以UPS构建的酿酒酵母表达载体及GFP的表达

以UPS构建的酿酒酵母表达载体及GFP的表达

王弘;郑文岭;杨连生;于淑娟;马文丽

【期刊名称】《华南理工大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2002(030)009

【摘要】利用通用载体质粒融合系统UPS构建出了以GFP(绿色荧光蛋白)为报告基因的酵母表达载体,经PCR、电泳、测序等手段证明了构建的准确性,同时验证了UPS的高效性及简便性.

【总页数】4页(P30-32,39)

【作者】王弘;郑文岭;杨连生;于淑娟;马文丽

【作者单位】华南理工大学,食品与生物工程学院,广东,广州,510640;广州军区,广州总医院医学实验科,广东,广州,510010;华南理工大学,食品与生物工程学院,广东,广州,510640;华南理工大学,食品与生物工程学院,广东,广州,510640;第一军医大学,分子生物研究所,广东,广州,510000

【正文语种】中文

【中图分类】Q50

【相关文献】

1.含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780的构建 [J], 邓丽;刘红;杨万年

2.一种以GFP为报告基因的酿酒酵母表达载体构建的新方法 [J], 王弘;郑文岭;马文丽;杨连生;崔东

3.真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL,pIRES2-EGFP/CD的构建和鉴定 [J], 梁兵;

袁芳;殷建瑞;谭丽华;高庆春;高聪

4.SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达 [J], 王明月;王浩;王冬梅;杨泽斌;崔梅英;刘宁;黄莉莉;关新刚

5.绿色荧光蛋白基因gfp真核表达载体pcT K GFP的构建 [J], 刘彦文;卢春彬;林勇;都同功;黄冰;陈系古

因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达

分子生物学综合实验论文题目: 绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达 中国·黄石 2010年12月 绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达 胡丽丹 （湖北师范学院生命科学院0803班湖北黄石 43500）

摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28α经过Bam H I和Not I双酶切连接后，得到pET-28α-pEGFP-N3重组质粒。取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。重组有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1 μL/mL 的卡纳霉素的LB培养基上培养。当A600达到0.7时，用终浓度为0.8 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。 关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆荧光蛋白水母 CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein Gene HU Li-Dan ( Class three Grade eight, College of Life Sciences department, Hubei Normal university ,Huangshi 435000) Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,has

been found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28αwas harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with Bam H I and Not I, the recombinant plasmid,namely pET-28α-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(Bam H I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21the competent cells. E. coLi BL-21containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 μL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h. Key words:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin 目录 1.前言： (1) 1.1绿色荧光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP） (1) 1.1.1 GFP研究背景 (1) 1.1.2 GFP研究应用 (2) 1.2基因的克隆与表达 (3)

发光细菌GFP的表达机理及应用

发光细菌GFP的表达机理及应用 发光细菌GFP是绿色荧光蛋白的简称，是由Aequorea victoria这种水母所产生 的一种蛋白质。GFP不但具有高度的应用价值，而且还是生物学研究中最有用的 分子标记之一。本文将从发光细菌GFP的表达机理、应用以及未来发展等方面进 行介绍。 一、发光细菌GFP的表达机理 GFP是一种由238个氨基酸组成的蛋白质，主要在海水深处生活的Aequorea victoria珊瑚中产生。GFP通过吸收紫外线光激发，产生荧光。GFP能在任何类型 的生物组织内发光，不会产生有害影响。除了绿色之外，GFP还能产生黄色、蓝色、紫色、红色等颜色的荧光。这些颜色的荧光由不同种类的GFP进行表达，这 些不同种类的GFP都具有不同的结构和光学特性。 GFP的结构包含一个由11肽段组成的β桶状结构和一个由α螺旋段组成的关 键性结构域。通过对这个结构域的分子工程改造，研究人员可以对GFP进行改造，使其在其他物种内表达并发光。 二、发光细菌GFP的应用 GFP已成为生物医学领域的热门研究课题。由于GFP可以与其他蛋白质相结合，并且不会对细胞造成任何影响，能够用于实现对生物系统的准确研究。GFP 可以制作成质粒，通过质粒转染等方法，将其导入到需要研究的细胞内。利用 GFP可准确观察到细胞内各种蛋白质分子的定位和表达等情况。 1、生物病理学：GFP在生物病理学领域已经有了广泛的应用。与其他标记方 法相比，GFP标记具有许多优势。第一，当有多种标记时，GFP在背景噪音中更 易于辨认；第二，直接观察细胞在活体状态下的各种功能，例如细胞的表面形态、细胞器的运动等。

