(生产管理知识)基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用

基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用

一、课程设计目的

了解工业生产中的新型育种技术并比较不同育种技术的优势；

学习理解基因工程育种技术及其操作原理；

研究基因工程育种技术在人干扰素生产中的创新。

二、课程设计题目描述与要求

本文介绍一种二十世纪七十年代发展起来的一种新型生物技术——基因工程，介绍其在育种中的应用。文中重点介绍了基因工程育种的一般步骤，以及近年来出现的运用基因工程进行定向育种的主要新技术：基因的定点突变，易错PCR，DAN重排及基因组重排。之后，应用基因工程育种技术重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素a2b, 通过优化补料分批培养时葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表达量和表达速率。不同的葡萄糖流加方式有各自的优点,采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表达量达到6 540 mg/L,高于目前已知文献中hIFNa2b的最高表达量5 200 mg/L。

三、课程设计报告内容

引言

基因工程是二十世纪七十年代发展起来的一种新型生物技术，其发展从根本上改变了生物技术的研究和开发应用模式。1972年美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV 40DNA、λ噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦佛大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素连个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。在二十世纪八十年代以来，随着大批大批成果的出现及应用，基因工程带来了一场新的革命。

利用这些技术，可以直接地、有针对性地在DNA分子水平上改造生物的遗传性状。通过转入外源基因，微生物和动、植物细胞可以产生出自身原来没有的蛋白质。同样，利用重组DNA技术，也可以使一些原来存在量极低但有重要工业或医学用途的小分子(抗生素)或蛋白质之外的大分子物质得以大量生产。特别是随着重组DNA技术的完善和发展，以基因水平为核心的现代分子定向育种技术越来越受到工业微生物育种学家的关注，并展示了良好的应用前景。

1、基因工程育种

基因工程育种是在基因水平上，运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达引，与前几种育种技术相比，基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有前途的一种育种新技术。基因工程技术的全部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主要环节。

1.1 基因工程育种的一般步骤是：

(1)目的基因的获得：一般通过化学合成法、物理化学法(包括密度梯度离心法、单链酶法、分子杂交法)、鸟枪无性繁殖法、酶促合成法(逆转录法)、Norther

杂交分析法、cDNA文库筛选法、杂交筛选法、编码序列富集(磁珠捕获)、产物导向法、Nod连接片段筛选法、外显子捕获法及外显子扩增法、剪接位点筛选法、作图克隆法、杂交细胞克隆法、消减杂交法、相同序列克隆法、差异显示逆转录PCR法、显微克隆与微克隆法和插入诱变法等方法获得目的基因。

(2)载体的选择：基因工程载体主要是质粒和病毒，载体一般为环状DNA，其要求有自我复制能力、分子小、拷贝数多、易连接和易筛选等特点。

(3)重组子体外构建：主要方法有粘性末端连接法、平端连接法、人工接头连接法和同聚物加尾连接法。

(4)重组载体导入受体细胞：其主要途径有转化、转导、显微注射、电穿孔法、快速冷冻法和炭化纤维介导法等。

(5)重组体筛选和鉴定：以合适的筛选方法选择具有最佳性能的突变重组子，重组体筛选和鉴定主要通过表型法、DNA鉴定筛选法，选择性载体筛选法、分子杂交选择法、免疫学方法和mRNA翻译检测法等方法来实现。

1.2 运用基因工程进行定向育种的新技术

1．2.1 基因的定点突变

定点突变(site—specific mutagenesis或site—directed mutagenesis)是指在目的DNA片断(例如：一个基因)的指定位点引入特定的碱基对的技术，其包括寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变以及以PCR为基础的定点突变。近十年来，定点突变技术获得了长足的发展，并且在此基础上又发展了很多新技术。例如：重叠延伸PCR法(Overlap Extension PCR简称EO—PCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重叠延伸PCR(One—stepOverlap Extension PCR，简称OOE．PCR)、单管大引物PCR(Single—tube Megaprimer PCR)、快速定点诱变法、多位点环状诱变法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定点诱变技术。在这些技术中，单管大引物PCRTAMS定点诱变技术最为简单和适用，并得到广泛的应用。

单管大引物PCR Picard等和HKe等分别建立了单管大引物PCR法。该法省去了传统上以PCR为基础的定点突变中第1轮PCR产物的纯化过程，实现了在同一管中先后进行2轮PCR反应的定点突变目标。在上述2组研究者建立的方法中，后者提出的方案更加巧妙、简单(图1)。其只需设计Tm值不同的2个侧引物，在第1

轮PCR反应中用Tm值低的侧引物(F1)和诱变引物，在较低的退火温度下进行扩增反应，产生大引物；然后再加入Tm值高的侧引物(F2)，在较高的退火温度下进行第2轮反应，扩增出含突变位点的整个DNA产物。Ke等在此方法中还提出了2条更为细致、有效的改进措施，使PCR产物的最终产量和纯度均有所提高。这2条改进措施为：(1)在第1轮PCR反应中，诱变引物的浓度仅为侧引物的1％，以减少诱变引物在第2轮PCR中的干扰作用；(2)在第l轮PCR反应后，亦即第2轮PCR反应前，增加5个循环的不对称扩增，这有利于提高其后的扩增效率。这种单管大引物法的优点是：实现了在同一管中先后进行2轮PCR反应，大幅简化了操作步骤，并且省时、省力。在对多个样品进行操作时，该方法的优点更为突出。在以PCR为基础的诱变方法中，该法是引入单位点突变最简单、最经济的方法。

图1 单管大引物PCR过程

Figure 1 The process of Single·tube megaprimer PCR

TAMS定点诱变技术 2003年，Young等报道了一种有目的地扩增突变链的定点诱变技术(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。该技术能够一次引入多个位点的突变，并且能够有目的地扩增突变链，从而使突变效率几乎达到100％。该方法主要分3步(图2)：(1)线性单链DNA模板的制备：通过线性PCR 制备单链DNA模板；(2)突变链的合成：该步骤需用2个锚锭引物(即Anchor5和Anchor3)和多个诱变引物(Mut1和Mut2)。(3)有目的地扩增突变链：设计扩增引物(PCR5和PCR3)，使其3′端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩增引物

只能退火到突变链而不是亲本链。在多位点的突变试验中，TAMS诱变技术应该是首选方法。

定点突变技术已在蛋白质的结构和功能改造上取得了很大成功。例如，利用定点突变改变酪氨酰-tRNA合成酶的活性中心，从而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫键，显著提高了该酶的稳定性。

图2 TAMS定点诱变技术原理和操作过程

Figure 2 The principle and operation process of TAMS

1．2.2 易错PCR

DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一种对特定基因进行随机诱变的可能方法。利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错PCR(Error_prone PCR，简称EP—PCR)。此方法的原理与操作如图3，其操作过程是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反应体系中，利用Mn替代天然的辅助因子Mg，使Taq DNA聚合酶缺乏校对活性，同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡，因此导致碱基的错配率大大增加，通常约为0.1％。另外，还可以在该反应体系中加入dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。这种方法可以将错配率最大提高至20％。孔荣等利用易错PCR使D-海因酶对底物的水解活性提高了2.4倍；黄瑛等用易错PCR使短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶活性提高了1.31倍，Km值由8.24mmol/L降低至7.717mmol/L，在pH>8.0时的稳定性也较野生型脂肪酶有所提高。

图3 易错PCR示意图

Figure 3 Sketch of error-prone PCR

1．2.3 DAN重排

DNA重排(DNA shufling)技术是一种利用重组文库的体外定向进化技术，Stemmer 于1993年首先提出。DNA重排的基本原理是首先将同源基因(单一基因的突变体或基因家族)切成随机大小的DAN片段，然后进行PCR重聚。那些带有同源性和核苷酸序列差异的随机DAN片段在每一轮循环中互为引物和模板，经过多次PCR循环后能迅速产生大量的重组DNA，从而创造出新基因。其操作的原理和步骤如图4。

图4 DNA重排的原理及操作步骤

Figure 4 The principle and operation process of DNA shuffling Zhao等在此基础上发明了一种更加简化交叉延伸程序( STEP)(图5)。此技术是在一个PCR反应体系中以2个以上相关的DNA片段为模板进行PCR反应。引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性(延伸)过程。在每一轮PCR循

环中，那些部分延伸的片段可以随机地与含不同突变的模板进行杂交，使延伸继续，并由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复进行直到获得全长基因片段，重组的程度可以通过调整时间和温度来控制。此方法省去了将DNA酶切成片段这一步，致使DNA重排方法进一步简化。

图5 交叉延伸程序的基本过程

Figure 5 Basic procedure of staggered extension process 近几年来，提高DNA重排技术捕获变异的能力一直是研究人员努力的方向。Ostermie等以核酸外切酶Ⅱ代替DNaseI对靶序列进行消化，发明了递减法建立杂交酶技术（ITCHY)，使得非同源性序列间也能发生重排，扩大了该技术的用途。Hiraga等开发的SISDC技术在组件内部引入了限制性内切酶识别标记，用相应的限制性内切酶代替DNase I产生重排片段。Bergquist等开发的DOGS技术则是根据保守模体区序列特征设计简并引物，扩增出保守同源区后再用重排操作生成突变富集体。由于此方法是在突变耐受的保守区直接增加转辙组的几率，所以其产生的突变频率大大增加。

