组织切片技术(精品)
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组织切片技术(精品)
组织切片技术第一章组织制片概述组织制片技术是观察细胞、组织的生理和病理形态变化的一种主要的方法。
组织化学技术和原位杂交技术都是以组织制片为基础的。
一、制片前的准备工作 1.染色缸和标本瓶的清洗用毛刷沾去污粉将染色缸和标本瓶里外擦洗，自来水冲洗干净备用。
金属银或组织化学染色时，器皿更要彻底清洗。
先去污粉洗，再洗液浸泡过夜，再自来水和蒸馏水冲洗。
洗涤液的配制：
重铬酸钾 300 克浓硫酸 300 毫升蒸馏水 3000 毫升 2.载玻片和盖玻片及其清洗载玻片简称为玻片或载片，一般尺寸为76 毫米26 毫米，厚度为 1-1. 5 毫米。
盖玻片一般为正方形或长方形，厚度为 0. 15-0. 5 毫米。
最常用的规格为 1818 毫米、 2020 毫米，还有其它规格的。
煮沸洗涤法: 新旧玻片均可采用。
洗衣粉水浸没玻片，加热煮沸 15-20 分钟，冷却，自来水冲洗，干净的白棉布或纱布擦干，保存备用。
酒精浸泡擦拭：
新的玻片或载片可直接用酒精浸泡、擦拭，保存备用。
洗液浸泡法：
要求严格的玻片，可在洗液浸泡后在冲洗干净。
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二、制片方法的种类（一）非切片法不用切片机、没有切片手续而制成切片的方法。
常用的有以下几种：
1.整体封藏法待制作的材料一般很小或为一薄片状，如无脊椎动物的水螅和草履虫等，脊椎动物的鸡胚和蛙胚等。
这些材料取下后经固定、脱水和染色就可以封藏在玻片内。
2.涂片法主要是液体或半流动性的材料，如血液、精液、细胞学检查、微生物等，直接将材料涂在玻片上，再经固定和染色制成标本。
血液涂片的制作与染色：
取一干净载玻片，用左手拇指和食指夹住，然后取一小滴动物血置于载玻片右端,再取另一张边缘光滑的载玻片, 斜置于血滴左侧, 先向右稍移动轻轻触及血滴,使血液沿玻片端展开成线状, 两玻片的角度以 30~40 为宜(角度过大血膜较厚,角度小则血膜薄), 轻轻将载玻片向左推进,即涂成血液薄膜,推进时速度要一致,否则血膜成波浪形,厚薄不匀. 待涂片在空气中完全干燥后,将血涂片靠近中央部分的两边(与载玻片短边平行的边)用玻璃铅笔圈上并平放在染色架上进行染色。
①滴加数滴瑞特氏-姬姆萨(Wrights-Giemse)混合染液覆盖已圈血膜，同时记住滴数，染 3-5 分钟。
②滴加等量的蒸馏水后稍加晃动玻片继续染色 5-10 分钟。
③用蒸馏水或自来水冲去染液(注意还要直接冲洗已圈部位),
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 吸水纸吸干或凉干即可观察。
3.撕片法疏松结缔组织和肠系膜等就是采用这种方法。
4.磨片法主要用于含钙盐较多的坚硬的材料，如脊椎动物的牙齿和骨。
5.撕碎法
6.压碎法
7.印片或触片法（二）切片法使用切片机切片而制成切片的方法。
常用的有以下几种：
.石蜡切片法、冰冻切片法、振动切片法、超薄切片法第二章石蜡切片技术第一节取材和固定制作切片的第一步就是把动物杀死，取下需要制作切片的材料。
动物杀死的方法很多。
根据动物的大小、种类及观察目的而定。
例如，青蛙和小鼠等较小的动物可用断头法。
一些较大的动物如兔子和猫等可用空气栓塞法，从耳静脉注射入空气，使动物心脏发生急性空气栓塞，循环障碍，痉挛而死。
此种方法各脏器易瘀血。
也可采用扑杀法。
无论那种方法都应该使动物迅速死亡。
动物杀死后立即取材和固定，否则组织会因失水变形和发生死后变化。
一、取材 1.动物屠宰前应写好程序，准备好刀子、剪
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子、镊子、线、注射器、生理盐水、固定液等。
固定液的量一般为材料的 10---15 倍或稍多。
2.取材注意事项取材的刀、剪要锋利；动作要轻，不可来回切割，不要挤压组织以免损伤内部，先用镊子轻轻夹住，再用剪子或刀子切下，被镊子夹过的部分不要；柔软的组织可取稍大些，固定数小时后再切成小的组织块，继续固定；取材要快；切取的材料应根据需要观察的部位进行选择，考虑好切面的方向。
3.取材的顺序先取容易自溶的组织，骨骼和肌肉后取，依次为心脏、肺、肝、脾、肾、小、大肠、肾上腺、睾丸、卵巢、子宫、脑垂体等。
取肠时可用生理盐水轻轻冲洗肠内容物，然后结扎一端，注入固定液，再结扎另一端，固定 34 小时后再切成小段。
肺脏可用少量固定液自气管或支气管注入，约 20 分钟后略膨胀再切成薄片固定。
4.取材的大小取材的大小一般为 0.50.50.3 厘米， 110.3 厘米，最厚不超过 0.5 厘米。
取材很关键，应新鲜、迅速。
二、固定将取下的材料，立即投入固定剂内，借助药品的作用，使组织细胞的形态结构保存起来。
（一）固定的目的 1.防止组织的溶解和腐败。
2.使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶类等各种物质沉淀下来，保存组织细胞原有的结构。
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 3.固定剂兼有硬化作用，使组织硬化、增加硬度，使组织不易变形，有利于以后的处理。
（二）固定剂的种类种类很多，一般分为单纯固定剂和混合固定剂。
单纯固定剂是用一种药品作为固定剂的如乙醇、甲醛等，混合固定剂是用几种药品配合起来，可以使各自的优点相互补充。
1.单纯固定剂 1）乙醇---无色的液体，可以与水以任何比例混合。
具有以下特点：
穿透速度快，与其他固定液混合使用时可以增加他们的穿透力。
酒精固定的组织硬化显著，体积收缩厉害，组织在高浓度酒精中滞留过久，会变脆，体积缩小原体积的 20%左右。
通常用 95%或 100% 的酒精固定，但是不宜放置过久，一般保存在 70%酒精。
