应用环磷酰胺对免疫抑制模型的建立及免疫抑制模型的检测

应用环磷酰胺对免疫抑制模型的建立及免疫抑制模型的检测

摘要

目的：应用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型并检测免疫抑制模型建立是否成功方法：十六只小鼠分为四大组，每组四只。将四只小鼠平均分为两组，分别为对照组和免疫抑制组，第一天对两组的四只小鼠进行初次免疫，对照组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，免疫抑制组小鼠分别注射0.4mlNS 和0.4mlOVA-AL(OH)3。此后分别于第8、10、12、14天给对照组小鼠注射0.4mlNS，给免疫抑制组小鼠注射100mg/kg的CTX。于第十五天对两组小鼠加强免疫，对照组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，免疫抑制组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，即四组分别为NS-NS组、OVA-NS组、NS-CTX组、OVA-CTX组，免疫抑制模型建立。用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬墨汁试验对天然免疫功能进行检测，淋巴细胞转化试验对细胞免疫功能进行检测，双向免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验对体液免疫功能进行检测。

结果：细胞免疫的检测（淋转实验）结果全为阴性，吞噬细胞功能的检测（吞噬实验）结果为阴性，体液免疫的检测（双扩实验和ELISA）结果有三项测定项目为阳性。

结论：虽然本实验不足以证明CTX对免疫功能的抑制作用，但从一些数据可以看出CTX的免疫抑制功能。

Abstract

Objective:cyclophosphamide was applied to establish the mice immunos uppression model and detection whether the immunosuppression model s uccess or not.

Meyhod:Divid the 16 mice into four groups, each group of four. Divid the four mice into two groups, control group and immunosuppressive gro ups. On the first day giver primary immune to the two groups of fou mic e, Control group mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (OH) 3 0.4 ml, Immunosuppressive mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (O H) 3 0.4 ml. In 8, 10, 12, 14 days inject 0.4 ml NS to the control group mice, inject 100 mg/kg CTX to the immunosuppressive mice. In the fift eenth day give strengthen immunity to the two groups of mice. Control g roup mice were injected NS 0.4 ml and OVA - AL (OH) 3 0.4 ml, Immu nosuppressive mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (OH) 3 0.4ml, which means the four groups were NS-NS group, OVA-NS grpoup, NS -CTX group, OVA-CTX group.,Immunosuppression model is established. Use macrophage cell in abdominal cavity of mice phagocytosis ink expe riment to test the natural immune function, The lymphocyte transformatio n test to test the cellular immune function, double immunodiffusion test, ELISA to test the humoral immune function.

Result: The results cellular immune detection (lymphocyte transformation test) were all negative, the result Phagocytes function detection (Consuming experiment) was all negative, three of the results of humoral immunity test ( double immunodiffusion test and ELISA) are positive.

Conclusion：Although this experiment is not enough to prove that CTX ‘s inhibitory effect on the immune function, but the CTX’s immunosuppressive function can be seen from some of the datas.

关键词：免疫抑制环磷酰胺固有免疫体液免疫细胞免疫

引言

目前化疗仍是临床上治疗肿瘤的三大有效手段之一,化疗在杀灭患者体内的癌细胞方面有很好的效果,但均有不同程度的毒副作用,如化疗后往往会出现白细胞减少,特别是中性粒细胞减少,血小板减少等情况，严重的会造成人体免疫功能降低甚至是免疫功能缺陷[1],随着肿瘤化疗的不断发展，肿瘤的治疗效果有了很大提高，但其免疫抑制的毒副作用却难以克服。近年，对免疫增强剂的研究多有报道，在免疫增强剂的研究中，常用到免疫抑制模型，因此如何建立免疫抑制模型成为免疫增强剂作用评价的关键。目前常用的化学造模剂有环磷酰胺、氢化可的松、地塞米松、环孢素A、长春新碱等。环磷酰胺是治疗恶性肿瘤最常用的烷化剂代表药物，其作用主要是破坏DNA 的结构，从而阻断其复制，导致细胞死亡，具有广谱抗癌作用，是联合化疗、手术和放疗辅助化疗的常用药物之一。

[2]环磷酰胺作为一种免疫抑制剂，已有大量研究表明其能抑制动物的体液和细胞免疫应答，造成动物的免疫抑制。本实验用环磷酰胺建立免疫抑制模型，从固有免疫和获得性免疫两方面用四种试验检验了免疫抑制模型是否成功建立。

1.材料与方法

1.1材料

试剂和器材：盐水（NS）、OVA+AL（OH）、33.5%苦味酸培养液（IMDM) 、5%FCS ConA （10μg/ml) 、白细胞计数液（2%冰醋酸）、MTT（5mg/ml)、二甲亚砜（DMSO)、 1.5%琼脂、PBS、洗液(PBS-Tween20)、封闭液、酶标抗体(HRP-GaM) Giemsa-Wrights 染液、5%苦味酸、酶标仪等。

实验动物：共分为四大组，每组将四只小鼠平均分为两组，分别为对照组和免疫抑制组，第一天对两组的四只小鼠进行初次免疫，对照组小鼠分别注射0.4mlNS 和0.4mlOVA-AL(OH)3，免疫抑制组小鼠分别注射0.4mlNS 和0.4mlOVA-AL(OH)3。此后分别于第8、10、12、14天给对照组小鼠注射0.4mlNS，给免疫抑制组小鼠注射100mg/kg的CTX。

1.2方法

1.2.1 加强免疫：对对照组和免疫抑制组的小鼠加强免疫，注射生理盐水（NS）：先用碘酒消毒小鼠头颈部，然后用1ml注射器吸取生理盐水0.4ml，在头颈部皮下注射生理盐水0.2ml，分3点注射；剩余的0.2ml进行腹腔注射。注射OVA：先用碘酒消毒小鼠头颈部，将(OVA+ AL(OH)3)混合物0.4ml吸入1ml注射器中，注射方法同上。

1.2.2 T淋巴细胞转化试验细胞免疫功能检测（T淋巴细胞功能测定）：实验动物无菌取脾和胸腺，细胞计数，调细胞浓度后在三复孔中加样。培养48小时后加入MTT，继续培养两小时，小心吸弃上清后加入DMSO震荡，使颗粒全部溶解，酶标仪测吸光度判定结果。

1.2.3 双向免疫扩散试验体液免疫功能B细胞功能检测：1.5%琼脂在微波炉内加热至完全溶解。将刻度吸管预热后，用刻度吸管吸取5ml琼脂加在载玻片表面，冷却15min后形成均匀的琼脂凝胶。倍比稀释抗血清，稀释度依次为1：1，1：3，1：7及1：15。待琼脂凝固后，按照打孔纸样打孔，每张载玻片打两组梅花孔。加样，Ag 和Ab每孔加满为止。放入湿盒，37℃扩散24小时。