DNA重排的最大特点是在反复突变过程中引进了重组这一自然进化中最重要的过程，而且其对可操作的靶序列的长度没有任何要求，可以达到几万kb。通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高，同时还打破了传统物种之间由于生殖隔离导致不能重组的界限。

1．2.4 基因组重排

基因组重排(genome shufling)技术是受DNA重排的启发，于2l世纪出现的全基因组改组技术。这种技术将分子定向进化的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。首先，利用经典的诱变育种技术获得含有目标性状的基因组库，然后利用原生质体融合技术将这些发生正向突变的菌株的全基因组进行多轮随机重组，从而快速筛选表型得到较大改进的杂交菌种。该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术，将各种亲本制成原生质体-融合-再生-再制成原生质体-融合-再生)，即递归原生质体融合(recursive protoplast fusion)的方法。Zhang等于2002年首次报道应用基因组重排方法快速地使弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)产生泰乐菌素的能力得到提高。该方法以营养缺陷型为出发菌株，仅用了1年时间，通过两轮基因组改组就从24 000株菌株中分离到2组共14株泰乐菌素高产菌株，其泰乐菌素产量高于通过经典诱变育种方法所筛得的生产菌株SF21，而后者(SF21)是用经典诱变育种方法在长达20年的时间中先后筛选过约1 000 000个菌株后才获得的。由此可见，此技术大大减少了工作量，并缩短了筛选时间。四川抗菌素工业研究所的徐波等以产量性状为标记特征，应用基因组重排的方法在一年之内使替考拉宁产量提高了65.3％。

除上述技术外，近年来又出现了一些新技术，例如：部分基因片段改组、单链DNA家族改组(SSDNAs)、简并引物基因改组(DOGS)、瞬时模板的随机嵌合、单向引物的随机重组、自我复制、体外随机引发重组(RPR)、酶法体外随机-定位诱变(random—site—directed mutagenesis)、交错延伸剪接PCR等。

2、基因工程育种技术在大肠杆菌种的应用

大肠杆菌是迄今为止研究的最为详尽的原核细菌，其K-12MG1655株的4 000多kb的染色体DNA已测序完毕，全基因共含有4 405个开放阅读框，其中大部分基因的生物功能已被鉴定。作为一种成熟的基因克隆表达受体，大肠杆菌被广泛用于分子生物学研究的各个领域，如基因的分离扩增、DNA序列分析、基因的表达产物功能鉴定等。由于大肠杆菌繁殖迅速，培养代谢易于控制，大肠杆菌的分子遗传学背景已相当明了，不断完善的基因操作技术可将大肠杆菌构建成为用于异源蛋白生产的分子工厂。因此，利用DNA重组技术构建大肠杆菌工程菌，以规模化生产真核生物基因尤其是人类基因的表达产物，具有重大的经济价值。现在已

有100多种异源蛋白通过大肠杆菌基因工程菌实现了产业化，其中包括一些结构相当复杂的人体蛋白，如HAS、pro-UK、MT、M-CSF及Hb等。工业中常用于生产医药蛋白如人胰岛素、人生长激素、人干扰素、人白细胞介素和抗体。以下以生产人干扰素为例介绍其应用。

人干扰素a2b (Human Interferona2b,hIFNa2b)是由165个氨基酸组成的多肽,具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、修复DNA结构损伤等作用。hIFNa2b在临床上广泛应用,对肝炎、呼吸道病毒感染、疱疹病毒感染等均具有治疗作用。大肠杆菌表达系统具有生长快速、发酵成本低、表达水平高等优点,是生产外源蛋白的理想表达体系。在大肠杆菌温度诱导表达外源蛋白的发酵过程中,如何控制升温诱导后菌体的生长,提高产物的比生产速率,是实现高密度高表达的关键。本文采用大肠杆菌BL21(pBAI)表达hIFNa2b,其表达通过温控型PL启动子调控。考察了补料方式对hIFNa2b生产速率的影响,hIFNa2b表达水平达到6 540 mg/L。

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

菌株宿主菌E. coli BL21(DE3)[BF-dcm ompT hsdS (r-Bm-B) galλ(DE3)],重组质粒为pBAI,带有氨苄青霉素耐药性标记,hIFNa2b基因表达受λPL启动子和质粒cI857编码的蛋白调控。

培养基种子培养基为LB培养基(蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,NaCl 10 g/L),灭菌后加入100 mg/L氨苄青霉素钠。分批发酵培养基为含葡萄糖5 g/L的LB 培养基。未特别注明的补料分批发酵培养基均为含葡萄糖5 g/L的2×LB培养基(蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L),补料液为400 g/L的葡萄糖。培养基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均为Oxoid产品,其余试剂为国产分析纯,采用去离子水配制。

2.1.2 培养方法

种子培养从-20°C保藏的甘油管中取出1ml菌液,接入装有30 ml种子培养基的250mL锥形瓶,于摇床200 r/min,30°C下培养10 h,为一级种子;将一级种子以1.5%的接种量转接至装有70 ml LB培养基的500 ml锥形瓶中,相同条件培养9 h,为二级种子。

发酵罐培养将二级种子以6%的接种量接入5 L发酵罐(RIBE-5型)中。培养

液装量为2.5 L，生长阶段控制温度30°C,表达阶段控制温度42°C，发酵过程中控制pH为7.0,通气量4 L/min，初始搅拌转速为400 r/min,发酵过程中转速逐渐提高以维持溶氧大于20%。补料分批培养过程中,初始葡萄糖耗尽后采用3种不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供应速率流加。恒pH方式为当pH超过7.0时自动补入葡萄糖；恒速流加以5.4 g/(L·h)的速率流加葡萄糖；恒比供应速率(QG)为0.27 g/(g·h)，每小时根据菌体浓度调整葡萄糖的流加速率。

2.1.3 测定方法

菌体浓度测定采用浊度法,测定波长600 nm处的光密度(OD600),根据标准曲线计算菌体干重。葡萄糖测定采用葡萄糖测定试剂盒(上海科欣生物技术研究所)测定。乙酸测定采用气相色谱法[5]。hIFNa2b的电泳测定采用三(羟甲基)甲基甘氨酸(φ=0.15)-SDS-聚丙烯酰胺三层胶系统分离目的蛋白[6],凝胶用考马斯亮蓝染色,用图像分析系统(Smart View analysis program,上海复日科技有限公司)定量。取发酵液于12 000 r/min,4°C下离心10 min,得到的菌体用Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L, pH 7.0,4°C)洗涤,然后溶于上样缓冲液中[12mmol/L、pH 6.8 Tris-HCl,甘油(φ=0.05),SDS(7.5 g/L),巯基乙醇(φ=0.02),溴酚兰(0.5 g/L]。

2.2 结果与讨论

2.2.1 分批发酵

在5 L罐中分批培养,结果见图6和表1。培养2.5 h升温诱导,此时菌体处于对数生长期,升温对于菌体生长的影响并不显著,表达初期菌体比生长速率较升温前略有下降。分批发酵中葡萄糖耗完时,乙酸积累达到最大值1.1 g/L。hIFNa2b 的表达水平达到749 mg/L,是相同培养基条件下摇瓶培养的2.9倍。诱导后1 h,hIFNa2b比生产速率为162 mg/(g·h),生产速率为275 mg/(L·h)；诱导后期比生产速率下降至95 mg/(g·h),但由于菌体浓度增大,生产速率达到363 mg/(L·h)。

图6 分批培养时菌体(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)的变化曲

线

Fig.6 Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■), acetic acid (●) and hIFNa2b (▲) in batch cultivation

2.2.2葡萄糖流加对于hIFNa2b生产水平的影响

要获得hIFNa2b的高体积表达水平,则需维持较高的比生产速率,并且增大

菌体密度,流加葡萄糖是一种很好的选择。

恒pH流加葡萄糖培养4 h后升温诱导表达hIFNa2b,此时残糖浓度为0.9 g/L。6 h时初始葡萄糖耗尽,溶氧迅速回升,开始用恒pH法补加葡萄糖,即pH高于设定值时蠕动泵自动加入葡萄糖溶液1 s。此补料分批发酵实验记为FB1,结果见图7和表1。升温诱导后,菌体生长明显减慢,升温后2 h菌体的比生长速率为0.425 h-1,与升温前的0.710 h-1相差很大,这与诱导时环境和细胞生理状态有关。与分批发酵相比较,升温诱导时(2.5 h)菌体处于对数生长前期,培养基中营养物质充分,而本实验中于4 h升温诱导时菌体处于对数生长后期,培养基中的营养物质已经被大量消耗,难以维持对数期的比生长速率。进入恒pH补料阶段后,菌体比生长速率下降的趋势进一步明显,发酵末期菌体比生长速率仅为0.025 h-1。

