菌种鉴定的分子生物学方法

菌种鉴定的分子生物学方法

——16S rDNA测序鉴定菌种

一．原理

细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。二．技术路线

该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下：

三．方法步骤

（一）细菌基因组DNA提取（酶解法）

1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。

2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。

3. 加140 μLTE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。37℃放置10分钟。

4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。再加入3 μL 蛋白酶K，混匀，55℃温育5分钟。

5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。

7. 重复第六步。

8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。

9. 加入50μL预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。

10. 电泳。取3μL溶液电泳检测质量。

注：如果待测菌为乳酸菌等不产生芽孢的菌类，且菌种非常纯净单一，则可以用直接煮沸法。（二）PCR扩增

1. 根据16S rDNA序列设计保守的扩增引物。

27 F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

1492 R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

2. PCR扩增体系：

按下表加入引物、模板、Mix和ddH2O，建立PCR扩增体系（50μL）

3. PCR

将EP管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增程序如下为：

4. PCR

拿出EP管，从中取出5 μL反应产物，加入1 μL上样缓冲液。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳30 min。在紫外灯下检测扩增结果。

（三）扩增片段的回收

根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切

割核酸条带，并回收目的片段。

1. 称量一2mL的EP管质量，记录。

2. 在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的P管内，称量。计算凝胶质量。

3．每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer，混匀。60℃温育至凝胶融化。

4．全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

5．加入500 μLBinding Buffer，10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

6．加入70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。

7．再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。

8．加入30μL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。

（四）DNA片段测序

将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16S PCR引物。

（五）序列比对

将测序的结果在NCBI上进行序列比对，根据比对结果得出鉴定菌种。

*主要仪器：

1. PCR仪（用于进行PCR扩增反应，一般国产价格在2-3万元，最低也要1.8万左右）

2.电泳仪（用于琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，一般国产几个在3000左右）

附录：实验试剂表。

细菌DNA特征序列鉴定法新增

细菌DNA特征序列鉴定法（新增） 细菌DNA特征序列鉴定法系以特征核酸序列作为目标检测物，用于药用原料、辅料、制药用水、中间产品、终产品、包装材料和环境等药品全生命周期质量控制中细菌的鉴定。 本法通过对细菌16S rRNA基因特征序列的测定，实现细菌的生物学鉴定。细菌16S核糖体RNA基因（16S ribosomal RNA gene, 16S rRNA基因）全长约1500 bp，包含9个可变区（Variable region, V区）和10个恒定区（Constant region, C区），在结构与功能上具有高度保守性，是细菌分类和鉴定中得到广泛应用的DNA特征序列之一。 实验环境和仪器的一般要求 开展细菌鉴定试验的环境应具备分子生物学实验室的基本条件，并符合相应级别的生物安全要求。 所用仪器有电子天平、离心机、冰箱、恒温仪、紫外分光光度仪，聚合酶链式反应分析仪（Polymerase chain reaction analyzer，PCR仪）、电泳仪、凝胶成像仪、核酸测序仪等。 试剂及其制备方法 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸钠缓冲液（TE缓冲液，pH 8.0）称取三羟甲基氨基甲烷12.1 g，加适量纯化水搅拌溶解，并稀释至100 ml，用盐酸试液调节pH值至8.0，得到1 mol/L储备液；称取乙二胺四乙酸二钠18.6 g，加适量纯化水搅拌溶解，并稀释至100 ml，用氢氧化钠试液调节pH值至8.0，得到0.5 mol/L储备液。取三羟甲基氨基甲烷储备液10 ml，乙二胺四乙酸二钠储备液2 ml，加纯化水稀释至1000 ml，121℃灭菌15分钟。 PCR反应缓冲液（pH 8.3）称取三羟甲基氨基甲烷12.1 g，氯化钾37.3 g，氯化镁2.4 g，加适量纯化水搅拌溶解，并稀释至1000 ml，用盐酸试液调节pH 值至8.3，121℃灭菌15分钟。 电泳缓冲液（TAE缓冲液，pH 8.0）称取三羟甲基氨基甲烷 4.84 g，冰乙酸1.14 ml，乙二胺四乙酸二钠0.75 g，加适量纯化水搅拌溶解，并稀释至1000 ml，用氢氧化钠试液调节pH值至8.0。

