电脑工作站 激光器 电动荧光显微镜扫描检测单元 实物照片说明: 电动荧光显微镜 扫描检测单元 CO2 培养系统控制器 激光器 电脑工作站 2 系统得使用 2、1 开机顺序 (1)打开稳压电源(绿色按钮) 等待2 分钟(电压稳定)后,再开其它开关 (2)主开关[ MAIN SWITCH ]“ON” 电脑系统[ SYSTEMS/PC ]“ON” 扫描硬件系统[ PONENTS ]“ON” (3)打开[ 电动显微镜开关] 打开[ 荧光灯开关] (注:具有5 档光强调节旋钮) (4)Ar 离子激光器主开关“ON” 顺时针旋转钥匙至“—” 预热等待约15分钟, 将激光器[ 扳钮] 由“Standby”扳至 “Laser run”状态,即可正常使用 (5)打开[ 电脑开关],进入操作系统

注:键盘上也具有[ 电脑开关] 2、2 软件得快速使用说明 (1)电脑开机进入操作系统界面后,双击桌面共聚焦软件ZEN 图标 (2)进入ZEN 界面,弹出对话框: “Start System”——初始化整个系统,用于激光扫描取图、 分析等。 “Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件,用于已 存图像数据得处理、分析。 (3)软件界面: 1 功能界面切换:扫描取图(Acquisition)、图像处理(Processing)、维护(Maintain) (注:Maintain仅供Zeiss专业工程师使用) 2 动作按钮; 3 工具组(多维扫描控制); 4 工具详细界面; 5 状态栏; 6 视窗切换按钮; 7 图像切换按钮;8 图像浏览/预扫描窗口;9 文档浏览/处理区域;10 视窗中图像处理模块 动作按钮: Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。 Start ——开始扫描单张图片或一个实验流程(1组图片,如XYZ、XYT 等)。 Stop ——暂停/结束扫描。 New ——建立一个新图像扫描窗口/文档。 激光连接状况检查 眼睛观察/相机/共聚焦LSM 光路切换(ZEN软件界面右上角): Ocular ——通过观察筒用眼睛观察。(激光安全保护装置自动阻断激光、保护眼睛。) Camera ——光路切换至相机。 LSM ——共聚焦扫描成像光路。 显微镜设置: “Ocular”——> “Light Path”——> 点击物镜图标,选择物镜——> 样品聚焦。 透射光控制(Transmitted Light Control) 反射光光闸控制(Reflected Light Shutter) 荧光激发块选择(Reflector) 共聚焦LSM 扫描设置 点击“LSM”(ZEN软件界面右上角),系统切换至共聚焦扫描光路: 光路设置: Smart Setup ——自动预设光路 选取“荧光探针”、“颜色”、扫描方法, 应用“Apply”。 (注:Fastest 为最快速扫描,多条激光谱线同时扫 描。Best signal 为最佳信号扫描,多条激光谱线顺 序扫描。Best promise 为兼顾速度与信号得折

适用于共聚焦显微镜的玻片结构的制作技术

本技术公开了一种适用于共聚焦显微镜的玻片结构，包括：中间玻片，所述中间玻片上设有若干第一通孔；盖玻片和载玻片，所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次层叠设置；弹性材料制成的密封圈，设于所述第一通孔内且厚度略大于所述中间玻片的厚度，使得所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次贴合时所述密封圈的上、下侧分别与所述盖玻片、所述载玻片抵接。通过设置密封圈，使用时先把中间玻片放在载玻片上，然后把密封圈放在第一通孔内，然后把观察物置于密封圈内，然后盖上盖玻片，再使用外置的夹紧件夹紧盖玻片、中间玻片和载玻片，由于密封圈的上、下侧分别与所述盖玻片、所述载玻片抵接，透明剂和荧光染料不容易溢出。 权利要求书 1.一种适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：包括： 中间玻片，设有若干第一通孔； 盖玻片和载玻片，所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次层叠设置； 弹性材料制成的密封圈，设于所述第一通孔内且厚度略大于所述中间玻片的厚度，使得所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次贴合时所述密封圈的上、下侧分别与所述盖玻片、所述载玻片抵接。 2.根据权利要求1所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：所述第一通孔的内

