化学发光免疫分析方法的研究及应用

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摘要：本文根据各化学发光免疫分析方法所使用标记物质的不同，将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法，并对各方法经典标记物质及分析方法原理进行了分析。同时，介绍了化学发光免疫分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用进展情况。

关键词：化学发光免疫分析；分类；研究进展

化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析［1］。

化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的［2］。

一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。

1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。

2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析

吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。（二）化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强

度。此传统的化学发光体系（HRP－H2O2－lumi-nol）为几秒内瞬时闪光，存在发光强度低、不易测量等缺点。后来，在发光系统中加入增强发光剂，以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。碱性磷酸酶（ALP）已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。

碱性磷酸酶和1，2－二氧环己烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的化学发光体系。这类体系中具有代表性的是Bronstein 等提出的ALP－AMPPD 发光体系。AMPPD 为1，2－二氧环己烷衍生物，它是一种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点是反应速度快，在很短时间内提供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要部分，一个是联接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸根基团，它维持着整个分子结构的稳定。（三）电化学发光免疫分析方法电化学发光是指由电化学反应引起的化学发光过程。Leland［3］

等已对三联吡啶钌体系的电化学发光机理进行了深入的研究。电化学发光的反应在电极表面进行，发光底物为三联吡啶钌［Ru （b p y）32+］，三丙胺（TPA）用来激发光反应。在阳极表面，两种物质同时失去电子。在电极板上Ru （bpy）32+被氧化成Ru （b p y）33+，TPA也被氧化成阳离子自由基（TPA+ *），TPA+ *自发地释放一个质子而变成非稳定分子（TPA*），将一个电子递给Ru （bpy）33+，形成激发态的Ru （bpy）32+*。Ru （bpy）32+*在衰减的同时发射一个波长为620 nm 的光子，重新回到基态Ru （bpy）32+。这一过程在电极表面反复进行，产生高效、稳定的连续发光，并不断增强。二、化学发光免疫分析方法的应用自1977 年Halman 等［4］创立化学发光免疫分析方法以来，免疫化学分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用取得了很大的进展。（一）医学检测肺结核病常以人体血清中CA125 含量为疾病标记物，上海交通大学Wang 等［5］建立了CA125 的毛细管化学发光免疫分析方法，以实现对肺结核病的检测。其方法的线性检测范围为2.5×10－11～1.0×10－9mol/L，检测限（S/N=3）为1.0×10－12mol/L，且标样的添加回收率为93％～109％。甲胎蛋白（AFP）为肿瘤疾病标志物，Yang等［6］利用链霉素化毛细管柱，建立了AFP 的化学发光免疫分析方法。该方法的最低检测限为0.1ng/mL，线性检测范围为0.5～200 ng/mL。研究结果表明该方法具有结构简单、更好的实用性及较宽的线性范围等优点。Zhang等［7］利用磁性微粒子和包被小管建立了AFP 的化学发光酶免疫分析方法。

在该方法中，AFP抗体首先包被于两种不同的固相载体上，如磁性微粒子和包被小管。再分别对这两种包被模式建立的化学发光免疫分析方法进行比较，通过再抗体包被浓度、标记于抗体上HRP 的稀释比例，分析所需时间，化学发光动力学等角度进行衡量，显示磁性微粒子具有较大的优势。Zhan 等［8］建立了 C 反应蛋白的电化学发光免疫分析方法。首先用生物素标记含有Ru （bpy）32+的脂质体后与亲和素反应，再与生物素化的C 反应蛋白抗体结合得到抗体包被的脂质体，同时亲和素包被的磁性微粒子与生物素化的抗体反应，得到抗体包被的磁性微粒子。两种抗体与 C 反应蛋白结合，构成双亲和素桥联的、磁性微粒子为固相分离剂的反应模式。

通过溶解脂质体释放出Ru （bpy）32+测定其强度进行测定。该方法的最低检测限为100ng/mL，检测范围为100ng/mL～10μg/mL。Knight 等［9］采用化学发光免疫夹心分析方法对梅毒病毒进行检测，并与传统的分析方法快速血浆素反应（RPR）和酶免疫分析方法（ELISA）进行比较，通过对多种样品进行检测，并与RPR 及ELISA分析方法结果有99.1％的正确率。茶碱是一种磷酸二酯酶（PDE）抑制剂，用于呼吸系统疾病的治疗。

Zhou等［10］建立了茶碱的化学发光免疫分析方法，该方法的最低检测限为0.51mg/L，线性范围为0.51～40mg/L，板内及板间变异系数分别为3.20％和3.57％。通过与FPIA 结果对30 例茶碱浓度进行比较，其相关系数为0.993。Peter 等［11］通过合