2、分子生物学：GFP已经成为分子生物学中最重要的分子标记技术之一。通 过观察GFP标记蛋白分子的表达、定位和交互关系，有助于更好地理解生物化学 反应。利用GFP标记，研究人员可以更好地分离和分析蛋白质、DNA和RNA， 进一步深入研究生物化学反应。 3、神经科学：大多数神经科学家利用GFP生物标记技术，将化学物质或电压 灵敏的通道与GFP合并。这样，研究人员可以把GFP标记蛋白导入到神经元内， 以便在活体脑组织内准确观察神经元的分布、活性和连接情况。 三、未来发展 GFP目前已经被广泛应用于生物学领域，甚至在Nano杂志上被评为21世纪最有影响的技术之一。如今，基于GFP的发光分子逐渐发展成为多种发光性质的材料，例如长波红光的蛋白质，以及被激发而产生短波长荧光的GFP变体等。 在未来，发光细菌GFP有望被开发成为用于癌症治疗的药物。通过使用基于GFP的技术，研究人员可以更好地理解癌症细胞内发生的生化变化，有助于研发 更为精确的抗癌药物。 总之，发光细菌GFP是一项非常有价值的技术，在多个领域得到了广泛应用。基于GFP的研究将继续拓展我们对生物学及其学科中的分子生物学、细胞生物学 和神经科学的理解。

(完整版)所有质粒载体汇总,推荐文档

酿酒酵母表达载体 pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP, 酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF，pY15TEF，pY16TEF, 酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47, 酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109；质粒pGADT7,pGBKT7；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T，PCL1， 酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,Y187,Y190, 毕赤酵母表达载体 pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZα A,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc， 配套毕赤酵母Pichiapink, 毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115， 原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括pET系列， pET-GST，pGEX系列（含GST标签），pMAL系列 pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis系列，pQE系 列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA （分泌型表达系列）,pQBI63（原核表达带荧光）pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinPoint-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF（+）, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk 233-3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK （+）,pBlueScript SK（-）pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C, 大肠杆菌冷激质粒： pColdI pColdII pColdIII pColdTF 原核共表达质粒： pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1，pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣： pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞： DH5a JM101 JM103

通用型植物GFP标签蛋白表达载体的构建和蛋白质的细胞内定位研究

通用型植物GFP标签蛋白表达载体的构建和蛋白质的细胞内 定位研究 孟祥潮;刘国富;刘营;鲍岳;曹雪松 【摘要】目的构建通用型植物GFP标签蛋白表达载体,研究蛋白质的细胞内定位对蛋白质组学和代谢组学等研究的意义.方法构建2种GFP标签蛋白质表达载体,分别在GFP的N和C端预留克隆位点,以克隆目的基因.利用该基因克隆载体,分别克隆内切酶FokI的切割结构域与MS2噬菌体外壳蛋白MCP的串联蛋白(FokI:MCP:FokI,FMF)至GFP的N和C端,得到FMF与CFP的融合蛋白GFP:FMF和FMF:GFP,其中FMF的N端带有细胞核定位信号.利用农杆菌介导植物瞬时表达侵染本氏烟草和洋葱表皮细胞,观察GFP荧光表达情况.结果成功构建了2种融合了目的基因和GFP的表达载体pER35 GFP-FMF和pER35 FMF-GFP.激光共聚焦结果显示侵染了只含GFP载体的农杆菌的烟草细胞,可在细胞核和细胞质中检测到GFP的绿色荧光,而侵染了含核定位信号FMF:GFP和GFP:FMF 2种融合蛋白载体的农杆菌的烟草细胞,只在细胞核中观察到绿色荧光.结论该载体系统可运用于研究蛋白质在植物细胞中的亚细胞定位,具有克隆简单、高效和通用性的特点. 【期刊名称】《中国生化药物杂志》 【年(卷),期】2016(000)005 【总页数】4页(P28-31) 【关键词】亚细胞定位;植物表达载体;瞬时表达 【作者】孟祥潮;刘国富;刘营;鲍岳;曹雪松

【作者单位】聊城大学生命科学学院,山东聊城252059;聊城大学生命科学学院,山 东聊城252059;聊城大学生命科学学院,山东聊城252059;聊城大学生命科学学院, 山东聊城252059;聊城大学生命科学学院,山东聊城252059 【正文语种】中文 【中图分类】Q944 利用绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)融合目的蛋白是目前研究 蛋白质亚细胞定位、蛋白质动态变化和表达量等的有效方法。该方法不需要繁琐的样品制备过程，不受非特异性标记的影响，可在光学显微镜下直接进行观察[1]， 是监测活细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记，已被广泛用作报告基因，是进行体内蛋白质研究的重要实验方法[2-6]。GFP在蓝光激发下发出绿色荧光， 可以与目标蛋白融合，作为荧光标记分子，特异性地观察蛋白质的亚细胞定位[7]。GFP能在蛋白质的N端或C端融合而保持其天然蛋白的特性，而且灵敏度高、对活细胞无毒害作用。GFP 在光照下是稳定的，各种光照都不会引起其变性，即使 与其他蛋白质融合后，也能利用荧光显微镜很方便地检测，所以应用广泛[8]。GFP蛋白经激光扫描共聚焦显微镜激光照射后，可产生一种绿色荧光，从而对蛋 白质进行精确定位。本实验旨在构建pER35GFP.1和pER35GFP.2系列表达载体，并将FMF融合蛋白构建入载体，对烟草叶片进行农杆菌侵染转化，再通过观察叶片中GFP的表达得到研究蛋白的定位情况。FMF融合蛋白中的FokI核酸酶和MCP(MS2噬菌体衣壳蛋白)[9]在天然状态下是不进入细胞核的，在融合蛋白FMF 两端加上核定位信号可观察FMF融合蛋白进入细胞核情况，从而验证本系统的有效性。 1.1 材料 1.1.1 试验植物、质粒和菌株:本式烟草(Nicotiana benthamiana)、质粒pER350