菌种鉴定手段

菌种鉴定手段 （1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。 （2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 （3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。（4）API细菌数值鉴定系统

API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 （5）功能性分析及功能基因 CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究，目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技术 随着微生物菌种应用的进一步发展，在食品安全管理、生物产品出口认证、知识产权保护等行业需求日益增加，微生物菌种株水平的鉴别技术成为一个迫切需要解决的问题。 CICC采用随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；采用SSCP技

酵母的分子生物学鉴定

生物技术通报 ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ ?技术与方法? ２００８年第５期 收稿日期：２００８－０３－１４ 基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）项目基金（２００３ＡＡ２１４０６１，２００６ＡＡ０２０２０３） 作者简介：唐玲（１９８３－），女，硕士研究生，研究方向：分子生物学；Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｇｌｉｎｇ１０１４９９＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：闫云君（１９６９－），男，教授，博士生导师；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｙｕｎｊｕｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ；Ｔｅｌ：（０２７）８７７９２２１４ 酵母种类繁多，不仅作为一种重要的工业微生物被广泛应用于各个领域，近年来，人们还利用酵母发酵来生产抗生素，维生素和酶等高附加值的产品，但酵母也会引发食物、制造物的腐坏变质，从而给人们带来巨大的经济损失，有的酵母还是人体和动物的致病菌（如，Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）。近两个世纪以来，酵母菌分类主要依据形态学鉴定和生理生化特性。目前，已发展起来各种用于酵母快速检测的商业化的试剂盒，可实现部分酵母（多是针对导致疾病的部分致病酵母）的鉴定，但是该类试剂盒对酵母的检测不仅费时，而且鉴定结果准确性不高。由于受到环境因素的影响，某些酵母菌属、种在形态学及生理生化特性方面差异极不显著，在这样的背景下，以化学为基础的分类法建立起来，通过细胞壁的成份、生物合成以及同功酶电泳图谱分析来 对酵母进行分类鉴定。现在，随着分子生物学的发展，ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交，染色体组型分析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ），染色体ＤＮＡ的限制性片段长度的多 态性分析（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａ ｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＤＮＡ），线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ）及核糖体ＤＮＡ序列分析（ｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），实时ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ），基因芯片 （ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ）等分子生物学的方法广泛地应用于酵母的鉴定中。分子生物学的方法不仅能够快速的将各种酵母鉴定到属或种，而且鉴定的结果精确度更高。随着数据库中分子信息量的增加，近年来应用分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛。 １核糖体ＤＮＡ鉴定法 核糖体ＤＮＡ普遍存在于生物中，真核生物的 核糖体ＲＮＡ中包括２６Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ和５Ｓ４种不同 酵母的分子生物学鉴定 唐玲 刘平黄瑛杨江科闫云君 （华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室，武汉４３００７４） 摘 要： 酵母种类繁多，与人类的关系极其密切，但目前由于研究方法的不同，对于酵母的分类还存在着不同的分 类体系。而准确快速的对酵母进行鉴定，既可以有效防止食品腐化变质，又可以增加经济效益，同时也为酵母的分类鉴定奠定一定的理论基础。对常用的核糖体ＤＮＡ鉴定法、ＤＮＡ指纹图谱鉴定、脉冲场电泳鉴定、实时ＰＣＲ和基因芯片等分子生物学鉴定方法在酵母鉴定工作中的研究情况进行了比较。 关键词： 核糖体ＤＮＡ ＤＮＡ指纹图谱脉冲场凝胶电泳实时ＰＣＲ基因芯片 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＹｅａｓｔ ＴａｎｇＬｉｎｇＬｉｕＰｉｎｇＨｕａｎｇＹｉｎｇＹａｎｇＪｉａｎｇｋｅＹａｎＹｕｎｊｕｎ （ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７４） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｙｅａｓｔｓｈａｖｅｗｉｄｅｒａｎｇｅａｎｄａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｈｕｍａｎｂｅｉｎｇｓ．Ｔｈｅｒｅｅｘｉｓｔｓｏｍｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆ ｙｅａｓｔｓｂａｓｅｄｏｎｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｆｉｎｄａｎａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｙｅａｓｔｓ，ｔｈｕｓｂｅｉｎｇａｂｌｅｔｏｐｒｅｖｅｎｔｆｏｏｄｃｏｒｒｕｐｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｅｃｏｎｏｍｉｃｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ａｌｓｏ，ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｂｏｕｔｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｂｅｐｒｏｖｉｄｅｄ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｄｅｓｃｒｉｂｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｙｅａｓｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ，ＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｇｅｎｅｃｈｉｐｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ＲｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇＰｕｌｓｅｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ

菌种鉴定方法

1. 菌落形态观察 观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。 2. 革兰氏染色 按照革兰氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检；干燥后，用油镜观察。 3. 鞭毛染色 挑取18~30 h新鲜平板培养物制备菌悬液，制片，室温自然干燥。滴加硝酸银染色A液覆盖3~5 min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。 4. 糖类分解试验 将被检菌接种于糖发酵培养基中，37℃培养2－3天。如果培养基变黄，说明产酸；如变黄的同时，还有气泡，说明既产酸又产气。培养基仍呈蓝色，说明未产酸。选取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。 5. 吲哚（靛基质）试验 将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1－2天。于培养液中加入戊醇或二甲苯2－3ml，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入试剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。 6. 淀粉水解试验 将LB琼脂加热融化，使冷到50℃，加入淀粉溶液，混匀后，倾注平板。将细菌划线接种于平板上，37℃培养24小时，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，培养基呈深蓝色，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环。 9. V－P试验 将被检菌接种于试验培养基中（葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g，溶于1 000ml 水中，分装于试管中，0.075MPa灭菌10分钟），培养2－7天后，于培养物中加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。 10.甲基红（M.R）试验 接种细菌，于37℃培养2－7天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0.1g 甲基经溶于300ml 95%乙醇中，加蒸馏水至500 ml），如呈红色，表示阳性。 11. 柠檬酸盐利用试验 将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2－4天，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。 12. 硝酸盐还原试验 将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1－2天，每管中先加入甲试剂0.1ml，再加乙试剂数滴，如出现红色，表示阳性。 13. 接触酶试验 将1ml 3%的H2O2倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为阳性。也可于清洁小试管中加少量H2O2（30%），再用清洁无菌的细玻棒（或火焰封口的毛细管或镍铬做成的接种环）醮细菌少许，插入H2O2液面下，有气

菌种鉴定

?（1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。 ?（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 CICC拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 ?（3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、 BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。 ?（4）API细菌数值鉴定系统 API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 ?（5）功能性分析及功能基因