1.2.4 ELISA试验体液免疫功能（B细胞功能检测）：用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA）稀释（10μg/ml) 。100 μl/孔加入聚苯乙烯酶标板中，4℃过夜。弃去孔内溶液，加入150 μl/孔2%BSA（封闭液），43℃，60mins。加样：弃去封闭液，加倍比稀释的待测免疫血清100 μl/孔43℃孵育40mins ；孵育结束后，用PBS-T洗液加满孔，每次3min，洗三次，在吸水纸上排干液体。酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG)，100μl/孔，置43℃孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次3min，在吸水纸上排干液体。于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100μl/孔，室温下避光显色。加50 μl/孔2M硫酸(终止液)。判定：肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的最高抗体稀释度为该抗体的效价。酶标仪测量： 490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照孔A值相比其比值≥2，相对应的最高抗体稀释度为该抗体的效价。

1.2.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬墨汁试验天然免疫功能吞噬细胞功能：实验前2天，给小鼠腹腔注射3％淀粉溶液１ml。给小鼠腹腔注射3％鸡红细胞悬液0.5ml，用苦味酸给小鼠做好标记，放回笼中；60min后脱颈椎处死小鼠。立即用酒精棉球消毒，剪开腹部皮肤，用镊子提起腹膜，用5ml注射器向腹腔打入2ml生理盐水，轻揉腹部1min后用镊子提起腹膜，用剪刀将腹膜剪开一小口，用1ml加样器反复吹打腹腔液后吸出腹腔液加入EP管中备用。充分吹打混匀EP管中的腹腔液后立刻吸取30ul加到玻璃板上并做好标记，再加Giemsa-Wright’s染液30ul 到玻璃板上的腹腔液中，静置染色2分钟。盖上盖玻片到显微镜下观察计数。

2.结果及分析

1.淋巴细胞转化试验结果

分析：淋转实验结果如上表所示，由于小鼠脾脏和胸腺的刺激指数均2，不足以作为免疫功能抑制结果的依据，故小鼠的细胞免疫结果为阴性。

2.双向免疫扩散试验及ELISA试验结果

分析：双扩实验结果效价也称滴度，它的表示法与抗体的稀释倍数有关，一般以该抗体能与其对应的抗原发生可见反应的最高稀释度来表示。如上表所示，NS-NS组与NS-CTX组结果为阴性；但与O V A-N S组相比，OVA-CTX组的抗体效价明显降低，小鼠的体液免疫功能受到抑制，结果为阳性。

ELISA实验结果肉眼观察，与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的最高稀释度为该抗体的效价。如下表所示，与NS-NS组相比，NS-CTX组的抗体明显减少，结果为阳性；与O V A-N S组相比，O V A-CT X组的抗体明显减少，小鼠的体液免疫受到抑制，结果为阳性.

3.吞噬细胞试验结果

分析：吞噬实验结果用40倍镜查找观察计算吞噬百分率。吞噬百分率:有吞噬作用的巨噬细胞数／计数的总巨噬细胞数×100％如上表所示，与NS-NS组相比，NS-CTX组的吞噬功能有两组受到抑制，CTX-OVA与NS-OVA相比，仅有一组可以看出吞噬功能受到抑制。

3.讨论：

本次试验中，细胞免疫的检测（淋转实验）结果全为阴性，吞噬细胞功能的检测（吞噬实验）结果为阴性，体液免疫的检测（双扩实验和ELISA）结果有三项测定项目为阳性。根据相关免疫力功能评价标准[3]：（1）增强免疫力功能判定在细胞疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品抑制免疫力功能；（2）细胞免疫功能结果判定细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两

个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性；（3）体液免疫功能结果判定体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性；（4）单核-巨噬细胞功能结果判定单核-巨噬细胞功能测定项目中一个实验的两个组结果阳性，可判定单核-巨噬细胞功能结果阳性。

综上所述，本次试验不足以证明环磷酰胺抑制了小鼠的免疫功能，但是从实验某些数据可以看出对免疫功能的抑制作用，许多研究证明了环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制效果。本实验失败的原因可能是操作的规范程度和试剂器材质量等。由于本次实验内容较多，步骤复杂，实验时间较长，而且作为第一次接触免疫实验的我们缺乏经验，操作不熟练，导致有很多测定失败，这是失败的主要因素。比如在淋转试验时计数细胞及调细胞浓度是有同学因为计算错误导致试验数据测定错误。吞噬实验中，由于切片制作过程出现失误，很多组没有在镜下看到细胞。总之，虽然本实验不足以证明CTX对免疫功能的抑制作用，但从一些数据可以看出CTX的免疫抑制功能。

4.参考文献：

[1]. 刘艳芳,唐庆九,张劲松,杨焱,贾薇,冯娜,唐传红,周帅拮抗化疗药物体外免疫抑制模型的建立及活性成分筛选食用菌学报,2010，2012，16(40):7486-7490. [2] 杨宪勇. 应用环磷酰胺构建C57BL/6J 小鼠免疫抑制模型[J]. 中国组织工程研究