成生物素睾酮标记物建立了睾酮的化学发光免疫分析方法，该方法的检测范围为0.2～20.0 nmol/L，最低检测限为0.125 nmol/L，板间方法的精密度为13％～16％，通过质谱仪器确证其方法的回收率为95％，显示了方法良好的灵敏度和准确率。Mirasoli等［12］建立了唾液中皮质醇的固相竞争化学免疫分析方法。通过人工重组的发光蛋白标记皮质醇而建立的免疫分析方法检测限为3nmol/L，线性检测范围为10～1 000 nmol/L。其他关于这方面报道还有Perschel 等［13］通过化学发光免疫分析对原发性醛固酮过多症（PHA）进行快速筛选，Tudorache等［14］利用磁颗粒免疫支持液膜方法（m-ISLMA）检测唾液中的孕酮含量，Iwata 等［15］利用双夹心化学发光免疫分析方法测定血浆中内皮素－1的含量等。关于这方面的应用，化学发光免疫分析方法应用的最为广泛，正是在医学检测方面大量成功的应用，带动了化学发光免疫分析方法在其他学科方面的普及。

（二）食品安全检测Quan 等［16］建立了食品中伏马菌素B1 的化学发光酶免疫分析方法，经方法优化后其线性检测范围为0.14～0.9μg/L，方法的灵敏度（IC50）为0.32 μg/L，方法的最低检测限（IC10）为0.09 μg/L，与伏马菌素B1 的ELISA 方法相比，其方法灵敏度提高了10 倍。且通过样品的添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA 分析方法与HPLC 方法有良好的相关性。

Yang等［17］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化学发光免疫分析方法，通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面，然后将抗体－碳纳米管固定在聚碳酸酯表面，再通过增强化学发光免疫法测定SEB 含量。牛奶、苹果汁和婴儿食品中的SEB 最低检测限为0.01 ng/mL，而ELISA 的最低检测限为1 ng/mL。Lin 等［18］人建立了食品中氯霉素的化学发光免疫分析方法，其方法灵敏度（0.05 ng/mL）、精密度、特异性及准确度等指标均与ELISA 分析方法类似。10个样品的板内和板间变异系数分别小于8％和20％，且样品的添加回收率在87％～100％。

四川大学华西医学院杨秀岑等人［19］建立了食品中沙门氏菌的化学发光免疫分析方法。该方法选用聚氯乙烯平片作为载体固定细菌，再与一抗及HRP 标记二抗温育，以化学发光免疫法测定食品中沙门氏菌。利用该方法对62 份食品样品进行检测，以P/N≥3作为阳性标准，符合率为85.5％。Magliulo 等［20］建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。该方法的最低检测限为1 pg/mL，且板间板内数据的变异系数均低于9％，回收率在96％～122％之间。Lin 等［21］建立了农产品中黄曲霉毒素B1 的化学发光免疫分析方法。该方法线性检测范围在0.05～10 ng/g 之间，检测灵敏度为0.01 ng/g，板间及板内变异系数分别为12.2％及10.0％。农产品中样品添加回收率在79.8％～115.4％之间。同时，将建立的分析方法与黄曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试验，相关系数为0.9098，显示其有较好的应用前景。

Alexandra 等［22］通过酶联免疫法和化学发光酶免疫法建立了DDT 及其代谢物的免疫分析方法，并对食物及环境样品中的DDT 及其代谢物进行检测。对DDT 及其代谢物，酶联免疫法的IC50值为0.6 ng/mL，而化学发光酶免疫法的IC50值为0.2ng/mL。David等［23］通过流动注射化学发光检测法对水样中的阿特拉津进行检测，对水样的最低检测限为 1.3 ng/mL，检测线性范围为2.15～150 ng/mL，通过SPE 柱净化浓缩后，对水样的最低检测限为14 ng/L。Samsonova等人［24］利用化学发光免疫分析方法建立了3 种三氮苯类除草剂（阿特拉津、草净津和莠灭净）的多残留免疫分析方法。在用建立的方法对含3 种除草剂混合物的环境样品进行检测，检出正确率为70％～100％。Waseem等人［25］通过流动注射化学发光免疫分析方法建立了除草剂西草净的检测方法，该方法的线性检测范围为0.01～2μg/mL，最低检测限（S/N=3）为7.5 ng/mL，4条标准曲线各抑制率的相对标准偏差为0.9％～2.3％。

利用建立的方法对水样中的西草净进行检测，回收率在97％～104 ％之间。中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所Jin 等［26］建立了蔬菜水果中三唑磷农药的化学发光免疫分析方法，该方法的线性检测范围为0.04～5 ng/mL，最低检测限为0.063 ng/mL，对生菜、胡萝卜、苹果、水和土壤的添加回收率分别为78.71％，67.52％，118.3％，117.2％和122.0％。同时建立的方法与液质串联质谱法进行相关性实验，结果显示有着较好的相关性（R2= 0.8996）。Aldo 等［27］建立了牛尿样品中瘦肉精的化学发光免疫分析方法。该方法以384 孔化学发光黑板为固相载体，样品添加量仅为20 μL。方法精密度符合分析要求（变异系数小于10％），添加回收率在96 ％～110 ％之间，方法最低检测限为0.08ng/mL。利用384 孔板为固相载体，可减少80％的试剂用量，并可大大提高对阳性样品的初筛效率。

