蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项

1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)

可以使用适当的裂解液。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)

(1) SDS-PAGE凝胶配制

(2) 样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳

i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾

干。

ii.灌胶与上样

（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）

（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）

（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

（4）配4%的浓缩胶,加入TEMED（TEMED,中文名为四甲基乙二胺，是一种无色透明的液体，有微腥臭味，可以用于配制SDS-PAGE胶。TEMED可以催化APS产生自由基，从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合,可作为一种促凝剂使用）后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

（5）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向里。）

（6）测完蛋白含量后，计算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5 ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。）

（7）加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

（8）

电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，

低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在

100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。

3.转膜(Transfer)

推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP36/FFP39)。硝酸纤维素膜(NC 膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

i.转一张膜需准备6张7.0～8.3 cm的滤纸和1张7.3～8.6 cm的

硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会

污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用

镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水

上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸

湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜

吸水。

ii.在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

iii.将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其

不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在

垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

iv.要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。

（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶

轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下

分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去

气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并

除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵

垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的

擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。

（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流

通。）

v.将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般

用60 V转移2 h或40 V转移3 h。

vi.转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜

晾干备用。

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20000的蛋白选用

0.45um的膜，小于20000的蛋白选用0.2um的膜。PVDF膜在使用时需预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。PVDF膜具有较高的机械强度，是印迹法中的理想固相支持物材料。western blotting转膜一般采用“滤纸-凝胶-膜-滤纸”夹心法,凝胶靠近负极,膜靠近正极.因为蛋白上结合有SDS,因而带负电,在电流的作用下会从负极向正极运动,从而转移到膜上。电场力作用条件下，带电粒子（PAGE胶中的蛋白）会发生定向迁移；蛋白大小如果超过膜孔径（0.22μm or 0.45μm），不会透过膜。Western Blot技术是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

一抗就是用来和你要检测的蛋白发生免疫反应的抗体，确定了需要检测样品的种属，就可以选择对应的一抗，而二抗是根据一抗来选择的，比如一抗是小鼠来源的，二抗就要是抗小鼠的。一抗有很多来源的，如鼠源、兔源等，现在很多生物试剂公司都有产品，选个质量有保证的比较可靠，一抗与目的蛋白(抗原)结合后连接牢固，再用TBS洗脱非特异性结合的抗体，再加二抗孵化，再洗脱，二抗一般用碱性磷酸化酶或者辣根过氧化物酶标记，这样待检目的蛋白就偶联上一抗--二抗--标记酶，最后再用发光液作为酶底物反应，在暗室中即可看见信号强弱不同的荧光，再用胶片曝光就得到了western最终结果。

4.封闭(Blocking)

将膜用TBS从下向上浸湿，移至含封闭液的平皿中，室温脱色摇床上摇动封闭1h。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。

转移成功后的膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合，增强信噪比。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20，缓冲溶液是TBS或PBS。

惰性蛋白质BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶或非离子去污剂Tween-20封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。Tween-20这种非离

子型去污剂在乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

将一抗用TBST(TBST中含有 Tris-Hcl， NaCl，tween20,是做WESTERN BLOT中常用的缓冲溶液)稀释至适当浓度（在1.5 ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2 h后，回收一抗。用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。

一抗孵育完成后洗膜是为了洗掉未和膜结合的抗体，而不是磷酸盐。只有洗干净非特异性结合在膜上的一抗，加二抗时才不会因非特异结合而呈现很重的背景。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应。

7. 蛋白检测(Detection of proteins) 化学发光，显影，定影

将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触。化学发光显影仪显影。

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被

免疫印迹实验报告——wester blot

Western blot实验报告 摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法 方法：western blot 结果：见后文 结论：western blot能很好地分离蛋白 关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白 Western blot test report Abstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transfer Results: see below Key words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。 免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。 蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。 1 试剂与仪器 1.1 试剂（所有试剂均供两组用） 1.1.1 8%电泳分离胶的配制 H2O 6.9ml