[3] 保健食品检验与评价技术规范[P]. 中华人民共和国卫生部,2003

环磷酰胺冲击疗法在狼疮性肾炎中的应用进展

环磷酰胺冲击疗法在狼疮性肾炎中的应用进展狼疮性肾炎引发肾功能衰竭的死亡率极高，而以往肾上腺皮质激素等激素 治疗方式起效慢、并发症多，且具有明显的毒副作用，如今医学界多使用环磷酰胺冲击疗法治疗狼疮性肾炎，本研究将对该疗法的药理原因、优势特点及弊端等做出阐述。 标签：环磷酰胺；冲击疗法；狼疮性肾炎；系统性红斑狼疮；进展 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一类自身免疫系统疾病，其病因尚不明确，多导致自身抗体与抗原结合为循环免疫复合物，对自身组织和器官造成损害，根据其累及的器官和组织的区别，可分类为狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）、神经精神性狼疮、狼疮性肺炎、狼疮性心肌炎以及狼疮性肝炎等。其中肾脏是SLE最常见的累及器官，引发狼疮性肾炎后，若患者无法得到及时治疗，其恶化为肾衰竭速度很快，蒋萍萍等[1-2]在对多例LN患者的治疗、护理中发现，SLE死亡病例中，30%以上是由于狼疮性肾炎导致的肾功能衰竭，死亡率很高。环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）是一类具有细胞毒性的免疫抑制剂，自19世纪50年代以来，CTX冲击治疗LN逐渐被医学界广泛关注，许进雄[3]认为其良好的疗效和较低的副反应率，是其目前临床广泛应用的主要原因。 1?LN治疗现状 在SLE患者中，肾累及的机率很高，几乎所有患者均伴有不同程度的肾脏损害。陈山源等[4-6]对SLE的病理及诊断研究中发现，该病累及严重的患者会出现LN病理学特征：肾脏组织内存在大量免疫复合物、补体、炎症细胞等沉积，肾单位遭到破坏，形成晚期纤维化。因此，梁春红[7]认为，治疗LN的重点为减轻肾脏炎症、修复肾脏功能和避免或减缓其肾衰竭进程。20世纪60年代，医学界多用大剂量皮质激素对LN进行治疗，疗效较为可观，但何庆南[8]的研究表明，激素治疗会导致许多并发症的出现，且无法有效减缓肾衰竭进程，因此，70年代初有人提出了CTX治疗手段，经张延等[9]不断优化与改善，该疗法短期效果明显，副作用率低，至今仍为临床LN治疗的首要方法。 2?CTX冲击疗法介绍 2.1?CTX的药理作用 CTX是一类人工合成的烷化免疫抑制剂，合成原料为氮芥与磷酸胺基，在临床免疫抑制方面应用广泛。原型CTX并无细胞毒作用，但在生物体内，肝微粒体酶和细胞色素P-450可将其氧化裂解为醛磷酰胺（Aldophosphamide），经血液循环到达细胞后，醛磷酰胺可进一步分解为具有高细胞毒和烷化作用的磷酰胺氮芥，可与分裂旺盛细胞的DNA形成烷化交叉连接，作用于细胞分裂的S期和G2期，是一种影响核酸的复制的细胞周期非特异性药物，使细胞分裂受到阻滞。吴小川[10]在对LN的病理分型治疗中发现，CTX对静息状态下的细胞影响不大，对免疫细胞有较大的影响：（1）前期可显著降低B淋巴细胞的数量，中后期同时抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖；（2）抑制淋巴细胞在接受抗原刺激后的母细胞转化；（3）降低体内免疫球蛋白指标。 2.2?CTX冲击治疗的优势 按照左正才等[11]制定CTX冲击治疗方案，每隔一定时间给予CTX静脉注射：（1）小剂量：400 mg/次，1次/2周，持续3个月后减少为1次/4周；（2）

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临床免疫学检验 1、免疫：是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能 2、免疫防御（对外）；免疫自稳（防自身免疫病）；免疫监视（防肿瘤）。 3、中枢免疫器官：骨髓、胸腺；外周免疫器官：淋巴结、脾脏（最大）、黏膜相关淋巴组织 4、 B 细胞：通过识别膜免疫球蛋白来结合抗原，介导体液免疫；B细胞受体=BCR=mIg 表面标志：膜免疫球蛋白（SmIg）、 Fc 受体、补体受体、EB 病毒受体和小鼠红细胞受体。 成熟 B 细胞： CD19、CD20、 CD21、 CD22 （成熟 B 细胞的 mIg 主要为 mIgM和 mIgD）同时检测 CD5分子，可分为 B1 细胞和 B2 细胞。 B 细胞功能检测方法：溶血空斑形成试验（体液免疫功能）。 5、T 细胞：介导细胞免疫。共同表面标志是 CD3（多链糖蛋白）；辅助 T 细胞的标志是 CD4；杀伤 T 细胞的标志是 CD8； T 细胞受体 =TCR。 T 细胞和 NK细胞的共同表面标志是CD2（绵羊红细胞受体）； CD3＋ CD4＋CD8－ =辅助性T细胞（Th） CD3＋ CD4－CD8＋ =细胞毒性T 细胞（ Tc 或 CTL）（ T 细胞介导的细胞毒试验） CD4＋ CD25＋ =调节性T细胞（Tr或Treg） T 细胞功能检测：植物血凝素（ PHA）刀豆素（ CONA）刺激 T 细胞增殖。增殖试验有：形态 法、核素法。 T 细胞亚群的分离：亲和板结合分离法，磁性微球分离法，荧光激活细胞分离仪分离法 *E 花环试验是通过检测SRBC受体而对T 细胞进行计数的一种试验； 6、 NK细胞：具有细胞介导的细胞毒作用。直接杀伤靶细胞（肿瘤细胞和病毒感染的细胞） 表面标志： CD16（ ADCC）、 CD56。 测定人 NK细胞活性的靶细胞多用K562 细胞株，而测定小鼠胞株。NK细胞活性则常采 用 YAC-1 细 7、吞噬细胞包括：单核 - 吞噬细胞系统（MPS，表面标志外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞）和中性粒细胞。CD14，包括骨髓内的前单核细胞、（表达 MHCⅡ类分子） 8、人成熟树突状细胞（DC）（专职抗原呈递功能）：表面标志为CD1a、CD11c和CD83。 9、免疫球蛋白可分为分泌型（ sIg ，主要存在于体液中，具有抗体功能）及膜型（ mIg，作为抗原受体表达于 B 细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白） 10、免疫球蛋白按含量多少排序：IgG＞IgA＞IgM＞IgD＞IgE五类（按重链恒定区抗原性（CH）排序） 免疫球蛋白含量测定：单向环状免疫扩散法、免疫比浊法。 11、免疫球蛋白的同种型抗原决定簇位于恒定区（CH、CL） 12、抗体由浆细胞产生。抗体分子上VH和 VL（高变区）是抗原结合部位。

免疫比浊法检测免疫球蛋白

免疫比浊法检测免疫球蛋白 一、实验目的 利用免疫比浊法绘制标准曲线，并检测样品中免疫球蛋白的浓度。（本小组检测的为IgG样品） 二、实验原理 1.抗原抗体反应(Antigen-antibody reaction)：抗原与其刺激机体产生的相应抗体在体内或体外发生特异性结合的反应。反应特点有：特异性、比例性、可逆性、敏感性。影响因素有：电解质、温度、酸碱度。 2.免疫比浊法：合适比例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG作用下形成微粒，使样品浊度发生变化。当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱，根据光的强度改变可测得微粒浓度。 分类：①透射比浊法（Transmission tubidimetry）当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈正相关。当抗体浓度固定（过量），样品的浊度与其中所含抗原量成正比。（特点）透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的时间较长。②散射比浊法（Nephelometry）光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光，其强度与复合物的数量和散射夹角成正比，与光的波长成反比。（特点）优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。 本实验采用透射法。 3.聚乙二醇PEG的作用：在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，3~4％的聚乙二醇，可破坏抗原抗体的水化层，促进抗原抗体靠近反应，但如浓度不适合，会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。 三、实验材料 免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)测定试剂(试剂1[PEG]，试剂2[羊抗人IgA, IgG]）（1管/每组）免疫球蛋白A, G(IgA,IgG)校准品，蒸馏水，血清样本（1管） 微量加样枪、ep管（1.5mL离心管） 酶标仪、水浴箱 四、实验步骤 1.在7个EP管中各加250μL IgG试剂1（PEG）。 2.7管分别加入蒸馏水、校准品原液、1：2校准品、1：4校准品、1：8校准品、1：16校准品、样本各2μL。 3.混匀后37℃水浴5min。 4.7管各加入85μL IgG试剂2（羊抗人IgG）。 5.混匀后37℃水浴10min。 6.分别吸取200μL至96孔酶标板中，用酶标仪在700nm处读取OD值。 五、实验结果与数据处理 2.标准曲线