图7 恒pH补料分批培养(FB1)中菌体(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及

hIFNa2b(▲)的变化曲线

Fig.7 Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■),acetic acid (●) and hIFNa2b (▲) in pH-statfed-batch cultivation (FB1) hIFNa2b表达量在11.5 h达到2 400 mg/L,是分批发酵的3. 2倍。诱导初期的2 h内,hIFNa2b比生产速率为148 mg/(g·h),生产速率高达730 mg/(L·h)。后期hIFNa2b表达速率明显减慢,发酵末期仅为10 mg/(g·h)。在恒pH补料分批培养中,

能较好地控制葡萄糖的流加,使得发酵后期没有乙酸积累。但是恒pH流加方式下的葡萄糖流加是基于有机氮源的异化代谢引起pH上升,随着培养基的氮源如氨基酸的逐渐消耗,减少了氨离子的产生,从而不易引起发酵液pH上升,导致葡萄糖补加速率的降低,使得培养过程中特别是发酵后期葡萄糖的供应不足。如图8所示,培养过程中葡萄糖流加速率rG从2.83 g/h下降到1.99g/h,葡萄糖比消耗速率QG 从0.115 g/(g·h)下降到0.087 g/(g·h),限制了hIFNa2b的表达。

与分批培养相比,虽然hIFNa2b的比生产速率有所下降,但总产量和菌体hIFNa2b含量大幅提高,说明菌体浓度升高有利于提高hIFNa2b表达水平,恒pH流加是一种操作方便的流加方式。

图8 恒pH补料分批培养(FB1)中葡萄糖浓度(■)、葡萄糖流加速率(◆)及葡

萄糖比消耗速率(▲)的变化曲线

Fig.8 Profiles of residual glucose(■), feeding rate of glu-cose (◆) and specific consumption rate of glucose(▲) in pH-stat fed-batch

cultivation (FB1)

恒速补料实验中hIFNa2b平均生产速率是恒pH补料时的1.65倍,表明葡萄糖供应的改善提高了hIFNa2b的表达水平,尽管葡萄糖的比消耗速率还是从诱导初期的0.28 g/(g·h)下降到0.21g/(g·h)。因为期望达到较高的菌体密度,所以生长期较长。诱导前培养基中营养物质消耗较多,8.5h时菌体的比生长速率已经降低到0.203 h-1,升温诱导后1 h,比生长速率更降低至0.074 h-1,营养消耗导致hIFNa2b的比生产速率仅27 mg/(g·h),大大低于恒pH补料分批培养实验FB1。通过恒速补糖方式取得了hIFNa2b非常高的表达量,但这是通过延长发酵时间和提高菌体浓度实现的,过低的比生产速率大大影响发酵生产效率。

2.3 诱导前添加有机氮源对hIFNa2b生产水平的影响

许多基因工程菌外源基因的表达显示出与生长速率相关的特性,而补料分批培养中,随着菌体浓度的提高,诱导初期的比生长速率明显下降,反映了营养的限制。因此在诱导前1.5 h补充有机氮源(酵母提取物25 g),以满足菌体生长和产物合成的需要。初始葡萄糖耗完后,采用恒比供应速率(0.27 g/(g·h))的方式补充葡萄糖,发酵过程记为FB3,结果见图9和表1。

图9 补料分批培养FB3中菌体(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)

的变化曲线

Fig.9 Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■), acetic acid (●) and hIFNa2b (▲) in fed-batch cultivation FB3 (yeast extract

was added at6.5 h)

采用恒比供应速率流加方式,葡萄糖流速根据菌体总量变化而变化,能够较好地满足细胞代谢及重组蛋白表达所需的能量需求,同时也避免了乙酸和残糖的积累,平均比生产速率为恒速流加时的2倍。可以看出,加入酵母抽提物,满足了菌体生长的需要,使得诱导前后均有较高的比生长速率,表达期平均比生长速率达到0.106 h-1。升温诱导5.5 h后,hIFNa2b表达量即达到5530mg/L,hIFNa2b最大比生产速率为124 mg/(g·h),hIFNa2b的平均生产速率大幅提高,达1 006 mg/(L·h)。分批发酵和不同补料分批发酵的实验结果归纳于表1。可以看出FB3添加的酵母提取物提供了氨基酸和核苷酸,有利于外源基因的转录和翻译,使hIFNa2b合成速率加快,hIFNa2b对于有机氮源的得率最高,是FB2的1.27倍,并且发酵周期仅13.5h,较FB2的20. 5 h大大缩短了时间,提高了hIFNa2b的生产速率,一次性添加有机氮源的操作也比较便捷,在生产上有一定的应用价值。

1) DCW at the beginning of inductionb；2) DCW at the end of culture 3) During 1 h post induction；4) Overall productivity of hIFNa2b；

5) Overall specific productivity of hIFNa2b；6) HIFNa2b yield based on total complex nitrogen sources；7) Specific hIFNa2b production

3 结论

目前hIFNα2b在临床的应用广泛,需求量大,但由于生产水平的限制,价格仍旧较高。本文通过优化补料分批培养时葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表达量和表达速率。分批培养时乙酸积累,对hIFNa2b表达有一定抑制作用,流加葡萄糖的策略使得表达期无乙酸积累,提高了hIFNa2b的表达水平。不同的葡萄糖流加方式有各自的优点,采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表达量达到6 540 mg/L,高于目前已知文献中hIFNa2b的最高表达量5 200 mg/L。恒比供应速率流加葡萄糖并在诱导前添加酵母抽提物,虽然总表达量5 530 mg/L,稍低于恒速流加方式,但是平均hIFNa2b生产速率高达1 006 mg/(L·h),是分批培养时的3.08倍,是恒速流加方式时的1.84倍,并且对有机氮源的得率提高到138 mg/g,大大缩短了发酵时间,为该表达系统的实际应用创造了条件。

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报,1995,19(4):380-384

(第一章)安全生产管理知识重点

第一章，第一节安全生产管理基本概念 安全生产管理：针对人们在生产过程中的安全问题，运用有效的资源， 发挥人们的智慧，通过人们的努力，进行有关决策、计划、组织和控制等活动，实现生产过程中人与机器设备、物料、环境的和谐，达到安全生产的目标。 根据生产安全事故造成的人员伤亡或者直接经济损失，事故一般分为以下4个等级 1、特别重大事故：a、30人以上死亡b、100人以上重伤（包括急性中 毒）c、1亿元直接经济损失 2、重大事故：a、10人以上死亡，30人以下重伤b、50人以上100人 以下重伤c、5000万元以上1亿元以下 3、较大事故：a、3人以上，10人以下死亡、b、10以上，50人以下重 伤，1000万以上，5000万以下 4、一般事故：3人以下死亡，10人以下重伤、1000万元以下 风险的分类 广义的风险：自然风险、社会风险、经济风险、技术风险和健康风险（五类）、 对于安全生产的日常管理的风险：人、机、环境、管理（四类） 海因里希法则（事故法则）：在机械事故中，伤亡、轻伤、不安全行为的比例为1：29：300 危险源的分类（根据危险源在事故发生、发展中的作 用）： 第一类危险源：指生产过程中存在的，可能发生意外释放的能量，包括生产过程中各种能量源、能量载体或危险物质。它决定了事故后果的严重程度，它具有的能量越多，发生事故后果越严重。 第二类危险源：导致能量或危险物质约束或限制措施破坏或失效的各种因素。它决定了事故发生的可能性，它出现越频繁，发生事故的可能性越大。

78种化学品按照《危险货物分类和品名编号》分为6大类9小类： 爆炸品（8种）、易燃气体（9种）、毒性气体（17种）、易燃液体（14种）、易于自燃的物质（3种）、遇水放出易燃气体的物质（3种）、氧化性物质（9种）、有机过氧化物（2种）、毒性物质（13种） 重大危险源：单元内存在危险化学品的数量等于或超过表1、表2规定的临界量。 第一章，第二节现代安全生产管理理论 安全生产管理原理与原则 一、系统原理 运用系统原理的原则有：1、动态相关性原则2、整分合原则3、反馈原则4、封闭原则 二、人本原理 运用人本原理的原则有：1、动力原则2、能级原则3、激励原则4、行为原则 三、预防原理 运用预防原理的原则有：1、偶然损失原则2、因果关系原则3、3E原则（工程技术对策、教育对策、法制对策）4、本质安全化原则 四、强制原理 运用强制原理的原则有：1、安全第一原则。2、监督原则 事故致因理论 一、事故频发倾向理论：个别容易发生事故的稳定的个人的内在货倾 向。（早期的，不符合现代理念） 二、事故因果连锁理论 1、海因里希事故因果连锁理论（时代局限性）：伤亡事故的发 生不是一个孤立的事件，尽管伤害可能在某瞬间突然发生，却是一系列 原因事件相继发生的结果。 伤害事故连锁构成 A、人员伤亡的发生是事故的结果。 B、事故的发生原因是人的不安全行为或物的不安全状态。 C、人的不安全行为或物的不安全状态是由于人的缺点造成 的。 D、人的缺点不由于不良环境诱发或者是由先天的遗传因素 造成的。 事故因果连锁过程概括为以下五个因素： A、遗传及社会环境。 B、人的缺点