蛋白质免疫印迹技术的实验研究

万方数据

万方数据

万方数据

蛋白质免疫印迹技术的实验研究 作者：张燕婉， 叶珏， 时那， 孟宪敏， 王来元， ZHANG Yan-wan， YE Jue， SHI Na， MENG Xian-min， WANG Lai-yuan 作者单位：中国医学科学院,阜外心血管病医院中心实验室,北京,100037 刊名： 实验技术与管理 英文刊名：EXPERIMENTAL TECHNOLOGY AND MANAGEMENT 年，卷(期)：2008,25(10) 被引用次数：21次 参考文献(9条) 1.郭尧君蛋白质电泳实验技术 2006 2.Nieman T Detection based on solution-phase chemiluminescence systems 1989 3.李晓军,秦浚川,武建国蛋白印迹技术研究进展[期刊论文]-临床检验杂志 2004(3) 4.Towbin H;Staehelin T;Gordon Electrophoretic franker of proreins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets.Procedure and some appHcations 1979(76) 5.Hauri H P;Bucher K Immunoblotting with monodonal antibodities:Importance of the blocking solution 1986(159) 6.高红,王贵新,王维林,张可仞用蛋白印迹技术初步评价肝母细胞瘤血管内皮生长因子表达的意义[期刊论文]-中华小儿外科杂志 2006(2) 7.Towbin H;Gordon J Immunoblotting and dot immunobinding:current status and outlook 1984(72) 8.Tovey ER;Baldo BA Characterisation of allergens by protein blotting 1987(08) 9.沈关心;龚非力抗体技术实验指南 2006 本文读者也读过(1条) 1.段勇.黄韬.袁育林.刘华.李娅.金克炜.DUAN Yong.HUANG Tao.YUAN Yulin.LIU Hua.LI Ya.JIN Kewei蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上皮钙粘蛋白的表达[期刊论文]-检验医学2009,24(1) 引证文献(7条) 1.秦双立,徐玥蛋白质印迹法在氟中毒研究中的应用[期刊论文]-山东化工 2015(13) 2.马瑛,马明,沈辉,骆新荣,高庆华不孕奶牛宫颈黏液相关ASA免疫印迹分析[期刊论文]-中国奶牛 2013(06) 3.程娜娜,韩榕He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管蛋白的影响[期刊论文]-激光生物学报 2013(04) 4.刘娇,华碧春,黄智锋蛋白表达检测技术在中药肝损伤机制研究中的应用进展[期刊论文]-浙江中医药大学学报2013(04) 5.韩继美胶体金免疫层析法对AFP、CEA和FN的快速检测[学位论文]硕士 2009 6.黄斌芳c-Jun基因启动子区的遗传变异与肺癌易感性的研究[学位论文]硕士 2012 7.程娜娜He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管结合蛋白MAP65-1的影响[学位论文]硕士 2014 引用本文格式：张燕婉.叶珏.时那.孟宪敏.王来元.ZHANG Yan-wan.YE Jue.SHI Na.MENG Xian-min.WANG Lai-yuan 蛋白质免疫印迹技术的实验研究[期刊论文]-实验技术与管理 2008(10)