酒精是一种还原剂，易被氧化成乙醛，再变为醋酸，所以不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合。
酒精可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前二者生成的沉淀不溶于水，后者所生的沉淀则溶于水，所以酒精固定的标本对核的染色不良。
2）甲醛---是一种气体，一般市售的为 37-40%的甲醛水溶
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液或者称福尔马林，易挥发，有强烈的刺激性气味。
福尔马林固定组织，渗透力强，组织收缩少，但经酒精脱水时收缩很大，它能使组织硬化并增加组织的弹性。
甲醛为非沉淀性固定剂，但是可与蛋白质化和，对脂肪、神经及髓鞘的固定效果较好，也可固定高尔基复合体和线粒体，为一般病理制片常用。
固定后，核的染色较好，胞浆染色较差。
适合固定的浓度：
10%的福尔马林。
固定小块组织数小时即可，时间长也没有关系。
加热可缩短固定时间。
对于较长时间固定的组织须流水冲洗 24 小时甚至 48 小时，否则会影响染色效果。
因为福尔马林防止久，能产生三聚甲醛白色沉淀，在高温下可变回甲醛，甲醛易氧化，变成乙酸，使溶液变为酸性，增加标本的酸性，严重时影响核的染色。
可用如下方法保持中性甲醛：
福尔马林 100 毫升，蒸馏水 900 毫升，一水磷酸二氢钠 4 克，磷酸氢二钠 6.5 克 3）醋酸---17℃以下结冰，又称冰醋酸。
此液能凝固细胞核中的蛋白质，适合染色质或染色体的固定，穿透力强，对于一般的组织块，只需固定 1 小时。
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4）苦味酸---是一种黄色结晶，在水中的溶解度为 0. 9-1. 2%，在空气中能自燃，在封闭容器中能剧烈爆炸，故在实验室中常配成饱和水溶液保存。
易溶于酒精、二甲苯、苯、水。
苦味酸可沉淀一切蛋白质，它对类脂物、碳水化合物无作用。
此固定液对细胞收缩明显，收缩程度可达 50%以上，但是不使组织变硬；穿透速度慢。
经苦味酸固定的组织不用水洗，可直接用 70%的酒精洗去黄色，即使留些颜色也无妨碍。
固定时间不宜过久，否则影响苏木精碱性染料的染色。
2.混合固定剂 1） Bouin 氏液：
苦味酸饱和水溶液 75 毫升福尔马林 25 毫升冰醋酸 5 毫升。
是一种良好的固定剂，一般组织学和胚胎学的材料均可固定，该液渗透力强，固定均匀，组织收缩少，可把一般的微细结构显示出来。
一般组织固定 12-24 小时，小块组织数小时。
2） Carnoy 氏液：
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纯酒精 60 毫升冰醋酸 10 毫升氯仿 30 毫升。
此液穿透速度快，达快组织不超过 3-4 小时，小块组织20-40 分钟，时间久了，会使组织膨胀并有硬化现象。
多用于细胞学制片，固定染色体、中心体、有丝分裂相等；对外膜致密的组织特别适合，也适于腺体和淋巴组织。
第二节洗涤和脱水一、洗涤材料从固定液中取出后，需要立即冲洗使其中含有的固定液全部除去。
否则留在组织中的固定液，有的可妨碍染色，有的可以发生沉淀物或结晶影响观察，有的可继续发生作用，使材料变坏或使以后的处理发生困难。
冲洗有一定的原则，视固定剂的种类而异：
1.含有苦味酸的固定液，如 Bouin 氏液，倒去固定液入 70%的酒精更换数次即可脱水。
如想除去苦味酸的黄色，可在 70%的酒精中加入少量的氨水（数滴），且能中和苦味酸，更换数次新液。
2.福尔马林固定的组织，一般不需要冲洗，固定时间长久的标本一定要充分水洗，否则会影响染色，一般自来水冲洗 12-24 小时。
3.含有铬酸、重铬酸钾的固定剂，必须流水冲洗，冲洗时间与固定时间相同或多于固定时间。
4.如固定液中含有氯化汞，应根据溶液的性质用水或酒精冲洗，冲洗后必须在 70%的酒精中加碘去汞（一般为 0.5%的碘酒精），
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因为汞易在组织内形成结晶不利于切片，不利于观察。
5.锇酸及含有锇算的固定液，必须用流水冲洗。
因为锇算能使组织发黑，影响染色，经过酒精时形成沉淀。
6.用酒精或酒精混合液固定的组织，一般不要求冲洗，若冲洗，酒精浓度应与固定液酒精浓度相同，不可用水冲洗。
二、脱水（一）脱水的目的和重要性组织冲洗完毕后进一步就是脱水。
因为组织经固定和洗涤后含有多量水分，因为水分不能和石蜡或火棉胶等支持剂混合，组织内有极少量的水分存在，就会妨碍这些支持剂的渗入，所以必须把组织中的水分彻底去除，这一步骤称为脱水。
脱水的作用：
有利于组织的透明和透蜡。
因为透明剂（二甲苯、氯仿）必须在组织完全无水的情况下才能渗入；水不能与包埋剂混合。
脱水有利于组织的永久保存，水的存在能使组织分解。
这是制片中相当重要的一个步骤，如果这一步骤没有掌握好，脱水不彻底，就会影响到组织的透明和透蜡，即使包埋好的材料也切不出好的切片，浪费材料和时间。
（二）脱水剂和方法脱水剂必须在任何比例下与水都
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能混合，主要有两种类型：
1.非石蜡溶剂的脱水剂如酒精、丙酮等，组织在脱水后必须经二甲苯透明才可浸蜡。
1）乙醇---常用的脱水剂，价格低廉，方法容易掌握。
但是能收缩和硬化组织，还必须透明后才能透蜡。
脱水方法：
一般组织可从 70%酒精开始，经过 80% 、 90%、 95%、 100%酒精，使其逐步脱水。
对一些柔软的组织如胚胎需从 20% 、 30%或 50%开始，否则组织收缩较大。
脱水的时间根据组织块的种类、体积大小而定。
高浓度酒精一般不超过 2 小时，最长不超过 3-4 小时。
脱水必须干净，在换入高一级的酒精时，要先在吸水纸上吸干以免把水分带入高一级的酒精中，夹持组织动作要轻，不要损坏组织。