侧壁与所述密封圈之间设有第一间隙。 3.根据权利要求1所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：所述密封圈的颜色为黑色。 4.根据权利要求1所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：所述第一通孔有两个。 5.根据权利要求1所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：还包括若干夹紧件，所述夹紧件具有上夹持部和下夹持部，所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片均设于所述上夹持部和所述下夹持部之间，所述上夹持部与所述盖玻片抵接，所述下夹持部与所述载玻片抵接，使得所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次紧贴。 6.根据权利要求5所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：所述盖玻片呈横向设置的矩形板状，所述夹紧件有两个，两个夹紧件分别设于所述盖玻片的左端、右端。 7.根据权利要求5所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：所述夹紧件为回形针。 技术说明书 适用于共聚焦显微镜的玻片结构 技术领域 本技术涉及实验器材领域，特别是涉及一种适用于共聚焦显微镜的玻片结构。

激光无线通信技术

激光无线通信技术 激光通信是一种以光波作为“载波”，大气、海水或太空作为传输介质的通信方式，与利用电磁波作载波的通信原理一样，只是承载信号的载波是激光，其波长更短，频率更高。与传统无线通信和有线通信相对应的，激光通信也形成了无线通信及有线通信，军事通信所关注的主要是激光无线通信。 激光无线通信具有电磁兼容性好、抗电磁干扰能力强、重量轻、功耗和体积小、保密性好等特点。保密性好的原因在于，一：激光具有高度定向性，发射波束非常短，通常发散角小于1弧度，在毫弧度级，二：信道速率高，能在短时间内大量发送数据，从而减少通信持续时间。波束窄使得抗干扰抗截获能力强，通信时间短的特点使得抗侦测、防窃听的能力强。另外，及激光通信的传输带宽宽，比较适合侦察图像等的实时传输。

美国航天局（NASA ）在2014年6月6日宣布，该机构5日利用激光束在3.5秒内把一段时长37秒的高清视频从国际空间站传送回地面，成功完成了一项“可能根本性改变未来太空通信的技术演示”，也预示着太空宽带时代的到来。这项实验的成功表明激光传输技术是可行的，完全可以作为下一步进行更高速率传输和实用性通信的技术基础。

应用及前景展望 1、用于提升星间通信速率 卫星微波通信的极限通信速率在2Gbps左右，近年来通信速率提升困难。而激光通信技术可以轻松实现10Gbps以上的通信速率，采用复用的手段甚至能获得Tbps 以上的通信速率。如此高的通信速率，使得太空通信如同从拨号上网时代升级到了宽带上网时代。 2、用于能源成本较高的空间通信 由于激光通信的光束发散角很小，大大降低了通信过程中信息被截取的可能性，目前还没有截获空间激光通信信息的可行手段，这使激光通信具有高度的保密性。而能量的高度集中,使得落在接收机望远镜天线上的功率密度高，发射机的发射功率可大大降低，功耗相对较低。这对应用于能源成本高昂的空间通信来说也是非常适用的。 3、用于水下通信 此外，激光在水下通信中也有很大的应用空间，电磁波在水中的衰减程度较大，传统的无线电波想要穿透海水，必须使用频率极低的波段，携带的信息量十分有限，传输时间长。然而，研究发现，激光中存在一个频段——光波波长为450～570nm 的蓝绿光，海水对其吸收损耗较小，它通过海水时，不仅穿透能力强，而且方向性极好。因此，激光通信也是深海中传输信息的重要方式之一，可以用于对潜通信、探潜探雷、测深等领域。 限制因素： 但空间激光通信中的激光是在自由空间中传播，因此存在巨大的传输损耗。空间激光通信，尤其是星地间的通信，最大的限制就是经过大气层时受到湍流，及其他天气、环境因素的影响。 其次，空间激光通信链路的距离从千公裡到数亿公里不等，并且链路之间不可能有中继放大，这与地面光纤通信千公裡的链路距离相比实现起来难度大得多。比如火星与地球之间的链路，由于距离太过遥远，激光的几何损耗极大，点对点的瞄准也更为困难。

德国Zeiss激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册

德国Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作制作：：Zeiss 光学仪器光学仪器（（上海上海））国际贸易有限公司 孙 凯 2009年6月

目录目录：： 1 系统的组成 系统组成及光路示意图 实物照片实物照片说明说明 2 系统的使用 2.1 开机顺序 2.2 软件的软件的快速快速快速使用使用使用说明说明 2.3 显微镜显微镜的的触摸屏控制 2.4 关机顺序 3 系统的维护

