【CN110133276A】一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910258412.8

(22)申请日 2019.04.01

(71)申请人 芜湖森爱驰生物科技有限公司

地址 241000 安徽省芜湖市芜湖县安徽新

芜经济开发区南次一路369号

(72)发明人 王晓波　朱雪姣　朱海峰　

(74)专利代理机构 北京润平知识产权代理有限

公司 11283

代理人 刘兵

(51)Int.Cl.

G01N 33/68(2006.01)

(54)发明名称

一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白

检测试剂盒

(57)摘要

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一

种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试

剂盒，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白

检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，

所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液80～

120mmol/L；谷胱甘肽0.5～1.5mmol/L；表面活性

剂0.02～1.5g/L；防腐剂0.05～2g/L；牛血清蛋

白15～30g/L；解离剂0.02～1g/L，且所述试剂R1

的pH值为6.5～7.5；所述试剂R2由以下物质组

成：磷酸盐缓冲液100～150mmol/L；促凝剂8～

15g/L；阻断剂2～8mg/L；蔗糖5～15mg/L；中性粒

细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球

20～50mg/L；防腐剂0.01～0.05g/L；其中，试剂

R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述

试剂R1的pH值为6.5～7.5。本发明提供的中性粒

细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，检测

灵敏度高。权利要求书2页 说明书7页CN 110133276 A 2019.08.16

C N 110133276

A

权　利　要　求　书1/2页CN 110133276 A

1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，其特征在于，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液80～120mmol/L；谷胱甘肽0.5～1.5mmol/L；表面活性剂0.02～1.5g/L；防腐剂0.05～2g/L；牛血清蛋白15～30g/L；解离剂0.02～1g/L，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；

所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液100～150mmol/L；促凝剂8～15g/L；阻断剂2～8mg/L；蔗糖5～15mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球20～50mg/L；防腐剂0.01～0.05g/L；其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5。

2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液90～100mmol/L；谷胱甘肽0.8～1.2mmol/L；表面活性剂0.5～1g/L；防腐剂0.2～0.8g/L；牛血清蛋白20～25g/L；解离剂0.2～0.8g/L，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；

所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液120～140mmol/L；促凝剂10～12g/L；阻断剂3～6mg/L；蔗糖6～10mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球24～45mg/L；防腐剂0.02～0.04g/L；其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5。

3.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体为单克隆抗体与多克隆抗体的混合，且单克隆抗体与多克隆抗体的比值为1:3～6。

4.根据权利要求3所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，在所述试剂R2中，所述多克隆抗体为兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体、羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体或鸡抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的一种；

所述单克隆抗体为鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。

5.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述阻断剂与所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球的浓度比为1: 3～15；

优选的，所述阻断剂选自鱼皮明胶蛋白1～3wt％、二亚乙基三胺五乙酸2～5wt％、NH2-PEG2～4wt％和壳聚糖1～5wt％，其余为磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述解离剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、尿素和十二烷基硫酸钠中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和司盘40中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000和硫酸葡聚糖钠中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和Proclin系列中的至少一种。

2

酸性蛋白酶的作用机理

酸性蛋白酶与碱性蛋白酶生产工艺的不同之处？ 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下（pH 2.5-4.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。可用于毛皮软化，酒精发酵，啤酒、果酒澄清，动植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加剂等等。本品在酸性条件下有利于皮纤维松散，且软化液可连续使用，是当前理想的毛皮软化酶制剂；在酒精发酵中，添加酸性蛋白酶，能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒粒间细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用碳源增加，从而可提高原料出酒率；另一方面，蛋白质的水解提高了醪液中α-氨基态氮的含量，促进酵母菌的生长与繁殖，提高发酵速度，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。 碱性蛋白酶碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶,不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点。1945年瑞士M等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶。 碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌 2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用

于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。 1、碱性蛋白酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，应用在食品行业可水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液。 2、碱性蛋白酶成功应用于洗涤剂用酶工业，可添加在普通洗衣粉、浓缩洗衣粉和液体洗涤剂当中，既可用于家庭洗衣，也可用于工业洗衣，可以有效的去除血渍、蛋类、乳制品、或肉汁、菜汁等蛋白类的污渍，另外也可作为医用试剂酶清洗生化仪器等。 3、在生物技术领域，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，而对DNA无降解作用，避免对DNA 完整性的破坏。 酸性蛋白酶如何灭活第一种方法几乎所有酶都适用，就是加热。第二种，既然是酸性酶，加入强碱应该也是可以的。 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究：(1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。 (2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性