2）丙酮---可代替酒精做脱水剂，作用和酒精相似。
脱水能力比酒精强，但组织收缩较大，多用于快速脱水或固定兼有脱水的方法中。
2.脱水兼石蜡溶剂的脱水剂如正丁醇、叔丁醇等，组织在脱水后可直接透蜡，不需要中间二甲苯透明的步骤。
1） .正丁醇---黄色液体，易挥发，吸入后发生头痛，脱水能力弱，但收缩小，可与水和酒精混合，能溶解石蜡，
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 可不经过透明直接浸蜡。
脱水程序是：
经过各级酒精，换入正丁醇，在换一次新正丁醇，最后入正丁醇石蜡中。
2）叔丁醇---无毒，可与水、酒精、二甲苯混合，是一种很好的脱水剂，此液不会使组织收缩或变硬，不必经过透明，直接浸蜡。
第三节透明组织在脱水后，所用的大多数脱水剂不能和石蜡相混合，透明剂既可以与脱水剂相混合又能和石蜡相混合，起到桥梁的作用。
它可以提出脱水剂，在代替脱水剂后导致石蜡的渗入。
当组织中全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织呈现不同程度的透明状态，此种现象称为透明。
如果组织不能透明，表明脱水未尽，必须重新返工，否则影响透蜡的进行。
在制片过程中，有两次透明。
第一次是脱水后、透蜡前组织块的透明，目的是便于透蜡包埋。
第二次透明是染色后切片的透明，目的是利于光线的透过便于显微镜的观察。
常用的透明剂最常用的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香
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柏油、丁香油、石炭酸等。
二甲苯---应用最广的一种透明剂，价格便宜。
五色透明，易挥发，易溶于酒精又能溶解石蜡，能与封片剂树胶混合，不能与水混合。
透明力强，作用较快，缺点是容易使组织收缩变硬变脆。
所以组织不能在内停留过久，而且必须在完全脱水后才能应用。
通常在制片进入二甲苯以前先经过 1：
1 的酒精和二甲苯混合液，避免材料收缩。
氯仿---组织在其中浸存较久，收缩不厉害，也不会变脆；极易挥发，在透蜡时，浸入材料中的氯仿比二甲苯容易挥发。
缺点是渗透力弱，透明时间是二甲苯的 2-3 倍。
苯---近似二甲苯，挥发较快。
对组织收缩较少，久浸组织也不会产生变硬变脆现象。
第四节透入和包埋组织经过脱水、透明后要让石蜡等支持剂透入内部使组织变硬并将组织包埋进去，以利于切片和观察，这个过程称为透入和包埋。
目的是除去组织中的透明剂，使石蜡渗入组织内部后把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成薄片。
一、石蜡的透入石蜡是从石油中分离出来的一种甲烷系固体碳化氢。
根据熔点的不同有软蜡和硬蜡之分。
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硬蜡熔点高，切片所用硬蜡熔点为 52-54℃或 56-60℃。
选用石蜡的熔点应根据切片时的室温条件和组织类型来考虑。
一般，石蜡硬度与组织硬度相近，组织较硬时用硬的石蜡；室温高时用硬蜡，室温低时用软蜡。
石蜡太硬，切片容易切碎，石蜡太软，蜡带容易皱缩，很难展平。
配制和使用新蜡时必须经久煮练，因为新蜡内往往含有气体或水分，需要加热再溶化，反复加热以除去蜡内气体，增加石蜡密度。
用过的废蜡加热过滤后仍可使用，比新蜡更好用。
透入过程：
当组织块在透明剂中透明好以后，就让石蜡渗入组织内部。
先将组织块放入石蜡和二甲苯的等量混合液中，这样可减少组织的收缩和扭转，使石蜡随着透明剂渗入到组织的每个部分。
从石蜡与二甲苯的混合液中取出组织块，必须经过纯石蜡Ⅰ 、纯石蜡Ⅱ和纯石蜡Ⅲ，在每个蜡中的时间一般为半小时左右。
根据蜡块的大小可适当变化时间，使石蜡中含有的剩余透明剂完全去除，以免影响切片。
二、石蜡包埋准备好石蜡包埋框或包埋盒、冷水、镊子
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等。
第五节切片、贴片和烤片一、切片石蜡切片机一次性刀片磨刀修快、粘在木块上，准备好毛笔、成蜡带的硬纸板，光滑面是反面应朝下放，有皱纹面是正面朝上。
切片中可能出现的各种问题：
1 切片分离不能形成蜡带：
室温过低或石蜡过硬，蜡边过小或不平。
2 蜡带弯曲：
蜡块上下面不平行，刀钝、蜡块不与刀刃平行等。
3 蜡片上卷，切过刀口致破裂：
刀口太钝或不清洁，刀的角度过大或石蜡过硬。
4 蜡片易粘在切片刀上或切片太皱：
室温太高或石蜡太软；刀片角度过小也能使切片皱缩。
5 切片厚薄不一；刀或蜡块未固定紧，切片机磨损或有故障。
6 切片出现裂隙或碎裂：
组织浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在透明剂中时间过久，组织已经发脆，无法补救。
7 切片出现纵口：
刀有缺口或石蜡内有硬的物质、刀口不清洁等。
8 切片时有沙沙声，切片有小孔：
组织在透蜡时温度过高，组织受损，无法补救。
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 9 切成之片，组织自动脱落或与石蜡分离：
透蜡不足。
二、贴片与烤片 1 展片---温水捞取法展片烤片机或简易的方法，以器皿成温水，约40℃左右，将预先割开的蜡片摊于水面上，蜡片受热自然张开浮游在水面上。
把玻片伸入水中将已经展开的蜡片移致玻片上，拨正位置，37℃烤干，约 6-12 小时即可染色。
2 捞片前玻片的处理---粘片剂蛋白甘油、铬明矾-明胶、市售的各种粘片剂等第六节染色根据不同的目的，选取不同的染色方法，如组织化学方法、免疫组织化学方法、细胞组织的特殊染色方法等。
介绍最常用的苏木精-伊红染色法染色步骤 1.脱蜡：
把已经干燥的切片放入二甲苯中约 10-15 分钟。
可以脱蜡 2 次，各 5-10 分钟。