磺胺－5－甲氧嘧啶是一种兽药，但对人体有害，因此在食品中不得检出。Wu等［28］建立了牛奶和鸡蛋中磺胺－5－甲氧嘧啶的化学发光免疫分析方法。该方法的最低检测限为3.2 pg/mL，线性检测范围为10～2 000 pg/mL 之间，方法变异系数小于18％，样品添加回收率在85％～105％之间。其他还有如Kijek［28］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B 的化学发光免疫分析等相关报道。（三）环境科学Christian 等［30］通过化学发光酶免疫分析方法建立了环境内分泌干扰物炔雌醇的免疫分析方法。其方法的检测限（S/N=3）为0.2±0.1 ng/L，信噪比为10 时其方法的检测限为1.4±0.8 ng/L，并通过建立的分析方法对表面水和污水处理厂的污水中的炔雌醇进行测定。Pittman等［31］通过磁性小珠和生物素－亲和素为载体建立了水样和土样中2，4，6－三硝基甲苯的免疫夹心电化学发光免疫分析方法。该方法的最低检测限为0.1±0.8 ng/mL，检测范围为0.1～1 000 pg/mL，其方法灵敏度比文献报道的提高了600 倍。

Zhao 等［32］通过建立微板式磁化学发光酶免疫分析方法来对水样中17β－雌二醇进行检测。通过微板磁性分离器可避免前处理过程以达到高通量分析，再结合高灵敏度的化学发光体系，建立了该方法。该方法的检测灵敏度为5.4 pg/mL，检测范围为10～3 000 pg/mL，且板间和板内检测值的变异系数均低于15％。三、化学发光免疫分析方法的发展趋势目前，化学发光免疫分析方法的发展主要表现在：（1）常见发光体系的不断完善，随着化学发光底物、氧化剂、催化剂、增敏剂及固相材料研究的不断深入，性能更加优异的化学发光体系将在今后研究中不断涌现；（2）基因工程抗原、抗体的制备及广泛应用，将进一步促进化学发光免疫分析方法的发展；（3）化学发光免疫分析方法与包括毛细管电泳等其他方法联用，将提高化学发光免疫分析的速度以及灵敏度，拓宽化学发光体系的应用范围。

参考文献

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荧光和化学发光免疫分析方法

荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应， 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类

完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。 半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合

化学发光免疫分析技术原理简介

化学发光免疫分析技术原理简介 20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。 一、化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或 抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。试

罗氏电化学发光免疫分析(精)

罗氏电化学发光免疫分析 技术是罗氏公司开发的,但全自动机械制造却由日本的日立公司承担,所以仪器上还有Hitachi的标志。这个仪器让大家吃惊的一大原因就在于一直在实验室研究的电致化学发光居然已经真正地产业化了,其中我们一直无法解决的诸多问题(尤其是重现性均已得到解答,看来罗氏的确花了不少心血开发这款仪器。 罗氏电化学发光免疫分析技术的性能特点——创新的技术,与众不同 一、最先进的检测原理 电化学发光免疫测定,是目前最先进的标记免疫测定技术,是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术,具有敏感、快速和稳定的特点,在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。 电化学发光(ECL是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,实际上是电化学和化学发光两个过程的完美结合。电化学发光与普通化学发光的主要差异在于前者是电启动发光反应,循环及多次发光,后者是通过化合物混合启动发光反应,是单次瞬间发光。因此ECL反应易精确控制,重复性极好。 电化学发光免疫测定是电化学发光(ECL和免疫测定相结合的产物,直接以[Ru(bpy3]2+标记抗体,反应时标记物直接发光。且[Ru(bpy3]2+在电极表面的反应过程可以周而复始进行,产生许多光子,使光信号得以增强。 二、专利的包被技术 链霉亲和素(streptoavidin,SA和生物素(biotin,B是具有很强的非共价相互作用的一对化合物,特异性强且结合紧密。一分子SA可与四分子B 相结合,增大了抗体结合量,达到放大效果。在ECL的试剂中,SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上,形成通用的能与B结合的固相载体,另一试剂为活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时,抗原或抗体即包被在磁性微粒上。 三、独特的载体