医学检验免疫学检验归纳总结

医学检验免疫学检验归纳 总结

三大免疫结合反应 直接凝集反应玻片凝集反应 试管凝集反应 间接凝集反应间接血凝试验 胶乳凝集试验 凝集反应 P47 明胶凝集试验 自身细胞凝集试验 抗球蛋白试验直接coombs试验（RBC膜上的不完全抗原） 间接coombs试验（血清中的游离抗原） 液体内沉淀试验絮状沉淀试验抗原稀释法 抗体稀释法 方针滴定法 免疫浊度测定 沉淀反应凝胶内沉淀试验单向扩散试验 双向扩散试验 免疫电泳技术对流免疫电泳 CIEP 火箭免疫电泳RIE 免疫电泳IEP 免疫固定电泳 交叉免疫电泳 三大标记技术 一、放射免疫：放射免疫：

免疫放射： 二、荧光免疫技术P81 荧时间分辨荧光免疫测定（方法）双抗体夹心法 光 免固相抗体竞争法 疫 分固相抗原竞争法 析 类 型 荧光偏振免疫测定测定 荧光酶免疫测定（方法）双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法 三、酶免疫技术 P95 酶免疫技术分类均相酶免疫测定 EMIT 克隆酶测定分析 异相酶免疫测定异相液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 酶联免疫吸附试验ELISA （方法）Ab 双抗体夹心法 双位点一步法 竞争法 Ag 间接法 双抗体夹心法 竞争法 捕获法 其他标记技术 化学发光免疫分析技术 CLIA 直接化学发光免疫分析CLIA P109 类型化学发光酶免疫分析CLEIA 电化学发光免疫分析ECLIA 生物素，亲和素放大技术

固相膜免疫测定免疫试验IFA 免疫层析试验 ICA 膜免疫测定的种类斑点酶免疫吸附试验 DOT-ELISE 酶联免疫斑点试验 ELISPOT 免疫印迹法 IBT/EITB 放射免疫浊度试验 RIPA 免疫细胞 1、分离方法外周血单个核细胞分离 PBMC P161 淋巴细胞分离贴壁粘附法 吸附柱滤过法 磁铁吸引法 Percoll分离液法 T细胞和B 细胞的分离 E花环沉降法 尼龙毛柱分离法 T细胞亚群分离亲和板结合分离法 磁性微球分离法 荧光激法细胞分离仪分离法 2、免疫细胞表面标志的检测方法抗体致敏细胞花环法 P174 免疫细胞化学法 免疫荧光法 FCM 3、功能检测 T 细胞增殖试验方法形态学 P178 3H-TdR掺入法 淋巴细胞 T细胞 MTT比色法 CFSE（活细胞染料） T细胞分泌功能检测 T细胞介导的细胞毒性试验 体内试验 B细胞：B细胞增殖试验、溶血空斑实验、ELISPOT、体内试验 NK细胞：..........

常用细胞免疫检测方法及其用途

细胞免疫功能检测常用有哪几种方法 一、迟发型过敏反应的体外检测方法 皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应（DTH）的两种常用方法。皮肤试验中诱发对曾经使病人致敏的抗原的再次应答，而接触性过敏是测试受者对从未接触过的物质发生致敏的能力。 1．皮肤试验用皮肤试验诊断DTH，常用的抗原有结核菌纯蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人类试验时在前臂皮内注射少量可溶性抗原，24～48小后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于10mm即被看作为阳性。表明受试者对该病原菌有了一定的细胞免疫能力，若皮试无反应，可用更高浓度的抗原重复试验，若仍无反应即为阴性，需排除皮试技术误差，也可能受试者从未接触过此抗原，也可能由于细胞免疫功能缺损，或由于细胞免疫功能缺损，或由于严重感染（麻疹、慢性播散性结核）造成的无反应性。 2．接触性过敏常应用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）诱发接触性过敏。化合物与皮肤蛋白质结合而导致DTH反应。在动物试验时，初次皮肤上涂抹DNCB后间隔7～10天再激发刺激，则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。 二、细胞免疫的体外检测方法 体外检测淋巴细胞的数量和功能，最易采集的是血标本，首先需分离或纯化淋巴细胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重为1.077的淋巴细胞分层液，当将血液重叠于淋巴细胞分层液之上离心时，由于红细胞（1.092）、多形核白细胞（1.090）、淋巴细胞（1.070）的比重不同而相互分开。淋巴细胞和单核细胞在血浆和分层液交界处形成一薄层。仔细分出这一薄层的细胞，其中淋巴细胞占80%，单核细胞占20%，淋巴细胞中T细胞占80%，B细胞占4%～10%，其作为非DT、非B细胞。 1．T细胞计数

免疫检测方法

免疫学检测方法 免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。随着学科间的相互渗透，免疫学涉及的范围不断扩大，新的免疫学检测方法层出不穷。免疫学方法的应用范围亦在日益扩大，不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法，也为众多学科的研究提供了方便。本章将从抗原、抗体、免疫细胞和细胞因子检测等方面概括介绍试验的基本类型、原理和主要用途，并对分子生物学技术(分子杂交、转基因、多聚酶链反应)在免疫学领域的应用作一简要介绍。 第一节检测抗原抗体的体外方法 抗原与相应抗体相遇可发生特异性结合，并在外界条件的影响下呈现某种反应现象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗体)检测未知抗体(或抗原)。试验所采用的抗体常存在于血清中，因此又称之为血清学反应(serological reaction)。 一、抗原抗体反应的特点 (一)抗原抗体结合的特异性 抗原借助表面的抗原决定簇与抗体分子超变区在空间构型上的互补，发生特异性结合。同一抗原分子可具有多种不同的抗原决定簇，若两种不同的抗原分子具有一个或多个相同的抗原决定簇，则与抗体反应时可出现交叉反应(cross reaction)。 (二)抗原抗体结合的可逆性 抗原抗体结合除以空间构型互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的非共价方式结合，结合后形成的复合物在一定条件下可发生解离，回复抗原抗体的游离状态。解离后的抗原和抗体仍保持原有的性质。抗原抗体复合物解离度在很大程度上取决于特异性抗体超变区与相应抗原决定簇三维空间构型的互补程度，互补程度越高，分子间距越小，作用力越大，两者结合越牢固，不易解离；反之，则容易发生解离。 (三)抗原抗体结合的比例性与结合物的可见性 抗原与抗体的结合能否出现肉眼可见的反应，取决于两者的比例。若比例合适，则可形成大的抗原抗体结合物，出现肉眼可见反应现象；反之，虽能形成结合物，但体积小，肉眼不可见。由于这种分子比例的差异，分别形成了三种区带现象。等价带表示抗原与抗体比例最合适，形成大而多的结合物，此时在反应体系中测不出或有极少游离的抗原或抗体；抗体过剩带(前带)和抗原过剩带(后带)皆表示抗原与抗体的比例不合适，所形成的结合物少且小，其反应体系中存在着游离的抗原或抗体。抗原抗体分子的比例与结合物大小的关系如图18.1所示。小分子可溶性抗原，因其表面积大，容易导致后带现象；而细胞等颗粒性抗原，在与抗体反应时则易出现前带现象。因此在抗原抗体检测中，为能得到肉眼可见的反应，在了解抗原的物理性状之后，对抗原或抗体进行稀释，以调整二者的比例。