1 系统的组成 激光扫描共聚焦显微镜系统主要由激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：：电动荧光显微镜电动荧光显微镜、、扫描检测单元扫描检测单元、、激光器激光器、、电脑工作站及各相关附件组成电脑工作站及各相关附件组成。。 系统系统组成及光路组成及光路组成及光路示意图示意图示意图：： 电脑工作站 激光器 扫描检测单元 电动荧光显微镜

实物照片说明实物照片说明：： 电动荧光显微镜 扫描检测单元 CO 2培养系统控制器 激光器 电脑工作站

2 系统的使用 2.1 开机顺序 （1）打开稳压电源打开稳压电源（（绿色按钮绿色按钮）） 等待2分钟（电压稳定）后，再开其它开关 （2）主开关 [ MAIN SWITCH ]“ON ” 电脑系统 [ SYSTEMS/PC ]“ON ” 扫描硬件系统 [ COMPONENTS ]“ON ” （3）打开 [ 电动显微镜开关 ] 打开 [ 荧光灯开关 ] （注：具有5档光强调节旋钮） （4）Ar 离子激光器离子激光器主开关主开关 “ON ” 顺时针旋转钥匙 至 “—” 预热预热等待约等待约15分钟分钟，， 将激光器 [ 扳钮 ] 由“Standby ”扳至 “Laser run ”状态状态，，即可正常使用 （5）打开 [ 电脑开关 ]，进入操作系统 注：键盘上也具有 [ 电脑开关 ]

激光共聚焦显微镜技术1讲解

激光共聚焦显微镜技术 The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。 1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 ?80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。 ?近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。如双光子，FCS,FLIM ,STED等。 共焦显微镜的优点 人眼分辨率：0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25μm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：μm 共焦显微镜的优点 ?电子显微镜的缺陷： 1.只能观察固定样品 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象 ?荧光显微镜的缺陷: 1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。 2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。 共焦显微镜的优点 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 激光扫描共焦显微镜技术 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别

无线激光通信调制方式性能分析

万方数据

无线激光通信调制方式性能分析 作者：赵婷， 陈宇， 宋宇， 闫志强， 张景萃， 齐雷 作者单位：长春理工大学电信学院,长春,130022 刊名： 科技资讯 英文刊名：SCIENCE & TECHNOLOGY INFORMATION 年，卷(期)：2011(16) 参考文献(4条) 1.何攀;李晓毅;侯倩基于LED的紫外光通信调制方式研究[期刊论文]-光通信技术 2010(4) 2.毛昕蓉;李荣无线光通信调制技术的性能分析[期刊论文]-通信技术 2009(42) 3.柯熙政;席晓莉无线激光通信概论 2004 4.David JT;David R Wisely lan Neild et OPtieal wlreless:the story so far 1998 本文读者也读过(5条) 1.柯熙政.陈锦妮.KE Xi-zheng.CHEN Jin-ni无线激光通信类脉冲位置调制性能比较[期刊论文]-激光技术2012,36(1) 2.赵丽丽.王挺峰.孙文涛.郭劲无线激光通信协议的设计[期刊论文]-中国光学2011,04(6) 3.卫斌.杨乾远.徐林.朱宏韬.WEI Bin.YANG Qian-yuan.XU Lin.ZHU Hong-tao一种用于大气激光通信透明传输的光端机[期刊论文]-光通信技术2010,34(7) 4.李国军.敬守钊.黄自力.唐湘成.LI Guo-un.JING Shou-zhao.HUANG Zi-li.TANG Xiang-cheng无线激光通信光发射模块的研究[期刊论文]-电子设计工程2011,19(5) 5.王鹏.邢柳.马永青.WANG Peng.XING Liu.MA Yong-qing无线激光通信APT系统设计[期刊论文]-光通信技术2011,35(3) 本文链接：https://www.sodocs.net/doc/3412730781.html,/Periodical_kjzx201116019.aspx