gfp表达质粒的构建实验报告

gfp表达质粒的构建实验报告 1.实验目的 本实验旨在构建含有绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒，以便在细胞中实现GFP的高效表达，为后续的生物荧光成像等应用提供支持。 2.实验原理 质粒是一种小型、自主复制的DNA分子，可与细菌染色体DNA分离。质粒上有多个限制性酶切位点，可用于插入外源基因。通过将目的基因插入质粒，并导入受体细胞，可以实现目的基因的表达。本实验将使用含有GFP基因的质粒，将其导入大肠杆菌细胞中，使其表达出绿色荧光蛋白。 3.实验材料 3.1仪器设备：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、恒温水浴锅。 3.2试剂：质粒提取试剂盒、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶Ⅰ、dNTPs、电泳缓冲液、琼脂糖凝胶。 3.3细胞系：大肠杆菌细胞。 4.实验步骤 4.1获取含有GFP基因的质粒：从公共数据库中获取含有GFP基因的质粒序列，并通过PCR扩增获得大量质粒。 4.2酶切质粒：使用限制性核酸内切酶对质粒进行酶切，获得含有GFP基因的片段。 4.3连接质粒：将酶切后的质粒片段与连接酶的作用下，将其连

接至具有相同黏性末端的大肠杆菌质粒上。 4.4转化大肠杆菌：将连接后的质粒转化至大肠杆菌细胞中，通过抗生素筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。 4.5验证重组质粒：通过PCR和DNA测序等方法验证重组质粒是否正确插入目的基因。 5.实验结果 通过本实验，我们成功构建了含有GFP基因的重组质粒，并成功导入大肠杆菌细胞中。通过荧光显微镜观察，发现大肠杆菌细胞发出绿色荧光，表明目的基因已正确表达。 6.结果分析 通过本实验结果，我们可以得出以下结论：首先，本实验成功构建了含有GFP基因的重组质粒；其次，通过荧光显微镜观察到目的基因已在大肠杆菌细胞中表达出绿色荧光蛋白；最后，本实验为后续的生物荧光成像等应用提供了支持。 7.结论 本实验成功构建了含有GFP基因的重组质粒，并在大肠杆菌细胞中实现了目的基因的高效表达。该实验结果为后续的生物荧光成像等应用提供了有力支持，具有重要价值。同时，本实验也为其他类似基因的表达提供了参考方法。

待测蛋白与gfp蛋白的融合表达

待测蛋白与gfp蛋白的融合表达 待测蛋白与GFP蛋白的融合表达是一项常用的实验技术，可以用来研究蛋白的亚细胞定位、功能性研究以及蛋白的相互作用等。在本文中，我将以一步一步的方式解释待测蛋白与GFP蛋白的融合表达的过程和原理。 第一步：选择适合的表达载体 在进行待测蛋白与GFP蛋白的融合表达之前，首先需要选择合适的表达载体。常见的表达载体包括质粒和病毒载体。质粒通常用于体内表达，病毒载体则可以用于体内或体外表达。选择表达载体时，需要考虑载体的大小、复制起源、选择标记等因素。在此过程中，一个常用的表达载体是pEGFP-C1，它兼具了高效的GFP蛋白表达和稳定性。 第二步：将待测蛋白与GFP基因连接 在将待测蛋白与GFP蛋白融合表达之前，需要将待测蛋白基因与GFP基因连接。连接的方法有多种，常见的方法包括PCR扩增和限制性内切酶消化连接。PCR扩增可以利用引物特异性扩增待测蛋白基因和GFP基因的DNA片段，然后通过连接酶将两个PCR产物连接在一起。限制性内切酶消化连接则需要选择适合的限制性内切酶将待测蛋白基因和GFP基因进行消化，然后通过DNA连接酶将两个消化片段连接在一起。 第三步：转染细胞或注射 在融合表达载体构建完成后，下一步是将表达载体导入到细胞中。有两种

常见的方法可以实现这一步骤：细胞转染和动物体内注射。细胞转染可以通过化学法、电穿孔法或基因枪等技术将表达载体导入到细胞中。动物体内注射则可以将表达载体注射到实验动物体内，使表达载体进入目标组织或器官。 第四步：蛋白表达检测 一旦表达载体成功转染或注射到细胞或动物体内，下一步是检测蛋白的表达情况。常见的方法包括免疫荧光染色、免疫组织化学、Western blot 等。免疫荧光染色可以使用抗GFP抗体或待测蛋白特异性抗体与GFP融合蛋白结合，并通过荧光显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位。免疫组织化学可以利用特异性抗体与融合蛋白结合，并使用组织化学染色技术观察蛋白的分布情况。Western blot可以通过抗体识别蛋白的特异性条带来检测融合蛋白的表达水平。 第五步：功能性研究和蛋白相互作用 一旦确定了待测蛋白与GFP蛋白的融合表达，接下来可以利用这个蛋白融合体来进行功能性研究和蛋白相互作用的研究。通过观察融合蛋白的亚细胞定位和分布情况，可以推测蛋白在细胞中的功能和对特定环境的响应。此外，可以利用融合蛋白来研究蛋白的相互作用，如蛋白与DNA、蛋白与蛋白之间的相互作用，可以通过共免疫沉淀、酵母双杂交和蛋白亲和层析等技术来研究。