化学发光免疫分析技术题库1-0-8

化学发光免疫分析技术题库1-0-8

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]化学发光剂必须具备的条件错误的是（） A.其物理、化学特性要与被标记或测定的物质相匹配 B.能与抗原或抗体形成稳定的耦联结合物 C.其化学发光常是还原反应的结果 D.在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性 E.发光的量子产量高 能作为化学发光剂的有机化合物必须具备下列条件：发光的量子产量高；它的物理、化学特性要与被标记或测定的物质性匹配；能与抗原或抗体形成稳定的耦联结合物；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列不会影响标记的因素是（） A.被标记蛋白质的性质 B.原料比 C.温度 D.湿度 E.标记率 影响标记的因素包括：①发光剂的选择。②被标记蛋白质的性质。抗原作为被标志物时，应具有较高的纯度和免疫学稳定性；抗体作为被标志物时，则要求具有较高的效价，应用提纯的IgG来代替全血清。③标记方法的选择应正确选择与发光剂和被标志物结构相适应的耦联方式。④原料比。在制备发光剂-IgG抗体结合物时，IgG：发光剂：交联剂的克分子比mol：mol：mol会影响结合物的发光效率。⑤标记率。是指结合物中IgG与发光剂之间的克分子比。由于每一种发光剂对应于被标志物都有特定的最佳标记率，标志物选择不好，会出现不易保存等现象。⑥温度。控制标记时的反应温度极为重要，对于较稳定的小分子被标志物，温度可稍放宽些；而当被标志物是抗原或抗体蛋白质时，由于蛋白质对热的不稳定性，应在保证标记反应进行的前提下，尽量选择较低的温度，以避免蛋白质在标记过程中活性的丧失。⑦纯化与保存。多数经耦联反应制备的结合物，使用前都需进行纯化，除去未结合的发光剂和交联剂。结合物一般可分装保存在-70℃条件下，最好冷冻干燥保存。

常见化学发光免疫分析技术比较

常见化学发光免疫分析技术比较 1、化学发光免疫分析 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，英音：[,kemi,lju:mi'nes?ns] [,imju:n?u?'sei] 是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 1.1、化学发光免疫分析原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hv) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。 1.2、化学发光免疫分析类型

化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种: (1)化学发光标记免疫分析法; (2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法 1.2.1化学发光标记免疫分析 化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) , 是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法, 大分子抗原则采用夹心法, 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。 1.2.2化学发光酶免疫分析 从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。 12.2.1HRP 标记的CLEIA

化学发光免疫分析技术及在临床检验中的应用分解

本科毕业论文 题目：化学发光免疫分析技术 及在临床检验中的应用 学院：化学与环境工程学院 班级：2011级应用化学2班 姓名：王俊烽 指导教师：李小花职称：讲师 完成日期：2015年05 月 22 日

化学发光免疫分析技术及在临床检验中的应用 摘要：化学发光免疫分析技术（CLIA）是把免疫反应和化学发光检测方法结合的一种分析技术。其中免疫反应的特异性和灵敏度都很高。CLIA是在酶联免疫分析、放免疫分析和荧光免疫分析后面发展起来的一种检测技术。由于其具有操作简单，标记方便，稳定度和检测灵敏度高，速度快，对环境没有污染等优点因此CLIA在临床上受到医学检验者和医生的一致好评。 关键词：化学发光免疫分析技术；基本原理；临床；医学检验 CLIA Technology And Its Application in The Clinical Laboratory Abstract：Chemiluminescence immunoassay (CLIA) is an analytical technique the immune response and chemiluminescent detection methods combined. Which the immune response is very high specificity and sensitivity. CLIA is the enzyme-linked immunoassay, put immunoassay and fluorescence immunoassay later developed a detection technology. Because of its simple, easy to mark, high stability and sensitivity, speed, no environmental pollution, etc. Therefore CLIA praise medical tests and doctors at the clinic. Key words :chemiluminescent immunoassay; fundamental; clinical; medical laboratory

全自动化学发光免疫分析仪Immulite2000标准操作规程完整

IMMULITE ? 2000 全自动化学发光免疫分析仪 标准操作程序 本文件仅供参考，各实验室需根据各自情况建立自己的操作规程 IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统标准操作规程

SOP编码：页数： 制定人签名：日期： 审核人签名：日期： 批准人签名：日期： 生效日期：颁发日期：周期性审查：年一次 修订登记： 审查登记：

[目的]描述IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统的使用和维护。 [范围] 适用IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统的操作。 [仪器工作原理和检测过程] 1 IMMULITE 2000使用包被特定抗体的聚苯乙烯珠子作为固相，包被珠放在一个特定的反应杯中，从而进行温育，清洗以及信号发生。