安全生产法律法规知识点汇总

安全生产法律法规知识点汇总 1、法的最基本属性是统治阶级的意志，不是共同意志； 2、社会主义法以国家意志形式体现了工人阶级领导下的广大人民的意志； 3、居住在我国的外国人，在某些问题上适用于他本国的法律； 4、《安全生产法》2002年6月29日公布，2002年11月1日起生效； 5、法具有国家强制性； 6、安全生产执法基本原则：合法、公正、公开，联合执法，惩戒与教育相结合，有法必依、执法必严、违法必究； 7、在同一类问题上，特殊法优于一般法； 8、部门规章由国务院有关部委制定； 9、地方性法规由省人大及常委会制定； 10、《安全生产法》基本原则：人身安全第一、预防为主、社会监督、综合治理； 11、《安全生产法》立法目的：加强管理、防止事故、保障安全、促进发展； 12、《安全生产法》调整范围：除香港、澳门外，从事生产经营活动的单位； 13、《安全生产法》排除适用：已发现的，特殊法中未做出规定的问题； 14、“安全第一，预防为主”是我国安全生产管理的方针； 15、生产经营单位的主要负责人对本单位的安全生产工作全面负责； 16、主要负责人是本单位安全生产工作主要领导责任的决策人； 17、工会：民主管理、民主监督； 18、县级以上地方各级人民政府负责安全生产监督管理的部门对本行政区域内安全生产工作实施综合监督管理； 19、安全生产技术服务机构依照执业标准； 20、安全资金投入应以法律、行政法规、国家标准、行业标准规定； 21、高危行业（无论有多少从业人员）应当设置安全管理机构或者配备专职安全管理人员； 22、300人以上的非高危行业应当设置安全管理机构或者配备专职安全管理人员； 23、300人以下的非高危行业应当配备专职或兼职的安全管理人员，或委

安全生产管理知识真题及答案

年注册安全工程师《管理》真题及答案 一单项选择题(共题，每题分。每题的备选项中，只有个最符合题意) .某化工企业在设施改造过程中，发生有毒气体泄漏爆炸事故，造成人死亡，人急性工业中毒，直接经济损失万元。依据《生产安全事故报告和调查处理条例》(国务院令第号)，该事故的等级是（）.一般事故.较大事故.重大事故.特别重大事故 .经统计，某机械厂十年中发生了起可记录意外事件。根据海因里希法则，该厂发生的起可记录意外事件中轻伤人数可能是（） 人人人人 3.某热力公司锅炉值班人员甲例行巡检时闻到疑似绝缘电缆烧焦昧道，随后发现锅炉蒸汽吹灰控制室内有浓烟。甲随即向值班室报告，值班班长立即拉闸，避免了一起严重火灾事故的发生。事后调查发现，造成该起事故的直接原因有:端子排环线接触不良，岗位专职人员巡检不到位;因未到大修期，控制室内控制盘一直没有经过检修处理。该公司的下列做法中，属于防止此类电气火灾事故的本质安全措施是( ) .控制室增设空调设备.将端子手排转接的环线取消，改为直接接线. .重新封堵控制盘柜内电缆..尽快恢复密封风机供电，防止蒸汽吹灰器枪头被烤坏 .某矿山企业在安全检查人员中开展“安全原理讨论活动”。参加活动的人员给出了以下关于安全管理原则的观点，其中正确的是( ) .“强制原则”是指连犯了纪律就应该得到相应的惩罚、 .“封闭原则”是指管理手段相互联系并相互制约的回路、 .“偶然损失原则”是指事故的发生只是偶然的，可以避免、 .“反馈原则”是指员工对领导的反作用、 .某煤业公司把勾人员甲在矿车与勾头未连接时推矿车，由于斜巷防跑车装置失灵造成“跑车”，将在巷道边操作的员工乙撞击碾压致死。为防止此类事故的再次发生，煤业公司采取了以下做法，其中符合通过有效技术手段防止事故的措施是( )。 .对把勾人员进行罚款.教育全公司人员引以为戒别 .解决防跑车装置失灵..加大安全监管人员监管力度 6.某工厂在提高职工安全管理素质的培训过程中，提出“我厂危险源比较多，不可能根除一切危险源和危险。所以宁可减少总的危险性，而不是只彻底消除几种选定的危险”的观点。该观点符合事故致因理论的（） .海因里希因果连锁理议.能量意外释放理论、 .系统安全理论.事故频发倾向理论 .某公司组织对供水系统进行安全检查，检查人员甲固执己见未听劝阻，在未佩戴防护用品条件下进入阀门井，下井后即晕倒在该井中，最终造成窒息死亡。事故调查发现，该公司未制定有限空间作业制度，阀门井在进行检查前己被污水污染含有有毒气体。下列关于该事故的说法中，符合轨迹交叉理论观点的是( )。: .违反安全规定和阀门井存在有毒气体共同作用导致事故发生、 .阀门井受污染产生有毒气体是导致事故发生的主要原因、 .甲性格偏执、不遵守规定是导致事故发生的根本原因、 .该公司的有限空间作业制度缺失是导致事故发生的直接原因. .某禽业公司厂房电气线路短路，引燃周围可燃物，燃烧产生的高温导致液氨储存设备和液氨管道发生物理爆炸，造成人死亡，人受伤。事故调查表明，导致该起事故的原因有:电气线路短路、工人安

《安全生产管理知识》模拟试题6

《安全生产管理知识》 一、单项选择题（每小题1分，共70分） 1.一般生产经营单位主要负责人和安全生产管理人员安全生产管理培训时间不得少于（）学时；每年再培训时间不得少于（）学时。 A．24，12 B．20，8 C．36，10 D．24，8 2.下列对 "本质安全"理解不正确的是（）。 A.包括设备和设施等本身固有的失误安全和故障安全功能 B.是安全生产管理预防为主的根本体现 C.可以是事后采取完善措施而补偿的 D.设备或设施含有内在的防止发生事故的功能 3.以下的论点中，（）不属于“偶然损失原则”的论点。 A.事故后果及其严重程度都是随机的。 B.反复发生的同类事故，并不一定产生完全相同的后果。 C.事故后果及其严重程度是难于预测的，因此，无论事故损失大小，都必 须做好预防工作。 D.为了预防事故的发生，就要从根本上消除事故发生的可能性。 4.安全生产管理的目标是减少、控制危害和事故，尽量避免生产过程中由于（）所 造成的人身伤害、财产损失及其他损失。 A．事故 B.危险 C.管理不善 D.违章 5.根据能量转移理论的概念，事故的本质是（）。 A.能量的不正常转移 B.造成人员死伤 C.造成经济损失 D.造成人员伤亡 6.要做到“安全第一”，就必须（）。 A．将高危作业统统关掉 B．提高系统的安全系数 C．实行“安全优先”的原则 D．提高劳动生产率 7.海因里希事故连锁理论把事故发生过程概括为五个部分，即（）。 A.管理缺陷；环境缺陷；人的不安全行为和物的不安全状态；事故；伤害 B.遗传及社会环境；人的缺点；直接原因；事故；伤害 C.基本原因；间接原因；人的不安全行为和物的不安全状态；事故；损失 D.遗传及社会环境；人的缺点；人的不安全行为和物的不安全状态；事故；伤害

安全生产管理知识总结

2011安全工程师《安全生产管理》要点总结195条 1、3E原则：工程技术对策、教育对策、管理对策防止事故发生。 2、反馈原则认为反馈是控制过程中对控制机构的反作用。错误：监督原则认为为使安全生产法得到落实应设立安全生产监督管理部门。 3、动态相关性原则告诉我们：如果管理系统的各要素都处于静止状态，就不会发生事故。 4、安全生产是为了使生产过程在符合物质条件和工作秩序下进行，防止发生人身伤亡和财产损失等生产事故，消除或控制危险有害因素，保障人身安全与健康，设备和设施免受损坏，环境免遭破坏的总称。 5、要做到安全第一，就必须实行安全优先的原则。 6、我国现行工伤事故统计中，按导致事故发生的原因工伤事故分20类。 7、安全和危险均是相对的概念 8、安全管理必须要有强大的动力，并正确应用动力，从而激发人们保障自身和集体安全的意识，自觉积极地搞好安全生产工作。这种管理原则是人本原则中的“激励原则” 9、海因希里法则事故后果为严重伤害、轻微伤害和无伤害的事故件数之比为1：29：300 10、危险源的构成要素有：潜在危险性、存在条件、触发条件。 11、海因希里因果连锁理论认为企业安全工作的中心是防止人的不安全行为、消防物的不安全状态。 12、安全生产检查的方法：仪器检查法、常规检查法、安全检查表法。