青蒿琥酯对CLP免疫抑制模型小鼠的保护作用及其作用机制的研究

目录 英文缩略词对照表 (1) 英文摘要 (3) 中文摘要 (10) 论文正文青蒿琥酯对CLP免疫抑制模型小鼠的保护作用及其作用机制的研究 (16) 第一章前言 (16) 第二章小鼠CLP脓毒症免疫抑制模型的建立与评价 (19) 2.1 材料与方法 (19) 2.2 实验结果 (24) 2.3 小结 (37) 第三章青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制小鼠的治疗作用 (38) 3.1 材料与方法 (38) 3.2 实验结果 (42) 3.3 小结 (54) 第四章青蒿琥酯对CLP脓毒症免疫抑制模型小鼠治疗作用的机制研究 (55) 4.1 材料与方法 (55) 4.2 实验结果 (62) 4.3 小结 (78) 全文总结 (79) 参考文献 (90) 文献综述脓毒症免疫抑制发生机制及治疗药物的研究进展 (95) 参考文献 (101) 研究生期间相关成果 (106) 致谢 (107) 万方数据

第三军医大学硕士学位论文 1 英文缩略词对照表 英文缩写 英文全称 中文全称 APCs AP antigen presenting cells ammonium persulfate 抗原呈递细胞 硫酸铵 AS artesunate 青蒿琥酯 ATCC American type culture collection 美国典型菌种保藏中心 ATP BASO Adenosine Triphosphate basophile granulocyte 三磷酸腺苷 嗜碱性粒细胞 CARS compensatory anti-Inflammatory response syndrome 代偿性抗炎反应综合征 CASP colon ascendens stent peritonitis 升结肠支架腹膜炎 CD leukocyte differentiation antigen 白细胞分化抗原 CFU colony forming unit 菌落形成单位 CLP cecal ligation and puncture 盲肠结扎穿孔术 DAB Diaminobenzidine 二氨基联苯胺 DSM DW dried skim milk distilled water 脱脂奶粉 蒸馏水 ECL EOS enhanced chemilumine scence eosinophile granulocyte 增强化学发光液 嗜酸性粒细胞 FBS fetal bovine serum 胎牛血清 GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 HLA-DR human leukocyte antigen DR 人类白细胞 DR 抗原 HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 ICU intensive care units 重症监护室 IFN interferon 干扰素 IL interleukin 白细胞介素 IRAK Interleukin-1 receptor-associated kinase 白细胞介素1受体相关激酶 LPS LYMPH lipopolysaccharide lymphocyte 脂多糖 淋巴细胞 万方数据

环磷酰胺冲击治疗肾病综合征的护理体会

环磷酰胺冲击治疗肾病综合征的护理体会 【摘要】目的探讨环磷酰胺(CTX)冲击治疗肾病综合征的护理经验,以防止或减轻并发症的发生。方法CTX剂量以8—10mg/kg冲击治疗肾病综合征，在CTX 冲击前.中.后均采用不同的护理方法和措施。结果25例肾病综合征患者的临床症状均明显缓解，其中2例出现严重胃肠道症状，3例出现一过性白细胞减少，经积极治疗护理后好转结论CTX冲击治疗肾病综合征是有效可行的方法，为取得满意的效果，护理工作显得很重要。 【关键词】肾病症状；环磷酰胺；护理 肾病综合征是由多种肾脏疾病引起的具有共同临床表现的一组综合征①泼尼松是治疗肾脏疾病的首选药物，但部分患者应用后效果欠佳，选用环磷酰胺（CTX）冲击治疗肾病综合征，并联合应用泼尼松，对于保护肾功能，延缓病情进展，降低复发率，较单一泼尼松效果好。我科自2002年1月—2006年1月来收治25例肾病综合征患者进行泼尼松联合CTX冲击治疗取得良好效果，现将有关护理体会做一报道 1.临床资料 1.1一般资料本组25例，男14例，女11例，年龄18—52岁，病程3个月—5年。全组病例均符合原发性肾病综合征的诊断标准②均为单纯应用泼尼松疗效不佳即为难治性肾病综合征患者。 1.2冲击治疗方法所有病例均采用激素联合CTX治疗，常规口服泼尼松 1mg/kg.d ,CTX以每月冲击一次，6次后改每3个月一次，总疗程2年，每次8—12mg/kg，加生理盐水100ml静脉滴注，每1—2周查白细胞，血小板1次，每次冲击治疗前后查肝肾功能 1.3疗效判断标准实验室检查，尿蛋白持续转阴，临床症状消失为显效，尿蛋白+~~++，临床症状缓解为有效，尿蛋白持续++~~+++，临床症状无明显好转为无效。

用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型

1材料与方法 1. 1. 2 主要试剂环磷酰胺、RPMI 1640 培养 液( 含L-谷氨酰胺，)、Hanks 液( HyClone)、MTT 试剂、 PBS 缓冲溶液( pH 值7. 2 ～ 7. 4，HyClone)、丝裂霉素C、SA 缓冲液，绵羊红细胞，补体( 豚鼠血清)、都氏试剂、LDH 基质液、 P815 细胞( 购于协和医科大学基础医学细胞中心)、YAC-1 细 胞、FITC-Anti-CD3、PE-Anti-CD4、PerCP-Anti-CD8 荧光抗体)。 1. 2 动物与分组 Balb /C 小鼠90 只，雌性，6 ～ 8 周龄，体重18 ～ 22g。颗粒饲料，室温(22 ± 2)℃，湿度60% ～ 80% 。 动物在实验室条件下检疫1 周后，实验分为3 项处理进 行，(1) 处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数;(2) 处理二: 测定NK 细胞活性，细胞毒性T 细胞活性;(3) 处理三:测定血 清半数溶血值。每项处理随机分为空白对照组、CTX-1 组和 CTX-2 组。 1. 3 实验方法和测定指标 1. 3. 1 剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX 的LD50为240mg / kg，以1 /4 LD50做为本试验中CTX-1 组的 CTX 剂量，即60 mg / kg 环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给予。CTX-2 组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔 注射给予动物200 mg / kg 环磷酰胺［2，3］( 用蒸馏水配制)。另设空白对照组，蒸馏水代替受试物，每日经口给予。动物灌胃 容积为0. 3ml /10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4 周 后测定各项免疫指标。 1. 3. 2 血液中T、B 淋巴细胞分类计数［4］动物处死前眼 眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3 支流式试管进行 测定，每管加入50μl 抗凝血。分别在3 管中加入CD3 /CD19 ，CD3 /CD4 /CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体。每管加 入2ml FACS 红细胞裂解液，室温下避光保存20min。1200r / min 离心5min，弃去上清液。每管再加入2ml PBS，1200r /min 离心5min，弃去上清液。加入0. 5ml PBS 混匀后上流式细胞仪进行检测。 1. 3. 3 细胞毒性T 淋巴细胞活性试验［5，6］ 1. 3. 3. 1 脾细胞悬液的制备( 效应细胞) 无菌取脾，用4 层 纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液。用Hank＇s 液洗2 次，每次离 心10min(1000r /min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0. 5ml 灭 菌水20s，裂解红细胞后再加入5ml Hank’s 液，混匀后1000r / min，10min 离心，用1ml 含10% 小牛血清的RPMI1640 完全培 养液重悬，调整细胞浓度为2 × 107 个/ml;加0. 5ml 此细胞悬 液于24 孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照孔。 1. 3. 3. 2 制备刺激细胞1000r /min，10min 离心处于对数生 长期的P815 细胞，用5ml DMEM 培养液悬浮P815 细胞于 15ml 离心管中，计数细胞。加入丝裂霉素C，相当于50μg / (2 ～ 5) × 107 个细胞。用锡纸包裹离心管以避光，在37℃水浴 30min。用Hank’s 液洗P815 细胞3 次，之后Hank’s 液悬浮