2.入 1/2 二甲苯与 1/2 纯酒精的混合液中 3-5 分钟。
此步骤可省略。
3.依次入不同浓度的酒精复水。
100% 2 分钟、 95% 1-2 分钟、 80%1-2 分钟、 70% 4.入蒸馏水 1-3 分钟。
5.入苏木精染色 10-15 分钟。
6.入自来水中使颜色发蓝或流水冲洗 5 分钟或更长，流水
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不能过大。
7.蒸馏水洗 1 分钟 8.入酸性水分化 0.5%的盐酸酒精（70%酒精）。
几秒或几十秒，为染色成败的关键。
9.蒸馏水洗 1 分钟 10.入碱性水复蓝 3-5 分钟。
核呈蓝色，其他结构无色。
11.蒸馏水洗 1 分钟 12.脱水。
70%、 80% 、 90%酒精各 1-2 分钟。
13. 95%的伊红酒精溶液 5-10 分钟 14.95%酒精去除多余的颜色， 1 分钟； 100%酒精两次，各 3-5 分钟。
15.二甲苯酒精混合液，纯二甲苯两次各 5-10 分钟。
16.树胶封片。
组织切片程序时间表取材、固定12-24 小时水洗（可省略） 12-24 小时脱水 70%酒精 2 小时或稍长 80%酒精 2 小时或稍长90%酒精 2 小时 95%酒精2 小时 100%酒精 1 小时 100%酒精 1 小时等比例二甲苯和酒精（可省略） 0.5 小时透明二甲苯 2 次各10-20 分钟透蜡 2 次各 20-30 分钟包埋切片贴片和烤片染色
病理组织切片裂隙补救方法的技术改良(一)
病理组织切片裂隙补救方法的技术改良(一) 【摘要】目的?：寻求病理组织切片易产生裂隙补救的新方法。方法：对易产生裂隙的组织蜡块用氨水涂抹后重新切片。结果：用此类方法处理组织，切片平整，结构完好，组织染色无明显差异。结论：氨水对病理组织切片裂隙的补救有明显的效果。 【关键词】石蜡切片;裂隙;氨水;软化 在常规石蜡切片过程中，我们常常会把大小不等的标本进行混合固定脱水处理，由此难免会出现标本处理不均的现象：或大的组织处理不足，或小的组织处理过度，使得部分组织变脆、变硬。组织切片常常表现为有边缘不齐的“龟壳状”(见图1)和“百叶窗样”裂隙。究其原因往往与组织脆性增加有关，若将此蜡块再行低温冷冻后切片，此种裂隙则更为明显和严重。为了补救这类问题蜡块，我们通过与兄弟单位的技术交流及自身的实践探索，发现适当使用氨水能有效软化组织，降低组织脆性，减少裂隙出现，且更有利于蜡块切出完好的蜡片。现报告如下。 1材料、方法和结果 1.1材料选取我院2008年行常规石蜡制片中组织蜡片出现裂隙的蜡块358只，其中包括淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、子宫、乳腺等手术切取标本，同时含有内镜、穿刺活检标本。试剂：纯氨水(上海三鹰化学试剂有限公司生产)500mL。 1.2方法①将此类容易产生裂隙的组织蜡块放入冷水中(水温0～5℃)约10min。②将蜡块放上切片机小心粗修至暴露整个组织切面，然后细切蜡片10余张(此蜡片弃之不用)，再将粗切把手逆时针转动1/4～1/2圈以退刀。③用脱脂棉球蘸取足量的纯氨水，覆盖在细切后的组织面上约10s，再行细切，直至有组织蜡片顺利切出，取前面3～5张展于裱片机内。④待蜡片充分展平后迅速裱于载玻片上。⑤常规烤片，染色，封固。 1.3结果用此类方法处理组织，切片平整，结构完好，除“龟壳状”裂纹尚存外(但明显缩小)其余裂隙均消失，组织染色无明显差异(见图2)。 2讨论 常规制片中出现裂隙是我们常规技术工作中经常碰到的问题，此类问题切片不仅影响切片质量，有时还会导致病理诊断的困难，更有甚者连蜡片都很难切出。马恒辉等1]提出导致切片裂隙有诸多原因，在实际操作中，组织处理因素是首要因素，由于甲醛、乙醇、二甲苯三者对组织均有不同程度的硬化作用，其过度处理必然导致组织弹性降低，表现为各种间质成分(特别是胶原、网状纤维)张力下降，脆性增加，发生断裂而呈“龟壳状”裂纹;或者尚未发生断裂，但组织过度冷冻后切片，切出的蜡片在室温中迅速膨胀，而呈“百叶窗样”裂隙。当然诸如子宫、乳腺等组织纤维含量极为丰富，过硬的组织蜡块接触刀锋产生震动，也会出现波纹裂隙。
组织切片制作步骤
组织切片制作步骤： 1.取材 确定所取材料的来源及部位，纵切还是横切； 取材要迅速，防止阻止发生进一步变化，材料体积要适宜。 下图为植物芽体取样实拍。 2.固定 （1）固定液的选择 最常用的固定液为FAA（万用固定液）。 它的优点是材料固定时间不受限制，固定时间短则数小时，长则数月或数年。（可做材料保存液） 配方：50％或70％酒精90ml 冰醋酸5 ml 福尔马林5 ml (柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精配制) （2）材料固定后的处理 冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。 (材料固定后，若暂时不能进行下一步操作，可于70%的酒精溶液或直接与FAA固定液中，于冰箱中4℃存放。) 下图为固定液浸泡的组织切块。 3.脱水 目的：水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进
入。 试剂：梯度酒精溶液 流程：70%---85%---95%--100%---100%每步1h-2h左右。 注意事项：保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，但也不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩，这个时间大家可以根据自己的实验来摸索一下，不必完全按照本操作来）。 下图为自动组织脱水机，适于大量样品组织脱水用。如果材料体积及样品量较少可用小烧杯做容器来进行逐级脱水。 4.透明 目的：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。 (二甲苯是最常用的透明剂，可以很好地与石蜡互溶) 流程：二甲苯与酒精的等体积混合液1h---纯二甲苯1h---纯二甲苯1h。 5.浸蜡与包埋 目的：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 浸蜡程序:(恒温) （1）低温浸蜡（36℃）：接上步，在有二甲苯和材料的烧杯中逐步加碎蜡至过饱和（石蜡不能溶解），过夜12-24h。 （2）高温浸蜡（55-60℃，高于石蜡熔点3℃）： 将上步二甲苯与石蜡的混合液倒出，不要倒掉材料，将烧杯中加入纯石蜡，共5-24h。纯石蜡需要更换三次。