13、股份制企业合资企业安全生产投入资金由董事会保证。 14、单位对新职工应进行***48小时安全生产教育培训，危险性较大的行业和岗位教育培训时间不少于***48小时。 15、安全检查五查“思想、管理、隐患、整改、事故处理” 16、国家规定对非矿山企业强制性检查的项目：特种设备、作业场所有毒有害物质 17、征收工伤保险费实行差别费率和浮动费率相结合是事故预防的主要机制。 18、常用的危险有害因素辨识方法有直观经验法和系统安全分析方法。 19、特种作业的批准机构为 20、职业病共10大类115种 21、安全标志分四类：禁止、警告、命令、提示 22、从长远观点来看，低成本高收益的预防措施是减少事故损失的关键。 23、安全教育培训的方法：讲授法、实际操作演练法、案例研讨法、读书指导法、宣传娱乐法。 24、劳动防护用品三证：生产许可证、产品合格证、安全鉴定证。 25、编制安措计划原则：必要性和可行性、自力更生与勤俭节约、轻重缓急与统筹安排、领导和群众相结合。 26、安措计划应与同年度的生产技术财务供销计划同时编制。总工审批、厂长下达。 27、主要负责人培训内容：方针政策法律法规规章规程规范标准、安全生产管理基本知识方法与安全生产技术行业安全生产专业知识、重

安全生产管理知识考试试题及答案 答案附后

【经典资料，ＷＯＲＤ文档，可编辑修改】 【经典考试资料，答案附后，看后必过，ＷＯＲＤ文档，可修改】 2015安全生产管理知识考试试题及答案 一、单项选择题(共70题，每题1分。每题的备选项中，只有1个最符合题意) 1.《企业职工伤亡事故分类标准》(GB6441-1986)将企业工伤事故分为20类，其中不包括( )。 A.交通伤害 B.机械伤害 C.起重伤害 D.冒顶片帮 2.本质安全中的( )动能是指。当设备、设施发生故障或损坏时，仍能暂时维持正常工作或自动转变为安全状态。 A.失误—安全 B.行为—安全 C.故障—安全 D.控制—安全 3.危险度表示发生事故的危险程度，它是由( )决定的。 A.发生事故的可能性与系统本质安全性 B.本质安全性与危险源性质 C.发生事故的可能性与发生事故的严重性 D.危险源的性质与发生事故的严重性 4。根据《重大危险源辨识》(GB8218-2000)，辨识重大危险源的依据是( )。 A.物质的物理特性 B.物质的比重及数量 C.物质的密度及数量 D.物质的危险特性及数量 5.依据系统安全理论，下列关于安全概念的描述，错误的是( )。 A.没有发生伤亡事故就是安全 B.安全是一个相对的概念 C.当危险度低于可接受水平时即为安全 D.安全性与危险性互为补数 6.在工业生产中，经常利用各种屏蔽来预防事故的发生，其应用的安全理论是( )。 A.因果连锁理论 B.系统安全理论 C.事故频发倾向理论 D.能量意外释放理论 7.我国安全生产方针中的综合治理强调的是( )。 A.抓住重点，遏制重特大事故 B.强化责任，落实企业自主管理 C.重在执法，完善法规标准建设 D.标本兼治，重在治本

建筑施工安全生产管理知识题库

施工安全生产管理知识题库 一、单选题（每题有4个备选答案，其中只有一个答案是正确的，多选、不选、错选均不得分。） 1．我国安全生产工作的方针是( )。 A.安全责任重于泰山B．质量第一，安全第一 C．管生产必须管安全D．安全第一，预防为主，综合治理 正确答案：D 2．我们将施工作业的场所统称为( )，也叫工地。 A.临时工棚B．工厂C．施工现场D．高处作业 正确答案：C 3.( )不属于施工作业的特点。 A.露天作业、交叉作业多B．高温作业多C．高处作业多D．手工操作多正确答案：B 4．在生产过程中直接从事( )的人员统称为特种作业人员。 A．脚手架搭拆B．手工操作C．特种作业D．高处作业 正确答案：C 5．下列属于国家标准的是( )。 A．《施工扣件式钢管脚手架安全技术规》(JGJ 130-2001) B．《施工现场临时用电安全技术规》(JGJ 46--2005) C．《施工现场机械设备检查技术规程》(JGJ 160-2008) D．《塔式起重机安全规程》(GB 5144-2006) 正确答案：D 6《法》规定，( )必须为从事危险作业的职工办理意外伤害保险，支付保险费 A.施工企业B．职工自己C．作业班组D．建设单位 正确答案：A 7．施工特种作业人员考核容，包括( )等。 A．安全技术理论和实际操作技能B．安全技术理论 C．实际操作技能D．自学能力 正确答案：A 8．施工特种作业操作书有效期为( )年。 A．3 B．4 C．1 D．2 正确答案：D 9．特种作业人员应参加培训时间不少于()学时的年度安全教育培训。 A．8 B．16 C．24 D．32 正确答案：C 10．公司级安全教育，由企业安全教育部门实施，下列()不属于公司教育容。 A．国家和地方有关安全生产方面的方针、政策及法律法规 B．施工安全、职业健康和劳动保护的基本知识 C．施工人员安全生产方面的权利和义务 D．工程概况、施工现场作业环境和施工安全特点 正确答案：D 11．属于防护头部安全防护用品的是( )。 A．安全帽、工作帽B．护目镜、防护罩

安全管理知识学习提纲

时间：2014年2月26日 地点：公司会议室 参加人员：各部门主管（谭勇、郑伟、杜健、税奇懿、李熊波、何建兴、张勇）主讲：杨林 内容： 《安全生产管理知识》内容提要 第一章安全生产管理概述第二章生产经营单位的安全生产管理第三章安全评价第四章重大危险源辨识与监控第五章事故应急救援第六章职业危害与职 业病管理第七章职业健康安全管理体系 第一章安全生产管理概述 1.基本要求：检验应考人员对安全生产管理基本概念的掌握程度； 对现代安全生产管理理论的熟悉程度；对我国安全生产工作现状和安全 生产管理方针的熟悉程度。 1.安全生产管理的基本概念 1.1劳动保护是依靠科学技术和管理，采取技术措施和管理措施，消 除生产过程中危及人身安全和健康的不良环境、不安全设备和设施、不 安全环境、不安全场所和不安全行为，防止伤亡事故和职业危害，保障 劳动者在生产过程中的安全与健康的总称。 1.2 安全生产为了使生产过程在符合物质条件和工作秩序下进行，防止 发生人身伤亡和财产损失等生产事故，消除或控制危险、有害因素，保 障人身安全与健康、设备和设施免受损坏、环境免遭破坏的总称。 1.3职业安全卫生职业安全卫生是安全生产、劳动保护和职业卫生的统称， 它是以保障劳动者在劳动过程中的安全和健康为目的的工作领域，以及 在法律法规、技术、设备与设施、组织制度、管理机制、宣传教育等方 面所有措施、活动和事物。1.4 安全指生产系统中人员免遭不可承 受危险的伤害 1.5 安全生产管理针对人们生产过程的安全问题，运用有效的资源， 发挥人们的智慧，通过人们的努力，进行有关决策、计划、组织和控制 等活动，实现生产过程中人与机器设备、物料、环境的和谐，达到安全 生产的目标。 1.6本质安全指设备、设施或技术工艺含有内在的能够从根本上防止 发生事故的功能。包括：失误—安全功能；故障—安全功能；上述两 项功能是设备、设施和技术工艺固有的，即在它们的规划设计阶段就被 纳入。 1.7 事故是指造成人员死亡、伤害、职业病、财产损失或其他损失 的意外事件。是人们不希望发生的，同时违背人们的意愿后果。 1.8 事故隐患指生产系统中可导致事故发生的人的不安全行为、物 的不安全状态、环境的不安全条件和管理上的缺陷。 1.9 危险是指系统中存在导致发生不期望后果的可能性超过了人们 的承受程度。注意危险度的概念，危险度用生产系统中事故发生的 可能性和严重性给出。 2.1安全生产管理的发展（安全、健康、舒适）2.2 安全生产管理的原理 与原则安全生产管理作为管理的一个分支，服从管理的基本原理系统原 理：动态相关性原则、整分合原则、反馈原则、封闭原则；人本原理：

2014年注册安全工程师—安全生产管理知识真题(附答案)