环磷酰胺冲击疗法治疗难治性肾病综合征的临床疗效

龙源期刊网 https://www.sodocs.net/doc/6c15718948.html, 环磷酰胺冲击疗法治疗难治性肾病综合征的临床疗效 作者：白敬恩魏云彪李宏 来源：《中国现代医生》2015年第20期 [摘要] 目的探讨环磷酰胺冲击疗法治疗难治性肾病综合征的临床疗效。方法回顾性分析难治性肾病综合征患者58例的临床资料，其中27例采用环磷酰胺冲击疗法联合激素治疗为观察组，31例患者单纯给予激素治疗为对照组；比较两组患者的临床疗效。结果观察组完全缓解率为66.7%，显著高于对照组（P0.05）。结论在常规治疗基础上给予环磷酰胺冲击疗法治疗难治性肾病能够显著提高缓解率。 [关键词] 环磷酰胺；冲击疗法；激素；难治性肾病综合征 [中图分类号] R692.3 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）20-0080-03 Clinical efficacy of cyclophosphamide pulse therapy for refractory nephrotic syndrome BAI Jing'en WEI Yunbiao LI Hong Department of Nephrology， Lvliang City People's Hospital in Shanxi Province， Lvliang 033000， China [Abstract] Objective To discuss clinical efficacy of cyclophosphamide pulse therapy for refractory nephrotic syndrome. Methods The clinical data of 58 cases with refractory nephrotic syndrome were respectively analyzed. 27 cases of observation group were treated by cyclophosphamide pulse therapy， and 31 cases of control group were treated by hormone therapy alone. Clinical efficacy of two groups was compared. Results Remission rate of observation was 66.7%， which was higher than control group（P0.05）. Conclusion Remission rate is improved with cyclophosphamide pulse therapy for refractory nephrotic syndrome. [Key words] Cyclophosphamide； Pulse therapy； Hormone； Refractory nephrotic syndrome 肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）可由多种病因引起，以肾小球基膜通透性增加和 表现为大量蛋白尿低蛋白血症、高度水肿、高脂血症的一组临床症候群。激素是治疗肾病综合征的常用药物，但是对于难治性肾病单纯使用激素治疗，效果欠佳。环磷酰胺是烷化剂类抗肿瘤药，除了抗肿瘤外，还具有很强的免疫抑制作用，临床上也用于肾病综合征以及免疫性疾病的治疗[1，2]。我院采用环磷酰胺冲击疗法联合激素治疗难治性肾病综合征，取得了较好的效果，现将结果报道如下。

免疫检测

免疫检测技术的研究进展 摘要：本文综述了近几年来出现的免疫检测技术的新方法，简要介绍了它们的原理、特点及其应用，并做出相应的比较。并论述了免疫检测技术在食品检验中应用的主要领域。免疫检测技术是基于抗体抗原反应的原理对待测物进行定量定性分析的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、简便等优点，是现代生命科学的重要研究手段，在生物分析检测领域有着广泛的应用前景。 关键词：免疫检测技术；分子印迹技术；流动注射免疫；免疫传感器；脂质体；MIA；应用 美国物理学家Yallow和Berson于1959年利用放射免疫检测法(Radioimmunoassay，RIA)检测血清中的胰岛素，从而将免疫检测方法引入化学分析界。从此，免疫检测技术被广泛应用于生物分析检测。 免疫检测技术是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定量或定性分析的检测方法。其基本原理是抗体和抗原之间的相互作用，其中抗原和抗体之间反应的特异性和灵敏性是免疫检测技术的关键。目前应用最广的免疫检测技术主要有：酶联免疫吸附试验(enzyme—linkedim—munosorbentassay，ELISA)，免疫荧光技术(im—munofIuorescenceassay，IFA)，免疫凝集试验(im—muneagglutination，IA)和免疫沉淀(immunopre—cipitate，IP)等，它们在生物领域发挥了极其重要的作用。 随着样品检测项目的不断增加，以及对快速、简单的原位检测的需求，促进了免疫检测技术的发展，出现了分子印迹技术(molecularimprintingtechnique)、流动注射免疫检测(flow injectionim— munoassay)、脂质体免疫检测(1iposomeimmunoas—say)、免疫传感器(immunosensor)，以及多组分免疫检测(multicomponentimmunoassay)等新免疫检测技术。 1 新型免疫检测技术简介 1．1分子印迹技术 分子印迹技术是最近10多年来发展起来的一种交叉技术，是模拟抗体抗原相互作用的具有特异选择性识别位点性质的技术。它利用化学手段合成一种高分子聚合物——分子印迹聚合物(mo—lecularlyimprintingpolymer，MIP)。MIP能够特异性吸附作为印迹分子的待测物，在免疫分析中可以取代生物抗体。与生物抗体比较，MIP具有稳定性好、制备周期短、费用低、易于保存和可以在复杂 环境中应用等优势。该技术是传统意义的蛋白质类抗原抗体免疫检测技术的延伸。 分子印迹技术研究在国外得到较高重视，特别是在生物药物检测。利用分子印迹技术第一次合成恩氟沙星的MIP，显示出与结构相似物环丙沙星的高度交叉反应性，能选择性识别混合抗生素中的喹诺酮类，并应用于清除复杂样品中的喹诺酮类的吸附剂；应用合成的吲哚美辛MIP作为识别物质，以及可溶性锰(1V)一甲醛一吲哚美辛的检测体系，建立了新的吲哚美辛检测的分子印迹化学发光方法，检测极限为4×10一g／mL。分子印迹技术尚存在一些缺点，例如水溶液或极性溶剂中进行分子印迹和识别仍是一大难题。该技术目前处于研究阶段，主要是以有机小分子化合物为检测对象。小分子化合物属于半抗原，制备相应的免疫检测用抗体，需要与大分子蛋白质连接，分子印迹技术的应用则免除了这方面的考虑。 1．2流动注射免疫检测 流动注射免疫分析技术(FIIA)是将流动注射分析与免疫分析结合的一种新的免疫检测技术。目前已在药物分析、环境监测及农药残留检测等生物检测方面得到了广泛应用。流动注射免疫分析一般采用异相免疫反应模式，使用固相载体固定抗原或者抗体，从而使游离部分从免疫反应结合物中分离。关于流动注射免疫分析的研究较多。钱昌顺L1检