菌种鉴定SOP

微生物的鉴定 1 原则 微生物鉴别应遵循逐步缩小范围的原则，用分类学的知识，一步步地将未知微生物逐步落实到科、属，然后选择相应的鉴定系统将未知的微生物鉴定到种。鉴定包括以下几个环节：①菌种采集②菌种纯化；3菌落形态学观察如形状、大小、色泽；4细胞形态观察如球状、杆状、螺旋状、弧状、丝状及其排列方式；5革兰氏染色反应，阳性或阴性；6氧化与发酵试验；7接触酶与氧化酶试验；鞭毛与动力等等。通过上述基础试验结果再结合细菌鉴定检索表，从而确定微生物所属范围，并选择合适的鉴别试验条，将微生物鉴定到种。也可采用分子生物学鉴定方法，提取DNA后通过扩增、序列分析等方法，测定DNA序列，得到鉴定结果。 2基本定向生化试验 在细菌鉴定过程中，需要最先完成的一些实验成为基本定向生化试验。以下详细介绍这些基本定向生化试验的原理、操作步骤和试剂配制的内容。 A革兰染色试验 原理：由于革兰阳性细菌的细胞壁较厚，细胞壁中的肽聚糖含量高且网格结构紧密，含脂量又低，当用结晶紫复合溶液染色细胞后用脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了结晶紫-碘复合物的逸出，故而菌体呈现深紫色；而格兰阴性细菌细胞壁中肽聚糖含量低，含脂量又高，当酒精脱色时，脂类物质被溶解，细胞壁通透性增大，结晶紫-碘复合物被抽提出来，从而使菌体呈现复染液的红色。 制片、染色操作在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌龄为18-24小时的菌苔与水滴充分涂抹成均匀的菌膜，自然烘干或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过几次，以固定涂片。滴加结晶紫液，初染1分钟，用自来水冲去结晶紫液。滴加卢戈碘液冲去残水并媒染约1分钟后，再用自来水冲去卢戈碘液，将玻片上的水甩干。滴加95%乙醇脱色约20-30秒，并立即用水冲净。滴加沙黄液染1-2分钟后，用水洗净沙黄液，晾干供镜检。 镜检观察在载玻片的菌膜上滴一滴香柏油，用显微镜的油镜观察标本，菌体呈红色为革兰阴性菌；菌体呈蓝紫色为革兰阳性菌。观察菌体的形态、排列（分辨并描述是球菌、杆菌、弧菌、放线菌）和大小（用已标定过大小的目镜微尺测量菌体大小）等。 B. 3%氢氧化钾试验 原理：在碱性溶液（3%KOH）中，革兰阴性细菌的细胞壁会快速破裂，细胞内的脱氧核糖核酸被释放到碱性溶液中，使溶液的黏性增强并形成黏丝：而革兰阳性细菌的细胞壁在碱性溶液中不会被溶解，细菌均匀地分散在碱性溶液中不会产生黏性。本实验用于当革兰染色试验的结果来确定革兰染色实验结果。 材料;3%KOH溶液（W/V）、木质牙签、待检菌的新鲜纯培养物（18-24小时）。 操作:在一洁净的载玻片上等距离滴上滴3%的KOH水溶液;用铜绿假单胞菌或具有等同反应的菌种作为阳性对照；用枯草芽孢杆菌或具有等同反应的菌株作为阴性对照；-用木质或塑料接种环从培养基分别挑取阳性、阴性和待检菌的新鲜纯培养物（18-24小时)于载玻片上的3滴KOH水溶液中，然后用接种环快速

常见细菌鉴定

常见细菌鉴定 平装: 331页 正文语种: 简体中文 开本: 16 ISBN: 9787117119610 条形码: 9787117119610 尺寸: x x cm 重量: 540 g 百分网内容简介 《临床常见细菌、真菌鉴定手册》着重对院内感染的常见细菌、真菌及其耐药性检测和研究进行了细致阐述。细菌耐药也是当前临床面临的重大难题之一，抗生素滥用是造成耐药性不断增长的主要原因。微生物是进化史上最成功的例子，存在几十亿年了，新兴的微生态学理论认为，人类和微生物之间是适应而不是对抗。院内感染菌株绝大部分是条件致病菌，当机体免疫力低下、抗生素使用不合理破坏了正常菌群，导致微生态失衡情况下，引起感染的发生、发展。我从事微生态研究多年，深刻认识到只有从生态平衡角度，将传统的单纯“杀菌”理论转变为“杀菌”加“促菌”理论，保护人体的正常菌群，维护人体微生态平衡，提高机体免疫能力，才是控制感染的根本办法。 百分网目录