备考2024年高考生物一轮复习知识点精炼专题36 发酵技术与发酵工程的应用(精练)含详解

发酵技术与发酵工程的应用 1、（2022·湖北·统考高考真题）关于白酒、啤酒和果酒的生产，下列叙述错误的是（） A．在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气 B．白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程 C．葡萄糖转化为乙醇所需的酶既存在于细胞质基质，也存在于线粒体 D．生产白酒、啤酒和果酒的原材料不同，但发酵过程中起主要作用的都是酵母菌 2、（2021·湖北·统考高考真题）中国的许多传统美食制作过程蕴含了生物发酵技术。下列叙述正确的是（）A．泡菜制作过程中，酵母菌将葡萄糖分解成乳酸 B．馒头制作过程中，酵母菌进行呼吸作用产生CO2 C．米酒制作过程中，将容器密封可以促进酵母菌生长 D．酸奶制作过程中，后期低温处理可产生大量乳酸杆菌 3、（2023·山东菏泽·山东省鄄城县第一中学校考三模）葡萄酒开启后，敞口时间稍长或将余酒倒回酒瓶中，贮存温度在30℃左右，葡萄酒会缓慢“变成”葡萄醋。下列相关叙述错误的是（） A．酿造葡萄酒和葡萄醋所利用微生物的主要区别是有无以核膜为界限的细胞核 B．酿造葡萄酒和葡萄醋所利用的微生物都能通过线粒体进行有氧呼吸 C．把葡萄酒缓慢“变成”葡萄醋的微生物可能来自空气 D．葡萄酒变成了葡萄醋是因为乙醇在醋酸菌的作用下生成了醋酸 4、（2023·山东·统考模拟预测）利用微生物发酵可以生产很多产品，下列关于发酵工程的叙述正确的是（）A．利用醋酸菌发酵生产果醋需提供充足的无菌空气 B．利用酵母菌发酵产生的赤霉素可以降低啤酒的生产成本 C．腌制泡菜时，要将材料装满泡菜坛，以提供无氧环境 D．利用传统发酵技术制作果酒、果醋和泡菜时需要人工接种菌种 5、（2023·山东潍坊·潍坊一中统考模拟预测）传统的啤酒发酵流程为：定型麦汁(适宜的发酵液)→添加酵母→前发酵(有氧条件)→主发酵(分为高泡期、低泡期)→后发酵→贮酒等阶段。下列说法错误的是（） A．定型麦汁前大麦种子需要发芽与糖化处理 B．加大酵母菌菌种的接种量可缩短发酵时间 C．前发酵期葡萄糖的消耗速率大于高泡期 D．在高泡期酵母菌进行无氧呼吸产生酒精 6、（2023·山东·高考真题）（多选题）果酒的家庭制作与啤酒的工业化生产相比，共同点有（） A．都利用了酵母菌无氧呼吸产生酒精的原理B．都需要一定的有氧环境供发酵菌种繁殖 C．发酵前都需要对原料进行灭菌D．发酵结束后都必须进行消毒以延长保存期 7、（2022·辽宁·统考高考真题）（多选题）β-苯乙醇是赋予白酒特征风味的物质。从某酒厂采集并筛选到一株产β-苯乙醇的酵母菌应用于白酒生产。下列叙述正确的是（） A．所用培养基及接种工具分别采用湿热灭菌和灼烧灭菌 B．通过配制培养基、灭菌、分离和培养能获得该酵母菌 C．还需进行发酵实验检测该酵母菌产β-苯乙醇的能力 D．该酵母菌的应用有利于白酒新产品的开发

来源于胞曲霉的α-1,2-甘露糖苷酶在酿酒酵母△alg3△och1△mnn1菌株中的定位表达

来源于胞曲霉的α-1,2-甘露糖苷酶在酿酒酵母 △alg3△och1△mnn1菌株中的定位表达 董宁远;张阁元;徐沙;高晓冬 【摘要】利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产医药糖蛋白,必须对其N-糖基化途径进行人源化改造.在敲除酿酒酵母W303A特异性糖基化基因ALG3、OCH1和MNN1后,表达来源于胞曲霉(Aspergillus saitoi)的α-1,2-甘露糖苷酶(MsdSp)进一步改造酿酒酵母N-糖链.通过在MsdSp的C-端添加内质网滞留信号(HDEL)和构建高尔基体滞留信号Kre2p与MsdSp的嵌合体蛋白实现MsdSp在内质网和高尔基体中的定位表达.结果表明,各突变株中均检测到Man3GlcNAc2和Man4 GlcNAc2型N-糖链,并且在强启动子酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)控制下,内质网定位表达MsdSp的菌株KM201中,Man3 GlcNAc2和Man4GlcNAc2型N-糖链含量较多.该研究为酿酒酵母N-聚糖进一步人源化改造提供依据. 【期刊名称】《食品与发酵工业》 【年(卷),期】2016(042)006 【总页数】6页(P1-6) 【关键词】酿酒酵母;人源化;N-糖链结构;细胞定位 【作者】董宁远;张阁元;徐沙;高晓冬 【作者单位】江南大学生物工程学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏

无锡,214122;江南大学生物工程学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡,214122;江南大学生物工程学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡,214122 【正文语种】中文 N-糖基化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式[1]，糖链对蛋白质的生物活性、稳 定性，分子间的相互识别，特定的免疫反应以及糖蛋白药物的半衰期等方面都有重要的影响[2-3]。目前已有多种糖蛋白药物被批准用于治疗人类疾病[4]。迄今为止，生产医药糖蛋白的主要途径是哺乳动物细胞培养(如中国仓鼠卵巢细胞系CHO、人类胚胎肾细胞HEK等)。哺乳动物细胞株的优势在于其重组蛋白的糖基化形式为复合型、杂合型，与人类相似。但是，基因操作复杂、外源基因不能精确定位、生产成本高等问题限制了哺乳动物表达体系的应用和发展[5]。近年来，研究人员开始 尝试在酵母等微生物中表达医药糖蛋白。 酿酒酵母和高等哺乳动物细胞内质网中的N-糖基化过程具有高度保守性[6-7]。二者均是先组装一个多萜醇寡糖前体(Dol-PP-Glc3Man9GlcNAc2)，然后在寡糖基 转移酶(OST)的催化下，将糖链从前体上转移至新生肽链的天冬酰胺(Asn)残基上(N-糖基化位点序列Asn-X-Ser/Thr)。随后，N-糖链被葡萄糖苷酶(Glucosidase)和α-1,2-甘露糖苷酶(α-1,2-mannosidase，MnsI)特异性识别，切去3个葡萄糖和1个甘露糖形成Man8GlcNAc2型N-糖链。进入高尔基体后，酿酒酵母和高等哺乳动物细胞的N-糖基化出现差异。在哺乳动物细胞高尔基体中一系列甘露糖苷 酶的作用下，切去5个甘露糖，形成Man3GlcNAc2糖链，再依次在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnTI)、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II(GnTII)、半乳糖基转移酶(GalT)及唾液酸转移酶(SiaT)的作用下，添加若干N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖和唾液酸，形成复合型或杂合型N-糖链[8]。然而，在酿酒酵母高尔基体中，

拟南芥WRI1转录因子对酿酒酵母脂肪酸合成的影响

拟南芥WRI1转录因子对酿酒酵母脂肪酸合成的影响 闵文莉;曹喜涛;季更生;屠洁;李强;陈欣;张国政;武国华 【摘要】转录因子是植物体内一类应答环境胁迫所产生的蛋白,通过激活或抑制转录的方式发挥调控作用.WRI1转录因子是油脂合成的关键因子,主要在脂肪酸合成与糖酵解后期发挥调控作用.为了获得高产脂肪酸的酵母菌株,以拟南芥cD-NA为模板,PCR扩增得到编码拟南芥WRI1转录因子的基因,经过Spe I/BamH I双酶切后连接到表达载体上,得到重组质粒p416-Atwri1.将重组质粒用PEG/LiAc化学转化法转入酿酒酵母BY4742中,通过营养缺陷型培养基进行筛选,挑取阳性菌落并进行摇瓶发酵,采用GC-MS对脂肪酸进行定性和定量分析.结果表明,Atwri1基因在酵母中的表达改变了脂肪酸的组成及含量,与空质粒酵母相比,重组酵母中长链脂肪酸的总含量增加了44.8％,为以后酿酒酵母生产脂肪酸实现工业化打下基础. 【期刊名称】《江苏科技大学学报（自然科学版）》 【年(卷),期】2018(032)006 【总页数】5页(P873-877) 【关键词】拟南芥;WRI1转录因子;酿酒酵母;脂肪酸 【作者】闵文莉;曹喜涛;季更生;屠洁;李强;陈欣;张国政;武国华 【作者单位】江苏科技大学生物技术学院,镇江212018;江苏科技大学生物技术学院,镇江212018;中国农业科学院蚕业研究所,镇江212018;江苏科技大学生物技术学院,镇江212018;中国农业科学院蚕业研究所,镇江212018;江苏科技大学生物技术学院,镇江212018;中国农业科学院蚕业研究所,镇江212018;江苏科技大学生物技术学院,镇江212018;中国农业科学院蚕业研究所,镇江212018;江苏科技大学生