环磷酰胺冲击疗法联合激素治疗肾病综合征的疗效观察

表2 两组患者治疗前后血流变指标比较 （x ?s ，mPa ·s ） 组别例数全血黏度高切 治疗前 治疗后全血黏度中切 治疗前 治疗后全血黏度低切 治疗前 治疗后血浆黏度 治疗前 治疗后观察组237.6?1.3 6.0?1.3*9.2?1.57.1?0.9*12.9?1.8 9.0?1.8* 1.8?0.4 1.3?0.1*对照组23 7.4?1.37.1?1.0* 9.8?1.39.0?1.2* 13.0?2.012.5?2.1* 2.1?0.1 1.9?0.1* P 值 注：与治疗前比较，* P <0.05 参考文献1 鲁东志.舒血宁注射液治疗脑梗塞35例［J ］.实用中医内科杂 志，2012，19（1）：53. 2 胡晓懿.银杏叶注射液治疗肺心病的疗效分析［J ］.当代医学，2012，18（9）：138 140. 3 张弘，蔡柏蔷.第八届全国肺心病学术会议纪要［J ］ .中华结核和呼吸杂志，2012，25（8）：503 504. 4 王雁，杨义芳.银杏叶的药理作用及机制研究进展［J ］ .中国现代应用药学，2011，18（1）：1 3. 5 邓晓琴，余琴，林红，等.慢性肺心病急性期患者血液流变观察［J ］ .上海医学检验杂志，2011，10（3）：178 180.6 蒲蓉，赖幼林.刺五加注射液对肺心病高勃血症血液流变学的影 响［J ］ .云南中医中药杂志，2012，21（6）：22 23.7 陈主初，郭恒怡，王树人，等.病理生理学［M ］.北京：人民卫 生出版社，2011：157 160. （收稿日期：2014 09 13） 环磷酰胺冲击疗法联合激素治疗肾病综合征的疗效观察 吴征 作者单位：418400湖南省怀化市第二人民医院靖州分院 【摘 要】 目的 观察环磷酰胺冲击疗法联合激素治疗肾病综合征（NS ）的临床效果。方法 选取2013年3 月—2014年3月怀化市第二人民医院靖州分院收治的NS 患者60例，按不同治疗方法分为观察组与对照组，各30例。观察组患者予以环磷酰胺冲击疗法联合激素治疗，对照组患者予以常规激素治疗。观察两组患者临床疗效、不良反应及各项指标变化情况。结果 观察组患者总有效率为93.3%，高于对照组的80.0%，差异有统计学意义（P <0.05），观察组患者不良反应发生率低于对照组（P <0.05），两组患者治疗前尿蛋白定量、血浆总蛋白、血清清蛋白、血肌酐、内生肌酐清除率比较，差异无统计学意义（P >0.05），治疗后观察组患者尿蛋白定量低于对照组，血浆总蛋白、血清清蛋白高于对照组（P <0.05），治疗后两组患者血肌酐、内生肌酐清除率比较，差异无统计学意义（P >0.05）。结论 环磷酰胺冲击疗法联合激素治疗NS 的临床效果显著，可降低不良反应发生率，改善患者预后。 【关键词】 肾病综合征；环磷酰胺冲击；激素；治疗结果 【中图分类号】 R 692 【文献标识码】 B 【文章编号】 1674 3296（2015）02C-0068-02 doi ：10.15887/https://www.sodocs.net/doc/6c15718948.html,ki.13-1389/r.2015.06.043 肾病综合征（NS ）常规激素治疗后效果较差，反复发作， 患者常无法耐受治疗［1］。环磷酰胺作为治疗NS 的首选药，在 患者体内被肝细胞微粒体羟化产生具有烷化功能的代谢产物， 具有较强免疫抑制作用［2］ 。本研究旨在观察环磷酰胺冲击疗 法联合激素治疗NS 的临床效果，现报道如下。1 资料与方法 1.1 一般资料 选取2013年3月—2014年3月怀化市第二人民医院靖州分院收治的NS 患者60例，按不同治疗方法分为观察组与对照组，各30例。观察组中男18例，女12例；年龄37~61岁，平均（55.3?0.7）岁；病程（10.3? 2.4）个月。对照组中男17例，女13例；年龄38~60岁，平均（54.7?0.8）岁；病程（11.5? 3.0）个月。患者均经临床症状和体征检查，并结合相应实验室检查确诊，符合WHO 关于 难治性NS 的诊断标准［3］ 。两组患者性别、年龄、病程比较， 差异无统计学意义（P >0.05），具有可比性。 1.2 方法 对照组患者予以泼尼松、双嘧达莫、雷公藤多苷等对症治疗。观察组患者予以环磷酰胺冲击疗法联合激素治疗，12mg /kg 溶于0.9%氯化钠溶液200ml ，静脉滴注<2h ，给予水化20ml /kg ，1次/d ，共治疗1个月，累积量120mg /kg ；均在住院期间开始治疗。 1.3 观察指标 观察两组患者临床疗效、不良反应及各项指标变化情况。 1.4 疗效判定标准 （1）完全缓解：24h 尿蛋白定量<200mg ，血清清蛋白>35g /L ，尿蛋白阴性，水肿消失，血脂、肾功能等生化指标恢复正常；（2）部分缓解：尿蛋白减少至+~++，24h 尿蛋白定量<1.0g ，血清清蛋白为25~35g / L ，生化指标基本正常；（3）无效：尿蛋白、血清清蛋白均无改变，血尿、水肿无缓解，生化指标出现加重。总缓解率=