实验二 徒手切片法和临时装片的制作方法以及植物细胞和组织观察
实验二临时装片的制作方法和徒手切片法以及植物细胞、组织观察 一、实验目的 1、掌握临时装片的制片方法、掌握徒手切片的方法 2、了解植物细胞结构。 二、实验材料 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、吸水纸、解剖针、培养皿、毛笔、滴管、纱布、 0.9%的NaCl溶液；洋葱、马铃薯、芹菜、番茄 三、实验内容和实验方法 （一）临时装片的制作 1、擦净载玻片和盖玻片 （1）擦载玻片用左手的拇指和食指捏信载玻片的边缘，右手用纱布将载玻片上下两面包住，然后反复擦拭，擦好后放在干净处备用。 （2）擦盖玻片先用左手拇指和食指轻轻捏住盖玻片的一角，再将右手拇指和食指用纱布把盖玻片包住，然后从上下两面隔着纱布慢慢地进行擦试。 2、取样 用滴管滴一点水或其他溶液（根据需要）于载玻片的中央，把观察物放于载玻片上的液滴中，展开或摇匀。 3、盖盖玻片 右手持镊子，轻轻夹住盖玻片的一角，使盖玻片的边缘与液滴的边缘接触，然后慢慢倾斜下落，最后平放于载玻片上，避免气泡的产生。如盖玻片下的液体过多，可用吸水纸将多余的液体吸掉。
（二）徒手切片法 徒手切片法不需要任何的机械设备，只需要一把锋利的刀片就可以完成切片的制作，方法简单，也容易保持物的生活状态，有很大的实用价值。 1、选材 选择软适度的材料，先截成适当的段块。一般直径大小以3~5mm、长度以20~30mm为宜。若材料太软，如幼叶等，不能直接拿在手中进行切片，可用适当大小的马铃薯块茎或萝卜块根等作支持物，将材料夹入其中，一起切片。 2、切片 用左手拇指、食品指和中指夹住材料，使其稍突出在手指之上，拇指略低于食指，以免刀口损伤手指。材料和刀刃上蘸水，使其湿润。右手拇指和食指横向平握刀片，刀片要与材料断面平行，刀刃放在材料左前方稍低于材料断面的位置，以均匀的力量和平稳的动作从左前方向向右后方拉切。切片时要用臂力而不用腕力，手腕不要动，靠肘、肩关节的屈伸来切片，拉切要快，中途不要停顿，更不能用拉锯方式进行切片。 每切2~3片就要把刀片上的薄片用湿毛笔移入盛有清水的培养皿中暂存备用。如发现材料切面出现倾斜，应修平切面后再继续切片。 3、镜检观察 连续切下很多切片后，挑选最薄的切片放于加了1滴清水的载玻片，盖上盖玻片，制成临时装片，进行镜检、观察。 （三）植物细胞的结构观察 1、洋葱表皮细胞的观察 取一洁净载玻片，于载玻片中央加上一滴水。取洋葱一个，剥下一片新鲜的带紫色的南鳞叶，和刀片从外表面（或内表面）切一个面积为4mm2左右的方形小格，然后用镊子将表皮撕下，迅速入入载玻片上的小水滴中（表面向上）。并使其平展，盖上盖玻片，即制成临时装片。将装片放在显微镜下，用低倍镜观察细胞结构。
植物组织切片制作以及注意事项
植物组织石蜡切片的制作以及注意事项 1 植物组织石蜡切片的制作方法 ⑴固定：用50%或70% FAA固定液（50%或70%酒精：甲醛：冰乙酸=16:1:1; 幼 嫩材料用50 % FAA；老的材料用70%的FAA），置于4℃固定24 h。 ⑵脱水：将固定液倒去，加入50%乙醇，室温静置30 min；重复一次，室温静置 20 min。换成1%番红O溶液(用70%酒精配制)，室温脱水染色过夜。次日继续 脱水，酒精浓度梯度和时间依次为：80% 乙醇1h、95% 乙醇1h、无水乙醇1h、40min（2次）。 ⑶透明：1/2无水乙醇+二甲苯混合液1h，纯二甲苯1h、40 min（2次）。最后加入 少量二甲苯（浸没材料即可）和碎蜡，放入38℃温箱中过夜。 ⑷浸蜡：将温箱温度调至56℃，计时1h；换成二级蜡1h；三级蜡（3次）各1h、 1h、40min（从温度上升到56℃开始计时）。 ⑸包埋：将带有材料的液体蜡倒入叠好的纸槽中，迅速放入冰水中使蜡凝固，防止 气泡产生，以及凝蜡不匀。 ⑹切片：修整蜡块，用Lica RM2126切片机切片，厚度5-10 μm。 ⑺贴片: 在载玻片上涂少许粘片剂，将切好的蜡带放入温水中，捞至载玻片上，最 后置于37℃恒温箱过夜烤片。 ⑻脱蜡及染色： ①番红-固绿对染 ⅰ脱蜡：二甲苯60min，二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、1%番红室温过夜。 ⅱ染色：80%乙醇5 min，1%固绿（用95%酒精配制）迅速蘸一下，大约10s，直接放到95%乙醇5min 、无水乙醇5min、无水乙醇5min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5min、二甲苯5 min（2次）。
组织切片制作步骤
徒手切片法： 徒手切片法是指手持刀片将新鲜的或固定的实验材料切成薄片的制作方法。徒手切片法是指不需要专门的仪器设备，试样也不需要特殊的化学试剂处理，而直接将新鲜的或固定的材料(一般为木质化程度较低的植物)切成薄片的方法。 基本信息： 徒手切片前，应先准备好一个盛有清水的培养皿。在切片时，用左手的拇指与食指、中指夹住实验材料，大拇指应低于食指2～3mm，以免被刀片割破。材料要伸出食指外约2～3mm，左手拿材料要松紧适度，右手平稳地拿住刀片并与材料成垂直。然后，在材料的切面上均匀地滴上清水，以保持材料湿润。将刀口向内对着材料，并使刀片与材料切口基本上保持平行，再用右手的臂力（不要用手的腕力）向自身方向拉切。此时，左手的食指一侧应抵住刀片的下面，使刀片始终平整。连续地切下数片后，将刀片放在培养皿的水中稍一晃动，切片即漂浮于水中。当切到一定数量后，可在培养皿内挑选透明的薄片用低倍镜观察检查。好的切片应该是薄且比较透明、组织结构完整，否则要重新进行切片。 对经检查符合要求的切片，如果只作临时观察，可封藏在水中进行观察。若要更清楚地显示其组织和细胞结构，可选择一些切片进一步通过固定、染色、脱水、透明及封藏等步骤，做成永久玻片标本。 徒手切片技巧 如果不想切斜，要注意两点，一个是左手拿的露出来那截要短，