Western免疫印迹方法

Western免疫印迹方法 所需溶液和试剂 注意：所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。 1 20X 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS): (#9808) 配制1L 1X PBS时，取50ml 20X PBS用950ml RODI 水稀释到1L，混匀。 2 1X SDS 上样缓冲液(#7722, #7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8，25°C), 2% w/v SDS, 10% 甘油, 50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。 3 转膜缓冲液：25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇(pH 8.5)。 10X Tris缓冲盐水(TBS): 配制1L时，称取24.2g Tris碱，80g NaCl加入1L水中；调整pH为7.6（稀释至1X使用）。 4 脱脂牛奶: (#9999) (重量体积比[w/v]) 5 封闭液：含5% w/v脱脂奶粉，0.1% Tween-20的1X TBS。配150ml时，在135ml水中兑入15ml 10X TBS，混匀；加入7.5g脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入0.15 ml Tween-20 (100%)，混匀。 6 洗液: 1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。 7 牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA): (#9998). 8 一抗稀释液：含5% w/v脱脂奶粉或BSA，0.1% Tween-20的1X TBS。配20ml时，在18ml 水中兑入2ml 10X TBS，混匀；加入1gBSA或脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入20 μl Tween-20 (100%)，混匀。做Western免疫印迹时，将膜孵育在稀释的抗体中轻轻摇动并4°C过夜。 10 预染蛋白分子量标准品，宽谱（预混型）: (#7720)。 11 印迹膜：本套方法在硝酸纤维素膜上优化过，CST推荐使用硝酸纤维素膜。PVDF也可以用本方法。 蛋白印迹 样品制备的通用方法如下所述： 1 刺激细胞：加入含调节因子的新鲜培养基处理一定的时间。 2 吸去培养基。用PBS清洗一次，吸去。 3 加入1X SDS样品缓冲液裂解细胞(6孔板中每孔加100 μl ，10cm盘中每盘加500 μl) 4 超声处理10–15秒打断DNA同时降低样品的粘度。样本中加蛋白酶抑制剂或者磷酸酶抑制剂，样本需要保持新鲜。使用磷酸化抗体时，建议使用CST 网站推荐阳性样本作为阳性对照 5 取20μl样品放在95–100°C加热5分钟，然后放在冰上冷却。 6 离心5分钟。 7 取20 μl加样到SDS-PAGE胶上(10 cm x 10 cm)。注意：CST建议同时加上预染蛋白分子量标准品(#7720, 10 μl/泳道)以验证转膜成功，还有生物素标记的蛋白分子量标准品(#7727, 10 μl/泳道)用于判断目的条带分子大小。 8 将电泳后的蛋白电转移到硝酸纤维素膜或是PVDF膜上。 膜封闭和抗体孵育 注意：以下所用试剂体积数为10 cm x 10 cm (100 cm2)膜的用量。使用不同大小的膜时，根据面积相应调整。

免疫印迹介绍及实验过程

免疫印迹 免疫印迹 免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。 免疫印迹法的基本原理 将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下, 使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等, 对抗原固定化基质膜进行检测和分析。 免疫印迹法的基本步骤 免疫印迹法（以抗原分析为例）基本上可分为抗原分离、抗原印迹和抗原检定三个步骤。在每一步中因采用的具体实验方法不同, 可构成多种免疫印迹分析系统。 免疫印迹法的优点 免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术。它具有下列优点： 1、湿的固定化基质膜柔韧, 易于操作； 2 、固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近, 不会象凝胶那样受孔径阻隔； 3、免疫印迹分析只需少量试剂； 4、孵育、洗涤的时间明显减短； 5、可同时制作多个拷贝, 用于多种分析和鉴定； 6、结果以图谱形式可长期保存； 7、免疫探针可通过降低PH值等方法, 象抹去录音磁带一样将探针抹掉, 再换用第二探针进行分析检测。免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此, 它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。 免疫印迹 免疫印迹又常称Western blot，是一综合性的免疫学检测技术。它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。由于免疫学检测敏感性高，并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩，因此，Western blot的灵敏度特别高，可达到放射免疫的分析水平。而使用一般的免疫学检测技术（如ELISA、放射免疫沉淀）检测时，由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强，往往并不容易达到目的。而Western blot却没有这些缺点。因此，Western blot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质（抗原）的检测。也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量。

(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验

蛋白免疫印迹（western blot）实验 实验步骤： 一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。【晶莱生物】 二、蛋白样品制备 1.单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提前开离心机预冷） （7）将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。BCA法。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。 (3)电泳

i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。 两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾 干。 ii.灌胶与上样 （1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 （操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。） （2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） （3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 （4）配4%的浓缩胶,加入TEMED（TEMED,中文名为四甲基乙二胺，是一种无色透明的液体，有微腥臭味，可以用于配制SDS-PAGE胶。TEMED可以催化APS产生自由基，从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合,可作为一种促凝剂使用）后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