常用免疫学检验技术的基本原理

常用免疫学检验技术的基本原理 免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T 细胞的克隆扩增，并分泌特异性的免疫球蛋白（抗体）。由于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体）。免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。 最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散，通过观察抗原－抗体相遇时产生的沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达到诊断的目的。这种扩散可以是蛋白的自然扩散，例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散实验。单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体的凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内，让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散，当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。 利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性，可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散，例如免疫电泳试验和双向免疫电泳。免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成分依次分散开。然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原的混合抗体，让各抗原成分与相应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。然后利用标准的抗原－抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体）的鉴别。上述的方法都是利用肉眼观察抗原－抗体反应产生的沉淀，因此灵敏度有很大的局限。比浊法引入沉淀检测产生的免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原－抗体反应产生的浊度，根据标准曲线来计算抗原（或抗体）的含量。该方法不但大大提高了检测的灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量的检测。

环磷酰胺用法

药理： 药效学 在体外无抗肿瘤活性，进入体内后先在肝脏中经微粒体功能氧化酶转化成醛磷酰胺，而醛酰胺不稳定，在肿瘤细胞内分解成酰胺氮芥及丙烯醛，酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。环磷酰胺是双功能烷化剂及细胞周期非特异性药物，可干扰DNA及RNA功能，尤以对前者的影响更大，它与DNA发生交叉联结，抑制DNA合成，对S期作用最明显。 药动学 口服后吸收完全，迅速分布到全身，少量可通过血脑屏障。环磷酰胺本身不与白蛋白结合，其代谢物约50％与蛋白结合。静注后血浆Ｔ1/2为4～6.5小时，50～70％在48小 时内通过肾脏排泄。 适应症： 适用于恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、淋巴细胞白血病、实体瘤如神经母细胞瘤、卵巢癌、 乳癌、各种肉瘤及肺癌等。 用法用量： 1.成人常用量口服每日按体重2~3mg/kg.静脉注射每次4mg/kg，每日或隔日一次。 或每次600~1200mg，每7~10日一次。 2.小儿常用量口服每日按体重2~6mg/kg，静脉注射每次2—6mg/kg，每日或隔日 一次。或每次10~15mg/kg，每周一次，以氯化钠注射液20ml稀释后缓慢注射。 [制剂与规格]环磷酰胺片50mg 注射用环磷酰胺（1）100mg（2）200mg （1）抗肿瘤：口服，一次50mg，一日3次；静注，一次每平方米400-600mg，每周一次，总量8g左右为一疗程。也可肌注，剂量同静注。动脉内注射，每次100-500mg，鞘内注射，每次50-100mg。（2）免疫抑制：一日50-150mg，两次粉服，连服4-6周。 静注，每次100-200mg，每日或隔日1次，连用4-6周。 禁用慎用： （1）孕妇用药须慎重考虑，特别在妊娠初期的三个月，由于环磷酰胺有致突变或致畸胎作用，可造成胎儿死亡或先天性畸形。本品可在乳汁中排出，在开始用环磷酰胺治疗时必 须中止哺乳。 （2）下列情况应慎用：骨髓抑制：有痛风病史、肝功能损害、感染、肾功能损害、肿瘤细胞浸润骨髓、有泌尿系结石史、以前曾接受过化疗或放射治疗。医学教育网搜集整理 肝病患者慎用。

拮抗化疗药物体外免疫抑制模型的建立及活性成分筛选

拮抗化疗药物体外免疫抑制模型的建立及活性成分筛选 以小鼠脾淋巴细胞为试验材料 , 将有丝分裂原刀豆蛋白 A(ConA)或细菌脂多糖(LPS)与化疗药物5氟尿嘧啶(5 Fu)联合使用建立了体外免疫抑制模型，并比较了多糖样品对5 Fu抑制淋巴细胞增殖的拮抗作用。结果表明 , 在供试样品中 ,F1 1[ 龙须菜 (Gracilaria lemaneiformis) 中分离多糖]和BW沪农灵芝1号(Ganoderma lucidum) 子实体中分离 ] 对 5 Fu 产生的轻度抑制有完全拮抗作用,19号[沪农灵芝1号(G. lucidum)子实体中分离] 样品刺 激淋巴细胞增殖活性最好 , 但对 5 Fu 产生的抑制基本无拮抗作用 , 表明样品刺激淋巴细胞增殖的活性与拮抗化疗药物抑制淋巴细胞增殖的活性无正相关性。 免疫抑制 ; 化疗药物 ; 多糖 肿瘤是危害人类健康的严重疾病 , 对其发生机制及治疗手段的 研究一直是医学领域的热点 [1] 。目前化疗仍是临床上治疗肿瘤的三大有效手段之一 , 化疗在杀灭患者体内的癌细胞方面有很好的效果 , 但均有不同程度的毒副作用 , 如化疗后往往会出现白细胞减少 , 特别是中性粒细胞减少 , 血小板减少等情况 [2], 严重的会造成人体免疫功能降低甚至是免疫功能缺陷 [3], 限制了化疗药物的使用 , 影响到癌症的治疗效果。因此 , 寻找能减轻化疗药物免疫抑制副作用的活性成分 , 对提高化疗药物的治疗效果和扩

大其适用范围有重要的意义。 研究表明 ,多糖具有免疫调节和抗肿瘤活性 , 其抗肿瘤活性主 要是通过调节机体的免疫功能而间接实现的 [4], 实验表明多糖在减轻化疗药物免疫抑制副作用方面效果明显 [5] 。如今多糖药物作为免疫调节剂已经成为辅助化疗、放疗和手术治疗肿瘤的重要组成部分。但多糖种类繁多、结构复杂 , 为了更好地对其进行开发利用 , 需要建立有效的活性筛选模型。常用的筛选减轻化疗药物免疫抑制副作用的模型多为动物体内模型 [6,7], 结果可信度高 , 但由于其耗时长、费用高、所需的样品量大等缺点 ,不适用于大量样品的初筛及样品分离过程中各组分活性的跟踪检测。若利用高效的体外细胞筛选模型进行初步筛选 , 获得相关的线索后再进行体内试验验证 , 将能大大提高活性成分的筛选效率。雷林生等 [8] 利用不同品系小鼠淋巴细胞相互作用后会引起淋巴细胞增殖这一特性 , 在细胞水平上考察了灵芝多糖拮抗抗肿瘤药物免疫抑制作用的效果 ,但该模型应用少、操作较复杂 ,因此需要建立方便、有效的筛选体系。 5 氟尿嘧啶 (5 Fu) 为临床上常用的化疗药物 , 主要副作用为 骨髓抑制 , 对在体内处于增殖状态的免疫细胞损伤较大。为了筛选拮抗化疗药物免疫抑制作用的样品 , 本研究取用小鼠的脾淋巴细胞,通过外加有丝分裂原刺激其增殖 , 模拟体内免疫细胞快速增殖的状态 ,再与 5 Fu 合用,建立免疫抑制模型。常用的有丝分裂原刀豆蛋白 A(ConA)和细菌脂多糖(LPS)分别刺激T淋巴细胞和 B 淋巴细胞增殖 , 为考察样品对不同淋巴细胞亚群的影响 , 本试验选用ConA和LPS两