NGAL中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白

一种新的肾损伤标志物— 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）的临床意义 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白( neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL) ，又称人脂质运载蛋白2( lipocalin 2，Ln2) 或噬铁蛋白( siderocalin) ，是人脂质运载蛋白家族中的一个新成员。近年来，NGAL 作为一种新的肾损伤标志物倍受关注。 1、NGAL 的生物学特性 NGAL 是1993 年Kjeldsen 等［1］研究中性粒细胞时发现的一种特殊颗粒组分，与明胶酶B 即基质金属蛋白酶9( matrixmetalloproteinase-9，MMP-9) 密切相关。人类NGAL 基因定位于第9 号染色体长臂( 9q34) ，全长5 869 bp，包括1 695bp 的5'端非转录区、178 bp 的3'端非转录区及由7 个外显子和6 个内含子构成的3 696 bp 的原初转录区; 其相对分子质量为25 000 bp。血小板活化因子( PAF) 、白三烯-B4( LT-B4)和N-甲酸基-甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸( N-formyl-Met-Leu-Phe) 等是NGAL 的配体［2］。在生理状态下，中性粒细胞、肾小管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、支气管上皮黏液细胞等分泌少量NGAL，而脑和周围神经、结肠、子宫和卵巢、胎盘、甲状腺等组织细胞中NGAL 的表达呈阴性。 NGAL 的生理功能尚不完全清楚，可能参与不同的生理、病理过程，涉及胚胎发育、细胞分化、肿瘤的发生发展、细胞凋亡、炎症免疫应答、脂质代谢等。在胚胎期，NGAL 发挥类似生长因子的作用，参与各类组织发育、生长及分化，促进乳腺癌、食管癌等肿瘤细胞增殖。NGAL 与MMP-9 以二硫键形成12 500 bp 的复合物，延长MMP 的蛋白水解活性，促进MMP-9 对细胞基底膜的降解，从而浸润周围基质，介导癌细胞转移。过去研究认为，NGAL 促进细胞凋亡，但近年来研究发现NGAL 还是一类应激蛋白，在外界有害物质刺激下，细胞分泌NGAL 是一种机体自身防御机制，使组织细胞免于凋亡［3］。NGAL 还是一类新的急性期反应蛋白，作为介导铁离子向胞内运输的新型载体，通过竞争性夺取螯合物中的铁来阻止细菌对铁的吸收，从而抑制细菌生长。 2、NGAL 是急性肾损伤的标志物 2．1 早期诊断急性肾功能损伤( AKI) 时血、尿NGAL 浓度通常会迅速升高，2 h 最为明显( 比临界值升高几十至几百倍) ，血清肌酐( sCr) 、尿酶等传统指标往往要在24 ～72 h 才后明显升高，因而NGAL 可用于AKI 的早期诊断。Mishra等［4］在体外循环术并发AKI 患儿的队列研究中发现，2h 尿NGAL 诊断AKI 的AUCROC 为0．998，其临界值为50 μg /L( ELISA 法) 时，敏感性、特异性分别为100%、98%，而血清NGAL 诊断AKI 的AUCROC 为0．906，其临界值为25 μg /L 时，敏感性、特异性为70%、94%; 多元回归分析显示，2 h 尿NGAL 水平是预测AKI 的强有力预测因子。也发现成年患者2 h 尿、血清NGAL 水平是诊断AKI 的可靠的早期诊断指标。meta 分析表明，NGAL 对AKI 的诊断效能受到标本类型、年龄、检测方法等因素影响，但NGAL 对儿童AKI 的诊断效能优于成年人，可能是成年人受到其他慢性疾病等因素影响。值得注意的是，脓毒血症等危重疾病患者，因受到炎症反应等因素影响，NGAL 可能并不适用于AKI 的早期诊断，诊断特异性欠佳。北美地区研究发现，143 名全身炎症反应综合征及脓毒性休克患儿入院后24 h 内，血清NGAL 诊断AKI 的AUCROC为0．677，在临界值为139 ng /mL 时，敏感性为86%，特异性仅为39%。经多变量分析后发现，血NGAL 并不是发生AKI 事件的预测指标［5］。在成人患者研究中也得到类似结论。另有研究表明，危重患儿48 h 内尿液NGAL 水平可以准确预测AKI 的发生( AUCROC 为0．79) 。但当sCr 升高后，AUCROC降至0．63［6］。ICU 中的AKI 成人患者血浆NGAL水平在48 h 后与正常对照组亦无显著性差异［7］。但李萍珠等［8］发现尿NGAL 可作为脓毒血症后并发AKI 的早期诊断标志物，准确性达0．968，这可能与种族间水平差异有关。 2．2 监测病情进展NGAL 还可以反映肾功能损伤的严重程度。Kusaka 等［9］在接受