尽量只能连续切2刀的样子(一般是可以切4，5刀的），一个是切口一定要水平，同时右手的刀片也要水平，拉刀的时候保持在一个平面上（拉快点容易做到）。这是根和茎的切法，不过每次的量会有所减少。对于叶，有三种切法，一个是直接切；一个是卷成管状，当茎来切；还有就是用三层刀片夹起来。其中，第一种适合于裸子植物那种针叶，方法要领和上面说的差不多；第二种适合于比较软的叶片，要领是要卷的细，中间的洞不要太大（大了容易斜）；第三种适用于比较坚韧，硬的叶片，绝对要放在载玻片之类的地方，要用划的，凌空切会很不顺，容易切不断。还有一种特殊的方法是切成小块的先，再夹到萝卜里面（事先挖个洞或切条槽），再一起切，这个适用于全部，根茎叶，软的硬的均可（就是那种针叶不太好用它，我都切不好）。所以克服柔软就是要注意，想办法使它变厚变硬（对叶：卷，夹，或者垫玻璃；对根茎，夹，或者用左手捏紧一点，捏上面一点，使它不会晃）。至于弯曲，我觉得不用太在意，要么舍弃掉这一段，要么用手压紧，关键只是上面要平。还有，如果切含有楞或者有叶脉的部分，一定要从这些地方开始切，先切硬的部分（朝向刀口）。平时切两到三层差不多，一层的细胞会破损，有空洞；这样也比较适合染色。 徒手切片的优缺点 徒手切片是用手持双面刀片或剃刀，将新鲜材料或预先固定好的材料（切前水洗）切成薄片，不经染色或经简单染色后，用水封片作临时装片观察。徒手切片法的优点是不需要复杂的设备，方法简便，制片迅速，而且能观察到植物组织的自然色泽和活体结构，常用于研
植物细胞学分析之组织切片技术
植物细胞学分析之组织切片技术 一、试剂 （1）卡诺氏固定液：无水乙醇与冰醋酸按体积比为3:1混合配制。 （2）1mol／L盐酸溶液：取浓盐酸（比重1.19）82.5ml，加入蒸馏水917.5ml。 （3）醋酸洋红染液：4-5g洋红，冰醋酸45ml，蒸馏水55ml，先将冰醋酸加入蒸馏水中煮沸，然后将火移去，立刻加入洋红，用玻璃棒搅匀溶化，冷却后过滤即成。 （4）70%酒精；95%酒精。 二、细胞分析方法 1．有丝分裂全过程的染色体制片方法 步骤：取材-预处理-固定-根尖解离1mol/L HCL-醋酸洋红染色-压片 （1）发根 挑选每份黑麦种子材料25粒，经流水冲洗，放于培养皿内温水浸泡24h。置于25℃恒温箱中发根。待根长到1～2cm时，于适宜时间用蒸馏水洗净，将水吸干，剪取根尖0.5～1cm进行预处理。为获得尽可能多的分裂相，根尖以上午9～10时剪取为宜。 （2）预处理 为了有利于有丝分裂中，染色体的观察和计数，通常要对材料进行不同的预处理。 预处理主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成，来获得更多的中期分裂相，同时还可以改变细胞质的粘度，促使染色体缩短和分散，便于压片和观察。 将根尖浸于蒸馏水内，1-4℃低温处理24h。 （3）固定 材料经预处理后，用流水冲洗2次，然后投入卡诺液（3份甲醇∶1份冰乙酸）中固定26h，用95％的乙醇洗两次，转入70％乙醇中保存备用（4℃）。固定的目的是： ①迅速防止细胞死亡后的变化，如自溶、腐败等，尽量保持生长状态结构。 ②使细胞中的蛋白质、脂肪等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。 ③使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。 ④使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。 ⑤防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。 （4）解离 常用酸解法：从70％乙醇中取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗后，吸水纸吸干，放入盛有1 mol/L的HCl的1.5ml离心管中，60℃水浴，恒温条件下解离10min。 植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁结构将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离，这一操作称为解离。同时，解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。 通过解离和压片，分生细胞的原生质体能够从细胞壁里压出，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量细胞质，让后续制片处理直接作用于染色体。 （5）染色 解离后吸出HCL，用蒸馏水水洗2次，每次3-5分钟，将根尖置于载玻片中间，切去根冠，从乳白色分生组织切取尽可能薄的一片，滴加1～2滴品红染液，染色5min。 （6）压片 在经染色的材料上加一滴染液，在染液左侧放一刀片，盖上盖玻片，用镊子垂直敲打，先轻轻敲出盖玻片下的空气，然后边敲边向外移动刀片，待刀片移出盖玻片后，覆一层吸水纸，用镊子垂直敲打 (注意勿使盖片搓动)，待材料分散均匀后，将玻片拿到酒精灯火焰上烤，烤至稍烫手为宜，然后迅速用拇指按住盖玻片，用力压。
病理组织切片的制作