2014注册安全工程师考试题-安全生产管理知识真题 一、单项选择题（共70题，每题1分。每题的备选项中，只有1个最符合题意） 1、甲市安全生产监督管理局对其市城乡结合部炼油厂组织安全检查 时，发现该厂运行中的管线支撑和吊架严重变形。有可能发生管线断 裂破裂。柴油泄漏事故。依据【安全生产事故隐患排查治理暂行规定】（国家安全生产监督管理总局令第16号），该隐患属于（A ）。 A、一般事故隐患 B、较大事故隐患 C重大事故隐患D、特大事故隐患 2、某省2003年度发生不期望的机械事件共计6600起。依据海因里 希法则推断，该省在2003年度可能发生机械伤害的轻伤事故是 （B ）起。 A 20 B 580 C 1060 D 6000 3、选矿厂真毒筛分机是利用多孔工作面的振动将松散的物料按颗粒大小分为多种粒级的分级设备。要提高振动的筛分效果。需要提高筛面的振幅和频率。随之带来的是高振动强度对设备设施、人和环境造成伤害。为防止这种伤害该厂应当优选采取的技术措施是（B ）。 A、增加操作人员的防护用品 B、减少振动筛运动时间 C增加振动筛维修保养频次D、进行振动筛减振设计 4、为了保证企业组织机构的稳定性和管理的有效性，某企业根据甲、乙、丙三位职工的从业经验和能力等综合因素分析，对三位职工岗位

进行了重新调整，这种调整，符合安全生产管理原理的（ A ）。 A、整分合原则 B、能级原则 C、3E原则 D、激励原则 5、某市一金属矿山企业发生一起严重透水事故，市安全生产监督管 理局要求该市所有金属矿山企业一律停产，全面开展隐患排查，经安全评估并验收合格后，方可恢复生产。该种做法，符合安全生产管理原理的（B ）。 A、动态相关原则 B、监督原则 C、行为原则 D、能级原则 6、某企业在安全生产标准化建设过程中，开展了创建安全班组达标 活动，旨在提升班组安全管理水平。张某担任该企业班组长多年，具有丰富的基层安全管理经验，张某发现在班组内可能造成较大事故的职工往往具有感情冲动等性格特点。依据事故频发倾向理论，针对具有这种性格特征的人员可采取的安全改进措施是（ C ）。 A、遵章办事，违者严罚 B、重新培训，更换岗位 C加强教育，重点监护D、加强现场安全警示及提示 7、海因里希法则将事故连续过程概括为五要素：并用多米诺骨牌形象地描述事故这种因果连锁关系，下列描述事故发生五要素的选项中，正确的顺序和内容是（B ）。 A、人的缺点，人的不安全行为或物的不安全状态，能量意外释放，事故，伤害 B、遗传及社会环境，人的缺点，人的不安全行为，或物的不安全状 态，事故，伤害 C人的缺点，管理缺陷，人的不安全行为或物的不安全状态，事故

2020年安全工程师考试《安全生产管理知识》考前检测试题B卷 含答案

省（市区） 姓名 准考证号 ………密……….…………封…………………线…………………内……..………………不……………………. 准…………………答…. …………题… 2020年安全工程师考试《安全生产管理知识》考前检测试题B 卷 含答案 考试须知： 1、考试时间：150分钟，本卷满分为100分。 2、请首先按要求在试卷的指定位置填写您的姓名、准考证号等信息。 3、请仔细阅读各种题目的回答要求，在密封线内答题，否则不予评分。 一、单选题（本大题共70小题，每题1分，共70分） 1、甲国有企业收购乙民营生物质发电公司45％的股份，完成收购后，乙公司总经理李某占股比20％，其他小股东合计占股份35％，为强化管理，甲企业派出副总经理王某任乙公司董事长，并组建乙公司董事会。依据《安全生产法》，乙公司的安全费用投入责任主体是（ ） A 、董事长王 B 、总经理李某 C 、乙公司董事会 D 、甲企业董事会 2、宋体依据《生产经营单位安全生产更世故应急元编制导则》（AQ/T9002-2006），针对具体的事故类别、危险源和应急保障而制定的计划或方案属于（ ） A 、综合应急预案 B 、专项应急预案 C 、现场处置方案 D 、基本应急预案 3、鉴于事故的不确定性和突发性，预警机制必须以（ ）为重要原则。 A 、高效率 B 、及时性 C 、全面性 D 、引导性 4、塔式起重机的接地必须牢固可靠,其接地电阻不大于（ ）Ω。 A 、4 B 、8 C 、10 D 、20 5、根据可能产生职业病危害程度的不同，《建设项目职业病危害管理办法》将建设项目分为一般职业病危害项目和严重职业病危害项目。下列项目中，不属于严重职业病危害项目的是（ ） A 、可能产生高度和极度危害化学物质的项目 B 、可能产生石棉纤维的项目 C 、可能产生10％以下游离二氧化硅粉尘的项目 D 、可能产生放射性职业危害因素的项目 6、辐射可分为电离辐射和非电离辐射。属于电离辐射的是（ ） A 、红外线 B 、x 射线 C 、激光 D 、紫外线 7、4月5日甲市某物流运输公司在乙市丙县境内公路上发生一起交通事故，造成重伤3人，轻伤3人，1辆运输车、2辆轿车严重受损，至4月10日在医院抢救的3人陆续死亡。关于组织这起事故调查的有关人民政府的说法，正确的是（ ） A 、丙县人民政府负责组织事故调查，甲市人民政府应当派人参加，运输公司配合事故调查 B 、丙县人民政府负责组织事故调查，乙市人民政府应当派人参加，运输公司配合事故调查 C 、乙市人民政府负责组织事故调查，甲市人民政府应当派人参加，丙县人民政府配合事故调查 D 、甲市人民政府负责组织事故调查，乙市人民政府应当派人参加，丙县人民政府配合事故调查 8、根据毒害作用机理不同，职业性有害气体可分为窒息性气体和刺激性气体。下列气体中，属

安全生产管理知识要点

安全生产管理知识要点文档编制序号：[KK8UY-LL9IO69-TTO6M3-MTOL89-FTT688]

【经典资料，ＷＯＲＤ文档，可编辑修改】【经典考试资料，答案附后，看后必过，ＷＯＲＤ文档，可修改】 安全生产管理知识要点 ★1、危险：是指系统中存在导致发生不期望后果的可能性超过了人们的承受程度。 安全：指生产系统中人员免遭不可承受危险的伤害。 ★2、危险源：指可能造成人员伤害、疾病、财产损失、作业环境破坏或其他损失的根源或状态。 ★3、重大危险源：是指长期地或者临时地生产、搬运、使用或者储存危险物品，且危险物品的数量等于或者超过了临界量的单元（包括场所和 设施）。 ★4、事故：在生产过程中，事故是指造成人员死亡、伤害、职业病、财产损失或其他损失的意外事件。有两个特性：一是人们不希望发生；二 是产生了人们不期望的后果。 ★5、事故隐患：指生产系统中可导致事故发生的人的不安全行为、物的不安全状态和管理上的缺陷。 ★6、本质安全：是指设备、设施或技术工艺含有内在的能够从根本上防止发生事故的功能。 ▲7、安全生产：是为了使生产过程在符合物质条件和工作秩序下进行，防止发生人身伤亡和财产损失等生产事故，消除或控制危险有害因素， 保障人身安全与健康，设备和设施免受损坏，环境免遭破坏的总称。 ▲8、劳动保护：是依靠科学技术和管理，采取技术措施和管理措施，消除生产过程中危及人身安全和健康的不良环境、不安全设备和设施、不 安全环境、不安全场所和不安全行为，防止伤亡事故和职业危害，保障 劳动者在生产过程中的安全与健康的总称。 ▲9、职业安全卫生：职业安全卫生是安全生产、劳动保护和职业卫生的统称，它是以保障劳动者在劳动过程中的安全和健康为目的的工作领 域，以及在法律法规、技术、设备与设施、组织制度、管理机制、宣传 教育等方面所有措施、活动和事物。 ★10、安全生产管理：是针对人们生产过程的安全问题，运用有效的资源，发挥人们的智慧，通过人们的努力，进行有关决策、计划、组织和 控制等活动，实现生产过程中人与机器设备、物料、环境的和谐，达到 安全生产的目标。 □11、安全生产管理的发展历史：从18世纪大机器代替手工劳动起，事故开始增加；20世纪以后科技术进步和生产的复杂化，重大事故时有发生；建国后党和政府一直重视安全生产工作，制定了一系列的安全生产

最新安全生产管理知识重点及总结

第一章安全生产管理基本理论知识点 1、安全生产：一般意义上讲，是指在社会生产活动中，通过人、机、物料、环境的和谐运作，使生产过程中潜在的各种事故风险和伤害因素始终处于有效控制状态，切实保护劳动者的生命安全和身体健康。 2、安全管理：针对人们在生产过程中的安全问题，运用有效的资源，发挥人们的智慧，通过人们的努力，进行有关决策、计划、组织和控制等活动，实现生产过程中人与机器设备、物料、环境的和谐，达到安全生产的目标。 3、安全生产管理的目标，减少和控制危害，减少和控制事故，尽量避免生产过程中由于事故所造成的人身危害、财产损失、环境污染以及他损失。 4、《企业职工伤亡事故分类标准》20类：物体打击、车辆伤害、机械伤害、起重伤害、触电、淹溺、灼烫、火灾、高处坠落、坍塌、冒顶片帮、透水、放炮、火药爆炸、瓦斯爆炸、容器爆炸、其他爆炸、中毒和窒息及其他伤害。 5、《生产安全事故报告和调查处理条例》（国务院令第493号）生产安全事故的分级： A/一般事故：死亡1-2人，重伤1-9人，直接损失：一千万以下。 B/较大事故：死亡3-9人，重伤10-50人，直接损失：一千万—五千万。