01 中性粒细胞功能测定

实验一、中性粒细胞吞噬功能测定Assay for Phagocytosis of Polymorphonuclear Leukocyte 【实验目的】 ?掌握中性粒细胞吞噬功能试验的原理； ?熟悉中性粒细胞吞噬功能试验的操作方法；?通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。

【实验原理】 血液中的中性粒细胞通称小吞噬细胞，具有吞噬细菌和异物颗粒的能力，在体外将中性粒细胞与细菌或异物颗粒在一定条件下共同孵育后，显微镜观察可见中性粒细胞内有细菌或异物颗粒。计数吞噬率和吞噬指数，可反映中性粒细胞的吞噬功能。有助于对疑有吞噬细胞功能障碍的疾病作出诊断。

【材料和试剂】 1.待测样本新鲜抗凝静脉血 2.被吞噬物灭活白色葡萄球菌菌液（6×108/ml）。 3.试剂无菌生理盐水，甲醇，瑞氏－吉姆萨染液。 4.器材EP管，75%酒精棉球、载玻片，微量移液器、恒 温箱，显微镜（香柏油，二甲苯）等。

【操作步骤】 1.白色葡萄球菌液制备。（已制备好） 2.待测血标本制备：静脉采血5ml。 3.在EP管内加40微升血液，20微升菌液，混匀。 4.将EP管置37℃温育30min，每隔10min混匀一次。 5.取一小滴上述混合液，置于载玻片上，推成薄血片，晾干。 6.甲醇固定4-5min，滴加瑞氏-吉姆萨染液A液2-3滴，染色1- 2min，再B液2-3滴，染色5-10min，水洗，晾干。 7.油镜下计数中性粒细胞(＞100个)、吞噬的细菌总数。

【推血片方法】 取血混合液一小滴，放于载玻片的右端。将推片置于血滴前端，与载玻片接触，成30°～40°角向后拉动推片，使与血液接触?待血液扩散形成一条线之后，以均速轻轻向前推动推片，则血液均匀地被涂于载玻片上而形成一薄膜。取两张无油脂的洁净玻片，左手拇指及中指夹持载玻片，右手持推片。30° 血滴越大，速度越快、角度越大--血膜越厚

明胶酶谱法检测步骤

明胶酶谱法检测步骤 1、明胶酶谱溶液配制 1.1.1洗脱液（1×）： 1.1.2Triton X-100， 2.5%（v/v）in water 配法：量取Triton X-10025ml，加去离子水定容至1000ml即可。 1.1.2孵育液（1×）：50mM Tris-HCl，5mM CaCl2·2H2O，0.02%Brij-35，0.2M NaCl，pH7.6。 配法： 1)称取Tris碱6.06g，CaCl2·2H2O0.74g（或CaCl20.555g），Brij-350.2g，NaCl11.7g； 2)加水至800ml； 3)用浓HCl调pH至7.6； 4)定容至1000ml。 1.1.32×上样缓冲液（不含β巯基乙醇） 0.5M Tris-HCl，pH6.8 2.5ml 甘油 2.0ml 10%（w/v）SDS 4.0ml 0.1%溴酚蓝0.5ml dH2O1ml Total10ml 1.1.45×上样缓冲液（不含β巯基乙醇） 配法： 1)量取下列试剂，置于15ml塑料离心管中

a)1M Tris-HCl（pH6.8） 2.5ml b)SDS1g c)溴酚蓝0.05g d)甘油5ml 2)加dH2O定容至10ml，Vortax振荡混匀； 3)小份分装（1ml/管），-20℃保存。 1.1.50.5%（w/v）考马斯亮蓝R-250400ml 配法： 1)称取2g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中； 2)量取100ml异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解； 3)加入40ml冰醋酸，搅拌均匀； 4)加入260ml去离子水，搅拌溶解； 5)用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。 1.1.6考马斯亮蓝脱色液（400ml） 配法甲醇：乙酸：水=200：40：160=5：1：4。 1.1.7明胶储液（10mg/ml in water） 配法：称取明胶（Sigma，猪皮来源）0.1g，加去离子水10ml，溶解。配好后储存于4℃。若凝固成胶冻状可用55℃水浴解冻。 1.1.810%SDS-PAGE凝胶之分离胶（含1.0mg/ml明胶） 配法： dH2O3ml 30%丙烯酰胺溶液 3.3ml