上篇临床细菌学 第一章需氧及兼性厌氧，革兰染色阴性杆菌、球杆菌、球菌及弯曲菌和螺旋菌 第一节心杆菌属 第二节放线杆菌属、艾肯菌属、金氏杆菌属和色杆菌属 第三节弗朗西丝菌属 第四节布鲁菌属 第五节军团菌属 第六节假单胞菌属 第七节伯克霍尔德菌属、窄食单胞菌属、丛毛菌属和食酸菌属 第八节不动杆菌属 第九节莫拉菌属 第十节金黄杆菌属和威克斯菌属 第十一节奈瑟菌属 第十二节鲍特菌属 第十三节产碱杆菌属、无色杆菌属、苍白杆菌属和根瘤菌属 第十四节弧菌属 第十五节气单胞菌属 第十六节肠杆菌科

第十七节巴斯德菌属 第十八节弯曲杆菌属和弓形菌属 第十九节螺杆菌属 第二十节巴尔通体属 第二十一节钩端螺旋体属 第二十二节疏螺旋体属 第二十三节密螺旋体属 第二章需氧革兰染色阳性球菌及杆菌 第一节葡萄球菌属 第二节链球菌属 第三节肠球菌属 第四节气球菌属及其相关菌属 第五节李斯特菌属和丹毒丝菌属 第六节棒状杆菌属及相关菌属 第七节芽胞杆菌属和其他需氧芽胞杆菌 第八节分枝杆菌属 第九节奴卡菌属、红球菌属 第三章专性厌氧菌 第一节消化球菌属、消化链球菌属、嗜胨菌属、微金菌属和厌氧球菌属 第二节韦荣菌属、氨基酸球菌属和巨形菌属 第三节丙酸杆菌属、放线菌属、双歧杆菌属、真杆菌

分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项

16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。

细菌鉴定方法

1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》（1999），中科院微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》（1978）的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种，参照了蔡妙英等译《芽孢杆菌属》（1980）的方法。 （1）革兰氏染色：挑选少许菌苔，涂布于干净玻片的蒸馏水中，风干固定，结晶紫染色（结晶紫2g，草酸铵0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化钾2g，水300 ml）作用1min，水洗，脱色，用番红O 液染3min，水洗，风干，光学显微镜观察。 （2）鞭毛染色：将16~24h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液（丹宁酸5g，FeCl3 1.5g，15%福尔马林2ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100 ml）染6~10min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3溶液）加热复染30min，蒸馏水冲洗，干燥，镜检，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 （3）运动性：半固体琼脂穿刺法，将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中，其中含0.3~0.6%的琼脂。适温培养，运动性可用透射光目测，如生长菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表明鉴定菌无运动性；如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示鉴定菌有运动性。 （4）芽孢染色：孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染20 min，水冲洗后在用0.5%番红O复染20~30s，水洗，吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。 （5）抗酸染色：常规涂片，石碳酸复红（10%碱性复红乙醇饱和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加热染色5 min，倾去染液用酸性乙醇脱色，吕氏美蓝（2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）复染2min，水洗，吸干，镜检。 （6）荚膜染色：在载片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min，加0.5%番红O液数滴滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30s，然后倾去染液，立即吸干，镜检。 1.2.2 培养及生理特性 （1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养1~2d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落和培养基的颜色等。 （2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每处理2管，目测生长情况。