白色假丝酵母菌pACT1-GFP质粒的构建及表达

白色假丝酵母菌pACT1-GFP质粒的构建及表达目的构建能够稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的白色假丝酵母菌菌株， 以便对目的基因进行示踪。方法构建pACT1-GFP质粒，以白色假丝酵母菌CAI4菌株作为感受态进行转化培养后，分别观察绿色荧光蛋白在两相型下的表达情况。结果含有pACT1-GFP的白色假丝酵母菌菌株，99%在两相型下均有较高水平的荧光蛋白表达，且荧光强度没有明显差别。结论pACT1-GFP能够在白色假丝酵母菌体内稳定表达。 标签：白色假丝酵母菌；绿色荧光蛋白；质粒 The construction and expression of Saccharomyces albicans pACT1-GFP plasmids Sun Jing, Jia Fen, Xia Ming-hui, Qian Hua, Dong Hongnan, Qi Qingguo. （School of Stomatology of Shandong University, Key Laboratory of Oral Biomedicine of Shandong Province, Jinan 250012, China） [Abstract] Objective To construct strains containing green fluorescent protein （GFP）to study gene regulation in Saccharomyces albicans cells during the infection process. Methods pACT1-GFP was constructed, and Saccharomyces albicans CAI4 was transformed. The expression of GFP in yeast and hyphal compartments was observed with micros-copy. Results 99% of Saccharomyces albicans cells containing pACT1-GFP fusion displayed significant fluorescence levels both in the yeast and hyphal compartments. The fluorescence intensity in two compartments had no obvious dif-ference. Conclusion pACT1-GFP can be expressed stably in the yeast cells. [Key words] Saccharomyces albicans；green fluorescent protein；plasmid 白色假丝酵母菌（Saccharomyces albicans）是口腔正常微生物群的组分之一，也是口腔中重要的条件致病真菌[1]，在特定条件下能够引起体表以及深部组织器官的感染，特别是免疫缺陷患者，可引发致命性的真菌感染。白色假丝酵母菌的致病性主要与细胞外酶、分泌型天冬氨酸蛋白酶、黏附因子、两相型态、毒素、细胞表面成分等毒力因子有关，这些因素在白色假丝酵母菌的定植、感染及疾病的发生发展过程中发挥相应的作用，但各毒力因素何时发挥作用及其具体的生理功能尚未完全确定。本实验的目的是构建能够稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent pro-tein，GFP）的白色假丝酵母菌株，以便对目的基因进行示踪，观察其在白色假丝酵母菌感染过程中个体菌细胞内基因表达情况，为研究毒力因子在菌株定植、感染及疾病发展过程中的基因表达调控特征及生理功能奠定基础。 1 材料和方法 1.1 主要试剂 硫酸盐腺嘌呤（adenine hemisulfate）、5-氟乳清酸（5-fluororotic acid，5-FOA）、酵母合成培养基补料（Yeast synthetic drop-out medium）、乙酸锂LiAC·2H2O、聚乙二醇PEG3350、鲑精DNASalmon sperm DNA（Sigma公司，美国），限制性内切酶SalⅠ、MluⅠ、Hind Ⅲ、NheⅠ、PstⅠ、StuⅠ及T4 DNA Ligase （Fer-mentas公司，加拿大）。 1.2 菌株及培养条件 白色假丝酵母菌CAI4（ura3::λimm434/ura3::λi-

酿酒酵母中与钙离子稳态调控因子 ScRCH1细胞质膜定位相关的转录因子基因的筛选检测

酿酒酵母中与钙离子稳态调控因子 ScRCH1细胞质膜定位相 关的转录因子基因的筛选检测 杜敬彩;曹春蕾;赵刚;赵运英;蒋伶活 【摘要】Gene of ymr034c in Saccharomyces cerevisiae is homologous to the gene of Carch1 in Candida albicans gene,CaRCH1 and C. albicans were related to calcium ion,lithium ion,and nidazoles resistance. Therefore,it was named ymr034c as Scrch1. The earlier study showed that ScRCH1 localizes at plasma membrane under the coercion of high levels of extracellular calcium ion. In order to study on regulation mechanism of the expression of Scrch1 gene, single-gene deletion mutants for 223 of coding transcription factor in S. cerevisiae was screened through fluorescent mi-croscopy. The results showed that after calcium ion treatment,five deletion transcription genes of ngg1,hal9,crz1, ada2,and swi6,caused ScRCH1-GFP fail to localize at the plasma membrane. In addition,the deletion of ino2 gene led ScRCH1-GFP localized to the plasma membrane under the conditions even without the treatment of calcium ion.%酿酒酵母细胞中ymr034c 基因与白念珠菌的 Carch1基因同源，CaRCH1与白念珠菌对钙离子、锂离子和硝唑类药物的耐受性相关。因此，把 ymr034c 命名为 Scrch1。前期研究结果显示，在胞外高钙离子胁迫条件下，ScRCH1定位于细胞质膜上。为了研究 Scrch1基因表达的调控机理，通过荧光显微镜技术对酵母细胞基因组中编码转录因子的223个单基因缺失菌株进行了筛选，分别检测了 ScRCH1-GFP 融合蛋白在它们中的亚细胞定位情况。结果发现，钙离子处理后，ngg1、hal9、crz1、ada2和 swi6五个转录因子基因的缺失造成ScRCH1-GFP 没有细胞质膜定位，而