人(Human)中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)ELISA试剂盒说明书

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断 人（Human）中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL） ELISA检测试剂盒 使用说明书 检测原理 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 样品收集、处理及保存方法 1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。 3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。 5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品 1.酶标仪（450nm） 2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3.37℃恒温箱 操作注意事项 1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。 2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。 3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。 4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。 5.所有液体组分使用前充分摇匀。

明胶酶谱实验方法

明胶酶谱实验 72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9） 抽提缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L CaCl2, 1μmol/L ZnSO4, 0.01% (v/v) Triton X-100, （0.5% PMSF）。 10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。 注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。 先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了 明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。你加了这个我保证你一辈子也做不出来。 蛋白浓度一般是先摸索一个量。就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug 跑一下电泳，先看结果。条带看不见的，或者太透明的，都不能选。就是要半明半暗的那种。看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。

(1)、5%浓缩胶(现配现用)： d3H2O 2.1ml 30%丙烯酰胺溶液0.5ml 1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml 10% SDS 30μl 10%过硫酸铵(AP) 30μl TEMED 3μl 3ml (2)、10%分离胶(现配现用)： d3H2O 2.1ml 30%丙烯酰胺溶液 2.31ml 1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml 10% SDS 70μl 10%过硫酸铵(AP) 70μl TEMED 5.6μl 1%明胶0.7ml 7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）： 0.32% Tris-HCL 6.4ml 4%SDS 8ml 50%甘油 3.2 ml 溴酚蓝0.024g d3H2O 2.4ml 20ml

人中性粒细胞载脂蛋白在细菌感染疾病中表达意义的研究进展

人中性粒细胞载脂蛋白在细菌感染疾病中表达意义的研究进 展 摘要：人中性粒细胞载脂蛋白（human neutrophil lipocalin，HNL) 属于lipocalin 家族，可通过多种途径抗菌，在细菌感染患者血清中可高度表达。血液病患者感 染率及致死率高，快速准确鉴别感染类型临床意义重大，且近年来，多项研究数 据表明，HNL鉴别急性细菌感染和病毒感染灵敏度和特异性均高于白细胞计数、 C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原（Procalcitonin，PCT）等临床 常用指标，本文就HNL在细菌感染性疾病，尤其是血液病合并细菌感染中表达意 义的研究进展作一综述。 关键词：人中性粒细胞载脂蛋白细菌感染表达 临床上由病原微生物引起的感染及其常见，尤其是细菌感染及病毒感染。 发生细菌感染除了与基础疾病有关以外，与使用激素、免疫抑制剂、大量使用抗 生素等也密切相关[1 2]，而对于细菌感染疾病的诊断，细菌培养为金标准，但耗 时长，阳性率低，且目前临床上常用指标，如白细胞计数、CRP、PCT敏感度或特异度低[ 3]，并且受多种因素影响，因此快速准确地鉴定感染类型，及时给予患者有效的治疗是非常重要的。HNL是一种新型铁载体结合蛋白，可通过多种途径抑 制细菌繁殖，控制细菌感染，近年来对于HNL与细菌感染方面的研究甚多，现综 述如下： 1.HNL生物学特点 HNL又叫做中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）[4]，它是储存在中性粒细胞二级颗粒中的一种分泌型糖蛋白，属于lipocalin家族，定位于乳铁蛋白，是一种新型铁载体结合蛋白，主 要以单体（25kDa）、通过二硫键相连的同源二聚体（45kDa）以及与明胶酶通过 分子间二硫键形成共价的异源多聚体（135kDa或220kDa）三种分子形式存在在[5]。生理条件下，可少量表达于多个系统的上皮细胞，如呼吸系统支气管上皮单 个粘液细胞，消化系统的胃壁细胞，泌尿生殖系统的肾小管等，但某些条件下， 如炎症和恶性肿瘤可能诱导上皮细胞、单核细胞及巨噬细胞大量分泌HNL[6]。作 为疏水性小分子转运的载体，能与细胞表面的受体相互作用，表现多样化的生物 功能。 2.HNL抗菌机制 HNL作为一种分泌型蛋白，具有一个保守的三级结构，即β折叠桶结构， 可结合并运输铁离子，它可以以单体的形式结合并转运铁离子出胞，也可以以HNL-铁复合物的形式转运铁离子入胞，HNL是是已知的最强的铁赘合剂，入胞后 一方面通过结合和螯合铁载细菌铁载体，即儿茶酚酸，能阻止微生物对铁的摄取，竞争性的抑制细菌的铁摄取，剥夺铁细菌，从而抑制细菌生长，并能内生抑菌蛋 白质，清理细菌的铁结合分子而抑菌，另一方面与细菌来源趋化物N-甲酰亮氨酰 苯丙氨酸(N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine,N-fMLP)结合，促进细胞释放 趋化因子，白介素等参与炎症反应，起到杀菌的作用[7-10]。HNL是固有免疫中抗微生物的重要组成部分，体外研究证据表明NGAL可以连接固有免疫和适应性免疫，激活CD4+/FoxP3及调节性T淋巴细胞，表明其可能参与调节细胞介导的免 疫力而起到杀菌作用[11], 除此之外还可促进中性粒细胞细胞成熟，诱导中性粒细 胞趋化作用，促进中性粒细胞粘附和外渗而杀菌[12]。 3.HNL在细菌感染时的表达意义