2. 样本与结合了碱性磷酸酶的试剂温育反应结合之后，通过高速离心将剩余试剂甩到与反应杯同轴的废液管路中。系统在几秒钟内完成四次离心清洗，以便与系统的其他同步。去除未包被试剂的包被珠仍然保留在反应杯中。 3. 包被珠上的结合标记随后同发光底物进行定量发光。当包被珠上结合的碱性磷酸酶标记同化学发光底物反应时，就产生发光。发光强度同样本中待测物的含量有关。仪器通过光电倍增管检测发光强度，随后计算出每个样本的结果。 4. 操作者在IMMULITE 2000上运行测试时，需要做下列操作：： 4.1进行每日探针清洗工作。 4.2 选择RUN IMMULITE 2000按钮。 4.3 查系统状态指示，加满或者清空耗材或者废物。 4.4 初始化样本和试剂加样器、蒸馏水喷嘴和底物喷嘴。 4.5 使用图像扫描器扫描试剂转盘上的过敏原试剂楔。 4.6在样本转盘上装载病人血清、质控、校正液和稀释液。 注意: 运行仪器需要用到的试剂都在 IMMULITE 2000试剂盒中。只有需要预稀释的测试项目才会有稀释液。 4.7 在工作列表列表界面为样本指定测试项目以及编号。 4.8 检查试剂以及与之匹配的包被珠是否足够完成所需测试。 4.9选择RUN开始实验。 5. 仪器自动检测过程: 在操作者按下 RUN 按钮之后，Immulite 2000 自动开始检测并输出检测结 果。 5.1 在反应杯中加入一个包被珠。 5.2 样本，特定的试剂和水加入到包被珠上。 5.3 反应杯运到温育圈，在37°C (98.6°F)的环境中震荡温育。 5.4 清洗测试杯。 5.5 加入底物，发光。 5.6 光电倍增管(PMT)检测光子强度，计算结果并打印。 [免疫分析原理] 1.双抗体夹心法：双抗体夹心法使用ALP标记的抗体在检测单位中进行反应。 1.1 标记的抗体的液相试剂加到检测单位中，标记有ALP的特异性抗体(Ab※ALP)与样品中的相应抗

全自动化学发光免疫分析仪产品技术要求

全自动化学发光免疫分析仪 主要由主机（包含样本架输送模块、反应杯配备模块、加样模块、试剂处理模块、温育反应模块、清洗分离模块、光学检测模块、电路控制模块）、软件（发布版本：V1.0）、电源线、串口线及附件（包含样本架、液路管）组成。 该产品基于间接化学发光法，与配套的检测试剂共同使用，在临床上用于对来源于人体血清、血浆或者其他体液样本中的被分析物进行体外定性或定量检测。 1.1产品型号划分说明 1.2结构组成 主要由主机（包含样本架输送模块、反应杯配备模块、加样模块、试剂处理模块、温育反应模块、清洗分离模块、光学检测模块、电路控制模块）、软件（发布版本：V1.0）、电源线、串口线及附件（包含样本架、液路管）组成。 1.3软件信息 1.3.1 软件名称：利德曼化学发光免疫分析仪器软件平台 1.3.2 发布版本：V1.0 1.3.3 版本命名规则 发布版本号：VX.Y 其中：VX.Y由version缩写V，主版本号及次版本号构成：表示正式发布的第一版程序。 X为主版本号，表示全功能集成第一个版本； Y为次版本号，表示此版本程序发布后暂时未发生变更。 1.3.4 运行环境 硬件配置：

CPU：主频1.7GHz以上。 内存：1G以上内存。 硬盘空间：40G以上均可。 软件配置：操作系统：WINDOWS 7 或WINDOWS 10。 2.1加样正确度与重复性 对仪器标称的样品最小加样量和最大加样量、试剂最小加样量和最大加样量进行检测，应符合表1的规定。 表1 加样正确度与重复性要求 2.2 反应区温度控制的正确度和波动度 反应区温度的偏倚应在：37.0℃±0.5℃，波动度不超过0.5℃。 2.3 光检测装置部分 2.3.1仪器噪声 检测空反应管的发光值应不大于200RLU。 2.3.2发光值的线性 在不小于3个发光值数量级范围内，线性相关系数（r）应≥0.99。 2.3.3发光值的重复性 采用发光剂法，变异系数（CV）不超过5％。 2.3.4发光值的稳定性 采用发光剂法，发光值的变化不超过±10％。 2.4 携带污染率 携带污染率应≤10-5。 2.5临床项目的批内精密度

全自动化学发光免疫分析仪

全自动化学发光免疫分析仪 技术审查指导原则 （第一次征求意见稿） 一、前言 本指导原则旨在指导注册申请人对全自动化学发光免疫分析仪注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是对全自动化学发光免疫分析仪的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