食物特异性IgG抗体检测试剂盒(条带免疫印迹法)产品技术要求siderun

食物特异性IgG抗体检测试剂盒（条带免疫印迹法） 适用范围：用于体外定性检测人血清中食物特异性IgG抗体（最多可检测切达干酪，白软干酪，牛肉，鸡肉，猪肉，鸡蛋，羊肉，火鸡，酸奶，巧克力，玉米，大米，小麦，大豆，柠檬，菠菜，青豆，小米，杏仁，芝麻，腰果，花生，旱芹，茄子，青椒，欧芹，卷心菜，胡萝卜，菜花，嫩豌豆，葵花籽，黑胡桃，蓝莓，菠萝，橘子，桃，苹果，榴莲，芒果，香蕉，葡萄，柚子，草莓，哈密瓜，麦芽，黑麦，酵母，蔗糖，黄油，肉桂，芥末，蜂蜜，咖啡，燕麦，大麦，荞麦，西兰花，杂色豌豆，大蒜，洋葱，可乐豆，红茶，牛奶，螃蟹，对虾，鳕鱼，羊奶，蛤，三文鱼，沙丁鱼，带鱼，扇贝，龙虾，草鱼，牡蛎，鳟鱼，金枪鱼，红辣椒，大葱，生菜，黄瓜，马铃薯，南瓜，甘薯，香菜，小白菜，西红柿，蘑菇，西瓜，橄榄90种食物特异性IgG抗体）。 1.1包装规格 6人份/盒，型号为FIGG-90； 9人份/盒，型号为FIGG-64；FIGG-48； 18人份/盒，型号为FIGG-36；FIGG-28；FIGG-21；FIGG-14A；FIGG-14B；FIGG-7A；FIGG-7B；FIGG-7C；FIGG-4A；FIGG-4B； 其中，各型号/包装规格检测项目如下： 表1 各型号/包装规格检测项目

2. 主要组成成分 表2 主要组成成分

2.1. 外观 2.1.1. 试剂盒外部包装盒应整洁，各组分应齐全完整，文字符号标识清晰，所有试剂瓶密闭，无漏液。 2.1.2. 样本缓冲液为无色或淡黄色澄清液体；浓缩洗液（10×）为无色澄清液体；酶结合物（10×）为无色或淡黄色澄清液体；底物液为淡黄色澄清液体。 2.2. 净含量 液体试剂装量不小于标示值。 2.3. 膜条宽度 膜条宽度不低于1.8mm。 2.4. 临界值及重复性 食物特异性IgG抗体企业参考品各检测项目临界值浓度均为37.5U/mL。阳性参考品各检测项目抗体浓度均为50U/mL，检测10次，结果的阳性率为100%，反应结果一致；阴性参考品各检测项目抗体浓度均为25U/mL，检测10次，结果的阴性率为100%，反应结果一致。 2.5. 批间差 抽取三个批次的试剂盒，每个批次按临界值及重复性的检验方法检测，各浓度反应结果应一致，应符合临界值及重复性的要求。

实验报告三 免疫印迹

实验三：免疫印迹 1 原理 免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。 免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。 蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。 转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。 2 试剂与仪器 2.1 试剂（所有试剂均供两组用） 2.1.1 转移缓冲液 Tris 3.025g 甘氨酸14.413g 甲醇20mL 加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL 2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)