蛋白酶酶切位点

蛋白酶酶切位点 木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素 胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写

名称三字符号单字符号 丙氨酸Ala A 精氨酸Arg R 天冬氨酸Asp D 半胱氨酸Cys C 谷氨酰胺Gln Q 谷氨酸Glu/Gln E 组氨酸His H 异亮氨酸Ile I 甘氨酸Gly G 天冬酰胺Asn N 亮氨酸Leu L 赖氨酸Lys K 甲硫氨酸Met M 苯丙氨酸Phe F 脯氨酸Pro P 丝氨酸Ser S 苏氨酸Thr T 色氨酸Trp W 酪氨酸Tyr Y 缬氨酸Val V 【生化】特异性蛋白酶的酶切位点 胰蛋白酶arg、lys，得到以arg、lys为C末端残基的肽段。胰凝乳蛋白酶phe、trp、tyr 等疏水aa。胃蛋白酶phe、trp、tyr等疏水aa。木瓜蛋白酶arg、lys。葡萄球菌蛋白酶，磷酸缓冲液ph7.8时断裂glu、asp。碳酸氢铵缓冲液ph7.8或醋酸铵缓冲液ph4.0时断裂glu。梭菌蛋白酶arg，用于不溶性蛋白的长时间裂解。CNBr断裂Met。羟胺断裂asn—gly间的肽键。二硫键可以用巯基化合物还原法或者过甲酸氧化法断裂.。 木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。 木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%；及纤维素酶等不同的酶。 番木瓜未成熟果实中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(Chymopapain A )、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapain B )、木瓜肽酶B (PapayaPeptidase B ) 等多种蛋白水解酶。且已知四种半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度的同源性。其中，木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。

Transwell实验 超详细之欧阳歌谷创作

Transwell侵袭实验总结 欧阳歌谷（2021.02.01） 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1.Transwell 关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一

样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 下图是一个Transwell装置的纵切面 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择 3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。

【CN110133276A】一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910258412.8 (22)申请日 2019.04.01 (71)申请人 芜湖森爱驰生物科技有限公司 地址 241000 安徽省芜湖市芜湖县安徽新 芜经济开发区南次一路369号 (72)发明人 王晓波　朱雪姣　朱海峰　 (74)专利代理机构 北京润平知识产权代理有限 公司 11283 代理人 刘兵 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) (54)发明名称 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 检测试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一 种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试 剂盒，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2， 所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液80～ 120mmol/L；谷胱甘肽0.5～1.5mmol/L；表面活性 剂0.02～1.5g/L；防腐剂0.05～2g/L；牛血清蛋 白15～30g/L；解离剂0.02～1g/L，且所述试剂R1 的pH值为6.5～7.5；所述试剂R2由以下物质组 成：磷酸盐缓冲液100～150mmol/L；促凝剂8～ 15g/L；阻断剂2～8mg/L；蔗糖5～15mg/L；中性粒 细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球 20～50mg/L；防腐剂0.01～0.05g/L；其中，试剂 R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述 试剂R1的pH值为6.5～7.5。本发明提供的中性粒 细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，检测 灵敏度高。权利要求书2页 说明书7页CN 110133276 A 2019.08.16 C N 110133276 A