二、适用范围 化学发光免疫分析根据化学发光物质的类型和发光特点，可分为电化学发光免疫分析和化学发光免疫分析，其中化学发光免疫分析根据发光剂的不同，可分为直接化学发光免疫分析、酶促化学发光免疫分析和鲁M诺氧途径免疫分析。目前，各类型化学发光免疫分析的常见发光剂包括：电化学发光剂为三联吡啶钌[（）]，直接化学发光剂为吖啶酯（），酶促化学发光剂为辣根过氧化物酶（）催化鲁M诺（氨基苯二甲酰肼，）及其衍生物或者碱性磷酸酶催化（′螺旋金刚烷）甲氧基（″磷酰氧基）苯二氧杂环丁烷（），鲁M诺氧途径发光剂为酞箐、二甲基噻吩衍生物及螯合物。 化学发光免疫技术根据反应过程中标记物是否需要分离可分为均相反应和非均相反应。均相反应主要应用于鲁M 诺氧途径免疫分析中，而非均相反应则应用于其他类型化学发光免疫分析中，通过采用固相分离、过滤分离、珠式分离、顺磁性颗粒分离等方式实现游离标记物和免疫复合物标记物的分离，其中顺磁性颗粒分离较其他分离方式更为常用。目前，基于鲁M诺氧途径免疫分析原理的产品还比较少，临床常用的全自动化学发光免疫分析仪更多地采用非均相反应模式。 本指导原则适用于采用上述化学发光免疫技术和反应

化学发光免疫分析方法的研究及应用

本文由：华夏学术传媒网提供https://www.sodocs.net/doc/6611422940.html, 摘要：本文根据各化学发光免疫分析方法所使用标记物质的不同，将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法，并对各方法经典标记物质及分析方法原理进行了分析。同时，介绍了化学发光免疫分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用进展情况。 关键词：化学发光免疫分析；分类；研究进展 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析［1］。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的［2］。 一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。（二）化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强

化学发光免疫分析法自己整理

化学发光免疫分析法(CLIA) A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法: (竞争法:用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体,待检抗原与检测信号成反比) 一、原理:本实验采用竞争法,酶标抗原与标准品抗原竞争抗体,标准品抗原浓度越大,结合到抗体上的酶标抗原越少,RLU越小,B/B 值越小。例:A为一种抗原 小分子,有免疫反应性。实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析,使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗A 抗体(FITC-A抗体)发生竞争性免疫反应,再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒,反应生成物结合在磁微粒上,在磁场经分离、洗涤后加发光底物,用冷光分析仪检测发光强度(RLU),测定尿液中A的含量。 二、仪器: 1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司); 2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min 3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯) 4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司)

5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂) 6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis 公司) 三、试剂 1、A标准品 2、A单克隆抗体 3、A-BSA结合物 4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子(5mg/mL) 5、FITC标记的A单克隆抗体 6、HRP标记的A 7、PBST 洗涤液(0、05mol/L PBS, 含0、05% Tween-20) 8、分析缓冲液(0、05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7、4, 含2、0%BSA、0、5 %的水解明胶、0、1%的Proclin-300) 9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢与对碘苯酚溶液) 实验用水为二次蒸馏水 四、试剂处理 1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品; 2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存、 FITC-A单克隆抗体溶液的配制: 取FITC-A单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000 的FITC-A单克隆抗体溶液, 4 ℃保存。(具体分析) 五、数据处理 通过测量标准品与样品溶液的发光强度(RLU),使用Fl ash’n glow LB955 发光分析仪自带软件中的数据处理程序对测得的数据进行处理、线性方程采用的就是logit(Y)-log(X)的线性回归数学模型, 以logitY 为纵坐标, logX 为横坐标, 其线性方程表达式为logit(Y) = a + blog(X), 线性方程中 X 为标准品(或待测样品)溶液的浓度, logit(Y) =ln(y/1-y),y=B/B0,式中, B 为标准品(或待测样品)溶液的发光强度, B0 为不加标准品(或待测样品)而加分析缓冲液的发光强度、根据标准品的浓度与发光强度值, 经线性回归得标准曲线, 代入样品

化学发光免疫分析技术题库1-1-8

化学发光免疫分析技术题库1-1-8

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列不会影响标记的因素是（） A.被标记蛋白质的性质 B.原料比 C.温度 D.湿度 E.标记率 影响标记的因素包括：①发光剂的选择。②被标记蛋白质的性质。抗原作为被标志物时，应具有较高的纯度和免疫学稳定性；抗体作为被标志物时，则要求具有较高的效价，应用提纯的IgG来代替全血清。③标记方法的选择应正确选择与发光剂和被标志物结构相适应的耦联方式。④原料比。在制备发光剂-IgG抗体结合物时，IgG：发光剂：交联剂的克分子比mol：mol：mol会影响结合物的发光效率。⑤标记率。是指结合物中IgG与发光剂之间的克分子比。由于每一种发光剂对应于被标志物都有特定的最佳标记率，标志物选择不好，会出现不易保存等现象。⑥温度。控制标记时的反应温度极为重要，对于较稳定的小分子被标志物，温度可稍放宽些；而当被标志物是抗原或抗体蛋白质时，由于蛋白质对热的不稳定性，应在保证标记反应进行的前提下，尽量选择较低的温度，以避免蛋白质在标记过程中活性的丧失。⑦纯化与保存。多数经耦联反应制备的结合物，使用前都需进行纯化，除去未结合的发光剂和交联剂。结合物一般可分装保存在-70℃条件下，最好冷冻干燥保存。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]不需酶催化反应即可发光的发光底物是（） A.吖啶酯 B.三联吡啶钌 C.鲁米诺或其衍生物 D.4-MUP E.AMPPD 吖啶酯化学发光特点：①推动发光的氧化反应简单快速，不需要催化剂，只要在碱性环境中即可进行；②反应体系中加入H2O2和NaOH溶液后，发光迅速，背景噪声低，保证了测定的敏感性；③吖啶酯可直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标志物的生物学活性和理化特性；④吖啶酯发光为瞬间发光，持续时间短，因此对信号检测仪的灵敏度要求比较高。