米曲霉(Aspergillus oryzae)黄酒小曲4转化体系的构建及脂肪酶的异源表达

米曲霉(Aspergillus oryzae)黄酒小曲4转化体系的构建及 脂肪酶的异源表达 李童;李燕萍 【摘要】以米曲霉(Aspergillus oryzae)H 4为研究对象,初步探究了其对潮霉素的敏感度及原生质体的制备时间.在0.1 mmol·L-1氯丙嗪和150μg·mL-1潮霉素B 共同存在的条件下,H4的生长被完全抑制;在酶解时间为3.5 h时,H4的原生质体有最佳的再生率33％.成功构建了重组表达载体pUC18-hygB-LIP并转化至米曲霉H4中.在液态发酵条件下,脂肪酶活力最高的转化子的酶活力比出发菌株H4高10.16 U·mL-1. 【期刊名称】《南昌大学学报（理科版）》 【年(卷),期】2019(043)003 【总页数】6页(P246-250,256) 【关键词】米曲霉;异源表达;液态发酵;脂肪酶 【作者】李童;李燕萍 【作者单位】南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西,南昌 330006;南昌大学中德联合研究院,江西,南昌 330006;南昌大学食品学院,江西,南昌 330006;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西,南昌 330006;南昌大学中德联合研究院,江西,南昌 330006;南昌大学食品学院,江西,南昌 330006 【正文语种】中文 【中图分类】Q815

米曲霉(Aspergillus oryzae)是传统酿造食品的核心菌株，拥有良好的发酵性能。 在发酵过程中，米曲霉分泌大量水解酶类[1,2]作用于发酵底物，产生的各种小分 子物质[3]是发酵食品的风味来源。由于米曲霉的黄曲霉毒素生物合成基因簇的同 系物在有利的条件下也不表达，被美国食品药物管理局(FDA)列为公认安全级(GRAS)菌株[4]，进一步促进了其在工业上的应用。 系统生物学领域的突破和代谢工程技术的发展，为米曲霉的开发利用提供了更广阔的前景，被广泛用于外源蛋白的表达。游离的二十碳三烯酸(DGLA)及其去饱和形 式的游离花生四烯酸(ARA)是生产类花生酸药物的有效原料，Tamano等人[5]在 米曲霉中表达了高山被孢霉合成DGLA的基因，其不饱和脂肪酸的产率比野生型 提高了9.2倍。Fumiyoshi等人[6]在米曲霉中分泌表达了特异性结合表皮生长因 子受体(EGFR)的美洲驼可变重链抗体片段(VHH)。将VHH与Taka-淀粉酶信号肽进行融合表达，得到具有免疫活性且亲和力高的抗EGFR VHH，产量达到73.8 mg·L-1。 药物抗性标记的特点是可在株型未知的情况下直接使用，目前已经发现可供米曲霉转化的药物抗性标记基因有潮霉素B抗性基因hygB[7]、吡啶硫胺素抗性基因 ptrA[8]、博来霉素抗性基因ble等。多数米曲霉菌株对抗生素敏感性较差，限制 了药物抗性标记在米曲霉转化系统中的应用，Suzuki等[9]通过添加钙调蛋白拮抗剂氯丙嗪的方法提高了米曲霉对博来霉素的敏感性，该方法也可应用于其他抗性标记基因。Sun等人[10]建立了以根癌农杆菌介导的双选择标记系统，该系统结合了尿嘧啶营养缺陷型和吡啶硫胺抗性，并成功在米曲霉3.042中使用。 脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3)又称三酰基甘油酰基水解酶，属α/β型水解酶超家族成员。脂肪酶具有特殊的催化活性，在水相及非水相中有不同的催化作用。在自然界中，脂肪酶的来源十分广泛，其中微生物脂肪酶具有更佳的底物专一性和稳定性，