C/重大事故：死亡10-30人，重伤50-100人，直接损失：五千万-1亿元 D/特别重大事故：死亡30人以上，重伤100人以上，直接损失：1亿元。 6、事故隐患分为：一般事故隐患和重大事故隐患。一般指危害和整改难度较小，发现后能够立即整改排除的。重大指危害和整改难度较大，应当全部或者局部停产停业，并经过一定时间整改治理方能排除隐患，或者因外部因素影响致使生产经营单位自身难以排除的隐患。 7、危险程度=风险度，指事故发生的可能性与严重性的结合。 8、海因里希法则：伤亡：轻伤：不安全行为的比例为1:29:300； 9、危险源：第一类指生产过程中存在的，可能发生意外释放的能量，包括生产过程中各种能量源、能量载体或危险物质。第一类决定了事故后果的严重程度，它具有的能量越多，发生事故后果越严重；第二类指导致能量或危险物质约束或限制措施破坏或失效的各种因素。广义上包括物的故障、人的失误、环境不良以及管理缺陷等因素，决定了事故发生的可能性，它出现的频率繁，发生事故的可能性越大。 10、重大危险源：长期地或者临时地生产、搬运、使用或储存危险品，且危险品的数量等于或者超过临界量的单元。

必须掌握的安全生产管理知识学习资料

必须掌握的安全生产管理知识 1、各单位安全网络图、岗位责任、安全技术操作规程必须上墙。并要悬挂整齐醒目。 2、层层签定安全生产责任书，建立健全各种安全记录，内容清楚、详细、齐全、属实。 3、公司所有员工必须积极参加各种安全活动、安全考试、知识竞赛等。 4、努力推行现代安全管理方法，普及完善标准化作业，建立并执行各项安全生产规章制度，班组成员能熟练掌握本岗位的安全技术规程和作业标准，做到会讲会用。 5、新工人和转岗工人必须经过三级安全教育。 6、安全档案要严格按标准建立，妥善保管；车间每半年、各班组每季度组织一次安全培训并考试，成绩不合格不准上岗。 7、班长为班组教育的责任人，必须及时为每位员工建立每三级班组安全教育档案，制定和实现班组安全目标，做到个人无违章，岗位无隐患，班组无事故，岗位尘毒浓度不超标，安全文明生产好。 8、各班班长为兼职班组安全员，负责本班组员工的安全工作。负责员工的安全教育，监督班组员工《岗位安全操作规程》的执行情况，检查工作现场设备、人员、环境的可靠性，符合安全条件后方可开始工作。 9、各班长每天班前会必须对员工进行安全教育，布置安全工作注意事项，检查场地、设备、机械、工具和防护措施，确认处于安全状态时，方可开展工作。 10、班组长要经安全培训考试合格，具备辨识危险、控制事故的能力，班组各成员要职责清、责任明。 11、班组成员要有“安全第一”的意识，“我要安全”的觉悟，“我会安全”的技能，“我管安全”的义务，“我保安全”的责任，做到自我防护，自主管理、自我教育。 12、每周生产调度会布置的安全工作要全面落实。 13、严格落实班前、班后会、安全日活动、安全检查、安全例会制度，做到有布置、有检查、有考核、有记录，由安全员监督检查。 14、危险场所及危险设施应采取防范措施，设立标志，要害岗位、重要设施要人人清楚。 15、火药库、油库、化验室、氰化钠库、发配电室、信号室、锅炉房、污水处理厂等要害部门必须做到出入记录齐全，物资支领手续齐全，标志悬挂醒目。 16、工作前要充分休息，班中不准打闹，不准带小孩及无关人员到生产作业场所，杜绝带病上岗。 17、上岗人员必须持有上岗证，上岗证由安全部门每半年考核一次，特种作业人员必须持特种作业证上岗。 18、各种大型安装、维修、检修等重点工程，各单位必须研究制定安全防范措施，并经安全环保部同意，方可施工。在重点项目检修过程中，单位必须设立监督岗，2米以上高空作业须系上安全带。 19、接班时或工作期间，认真检查本岗位的设备、安全设施以及使用的工具是否处于良好状态，发现问题立即修理、更换，不许带病运转和勉强使用。 20、各种防尘、防护设施必须安全可靠，操作岗位工人及班组长上班和生产管理人员进入车间、工段，必须按要求穿戴劳保用品。

安全生产管理知识重点及总结

安全生产管理知识重点及总结 1、安全生产：一般意义上讲，是指在社会生产活动中，通过人、机、物料、环境的和谐运作，使生产过程中潜在的各种事故风险和伤害因素始终处于有效控制状态，切实保护劳动者的生命安全和身体健康。 2、安全管理：针对人们在生产过程中的安全问题，运用有效的资源，发挥人们的智慧，通过人们的努力，进行有关决策、计划、组织和控制等活动，实现生产过程中人与机器设备、物料、环境的和谐，达到安全生产的目标。 3、安全生产管理的目标，减少和控制危害，减少和控制事故，尽量避免生产过程中由于事故所造成的人身危害、财产损失、环境污染以及他损失。 4、《企业职工伤亡事故分类标准》20类：物体打击、车辆伤害、机械伤害、起重伤害、触电、淹溺、灼烫、火灾、高处坠落、坍塌、冒顶片帮、透水、放炮、火药爆炸、瓦斯爆炸、容器爆炸、其他爆炸、中毒和窒息及其他伤害。 5、《生产安全事故报告和调查处理条例》（国务院令第493号）生产安全事故的分级：A/一般事故：死亡1-2人，重伤1-9人，直接损失：一千万以下。B/较大事故：死亡3-9人，重伤10-50人，直接损失：一千万安全功能，操作者即使操作失误，也不会发生事故或伤害；b：故障人的不安全行为或物的不安全状态人的缺点是由于不良环境诱发或者是先天的遗传因素造成），控制不足起源论；直接原因接触（改进装置、材料及设施，防止能量释放，通过训练、提高工人识别危险的能力，佩戴个体保护用品等来实现），受伤损失（能量意外释放理论揭示了事故发生的物理本质，为人们设计及采取安全技术措施提供理论依据）c能量意外释放理论：哈登认为能量的大小、接触时间的长短和频率以及力的集中程度。（用安全的能源代替不安全的能源：用气代电、用水代火药爆破；限制能量：利用低电压设备防止电击、限制露天爆破装药量以防止个别飞石伤人；防止能量蓄积：应用低高度位能、控制爆炸气体浓度、通过接地消除静电蓄积、利用避雷针放电保护重要设施；控制能量释放：建立水闸防止高势能地下水突然涌出；延缓释放能量：安全阀、逸出阀控制气体，全面崩落法管理巷道顶板，控制地压，用各种减振装置吸收冲击能量，防止人员受到伤害；开辟释放能量的渠道：安全接地、探放水、瓦斯抽放；设置屏蔽设施：防护罩、安全围栏、个体防护品；提高防护标准：改变工艺流程：不安全为安全流程，用无毒少毒物质代替剧毒有害

安全师《安全生产管理知识》试题及答案

2005年安全师《安全生产管理知识》试题及答案 一、单选题（70 ×1分= 70分） 1、从安全生产的角度，______是指可能造成人员伤害、疾病、财产损失、作业环境破坏或其他损失的根源或状态。 A、危险 B、危险度 C、危险源 D、重大危险源 2、_________是为了使生产过程在符合物质条件和工作秩序下进行，防止发生人身伤亡和财产损失等生产事故，消除或控制危险有害因素，保障人身安全与健康，设备和设施免受损坏，环境免遭破坏的总称。 A、安全 B、安全生产 C、安全卫生 D、安全条件 3、安全生产管理的目标是减少和控制___①___，减少和控制___②___，尽量避免生产过程中由于事故所造成的人身伤害、财产损失、环境污染以及其他损失。 A、①有害②事故 B、①危险②有害 C、①危害②事故 D、①危险②事故 4、安全生产管理的基本对象是企业的________。A、生产资源B、员工C、设备D、环境 5、2004年1月，国务院发布了指导安全生产工作的纲领性文件_______。 A、《关于进一步加强安全生产工作的决定》 B、《国务院关于特大安全事故行政责任追究的规定》 C、《关于加强企业生产中安全工作的几项规定》 D、《关于认真作好劳动保护工作的通知》 6、劳动保护的对象首先是保护________。A、从事生产的劳动者B、企业的领导C、安全管理者D、生产管理者 7、安全生产管理机构指的是生产经营单位中专门负责安全生产监督管理的内设机构，其工作人员都是 _______安全生产管理人员。A、专职B、兼职C、专职或兼职D、管生产的 8、一般来说，股份制企业、合资企业等安全生产投入资金由_______予以保证。 A、厂长 B、投资人 C、董事会 D、总经理 9、生产经营单位的主要负责人和安全生产管理人员必须具备与本单位所从事的生产经营活动相应的 ____________和管理能力。A、安全生产技术B、安全生产技能C、安全意识D、安全生产知识 10、生产经营单位应当向从业人员如实告知作业场所和工作岗位存在的_______、防范措施以及事故应急措施。 A、危险因素 B、事故隐患 C、设备缺陷 D、重大危险源 11、矿山单位主要负责人安全资格培训时间不得少于____学时。A、24 B、48 C、16 D、8 12、从业人员调整工作岗位或离岗一年以上重新上岗时，应进行相应的_____安全生产教育培训。 A、专门的 B、厂级 C、车间级 D、班组级 13、根据终身教育的观念，生产经营单位应当对在岗的从业人员进行__________的安全生产教育培训。 A、全面 B、长期 C、经常性 D、临时性 14、取得《特种作业人员操作证》者，每_________年进行一次复审。A、1 B、2 C、3 D、4 15、大量生产或使用____________级危害程度的职业性接触毒物的建设项目需要进行安全卫生预评价。 A、Ⅳ B、Ⅲ C、Ⅰ、Ⅱ D、Ⅴ 16、《安全生产法》第______条规定：生产经营单位必须为从业人员提供符合国家标准或者行业标准的劳动防护用品，并监督、教育从业人员按照使用规则佩戴、使用。A：17 B：29 C：35 D：37 17、职工原在军队服役，因战、因公负伤致残，已取得革命伤残军人证，到用人单位后旧伤复发的，按照