化学发光免疫分析方法

化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。 一、化学发光免疫分析方法的类别 化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为 3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。 （一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。 鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。 （二）化学发光酶免疫分析 化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。此传统的化学发光体系（HRP－H2O2－lumi-nol）为几秒内瞬时闪光，存在发光强度低、不易测量等缺点。后来，在发光系统中加入增强发光剂，以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。碱性磷酸酶（ALP）已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。 碱性磷酸酶和1，2－二氧环己烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的化学发光体系。这类体系中具有代表性的是Bronstein 等提出的ALP－AMPPD 发光体系。AMPPD 为1，

化学发光免疫分析技术题库1-2-10

化学发光免疫分析技术题库1-2-10

问题： [单选]标本为组织切片的细胞表面粘附分子最常用的测定方法是（） A.酶免疫组织化学方法 B.免疫荧光方法 C.流式细胞仪 D.化学发光免疫测定方法 E.时间分辨荧光免疫测定方法

问题： [单选]细胞外可溶性粘附分子的最常用的测定方法是（） A.原位PCR B.原位RT－PCR C.化学发光免疫测定方法 D.RT－PCR E.ELISA

问题： [单选]下列有关化学发光错误的说法是（） A.化学发光是指伴随着化学反应过程所产生的光的发射现象 B.化学发光与荧光形成激发态分子的激发能相同 C.化学发光是吸收了化学能使分子激发而发射的光 D.大多数化学发光反应为氧化还原反应 E.化学发光必须提供足够的化学能 化学发光是吸收了化学能使分子激发而发射的光，而荧光是吸收了光能使分子激发而发射的光。https://www.sodocs.net/doc/6611422940.html,/ 电竞之家

问题： [单选]化学发光免疫测定的发光剂不包括（） A.鲁米诺 B.吖啶酯 C.碱性磷酸酶 D.异鲁米诺 E.三联吡啶钉 除选项C外，其余均可作为化学发光免疫测定的发光剂。

问题： [单选]下列关于化学发光效率说法错误的是（） A.又称化学发光反应量子产率 B.发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率 C.发光效率决定于激发态分子发射效率 D.发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质决定 E.所有的发光反应都具有相同的化学发光效率 每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。

化学发光免疫分析法-自己整理

化学发光免疫分析法（CLIA） A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法： （竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比） 一、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B0值越小。例：A为一种抗原小分子，有免疫反应性。实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU），测定尿液中A的含量。 二、仪器：

1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司); 2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min 3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯) 4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司) 5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂) 6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis 公司) 三、试剂 1、A标准品 2、A单克隆抗体 3、A-BSA结合物 4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL） 5、FITC标记的A单克隆抗体 6、HRP标记的A 7、PBST 洗涤液(0.05mol/L PBS, 含0.05% Tween-20) 8、分析缓冲液(0.05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7.4, 含2.0%BSA、0.5 %的水解明胶、0.1%的Proclin-300) 9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液) 实验用水为二次蒸馏水 四、试剂处理 1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品； 2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存. FITC-A单克隆抗体溶液的配制:

引进全自动化学发光免疫分析仪可行性报告书

引进全自动化学发光免疫分析仪可行性报告书 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

引进全自动化学发光免疫分析仪可行性报告书尊敬的各位领导： 随着检验技术快速的发展，在免疫检测项目方面也取得了很多优秀的成果。全球临床的实践验证，化学发光免疫分析技术由于其检测速度快、检测结果性能好、操作简单、等优点目前已成为全球最经典最先进的检测技术。 随着未来医院的不断发展壮大，考虑到医院的长期效益，我科需求一台全自动化学发光免疫分析系统，更好的满足临床诊疗工作的需要。 一、引进理由 1、引进先进医疗设备、提高医疗市场竞争力的需要，并且周边医院都有同类似的仪器（大英、河边镇中心卫生院、安居区人民医院）。 2、根据多数医院的了解，该设备都能取得良好的经济效益和社会效益。因此引进全自动化学发光仪是提高工作效率和检验质量的必需条件。 3、据统计，医院临床科室许多诊断依据来自，现在医学非常强调循证医学，作为窗口科室，先进的检验仪器有助于提高临床诊断率，提升医院在本地区的档次和地位，树立良好的社会形象。 4、提升经济效益、促进医院整体发展的需要