构建酿酒酵母细胞工厂生产番茄红素

构建酿酒酵母细胞工厂生产番茄红素 为构建高效生产番茄红素的酿酒酵母细胞工厂，本研究首先在酿酒酵母中引入番茄红素生物合成途径基因CrtB和CrtI，获得能生产0.17 mg·L-1番茄红素的初始工程菌ZD-L-000。在此基础上，在工程菌ZD-L-000中分别过表达MV A途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、萜类合成调控的转录因子编码基因upc2.1、二萜生物合成的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶与法呢基焦磷酸合酶编码基因BTS1-ERG20，以及来自嗜酸热硫化叶菌的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因SaGGPS，考察这些基因过表达对番茄红素合成的影响，结果发现过表达upc2.1基因未能提高番茄红素的产量，但过表达tHMG1、BTS1-EGR20和SaGGPS基因均能显著提高番茄红素的产量，分别为初始菌株的2.0，16.9和20.5倍。在进一步研究中，tHMG1、BTS1-EGR20和SaGGPS等有效基因被一同整合入工程菌ZD-L-000，获得的高产菌株ZD-L-201中番茄红素的产量提高77.0倍，达到13.23 mg·L-1；在高密度-两相发酵体系中工程菌ZD-L-201的番茄红素产量能进一步提高到135.21 mg·L-1 （提高10.2倍）。本研究获得的工程菌为微生物发酵法生产番茄红素提供了基础。 标签：番茄红素；酿酒酵母；合成生物学；甲羟戊酸途径 番茄红素（Lycopene）是一种抗氧化活性很强的功能性天然色素，在癌症预防，抗衰老和增强机体免疫力等方面有广泛应用，市场巨大[1]。目前主要在番茄中直接提取，或利用三孢布拉氏霉菌Blakeslea trispora、欧文氏菌Erwinia uredovora和成团泛菌Pantoea agglomerans等野生微生物来发酵生产番茄红素[1]。然而直接提取法存在的资源依赖和环境破坏，野生微生物菌种性能差、产量低、难以工业化生产等问题影响番茄红素的生产[2]。通过发掘目标化合物生物合成途径的关键基因，利用合成生物学技术，设计和改造微生物菌株来生产天然产物被认为是一种最有潜力的资源获取方法[3-5]。 自然界中萜类基本单元异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）生物合成途径有两条：在真菌和植物细胞胞液/内质网上，由乙酰CoA经甲羟戊酸（MV A）途径合成；在细菌与植物质体中由丙酮酸与3-磷酸甘油醛经2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途径合成[3，6]。在番茄红素生物合成途径中，IPP和DMAPP这两个萜类单元能被法呢烯焦磷酸合酶（FPS）和牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPS）依次催化得到二萜类的通用前体牻牛儿基焦磷酸（GGPP）；GGPP能继续被八氢番茄红素合成酶（CrtB基因编码）和八氢番茄红素去饱和酶（CrtI基因编码）催化形成番茄红素（图1）[7，8]。安全模式微生物酿酒酵母中存在高效合成萜类的MV A途径，在前人的研究中，酿酒酵母已被成功改造为生产青蒿酸[5，9]、丹参酮[10-11]和人参皂苷[12-13]等多种药用萜类化合物的工程菌，利用酿酒酵母作为底盘菌构建生产番茄红素细胞工厂具有很大潜力。 前期研究中，Yamano等将欧文氏菌的番茄红素合成基因引入到酿酒酵母中获得了产量为113 μg·g-1细胞干重的番茄红素工程菌[8]。为进一步获得高产番茄

2022-2023学年山东省名校联盟高二3月质量检测联合调考生物试题B卷

2022-2023学年山东省名校联盟高二3月质量检测联合调考生物试题B卷 1.桑葚与草莓营养价值极高，口味调和。草莓中含量较高的维生素C有助于延缓桑葚天然 色素的氧化；桑葚独有的花青素、白藜芦醇等物质能显著增强复合果酒的功效。下图为桑葚草莓复合果酒的工厂化制备流程，下列说法错误的是（） 桑葚和草莓原料的挑选和清洗→混合搅拌→添加偏重亚硫酸钾→榨汁→调糖和调酸→灭菌桑葚与草莓接种发酵 A．在生产复合果酒的过程中，要防止桑葚天然色素被氧化 B．果酒发酵初期通入氧气能促进酵母菌繁殖，有利于加快果酒发酵 C．复合果酒的制备过程中对发酵设备要进行灭菌处理 D．变酸的果酒表面会形成一层菌膜，这层菌膜是由乳酸菌形成的 2.《尚书·说命》中的“若作酒醴，尔惟魏冀”提到酿酒必须要用酒曲。酒曲是以谷物为原料， 破碎加水压制而成的，富含多种微生物，经水浸泡后投入蒸熟的米即可用于酿酒。下列相关叙述正确的是（） A．酒曲中富含乳酸菌等多种微生物，可将糖彻底氧化分解成酒精 B．将米蒸熟起到杀菌的作用，待冷却至室温后再加入酒曲进行发酵 C．将酒曲与蒸熟的米混合后置于空气流通的环境中，以缩短发酵时间 D．酿酒过程中，发酵液中会有气泡产生，可打开发酵罐的盖子放气 3. 2023年1月，3头利用体细胞克隆技术培育高产长寿奶牛陆续出生，这是我国首次采用克 隆技术对现存群体中终生产奶量高于100吨的优良荷斯坦奶牛进行种质复原保存及良种繁育，技术流程如图所示。下列说法正确的是（） A．供体细胞一般选择优良动物的胚胎干细胞 B．将采集的卵母细胞通过显微操作去核后才能进行核移植 C．重构胚一般要培养到囊胚期或原肠胚期才适合进行移植 D．克隆牛属无性繁殖，犊牛的遗传物质都来自供体细胞 4.我国科学家构建了一株嗜盐单胞菌H，该菌能以甘蔗榨糖后的废弃液为原料，在实验室 发酵条件下发酵产生PHA等新型高附加值的可降解材料，其工艺流程如图所示。下列说法正确的是（）