人体白细胞的种类和功能

人体白细胞的种类和功能 人体内白细胞为无色有核细胞，在血液中呈球形，它能以变形运动穿过毛细血管壁，进入结缔组织。正常5000—10000/mm3。 一、种类及特点 根据细胞质和细胞核的染色特点，可把白细胞分为两大类： 有颗粒白细胞：嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞 无颗粒白细胞：淋巴细胞，单核细胞 正常时各种白细胞数目保持一定比例，称为白细胞分类计数，正常情况下数目如下： 疾病状况下，白细胞总数和分类计数都可发生改变。 二、白细胞的功能 ①中性粒细胞白细胞 : 吞噬和消化侵入微生物和机体本身的各种坏死细 胞,包括衰老和受损红细胞.是机体防御功能重要组成部分。细胞内溶酶体丰富，并做变形运动。 中性粒细胞可通过变形运动渗出毛细血管壁进入组织液,在组织液内游走(趋化性)。如果白细胞的的溶酶体释放的酶量过多，不仅能杀死和溶解细菌，本身也将致死，死亡的白细胞连同细菌分解物一起成为浓液组成部分。 ②嗜酸性粒细胞：能限制嗜碱性粒细胞和肥大细胞中的活性物质的合成和释放；当机体患某些过敏性疾病时，嗜酸性粒细胞数量增多，有人认为她和机体的过敏性反应有关。 ③嗜碱性粒细胞：含有多种生物活性物质，与肥大细胞相似，细胞颗粒中能合成组织胺和过敏性慢作用物质。

组织胺：使小动脉和毛细血管扩张，并使毛细血管和微静脉通透性增加，与人过敏反应有关。 过敏性慢作用物质：可使血管通透性增加，并使平滑肌收缩，特别是使支气管和细支气管的平滑肌收缩，从而引起哮喘。总括起来嗜碱性粒细胞所释放的活性物质可引起哮喘，寻麻疹，食物过敏等各种反应，同时又引起嗜碱性粒细胞聚集这一局部。 ④淋巴细胞：具有免疫功能 T细胞：骨髓中生成的淋巴系干细胞在胸腺中发育成熟，参与细胞免疫。血液中 80-90% 淋巴细胞属于T淋巴细胞。 B细胞：造血干细胞在骨髓中分裂分化成B细胞，多集中在淋巴结等淋巴器官中。参与体液免疫—抗体免疫。 ⑤单核细胞：从血管进入组织后，便分化成巨噬细胞，吞噬细菌和病毒等 三、白细胞测定临床意义 （一）白细胞增加：外周血液中白细胞数超过10×109/L称为白细胞增多症。白细胞增多可以是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞增多。临床常见为淋巴细胞增多症。 1、中性粒细胞增多症 生理性：如饭后和剧烈运动后；冷水浴后及极度恐惧和疼痛后等、妇女经期及妊娠等。 病理性： （1）急性感染：某些细菌（葡萄球菌、肺炎球菌等）病毒（水痘病毒、狂犬病毒）引起的感染； （2）非感染性炎症，如急性风湿热、少年型类风湿关节炎等 （3）组织坏死：严重外伤、手术创伤、烧伤等。 （4）急性失血及贫血 （5）急性中毒：如化学毒物及药物中毒、尿毒症等。 （6）粒细胞异常增生：急性粒细胞白血病，骨髓增生性疾病 （7）其他：如脾脏切除后。 2、嗜酸性粒细胞增多症 外周血中嗜酸性粒细胞绝对值超过0.45×109/L,称为嗜酸性粒细胞增多症. 嗜酸性粒细胞增多常与许多疾病有关，特别是寄生虫感染和过敏性疾病。 ３、白血病 是骨髓和其他造血组织中原始和幼稚细胞异常增生的一种恶性疾病。临床表 现贫血、出血、感染及白血病细胞侵润机体各组织、器官所产生的相应表现。 ⑴病因： 病毒：人类T细胞白血病，已肯定是由人T细胞病毒-Ⅰ引起的 放射性核素：其致白血病的作用是肯定的，其作用与照射剂量的大 小和部位有关 化学因素：（如烷化剂、细胞毒药物）及化学毒物（苯）可诱发 遗传因素：家族性白血病约占7%。 其他血液病：骨髓增生性疾病、淋巴瘤等最终可发展为急性白血病。 ⑵分类： 按病程缓急及白细胞分化程度可分为 急性白血病：起病急，自然病程约半年以内。骨髓中以原始和早期幼稚细 胞增生为主，正常造血受到抑制的恶性疾病。成人以急性粒细胞白血病多见，儿童以急性淋巴细胞较多见。临床表现主要为贫血、出血、继发感染发热及白血病细胞侵润