不常见细菌的快速鉴别方法

不常见细菌的快速鉴别方法 一. 不常见革兰阴性菌 1. 布氏杆菌属 布氏杆菌属是一类革兰阴性细小杆菌，牛、羊、猪等动物最易感染。人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品，均可被感染。布氏杆菌病广泛分布世界各地，我国部分地区曾有流行。布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6个种，20个生物型。中国流行的主要是羊、牛、猪三种布氏杆菌，其中以羊布氏杆菌病最为多见。 布氏杆菌属细菌为非抗酸性，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，呈球杆状(见图1)。血琼脂(BAP)上为透明或半透明、光滑且有光泽菌落。此细菌不在麦康凯琼脂上生长。布氏杆菌属细菌尿素阳性，触酶、氧化酶阳性，而吲哚阴性。由于该菌属细菌具有强的传染性，因此一旦怀疑应送往LRN B级参考实验室进行确认。 2. 空肠弯曲菌 空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食物源性病原菌，认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。其致病因素包括粘附、侵袭、产生毒素和分子模拟机制等四个方面，通过分子模拟机制可以引起最严重的并发症一格林一巴利综合征。空肠弯曲菌可以通过产生细胞紧张性肠毒素、细胞毒素和细胞致死性膨胀毒素而致病。空肠弯曲菌对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感，但近年发现了不少耐药菌株及多重耐药性菌株。 空肠弯曲菌菌体轻度弯曲似逗点状(见图2)。菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。微需氧菌，在含2.5～5%氧和10% CO2的环境中生长最好，在正常大气或无氧环境中均不能生长，最适温度为37～42℃。本菌在普通培养基上难以生长，在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象。空肠弯曲生化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素。可还原硝酸盐，氧化酶和触酶为阳性。能产生微量或不产生硫化氢，甲基红和v-p试验阴性，枸椽酸盐培养基中不生长,在弯曲菌中马尿酸呈阳性反应具有重要鉴定价值。

真菌学实验指导

本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。 本指导书适用于生物技术和生物科学专业。

1、实验：内生真菌的分离及鉴定 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3 2、实验报告基本内容要求 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????7 3、实验报告格式????????????????????????????????????????????????????????????????8

实验内生真菌的分离及鉴定 实验学时：18 实验类型：综合 实验要求：选修 一、实验目的 1.了解真菌形态的基本特征。 2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。 二、实验内容 采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。 三、实验原理、方法和手段 （一）实验原理 根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。 （二）实验手段和方法 1、内生真菌分离纯化方法 1.1样品的表面消毒及预处理 分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。 老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。 对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块 将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。 灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻

细菌常用生理生化鉴定

细菌鉴定中常用的生理生化反应 录入时间:2009-8-13 15:12:12 来源：中国生命科技论坛 1、实验原理 （1）细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 （2）糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 （3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验） 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。 （4）大分子物质代谢实验． 靛基质（口引睬）试验 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做） 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 （5）有机酸盐及氨盐利用试验 柠檬酸盐利用试验 柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢按是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溟廖香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。 2、实验仪器，材料和用具 （1）实验仪器 37OC 恒温培养箱、20OC 恒温培养箱（室温代替）。 （2）微生物材料 大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四种菌种的斜面各1 支。 （3）试剂

细菌菌株的分子鉴定步骤

(1)小量提取细菌基因组总DNA a.挑LB平板上新鲜活化的单菌落于5mL LB培养基中，25℃震荡培养24 h； b.转移3mL菌液于5mL离心管中，4℃，12000r/min，离心5min，弃掉上清； c.将细菌沉淀物用0.5mol/L NaCl洗一次，尽量空干上清液； d.将沉淀重悬于1mL 50mmol/L Tris (pH 8.0)缓冲液中，然后加入0.2mL新鲜配置的溶菌酶溶液(10mg/mL in 0.25mol/L Tris，pH8.0)和0.8mL 0.25mol/L的EDTA溶液，混匀后于37℃处理1 h，再加入200μL 10%SDS溶液，混匀后放置于55℃处理5min； e.加入等体积的酚-氯仿(1:1)，盖好上下颠倒混匀3min，12000r/min，离心10min； f.转移上相至新的离心管中，重复上个步骤直到无白色变性蛋白层出现； g.取上清，加入3μL 10mg/mL的去DNase的RNase溶液，37℃水浴1h； h.重复步骤e； i.在上相中加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置30min；. j.4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗两次，干燥后溶于100μL的TE中，-20℃保存备用。 (2) PCR扩增16S rDNA序列 a. 以上述细菌基因组总DNA为模板，.扩增所用引物为， 上游引物：5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’；（27F） 下游引物：5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’。（1492R） b. PCR反应体系参见PCR扩增试剂盒说明书 c. PCR反应条件也主要参考说明书 94℃预变性5min，94℃ 45s，56.2℃ 45s，72℃ 90s，30个循环； 72℃ 10min，4℃保温。 d. PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测 e. PCR产物测序。 (3)构建进化树 将菌株16S rRNA的序列与GenBank数据库中序列比对，构建系统发育树。