文献综述 免疫印迹法

免疫印迹法近年发展综述 摘要：简述了免疫印迹法的原理和方法，并对近年来的应用作了简要概括，使读者能对免疫印迹法的近年发展有一定的认识，并对其未来的发展作展望。 关键词:免疫印迹法小分子蛋白间接疫荧光法 HIV抗体糖尿病 前言：蛋白免疫印迹法自发明以来，发展迅猛，本文对其近年来的发展作了简要概述。 正文： 1原理 蛋白免疫印迹技术(Westernblot)由美国斯坦福大学的乔治·斯塔克发明，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白样品进行着色，再通过分析着色的位置和深度获得目的蛋白在样品中的表达情况信息[1-3]。蛋白免疫印迹技术集凝胶电泳、蛋白转印和免疫学标记等三部分于一体，在现代生物医学中广泛应用[4,5]。 2方法简述 该项技术通过聚丙酰胺凝胶电泳分离目的蛋白质标本，并将其转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜，聚偏二氟乙烯膜等）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的单克隆或者多克隆抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗起反应，经过底物显色检测电泳分离的特异性目的蛋白成分与含量[6-8]。 3应用 蛋白免疫印迹法自发明以来被广泛应用于现代生物学研究中的蛋白质定性和半定量分析[9]。 3.1免疫印迹法、酶联免疫法及放射免疫法对胰岛自身抗体检测的比较 采用免疫印迹法测定81例糖尿病患者胰岛自身抗体,将结果与酶联免疫法测定的GAD-A、ICA,放射免疫法测定IAA结果进行比较。结论是放射免疫法检测IAA、酶联免疫法检测ICA阳性率均高于免疫印迹法,免疫印迹法检测GAD-A阳性率则高于放射免疫法[10]。 3.2检测小分子蛋白的实验条件优化研究 探讨免疫印迹法不同参数对小分子蛋白检测效果的影响，从而优化并获得最佳实验条件。方法：比较不同转膜电压和时间、转移缓冲液甲醇含量、不同化学发光剂对小分子蛋白的检测效果。结论是选用高电压、短时间组合，选择含20%甲醇转移缓冲液和飞克级化学发光剂信号均有助于小分子蛋白免疫印迹检测[11]。

蛋白印迹实验报告

蛋白印迹实验报告 篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白 实验十二Western印迹鉴定目标蛋白 实验目的 1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法； 2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。 实验原理 Western印迹法简称蛋白质印迹法。蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位

素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。 试剂与器材 试剂 1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL； 2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中； 3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL； 洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20； 5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。 6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,

用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。高压灭菌20 分钟，室温保存。用前稀释至1x 。 7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。 器材 电泳装置一套; 2.电转移膜装置 3.抗体-酶反应摇床 操作方法 〈一〉电转移 1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。 2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。 3．剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号（2）。 4．按下图示制备“夹心饼”，打开电极板，在一边放上一块纤维垫，再依次往上叠加3-4张滤纸，将凝胶轻放于滤

免疫印迹(WB)实验操作具体步骤及详细说明

免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明 一、试剂和溶液 转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色 二、实验步骤 1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟； 2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿， 半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟； 3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带； 4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗 涤3 次； 5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h； 6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说 明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜； 7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min； 8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行 稀释）中，室温混摇2h； 9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min； 10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在

有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好； 11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝 光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干； 12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。

Western Blot蛋白免疫印迹法

3 Western blot 3.1 试剂配制 1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）： 丙烯酰胺（Acr），29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis），1g，去离子水溶解，37℃水浴助溶，定容至100mL。0.45μm滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。 2）10%十二烷基硫酸钠（SDS）： SDS，10g；H2O，80mL。68℃加热溶解，浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。 3）10%过硫酸铵（AP）： AP，1g；H2O，10mL。避光，4℃保存。（4℃2周） 4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）： Tris，18.17g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至8.8，定容至100mL，4℃保存。5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）： Tris，12.11g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存。6）电泳缓冲液（10×）： 甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O，800mL。调节pH至8.3，定容至1L，4℃保存（用时稀释为1×）。 7）5×SDS-PAGEloadingBuffer（5mL）： 1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；溴酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。充分混匀，分装成500μL/份，室温保存。使用前每份加入25μLβ-巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。 8）考马斯亮蓝染色固定液： 40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇，室温保存 9）考马斯亮蓝染色液： 考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。室温保存。 10）考马斯亮蓝染色脱色液： 醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存 11）膜转移缓冲液： 甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；加H2O 600mL充分溶解，加200mL 甲醇，混匀，定容至1L，室温保存。 12）TBS缓冲液： NaCl，8.8g；1M Tis-HCL(pH 8.0)，20ml，加入约800 H2O搅拌溶解，定容至1L，

蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)技术手册

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册 蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A 蛋白样本提取制备 1 细胞或组织裂解 2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量 4 电泳上样样品的准备 B 电泳 1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳 C 转膜与显色（Western Blot） 1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜 3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色 D 常见问题分析与解决方案 附录1 WB实验试剂配制方法 附录2 SDS-PAGE胶的配制

WB概述: 检测原理:

A 蛋白样本提取制备 蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤， 总体原则和注意事项： 1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 （通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品） 2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择） 3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略） 5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 A-1 细胞或组织裂解 A-1-1 细胞裂解 裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择* 目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒 全细胞NP-40 or RIPA（附录1）全蛋白抽提试剂盒 细胞质（可溶蛋白）Tris-HCl（附录1）胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒 线粒体蛋白提取试剂盒 细胞质（细胞骨架等不溶蛋白）Tris-Triton（附录1）蛋白分级抽提试剂盒 细胞质（磷酸化蛋白）磷酸化蛋白抽提试剂盒 细胞膜NP-40 or RIPA（附录1）膜蛋白抽提试剂盒 蛋白分级抽提试剂盒 细胞核RIPA（附录1）核蛋白抽提试剂盒 线粒体RIPA（附录1）线粒体蛋白抽提试剂盒 亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法： 1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2） 2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask). 3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中， 44℃摇动30 min 54℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力） 6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀. A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解， 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80°C， 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组 织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml). 4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本， 弃沉淀,

蛋白检测篇1-Western Blot

编号：１－１ 主题：Western Blot（蛋白质印迹法） 概述： 蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 目的： 获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 原理： 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 步骤： 1.提取组织或细胞蛋白； 2.测定蛋白质浓度；

3.电泳： 电泳条件为：恒压100V，待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止（约120min）； 4.电转膜仪转膜： 转膜条件为：恒流250mA ，2h（时间可根据目的蛋白分子量适当调整）； 5.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭1h； 6.加一抗：一抗封膜之后室温条件下摇1h然后放入4℃冰箱中过夜； 7.收一抗，PBST洗膜3次，10min/次； 8.二抗孵育： 室温孵育1h，所用二抗的比例和种属见步骤9）表格。 9.洗膜：PBST洗膜2次，PBS洗膜一次，10min/次。 10.显色 流程图：

WB免疫印迹实验常见问题全汇总

【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦 做了很久的WB（western blot ），走了很多弯路，但是WE想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。 以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。 WB常见问题分析 1. 为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？ 原因有很多： a）细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞； b）细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性； c）抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题； d）酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。 2. 我做的蛋白质分子量很小（10KDa ），请问怎么做 WB ？ a）可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可； b）也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用 Tricin e-SDS-PAGE 体系。 3. 我的目的带很弱，如何加强？ a）可以加大抗原上样量，这是最主要的； b）也可以将一抗稀释比例降低； c）还可以延长曝光时间。 4. DAB好还是ECL好？ DAB有毒，但是比较灵敏，是 HRP最敏感的底物； ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以 检测pg级抗原。 5. 胶片是一片空白，是怎么回事？ 如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a）二抗的HRP活性太强，将底物消耗光； b）ECM 底物中H2O2，不稳定，失活； c）ECL底物没覆盖到相应位置； d）一抗选择不当二抗失活； e）二抗失活。 6. 磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？

蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )

蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB ） 标签： western-blot 免疫印迹 蛋白质 蛋白质免疫印迹可应用于：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。 实验材料 蛋白质样品 试剂、试剂盒 裂解液 PBS SDS上样缓冲液 电泳缓冲液 转移缓冲液 丽春红染液 TBST TBS 洗脱抗体缓冲液 抗体 仪器、耗材 电泳仪移液器脱色摇床显影仪 实验方法原理 Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤 一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 ul。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1） 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2） 每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 ul PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）