激光共聚焦显微镜

激光共聚焦显微镜 1．激光器： 1.1系统激光器覆盖可见光及紫外光： 1.1.1蓝光固体激光器488nm20mW； 1.1.2绿光固体激光器552nm20mW； 1.1.3红光固体激光器638nm，20mW 1.1.4紫外固体激光器405nm50mW； 1.2激光器的开闭和电压调节完全由软件控制，无需另设单根激光器的开关。并具有激光寿命保护装置。 1.3具有激光强度回馈稳定电路设计，在动态记录中激光强度不会受环境的影响而改变。 2．共聚焦扫描系统： 2.1激光扫描系统直接与共聚焦机身连接 2.2检测器数量 ①三个荧光扫描检测器+一个透射光DIC（明场/相差/微分干涉）扫描检测器； ②扫描检测器包括2个光电倍增管（PMT）和一个磷砷化镓混合型检测器HyD。*③可以升级为五个以上独立连续光谱荧光检测器。 2.3连续分光设计系统（或其它光谱分离系统） *①三个通道，一个透射光DIC通道；二个荧光通道均为可做连续全光谱检测的荧光通道； ②光谱型荧光通道可自由更换荧光通道检测的波长范围，二个荧光通道和一个透射光DIC通道可同时进行快速扫描； ③多通道荧光图像即时叠加、荧光图像与透射光DIC图像即时叠加，精确对光谱进行分析； ④荧光通道具有高精度的共聚焦针孔，具有宽波谱范围内的色差校正功能，保证在多重荧光标记的同时检测过程中每个通道扫描光切平面和厚度的一致性和荧光精确定位。 2.4光谱扫描功能 ①高速多通道光谱分析和扫描，可获得透射光谱图像； ②光谱分辨率2nm，可连续以1nm波长调节； ③光谱扫描范围：400-800nm；光谱扫描步进：1nm； ④高速棱镜分光，线性光谱拆分，可区分光谱大量重叠的染料； ⑤光谱数据来源：用户指定/用户自建/厂家预设（可调节）。 2.5扫描速度及速度调节 *①扫描视野22mm下扫描速度7幅/秒（512×512pixels）；70幅/秒（512×16pixels）； ②双向扫描速度3600线/秒；扫描速度可精确调节。 2.6共聚焦针孔1个，全自动调节型，孔径50-300微米，调节步进0.5微米。

LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册2013-5-13

Leica激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 2013年3月

目录： 1 系统的组成 系统组成 (3) 光路示意图 (4) 2 系统的使用 2.1 开机顺序 (5) 2.2 软件界面简介 (7) 2.3 在显微镜下观察样品 (8) 2.4 采集共聚焦图像 (9) 2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack） (11) 2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan） (15) 2.7 波长扫描（xyλScan） (16) 2.8 HyD检测器 (17) 2.9 图像的保存及输出 (18) 2.10 关机 (20) 3 系统的维护 (21)

Leica SP8 系统组成图

1可见波长激光或白激光15UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜 2声光调制器（AOTF）16扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3红外激光（IR）* 17在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4电光调制器18物镜（可提供各种选择）* 5紫外激光* 19在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 AOTF或直接调制器（DMOD）20正方型针孔 7STED 激光* 21Fluorifier盘* 8Setlight监控二极管22X1出口接口* 9AOBS, 及其他选配件23外置检测器* 10用于FRAP的光束增强镜* 24色散棱镜 11红外激光耦合25分开的荧光光谱 12与CS2紫外光路耦合的紫外激光26最多5个光电倍增管或4个HyD检测器 13STED激光耦合*选配组件 14全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件