菌株分离鉴定、药敏实验及PCR扩增实验过程

目录 2.1菌株的分离纯化 (1) 2.1.1菌株的分离 (1) 2.1.2菌株的纯化 (1) 2.2菌株的鉴定 (2) 2.2.1革兰氏染色镜检 (2) 2.2.2菌株的生化鉴定 (2) 2.3药敏试验 (3) 2.3.1药物的配制 (3) 2.3.2质控 (4) 2.3.3MIC（最小抑菌浓度）实验 (4) 2.4 CTX- M型基因的PCR扩增模板的提取 (7) 2.5 CTX- M型基因的PCR扩增 (7) 2.5.1 PCR 扩增引物及条件 (7) 2.5.2电泳检测PCR扩增产物 (8)

2.1菌株的分离纯化 2.1.1菌株的分离 2.1.1.1实验的准备 1.分离管的准备：本实验需要100个50ml离心管 （1）用过的离心管，将盖子拧开，加入清洁剂，沸水浴10min，毛刷清洁； （2）没入加入清洁剂的水中，灌满水，不要留有大气泡； （3）放入超声清洁机中超声清洁45min，25℃,100Hz； （4）倒出管中水，灌满去离子水，再超声20min，25℃，100 Hz； （5）倒出管中水，重复（4）一次； （6）倒出管中水，放入60℃烘箱中烘干； （7）待烘干后装入保鲜袋中，扎孔通气，再用报纸或牛皮纸包好，放入高压锅中高压灭菌，121℃，20min； （8）高压后取出放入烘箱中，烘干后待用。 2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所选试剂的规格进行配制，再送入高压锅中高压灭菌，高压后放入烘箱中烘干待用。注意瓶装液体高压前一定要盖子拧松。 3.试管的准备：本实验需要100根试管 （1）塞子拔出，与试管一起放入清洁剂水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清洁； （2）10个一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，报纸或牛皮纸包好，高压； （3）取出后烘干待用。 4.LB肉汤培养液的准备：本实验需要100根LB管 根据所选购商品说明配制，将配制好的LB培养液，分装到100根干净试管，每根3ml，包好后于121℃高压15min，烘干待用。 5.麦康凯琼脂培养基的准备： 按所选商品说明配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。 2.1.1.2实验过程 （1）每个分离管装入20mlBPW； （2）三点取样剪取100份待检肉样分装到100个分离管中，按肉样的标号在分离管上标号，放入37±1℃温箱摇床上培养6h，200r； （3）取分离管中的菌液50μL加入LB管中，标号，37±1℃温箱摇床上培养10-12h，200r； （4）用接种环取一环菌液画到麦康凯琼脂培养基上，标号，37±1℃温箱过夜培养。 2.1.2菌株的纯化 2.1.2.1实验的准备 1.伊红美兰（EMB）琼脂培养基的准备： 按所选商品的规格配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。 2. LB肉汤培养液的准备：同2.5.1.1.1中LB肉汤培养液的准备。 2.1.2.2实验过程

细菌分子生物学鉴定

是的，要做PCR。 首先你要提出细菌的DNA。 方法如下： 1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP 管中，再加甘油（30-40%）进行保种。（-80摄氏度保藏2年） 2、提取DNA（CTAB法）： （1）取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。 （3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），溶菌酶3ul，混匀，于50℃温育1h。 （4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl 溶液，混合后再65℃温育30min。 （6）冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质)：氯仿：异戊醇（增强酚的作用）（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。 （7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min 离心5min将上清液转移到新的EP管。（纯化作用） （8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。