病理组织切片的制作 卢文丽吴中华方肇勤 （2007/01/04） 一、器材（按一小组，约4-6人） 眼科镊：直无勾10cm 、弯无勾10cm各5把； 组织镊；12.5cm 2把； 眼科剪：直尖10cm 4把； 解剖剪：cr/14，4把； 普通双面刀片：10片/盒×1盒； 染色架：5个； 染色缸：1000ml，14-15个； 切片盒：50片/盒×3盒或100片/盒×2盒； 37度、60度恒温箱：各1个； 磨砂载玻片：50片/盒×3盒； 盖玻片：100片/盒×2盒； 广口瓶：30ml或60ml×20个； 滴管及配套吸头：4个； 玻璃漏斗：φ90 3个；玻璃搅棒：2支 普通粗孔大张滤纸：20张； φ90mm玻璃培养皿：4个； 中号普通毛笔：2支； 烧杯：500ml 、1000ml 各1个； 量筒：100ml、500 ml、1000 ml各1个； 组织切片机及配套刀片：4台； 摊片用水浴锅：2台； 生物切片石蜡：5盒，熔点：56-58℃； 电子天平：1台； 酒精灯：150ml，4台； 脱水篮：1-2个； 打火机、标签纸、铅笔各一，卷筒纸、乳胶手套、口罩、医用纱布足量。 二．试剂 苦味酸（2.4.6-三硝基苯酚）：30g/瓶×1瓶； 37%~40%福尔马林液：500ml/瓶×1瓶； 冰醋酸：AR，500ml/瓶×1瓶； 无水乙醇：AR，500ml/瓶×10瓶； 二甲苯：AR，500ml/瓶×10瓶； hematoxylin苏木色素（苏木精）：10g/瓶×1瓶； 酸性品红（曙红丫水溶）：25g/瓶×1瓶； 碘酸钠：AR，500g/瓶×1瓶；柠檬酸：AR，500g/瓶×1瓶; 水合氯醛：AR，250g/瓶×1瓶;铵矾（ALNH4(SO4)2·12H2O）或钾矾（ALK(SO4)2·12H2O）：500g/瓶×1瓶 蛋白甘油（甘油/鸡蛋清=1/1）：50ml 中性树胶：100g/瓶×2瓶。若中性树胶过于粘稠，可与二甲苯按7/3的比例稀释。 蒸馏水：5000ml
病理切片的制作过程
1.7.1 修整组织 将手术切取的乳腺肿瘤切成一个平整面，各组织块不宜太大，以便固定剂穿透和组织脱水等操作，通常以10 mm×10 mm×3mm或5mm×5mm×3mm为宜。找到不同的部位切取2块，以备后用。 1.7.2 组织洗涤 组织经修整后，组织中的福尔马林等必须冲洗干净，尤其是含有重金属的物质存在。因为残留在组织中的福尔马林，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察，所以组织修整后应冲洗12h左右。 1.7.3 组织脱水 组织经洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。 80%乙醇溶液：2h 95%乙醇溶液:1h 95%乙醇溶液:1h 100%乙醇溶液:30min 100%乙醇溶液:30min 1.7.4 组织透明 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。 二甲苯Ⅰ：30min 二甲苯Ⅱ：10min 1.7.5 组织浸蜡 浸蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便组织包埋。浸蜡时间根据组织的透蜡时间较长，需3h左右。浸蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。 石蜡Ⅰ：1h
石蜡Ⅱ：1h。 石蜡Ⅲ：1h 1.7.6 组织包埋 将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块的过程。包埋时，将纸盒放在温箱旁边，用镊子夹取组织平放于纸盒底部，，再用温镊子轻轻拨动组织，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，沿壁倒入包埋用的纸盒中，速度要慢。待石蜡凝固（约30min）后放入冰箱保鲜层内以备后用。包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡，新的石蜡一般要熬顿几次，以免石蜡固定后有气泡，影响切片。用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间。 1.7.7 组织切片 （1）从冰箱里拿出蜡块，进行修快 （2）将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。 （3）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。 （4）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。 （5）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。 （6）调整厚度调节器到所需的切片厚度，先调约为25um，待切平后改为5um。 （7）一切调整好后方可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-60r/min。 （8）切成的蜡带到10-20cm长时，右手用另一支毛笔轻轻地将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。 （9）感觉效果较好的蜡片一小段，用单面刀片切取，再放入约43℃的水浴锅中展片，观察切片是否良好。 （10）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。 1.7.8 贴片
植物组织石蜡切片制作