激光技术 答案讲解

考试时间：12月17日 19:00—21:00 考试地点：思源楼411，412， 座位安排：学号03211138-05231022在411教室，05231144—06292044在412教室 第一章作业（激光技术--蓝信鉅，66页）答案 2．在电光调制器中，为了得到线性调制，在调制器中插入一个1／4波片，（1）它的轴向应如何设置为佳? （2）若旋转1／4波片，它所提供的直流偏置有何变化? 答：（1）. 其快、慢轴与晶体主轴x 轴成450角（即快、慢轴分别与x’、y’轴平行）。此时，它所提供 的直流偏置相当于在电光晶体上附加了一个V 1/4的固定偏压(E x’和E y’的附加位相差为900)；使得调制器在透过率T=50%的工作点上。 （2）. 若旋转1／4波片，会导致E x’和E y’的附加位相差不再是900；因而它所提供的直流偏置也 不再是V 1/4。当然调制器的工作点也偏离了透过率T=50%的位置。 3.为了降低电光调制器的半波电压，采用4块z 切割的KDP 晶体连接(光路串联、电路并联)成纵向串联式结构。试问：(1)为了使4块晶体的电光效应逐块叠加，各晶体的x 和y 轴取向应如何? (2) 若λ=0.628μm ，n 。＝1.51，γ63＝23.6×10—12m ／V ，计算其半波电压，并与单块晶体调制器比较之。 解：(1) 为了使晶体对入射的偏振光的两个分量的相位延迟皆有相同的符号，则把晶体x 和y 轴逐块旋转90安置，z 轴方向一致（如下图）， (2).四块晶体叠加后，每块晶体的电压为： v 966106.2351.1210628.0412n 41V 41V 123-663302' 2=?????=?==-γλλλ 而单块晶体得半波电压为： v 3864106.2351.1210628.02n V 123-6 63302 =????==-γλλ 与前者相差4倍。 4．试设计一种实验装置，如何检验出入射光的偏振态(线偏光、椭圆偏光和自然光)，并指出是根据什么现象? 如果一个纵向电光调制器没有起偏器，入射的自然光能否得到光强调制?为什么？ 解：（1）实验装置：偏振片和白色屏幕。 a. 在光路上放置偏振片和白色屏幕，转动偏振片一周，假如有两次消光现象，则为线偏振光。 b. 在光路上放置偏振片和白色屏幕，转动偏振片一周，假如光强有两次强弱变化（但无消光现象发生）；则为椭圆偏振光。 c. 在光路上放置偏振片和白色屏幕，转动偏振片一周，假如光强没有变化；则为自然光（或圆偏振光）。区分二者也不难，只需在偏振片前放置一个四分之一波片（可使圆偏振光变为线偏振光， 可出现a 的现象）即可。（这里自然光却不能变成线偏振光） （2）自然光得不到调制。原因是自然光没有固定的偏振方向，当它通过电光晶体后没有固定的位相差； 因而不能进行调制。 x y z x y z x y z x y z

共聚焦原理及操作

一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定 按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。 Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。Ca2+荧光探针用于检测[Ca2+]i 的基本原理如图7.1所示。 图Ca2+荧光探针检测[Ca2+]i的基本原理 a，代表一个细胞模型；b，Ca2+荧光探针的负载； c，Ca2+荧光探针去酯化；d，去酯化的Ca2+荧光探针与细胞质内游离Ca2+结合。 Fig. The mechanism for [Ca2+]i detection by fluorescent Ca2+ probe. [Ca2+]i的检测方法根据文献(Pan, Z., et al., 2000)，并作适当的改进。具体过程如下： 1 Ca2+荧光探针负载 1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次，加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为

激光共聚焦显微镜操作规程

激光共聚焦显微镜操作规程 一、准备工作 a)打开计算机。依次打开激光器电源、钥匙开关。多线氩离子(458 nm, 488 nm, 514 nm) ON、氦氖绿(543 nm) ON、 氦氖红(633 nm) ON。打开汞灯电源开关。 b)登陆Windows XP系统。双击快捷方式：FV10-ASW 1.1。User ID: Administrator ; Passeword: Administrator。注 意区分大小写。 二、显微镜镜下观察 １.微分干涉差观察 a)使用手控面板选择物镜。插入起偏镜。插入微分干涉滑块。 b)点击FV10-ASW软件中的图标。标本聚焦. ２.荧光观察： c)使用手控面板选择物镜。 d)打开汞灯的机械快门，拉出DIC滑块，点击FV10-ASW软件中的图标 e)使用手控面板选择荧光滤色片。标本聚焦。 ３.获取单张荧光图像 a)点击FV10-ASW软件中的按钮。 b)关闭汞灯快门，点击按钮，关闭卤素灯快门。 c)点击染料选择按钮，在染料列表中，双击用于观察的荧光染料。点击Apply按钮。 d)点击XY Repeat按钮开始扫描。调节图像。点击Stop按钮停止扫描。 e)选择AutoHV,，并选择扫描速度。 f)点击XY按钮取得一幅图像。 g)点击SeriesDone按钮，“2D View-LiveImage(x)”2D界面就出现。 h)保存该幅图像:右图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像。(保存为“xml”类型是击FV10-ASW 软件专用的图像格式。) ４.获得单张（荧光+微分干涉）图像 a)点击FV10-ASW软件中的按钮，关闭汞灯快门。点击按钮，关闭卤素灯快门。 b)点击染料选择按钮，在染料列表中，双击用于观察的荧光染料。点击Apply按钮。 c)选择TD1。 d)点击XY Repeat按钮开始扫描。调节绿色(FITC)图像和微分干涉差的图像。点击Stop按钮停止扫描。 e)选择AutoHV, 并选择扫描速度。 f)点击XY按钮取得一幅图像。 g)点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)”2D界面就出现。 h)保存该幅图像。 ５.获取3D图像 例: 绿色荧光(FITC)和红色荧光(Rhodamine)双标（这里介绍线序列扫描取图的过程.）