酶谱法检测金属蛋白酶活性

原理 酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。 复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。 2试剂的配制 （1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量） 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括） ddH2O 4.5ml 30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8） 2.5ml 10% SDS 100ul 10%过硫酸铵（APS）100ul TEMED 8ul 1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5ml B.浓缩胶的配制 浓缩胶6ml ddH2O 4.5ml 30%储备胶0.75ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml 10% SDS 60ul 10%过硫酸铵60ul TEMED 6ul

蛋白酶的种类

蛋白酶的论述 摘要：蛋白酶（英语：Protease）是生物体内的一类酵素（酶），它们能够分解蛋白质。分解方法是打断那些将氨基酸连结成多肽链的肽键。抑制蛋白酶活性的小分子化合物被称蛋白酶抑制剂。许多病毒蛋白酶的抑制剂是很有效的抗病毒药。 1．木瓜蛋白酶 1.1木瓜蛋白酶简介 木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。 1.2木瓜蛋白酶的特点 木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI)为8.75；最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。木瓜蛋白酶由212个氨基酸残基组成，当用氨基肽酶从N末端水解掉分子中的2/3肽链后，剩下的1/3肽链仍保持99%的活性，说明木瓜蛋白酶的生物活性集中表现在C末端的少数氨基酸残基及其所构成的空间结构区域。 木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。 酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰。1.3木瓜蛋白酶物理化学性质 本品为乳白色至微黄色粉末，具有木瓜特有的气味,稍具有吸湿性。水解蛋白质能力强,但几乎不能分解蛋白胨，易溶于水,甘油,不溶于一般的有机溶剂,耐热性强。由木瓜制得的商品酶制剂中，含有如下三种酶：(1)木瓜蛋白酶，分

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白参考值范围确定资料

转铁蛋白（TRF）测定试剂盒（免疫比浊法） 参考值范围确定资料 深圳市锦瑞电子有限公司

转铁蛋白（TRF）测定试剂盒（免疫比浊法） 参考值范围确定资料 转铁蛋白(Transferrin，TRF，TF，又称为铁传递蛋白、血清运铁蛋白、运铁蛋白、嗜铁蛋白、铁糖蛋白)是一种重要的β-球蛋白，是脊椎动物体内铁的运输者。转铁蛋白是体液中不可缺少的成分，不仅参与铁的运输与代谢，参与呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节，还能调节铁离子平衡和能量平衡，更具有抗菌杀菌的保护功能，因而转铁蛋白具有较全面的蛋白质生理功能。转铁蛋白的主要生理功能是把铁离子从吸收和储存的地方运输到红细胞供合成血红蛋白用，或输送到机体的其他需铁部位。 转铁蛋白(transferring，TRF)作为一种特殊的蛋白, 已被广泛应用于临床。血清TRF测定可用于贫血的诊断及治疗的监测。血清TRF升高的最常见原因是缺铁性贫血，研究发现血清铁降低，TRF升高可产生在贫血发生之前。目前，血清TRF测定已普遍应用于贫血的诊断和对治疗的监测。血清TRF测定还有助于肝、肾疾病的病情观察和预后判断。近年研究表明，TRF主要在肝脏内合成，反过来又可促进肝细胞的再生，故肝脏发生病变，血清TRF含量降低，且与病情的严重程度一致。 1. 材料和方法 1.1 对象 2011年9－12月到深圳市蛇口人民医院的体检人员，涉及人群有干部、工人、学生、公司职员和医院职工等，对肝肾功能、血脂、血尿常规各项检测指标正常，血压、B超、心电图、X光透视心肺正常的人员。按性别分为两组，每组各120个参考值数据。 1.2 仪器与试剂 采用锦瑞电子有限公司的全自动生化分析仪GS400，试剂为本公司生产的液体双试剂，转铁蛋白（TRF）采用免疫比浊法。校准品和两水平值的质控品均为RANDOX生产，校准品为CAL2350复合定标液，批号为685UN；质控为HN1530和HN1532，批号分别为621UN、434UN。