是个含金量极高的科室。据统计分析，收入普遍占医院总收入的8-12％，如引进全自动化学发光仪后，据了解，纯利可达45％左右。增大了临床要求和目前激烈的市场竞争需求 5、为临床快速提供检验结果的需要 全自动化学发光免疫分析仪测试速度高达100---180测试/小时，回报及时准确，并且对急诊项目设有急诊功能。 6、为临床提供全面检测项目的需要 全自动化学发光免疫分析仪可提供全面的检测项目，项目包涵：肿瘤、激素、甲状腺功能、心肌梗塞等多项。可灵活方便地分系统设置项目组合，大大方便临床诊断。 7、检验质量质控的需要 全自动化学发光免疫分析仪由仪器自动采样、加样并自动检测，采用独立试剂包，最大限度减少手工加样、试剂线性、交叉污染等因素对检验结果的影响，精密度、准确度都非常高。 二、经济效益分析 简单测算如下： 在收费价格方面，了解本地的情况是：我院每年住院病人是3000多人，每人只做两对半，年收入达30多万元，成本预计55%，年纯收入：150000元左右通过上述测算估计，引进全自动化学发光免疫分析仪效益可观。

化学发光免疫分析法报告

化学发光免疫分析法概述 化学发光是物质在氧化还原过程中发光的现象。能产生化学发光的物质称为化学发光剂。 化学发光免疫分析法是用化学发光剂包括发光物质或者发光反应催化剂等直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，藉以检测抗原或抗体的分析技术。将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应后，通过化学发光反应来测定发光标记物或酶标记物的化学发光信号，从而确定待测抗原或抗体的浓度.化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，clia）兴起于20世纪80年代，由于方法成熟，目前已经成为临床免疫诊断的主要方法。化学免疫分析是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。临床上所用的化学发光试剂盒包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术（elisa）。 根据标记物的不同可分为三大类:1.标记酶的化学发光免疫分析，其中应用 最多的是三种酶：依据HRP-Luminol-H 20 2 -对碘苯酚(PIP)增强型化学发光反应体 系进行检测的辣根过氧化物酶(HRP)；能催化AMPPD的分解反应从而产生化学发光进行抗原抗体定量分析的碱性磷酸酶(ALP)；另一种是虫荧光素酶，能催化氧化虫荧光素产生发光而实现对ATP、各种激素、药物以及抗原抗体的定量分析。2.标记直接化学发光物质的化学发光免疫分析，最典型的是标记氨基异鲁米诺(ABEI)和吖啶酯类的化学发光免疫分析。3.标记荧光物质，通过过氧化草酸酯化学发光体系进行检测的化学发光免疫分析。按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点，可以将标记分子分为“直接偶联”和“间接偶联”两种方式。间接偶联可以在原有结构中引进新的活性基，增加反应活性。 下面就鲁米诺、光泽精等几种化学底物发光原理作一简要评述。 1 常见的发光物质 1.1 鲁米诺和其衍生物鲁米诺（luminol）和其衍生物是最早在化学发光免疫分析中使用而且被临床较广泛应用的一种常用的化学发光物。吴秋华等［1］对2003年以前鲁米诺在化学发光反应的进展以及应用做过详细的概述。 在碱性溶液中，鲁米诺可以被多种氧化剂氧化（H 2O 2 ）而发光，发光底物在 酶（辣根过氧化物酶、过氧化氢酶和黄嘌呤氧化酶等）的作用下，发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。

(仅供参考)化学发光免疫分析技术及厂家简介

化学发光免疫分析技术及厂家简介 2017.01.16

目录 第一部分化学发光简介第二部分化学发光类型第三部分进口化学发光系统简介 第四部分国产化学发光系统简介

--发光原理 激发态ν 发光：是指分子或原子中的电子吸 收能量后，由基态（较低能级）跃 能量h.ν迁到激发态（较高能级），然后再 回到基态，并释放光子的过程。 基态ν0

--发光类型 形成激发态分子的能量来源不同 指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。发生在生物体内的发光现象。如萤 火虫的发光，反应底物为萤火虫荧 光素，在荧光素酶的催化下，利用 ATP能，生成激发态氧化型荧光素， 它在回复基态时多余的能量以光子 的形式释放出来。 指伴随化学反应过程所产生的光的 发射现象。某些物质(发光剂)在化学 反应时，吸收了反应过程中所产生 的化学能，使反应的产物分子或反 应的中间态分子中的电子跃迁到激 发态，当电子从激发态回复到基态 时，以发射光子的形式释放出能量。 光照发光生物发光化学发光

--化学发光分类——发光剂不同 酶促（间接）化学发光 ?用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。 ?优势：发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，发光信号强而稳定，且发光时间较长； 检测方式简单、成本较低； ?代表厂家：贝克曼-库尔特Access、DPC、三联、安图等。