激光共聚焦技术讲解

模块九激光共聚焦技术 1. 实验目的 让学生了解激光共聚焦显微镜硬件组成，掌握激光共聚焦显微镜常用的基本操作及注意事项，能够熟练、准确地设计光路，重点掌握激光共聚焦显微镜测定细胞荧光信号动态变化的方法以及钙指示剂（fluo-3/AM）标记Ca2＋的基本原理与方法，了解激光共聚焦显微镜在生物学上的应用。 2. 实验原理 激光扫描共聚焦显微镜是采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。 激光扫描共聚焦显微镜基本结构 （1）扫描模块 扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播方向）、发射荧光分色器（选择一定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）组成。 荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象。 （2）荧光显微镜系统 激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。 （3）常用激光器 激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型： 多谱线Ar离子激光器（氩离子激光器）：发射波长为458 nm、477 nm、488 nm、514 nm的蓝绿光；He-Ne激光器（氦氖激光器）：发射波长为543 nm的绿光和633 nm的红光；UV激光器（紫外激光器）：发射波长为351 nm、364 nm的紫外光。 （4）辅助设备 风冷、水冷冷却系统及稳压电源。 激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理：激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光器发射的一定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平面上，样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检测器，并成像于计算机监视屏上。这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共焦图像，称为光切片。

激光技术-答案讲解

考试时间：12月17日 19:00—21:00 考试地点：思源楼411，412， 座位安排：学号032112在411教室，05231144—06292044在412教室 第一章作业（激光技术--蓝信鉅，66页）答案 2．在电光调制器中，为了得到线性调制，在调制器中插入一个1／4波片，（1）它的轴向应如何设置为佳? （2）若旋转1／4波片，它所提供的直流偏置有何变化? 答：（1）. 其快、慢轴与晶体主轴x 轴成450 角（即快、慢轴分别与x’、y’轴平行）。此时，它所提 供的直流偏置相当于在电光晶体上附加了一个V 1/4的固定偏压(E x’和E y’的附加位相差为900 )；使得调制器在透过率T=50%的工作点上。 （2）. 若旋转1／4波片，会导致E x’和E y’的附加位相差不再是900 ；因而它所提供的直流偏置也 不再是V 1/4。当然调制器的工作点也偏离了透过率T=50%的位置。 3.为了降低电光调制器的半波电压，采用4块z 切割的KDP 晶体连接(光路串联、电路并联)成纵向串联式结构。试问：(1)为了使4块晶体的电光效应逐块叠加，各晶体的x 和y 轴取向应如何? (2) 若λ=0.628μm ， n 。＝1.51，γ63＝23.6×10—12 m ／V ，计算其半波电压，并与单块晶体调制器比较之。 解：(1) 为了使晶体对入射的偏振光的两个分量的相位延迟皆有相同的符号，则把晶体x 和y 轴逐块旋转90安置，z 轴方向一致（如下图）， (2).四块晶体叠加后，每块晶体的电压为： v 966106.2351.1210628.0412n 41V 41V 12 3-6 63302' 2 =?????=?==-γλλλ 而单块晶体得半波电压为： v 3864106.2351.1210628.02n V 12 3-6 63302 =????==-γλλ 与前者相差4倍。 4．试设计一种实验装置，如何检验出入射光的偏振态(线偏光、椭圆偏光和自然光)，并指出是根据什么现象? 如果一个纵向电光调制器没有起偏器，入射的自然光能否得到光强调制?为什么？ 解：（1）实验装置：偏振片和白色屏幕。 a. 在光路上放置偏振片和白色屏幕，转动偏振片一周，假如有两次消光现象，则为线偏振光。 b. 在光路上放置偏振片和白色屏幕，转动偏振片一周，假如光强有两次强弱变化（但无消光现象发生）；则为椭圆偏振光。 c. 在光路上放置偏振片和白色屏幕，转动偏振片一周，假如光强没有变化；则为自然光（或圆偏振光）。区分二者也不难，只需在偏振片前放置一个四分之一波片（可使圆偏振光变为线偏振光，可出现a 的现象）即可。（这里自然光却不能变成线偏振光） （2）自然光得不到调制。原因是自然光没有固定的偏振方向，当它通过电光晶体后没有固定的位相差； 因而不能进行调制。 x y z x y z x y z x y z