安全生产管理知识题库

安全生产管理知识题库 一、判断题（共650题） 1、安全生产管理，坚持安全第一，预防为主、综合治理的方针。（）答案：正确 2、矿山企业必须建立健全安全生产责任制。（）答案：正确 3、用人单位必须依法参加工伤社会保险。（）答案：正确 4、矿山建设的附属工程必须和主体工程同时设计、同时施工、同时投入生产使用。（）答案：错误 5、从业人员发现直接危及人身安全的紧急情况时，经上级同意后，方可停止作业或采取可靠的应急措施后，撤离现场。（）答案：错误 6、从业人员在作业过程中，应当严格遵守本单位的安全生产规章制度和操作规程，服从管理，正确佩戴和使用劳动防护用品。（）答案：正确 7、井下爆破作业开始前，必须确定危险区范围，但不必发出声光报警信号。( )答案:错误 8、职业病危害严重的用人单位，应当设置或者指定职业卫生管理机构或者组织，配备专职或者兼职职业卫生管理人员。( ) 答案:错误 9、安全评价把研究的所有对象都视为系统。( ) 答案:正确 10、地下开采的一个重要特点就是变剥离覆益在矿床上部及其周围的表土和岩石，并将其运至专设的场地排弃。( ) 答案:错误

11、生产巷道是为了准备采矿而开掘的巷道。( )答案:错误 12、职工患职业病时，不应当认定为工伤。( )答案:错误 13、预案编制是编制预案的重点工作，是一项专业性和系统性很强的工作。( )答案:正确 14、水是造成滑坡的一个主要因素，它能使岩体的内摩擦角和黏聚力等物理性能指标降低，从而削弱边坡岩体的抗剪强度。( )答案:正确 15、最小抵抗线是指爆炸药包的几何中心到临近自由面的垂直距离。( )答案:正确 16、中国境内用人单位，凡有关职业健康方面的工作，不需要接受统一监督管理，履行《职业病防治法》等法律法规所规定的职责。（）答案:错误 17、安全生产监督检查人员执行监督检查任务时，必须出示有效的监督执法证件。( )答案:正确 18、斜井施工斜井内人行通道一侧，每隔30-50m应设一躲避硐。( )答案:正确 19、矿山企业向职工发放保障安全生产所需的劳动防护用品有困难时，可以发现金。( )答案:错误 20、导爆索是指管壳内装入起爆药，能使药包爆炸的装置。( )答案:错误 21、杂散电流、雷电和静电是引起电雷管起爆早爆事故的主要原因。( )答案:正确

注册安全工程师安全生产管理知识知识点汇总必考点知识讲解

注册安全工程师－安全生产管理知识知识 点汇总－必考点 1. 什么叫安全？ 泛指没有危险、不受威胁、不出事故的一种状态和过程。 2. 什么是安全生产？ 答：安全生产是为了使生产过程在符合物质条件和工作秩序下进行的，防止发生人身伤亡和财产损失等生产事故，消除或控制危险、有害因素，保障人身安全与健康、设备和设施免受损坏、环境免遭破坏的总称。 3. 什么是安全生产管理？ 答：针对人们在生产过程中的安全问题，运用有效的资源，发挥人们的智慧，通过人们的努力，进行有关决策、计划、组织和控制等活动，实现生产过程中人们与机器设备、物料、环境的和谐，达到安全生产的目的。 4. 什么是“三违”现象？ 答：违章指挥；违章操作；违反劳动纪律。 5. 我国当前努力构建的安全生产工作格局是什么？ 答：政府统一领导、部门依法监管、企业全面负责、群众参与监督、全社会广泛支持。 6. 什么是事故？ 答：造成人员死亡、伤害、职业病、财产损失或其他损失的意外

事件。 7. 什么是事故隐患？ 答：生产系统中可导致事故发生的人的不安全行为、物的不安全状态和管理上的缺陷。 8. 什么是危险？ 答：系统中存在导致发生不期望后果的可能性超过了人们的承受程度。 9. 什么是本质安全？ 答：设备、设施或技术工艺含有内在的能够从根本上防止发生事故的功能。包括“失误——安全”功能（操作者即使操作失误，也不会发生事故或伤害，或者说设备、设施和技术工艺本身具有自动防止人的不安全行为的功能）和“故障——安全”功能（设备设施或技术工艺发生故障或损坏时，还能暂时维持正常工作或者自动转变为安全状态）两个部分。 10. 安全生产“五要素”分别是什么？相互关系如何？ 答：安全生产“五要素”是指（1）安全文化，即安全意思，是存在于人们头脑中，支配人们行为是否安全的思想；（2）安全法制，即安全生产法规和安全生产执法；（3）安全责任，主要指搞好安全生产的责任心；（4）安全科技，是指安全生产科学与技术；（5）安全投入，保证安全生产必须的经费。 安全生产“五要素”既相对独立，又是一个有机统一的整体，相辅相成甚至互为条件。

安全生产管理知识真题答案附后

安全生产管理知识真题答 案附后 Newly compiled on November 23, 2020

【经典资料，ＷＯＲＤ文档，可编辑修改】 【经典考试资料，答案附后，看后必过，ＷＯＲＤ文档，可修改】 一、单选题 1、根据生产安全事故造成的人员伤亡和直接经济损失，一般将事故分为特别重大事故、重大事故、较大事故和一般事故。按造成的直接经济损失划分，重大事故的标准是（）。 A、1000万元以下 B、1000万元以上（含1000万元），3000万元以下 C、3000万元以上（含3000万元），5000万元以下 D、5000万元以上（含5000万元），1亿元以下 2、海因里希将事故因果连锁过程概括为五个要素，并用多米诺骨牌来形象地描述这种事故因果连锁关系。五个要素为（）。 A、人的缺点、人质不安全行为或物的不安全状态、能量意外释放、事故、伤害 B、遗传及社会环境、人的缺点、屏蔽失效、事故、伤害 C、人的缺点、管理缺陷、人的不安全行为或物的不安全状态、事故、伤害 D、遗传及社会环境、人的缺点、人的不安全行为或物的不安全状态、事故、伤害 3、中宣部、国家安全生产监管总局、公安部、广电总局、全国总工会、团中央和全国妇联等组织开展了2011年全国“安全生产月”活动，该活动的主题是（）。 A、关爱生命、安全发展 B、安全责任、重在落实 C、安全发展、预防为主 D、治理隐患、防范事故 4、为了加强安全生产工作，我国对若干具有较高生产安全风险的企业实行了安全许可制度。下列企业中，实行安全许可制度的是（）。 A、道路运输企业、危险化学品生产企业、民用爆破器材企业 B、烟花爆竹生产企业、民用爆破器材生产企业、冶金企业 C、危险化学品生产企业、矿山企业、机械制造企业 D、石油天然气开采企业、建筑施工企业、危险化学品生产企业 5、在企业安全生产管理过程中，对于不同岗位所需安全生产管理人员的安排，要根据其个人从业经验、能力等综合因素决定，这体现了（）。 A、整分合原则 B、能级原则 C、3E原则 D、激励原则 6、甲公司投资建设码头项目，由乙公司对该项目设计、施工总承包。其中，基础土石方工程分包给丙公司。丙公司在浇注混凝土过程中，由于丁公司（混凝土供应商）混凝土车胶管摆动，将正在浇注混凝土的丙公司一名员工打死。该事故的事故发生单位为（）。 A、甲 B、乙 C、丙 D、丁