（9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。（10）加入50ul（双蒸水）/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。 （11）电泳检测 6、PCR扩增：（细菌的通用引物为27F和1492R）将提取得到的DNA 进行PCR扩增，电泳检测扩增得到的16S rDNA（如果菌类分明，条带清晰，PCR原液可直接送去测序，双向测通，得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对，得出鉴定结果） 7、酶切带型分型确定操作单元：将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切，电泳检测酶切产物，酶切带型相同的分为一个操作单元。 8、连接转化：从每一个操作单元中选取一株菌的16S rDNA进行连接实验。将连接产物转入感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含有Amp的平板上，倒置培养12-16h。 9、克隆子挑选及PCR鉴定：从上一步的平板上挑取单菌落于含有Amp的液体培养基中震荡培养12h，以培养液为模板直接进行PCR 扩增鉴定（1000-2000bp）。将含有目的片段的克隆子菌液低温保存。 10、测序：将含有目的片段的克隆子菌液送去测序。 11、序列拼接：运用DNAMAN软件对测序得到的序列进行拼接。 12、建树：对拼接得到的序列用Blast进行比对，最后将比对得到的所有序列运用MEGA6建立系统发育树。

菌种鉴定的分子生物学方法

菌种鉴定的分子生物学方法 ——16S rDNA测序鉴定菌种 一．原理 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。二．技术路线 该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下： 三．方法步骤 （一）细菌基因组DNA提取（酶解法） 1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。

细菌鉴定流程

细菌鉴定流程： 取一环标本四区划线接种平板（如为粪便标本接种SS,MAC平板） 培养18-24小时后取一区菌落革兰染色，报告为革兰阳性球菌/革兰阴性球菌/革兰阳性杆菌/革兰阴性杆菌，注意区分细菌和真菌 一般情况下不会给你们做革兰阳性杆菌和革兰阴性球菌 革兰阳性球菌鉴定流程： 先做3%触酶试验：阳性的为葡萄球菌或微球菌，阴性为链球菌或肠球菌 葡萄球菌和微球菌的区别：葡萄糖OF试验，葡萄球菌为F型，微球菌为O型 所以如果做到一个触酶阳性的革兰阳性球菌都要做下葡萄糖OF试验，DNA酶试验，新生霉素试验，血浆凝固酶试验 链球菌和肠球菌的区别：链球菌高盐和胆汁七叶苷试剂均为阴性，而肠球菌都为阳性。 链球菌属内区别：本来可以通过溶血来区分一些的，但是由于实验室的平板αβ溶血比较难区分 所以如果做到一个触酶阴性的革兰阳性球菌都要做下高盐，胆汁七叶苷，杆菌肽，奥普托欣，CAMP 如果做到一个奥普托欣敏感的革兰阳性球菌再加做胆汁溶菌试验和菊糖试验（阳性为变红）可判定为肺炎链球菌 革兰阴性杆菌鉴定流程： 先做氧化酶试验： 氧化酶阴性的革兰阴性杆菌都要做下KIA，MIU，葡磷两支(做MR，VP)，苯丙，枸橼酸盐，硝还，蛋白胨水（做吲哚试验），赖氨酸，鸟氨酸，氨对 如果KIA结果为A/A或者K/A的应为肠杆菌科细菌，如上面向个反应还不能区分细菌到种根据教科书307页加做试验。 一般情况下只会给你们做大肠埃希菌，志贺菌属（四种），沙门菌属（甲副，乙副，伤寒），弗劳地枸橼酸杆菌，肺炎克雷伯，产酸克雷伯，产气肠杆菌，阴沟肠杆菌，普通变形杆菌，奇异变形杆菌，沙雷菌属，摩根菌属，普罗威登斯菌属。 如果KIA结果为K/K应怀疑为不动杆菌属或者嗜麦芽窄食单胞菌：这两个菌区分可通过麦芽糖和赖氨酸试验区分， 如为氧化酶阳性，要做葡萄糖的OF试验（用非发酵），硝还产气，精氨酸双水解酶，一般情况下只有两种菌给你们做一个是铜绿假单胞菌，一个是粪产碱杆菌， 真菌给你们做的一般情况只有白色念珠菌和新生隐球菌，通过墨汁负染，芽管试验，厚膜孢