激光通信技术1解析

激光通信经历了大气通信和光波导（光纤）通信两个重要的发展阶段。早期的激光大气通信曾掀起了世界性的研究热潮，许多经济和技术力量雄厚的发达国家在这个阶段投入了大量的人力、财力和物力，对激光大气通信进行了广泛的研究开发。早期的激光大气通信所用光源多数为二氧化碳气体激光器、YAG固体激光器、He-Ne气体激光器等。二氧化碳气体激光器输出激光波长为10.6μm，此波长正好处在大气信道传输的低损耗窗口，是较为理想的通信用光源。与激光大气通信技术研究基本同步展开的还有光纤波导通信，从而在技术上形成了激光通信中与传统通信相对应的激光无线通信（激光空间通信）和激光有线通信（激光光纤通信）。 1975年，世界上第一条光纤通信实验应用线路在美国芝加哥开通，揭开了光纤通信应用的序幕。此后，随着光纤制作技术、半导体器件技术、光通信系统技术的不断完善和成熟，光纤通信从80年代起在全世界掀起了应用的热潮，并迅速被确认为是地面有线通信最有发展潜力的重要的通信手段，以致得到了一日千里的发展和推广应用。与此同时，激光大气通信技术由于器件技术、系统技术和大气信道光传输特性本身的不稳定性等诸多客观因素一时得不到很好的解决和弥补，便在轰轰烈烈的光纤通信热潮中，隐退得几乎无影无踪。 1.存在的主要问题 一段时间以来，激光大气通信技术之所以难以得到应有的发展和推广应用，存在的主要技术问题是： 对大气信道衰减大及误减随机变化量大的补偿技术问题;大气湍流的影响，使信道折射率发生不均匀的随机变化，其结果使接收光斑发生所谓的闪烁现象和漂移现象。要削弱大气湍流的影响，有许多技术工作要做；

驱动功率小、转换效率高、激光输出功率大、调制带宽及伺服系统简单的激光发射器件的制作；灵敏度高、噪声特性好，适合于常温环境下工作的接收器件的制作；体积小、重量轻、光学特性好、便于安装、调校的光学收发天线的制作；背景噪声的滤除技术问题；如果采用窄带光滤波技术，又是存在激光器的频率稳定技术；在机动性要求高和工作平台方位稳定性差的场合应用，自动跟瞄技术也很关键。上述可归纳为：解决全天候、高机动性和高灵活性稳定可靠工作问题。 2.悄然复兴的激光大气通信技术 激光问世后，将激光应用于通信的想法就随之产生了。在国际上，美国、英国、日本、前苏联等国家，广泛开展了对激光大气通信的深入研究。 然而，进入80年代中后期，国际国内大部分从事激光大气通信技术研究的单位相继停止了进一步研究。有的国家甚至还宣布了走激光大气通信研究的路是一条“死胡同”，“走不通”。尽管如此，国内外仍有单位和人员始终在坚持不懈、孜孜探求解决激光大气通信技术问题之路。 1998年，巴西AVIBRAS宇航公司公布了该公司研制的一种便携式半导体激光大气通信系统。这种通过激光器联通线路的军用红外通信装置，其外形如同一架双筒望远镜，在上面安装了激光二极管和麦克风。使用时，一方将双筒镜对准另一方即可实现通信，通信距离为1km，如果将光学天线固定下来，通信距离可达15km。1989年美国FARANT1仪器公司成功地研制出一种短距离、隐蔽式的大气激光通信系统。1990年，美国试验了适用于特种战争和低强度战争需要的紫外光波通信，这种通信系统完全符合战术任务的要求，通信距离为5~2km。如果对光束进行适当处理后，通信距离可达5~10km。