明胶酶谱分析法

明胶酶谱分析法 一。用品 1.细胞培养或者提取组织 2.试剂的配制 （1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶5ml（包括） ddH2o 1.5ml 15ml 30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）1.65ml 4.95ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8）1.25ml 3.75ml 10% SDS 50ul 150 ul 10%过硫酸铵50ul 150 ul TEMED 4ul 12 ul 1%明胶0.5ml 1.5 ml B.浓缩胶的配制 浓缩胶3ml ddH2o 2.1ml 6.3ml 30%储备胶0.5ml 1.5ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.38ml 1.14ml 10% SDS 30ul 90 ul 10%过硫酸铵30ul 90 ul TEMED 3ul 9 ul （3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液 0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3） （4）4 ×上样缓冲液 0.32% Tris-HCL 6.4ml 4%SDS（PH7.2）8ml 16%甘油3.2 ml 溴酚蓝0.024g ddH2o 2.4ml (5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 漂洗液；50mmol/L Tris -HCl，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 （7）孵育液：50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2, 0. 02% Brij-35 ,pH7.6 （8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)产品技术要求北京赛诺浦

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）适用范围：用于体外定量测定人体血浆和尿液中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。 1.1 试剂盒包装规格 试剂1：1×20mL，试剂2：1×5mL；试剂1：2×60mL，试剂2：2×15mL； 试剂1：3×40mL，试剂2：3×10mL；试剂1：4×60mL，试剂2：4×15mL； 试剂1：2×400mL，试剂2：1×200mL；试剂1：2×40mL，试剂2：2×10mL。 校准品（选配）：6×0.5mL（六水平）；6×1mL（六水平）；6×3mL （六水平）。 质控品（选配）：1×0.5mL；1×1mL；1×3mL。 1.2 试剂盒主要组成成分 注：校准品和质控品存在批特异性，具体浓度见对应批次产品标签。

2.1 外观 试剂1：无色至淡黄色澄清液体；试剂2：乳白色液体。 校准品：无色至淡黄色澄清液体。 质控品：无色至淡黄色澄清液体。 2.2 净含量 液体试剂的净含量不得低于标示体积。 2.3 试剂空白吸光度 在37℃、546 nm波长、1cm光径条件下，试剂空白吸光度范围应在(0.3，2.0)之间。 2.4 分析灵敏度 测定浓度在150ng/mL附近的样本时，吸光度变化值（ΔA）应不小于0.005。 2.5 线性 在（50，2500）ng/mL范围内：线性相关系数r不小于0.990；在[500，2500）ng/mL范围内，线性相对偏差应不大于±15%；（50，500）ng/mL范围内，线性绝对偏差应不大于±75ng/mL。 2.6 重复性 重复测试两份高低浓度的样本，所得结果的变异系数（CV%）应不大于10%。 2.7 批间差 不同批号试剂测试同一份样本，测定结果的批间相对极差应不大于15%。 2.8 准确度 与已上市产品进行比对试验，在（50，2500）ng/mL范围内，线性相关系数r不小于0.975。在（50，500]ng/mL区间内线性绝对偏差不大于± 75ng/mL；在（500，2500)ng/mL区间内线性相对偏差不大于±15%。 2.9 质控品赋值有效性 测定结果在靶值范围内。 2.10 校准品溯源性

蛋白酶的种类

蛋白酶的种类 1．木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。 木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。 木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI)为8.75；最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

2．胃蛋白酶 胃蛋白酶（英文名称：Pepsin）是一种消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主细胞所分泌，功能是将食物中的蛋白质分解为小的肽片段。胃蛋白酶原由胃底主细胞分泌，在pH1.5～5.0条件下，被活化成胃蛋白酶，将蛋白质分解为胨，而且一部分被分解为酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。可分解蛋白质中苯丙氨酸或酪氨酸与其他氨基酸形成的肽键，产物为蛋白胨及少量的多肽和氨基酸，该酶的最适pH为2左右。 3．中性蛋白酶 中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、PH值下，本品能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。可广泛应用于动植物蛋白的水解，制取生产高级调味品和食品营养强化剂的HAP和HVP，此外还可用于皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工。 利用中性蛋白酶的酶促反应，可把动植物的大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，以利于蛋白质的有效吸收和利用，其水解液AN%高，水解度高，风味佳，已广泛用于生产高级调味品和食品营养强化剂，各种动物来源性抽提物生产功能性骨、肉提取物（骨素）、水产提取物、蛋白胨、肽等及研究开发一些高附加值的功能食品。