植物组织石蜡切片的制作 一、实验目的 1．熟练掌握石蜡切片的方法。 2．掌握永久制片的制作过程，为研究植物的内部结构奠定基础。 3．学会植物内部结构的比较研究方法。 二、实验器具与试剂 1．器具 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2．试剂 10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 三、实验材料 幼嫩植物各部分，根据季节选择材料。 四、实验内容与方法 石蜡切片法是显微技术上最重要、最常用的一种方法。它是把材料封埋在石蜡里面，用旋转切片机切片，可以切出很薄的切片。凡是精细的工结构，大都用石蜡切片。全都过程如下：1．固定 2．洗涤 3．脱水与硬化 4．脱酒精 2．封埋 6．切片 7．粘片 8．脱蜡 9．染色 10．脱水 11. 透明 12．胶封 （一）固定 1．固定的意义：固定就是用药品把细胞杀死，使细胞的原生质凝固，死后不发生变化，尽可能保持原来的结构以供我们观察。良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。 2．固定液的种类：固定液的种类很多，根据配制成分可划分为： (1) 简单固定液：以一种化学药品配制的固定液。常用的简单固定液有： A．酒精即乙醇，用作固定液，常用纯酒精或95％酒精。酒精穿透力强，固定时间常在1小时以内。高浓度酒精有使材料收缩的作用。70％的酒精可作保存液。配制低度酒精必需要用普通酒精即95％的酒精，绝不可用纯酒精。酒精为还原剂，不能与铬酸、锇酸、重铬酸钾等氧化剂配合。酒精可使核酸，蛋白质及肝醣等发生沉淀，但能溶解脂肪及拟脂。 B．福尔马林即甲醛，具强烈刺激性的气味，纯净的甲醛，为无色透明液体。固定用的浓度为4-10％甲醛也是强还原剂。不能与铬酸、锇酸等氧化剂配合。经固定后，材料变硬，通常不引起皱缩，但随后经过他种药剂处理时，就每每出现皱缩。所以甲醛一般不单独作固定，而与其他液体混合使用。 C．醋酸：为无色透明的液体，刺激性极强，冷则凝结成冰，故又叫冰醋酸。醋酸以与水和酒精配成各种比例的溶液，所用浓度为0.2～5％，也常与其他固定剂配合使用。醋酸穿透性很强，单独使用，有使原生质膨胀的作用，故常与酒精，甲醛等合用，醋酸为固定染色体的优良固定液，因此固定染色体的固定液中，几乎都含有醋酸。 (2) 混合固定液：由几种药剂，适量配制而成。常用的有下列几种： A、F.A.A固定液(又称万能固定液)： [用途]这个固定液在植物研究上，应用最多，为植物组织最常用的固定液。固定时间，不受
组织切片及定向包埋技术
组织切片及定向包埋技术 谭夕东215123 摘要:本文对淡水鱼类各组织的常规石蜡切片中常迂到的技术障碍进行了探讨性的研究。经过多次反复试验总结出了多种有效方法,使各类组织切片都能得到满意的效果,同时减少了试剂的致毒作用和环境污染。在此工作基础上提出了光镜—电镜的定向包埋技术,使光镜的局限性扩展到超微结构使微观与超微结构能有统一的认识。 关键词:淡水鱼类;脆化;松脆;稚鱼;卵黄囊 随着淡水渔业的发展,人们对鱼类的研究也从宏观渐至微观。但对于有些组织如成熟卵及卵黄囊很大的稚鱼等,经过苯、醇类作用后脆化不能切制成完整的片子。但是在石蜡切片的制作过程中,我们历来都是用苯类(尤其是二甲苯)作为透明剂和石蜡的有机溶剂。组织块经酒精脱水后,必须再用二甲苯作为中间媒介剂将酒精取代出来,然后才能进行透蜡。否则,虽然水分除尽,但组织内部积蓄酒精,石蜡仍难透入。同样,切片染色前和染色后,也需要用二甲苯脱腊和透明。因此在整个制片过程中,不但要多次用二甲苯和酒精,而且组织块在其中浸渍时间难以掌握,久浸会使组织松脆,影响切片质量;时间不足又影响透蜡效果,我们采取了预先处理、补救方法及改变化学试剂等方法使较难切制的组织都能得到满意的片子。另一方面,由于光镜的局限性及切片厚度的影响,在选择样本内容易使切片组织丧失。直接制成电镜样本,有时由于切片大小,修块不准等多种原因,影响观察,而采用将样本首先精确定位的包埋技术,然后转制成电镜样本来进一步观察使微观与超微观结构能有统一的认识。 1材料与方法 1·1材料 标本采自黑龙江水产研究所实验埸。分别取鲟鱼、鳟鱼、大白鱼的肝、鳃、卵等。用Bouin氏液、Carnoy 氏液和10%甲醛固定液固定,常规石蜡包埋。切片厚度8μm, H-E染色,光学显微镜镜检,拍照。 1·2方法 1·2·1补救方法 主要对于一些已经包埋好的但切片效果不好的组织块。火棉胶(Ceuoidin)是三硝基纤维素的商品名,是由浓硝酸和浓硫酸作用于脱脂棉而成,易溶于酒精及乙醚的等量混和液体中,也可溶于丙酮及丁香油等。利用其特点,采用了火棉胶补救法,在切制片中用毛笔在组织块表面上涂一薄层10%火棉胶使整片组织粘连一起,这样可以切制成完整的组织片子,稍停数秒钟待火棉胶干燥再切下一张,然后将胶面向上贴在载玻片上,染色时在脱腊前先将胶膜脱去,然后再进行常规的染色至封片。 1·2·2预先处理法 Blendrum氏技术对于已固定的小组织块的制片是一种非常有效的方法。组织从固定剂中取出,水洗后浸于4%碳酸水溶液内1~3d。如组织太硬不论是切制迂到困难还是做先期的防护处理均可将蜡块浸泡在Mouirex内过夜次晨用常规方法切片,虽然蜡块切面有肥皂样硬度但对切片和染色皆十分优良。 1·2·3改良化学试剂 由于苯类使组织松脆影响切片质量,而且对人体有害。参考有关资料我们用兼具脱水作用的透明剂松油醇(Terpineol)代替无水酒精与二甲苯制作石蜡切片,并以攸伯拉(Euparal)封片获得相当满意的结果,具体方法如下:松油醇,又名萜品醇,松节油透醇和松脂醇,分子式为C10H18O,是有三种异构体的混合物。折光率为1·483~1·486。它是一种无色粘稠液体,具有丁香味和甜味或樟脑味,能与醇和醚相混溶,难溶于水,也可溶解石蜡。攸伯拉为无水封片剂之一,国外已普遍用于切片封苫。其优点是: (1)标本可以直接从95%酒精取出封片,不必经过无水酒精。 (2) 24h即可干燥。 (3)折光率为1·483,较中性树胶(1·578)为低。比较接近动植物细胞的折光系数 (1·4左右)因此,许多未染色或染色很浅在中性树胶中看不清的细微构造,用攸伯拉 封片就能显示出来。 1·2·4将已固定的样本转制成电镜样本 将样本放入10%甲醛固定液中,然后用锋利刀片取出样本放入磷酸缓冲液(pH=7·4)中冲洗,按电镜生物样本常规制备法进行锇酸的二次固定,磷酸缓冲液冲洗及各级丙酮脱水,最后用环氧树脂#618进行包埋和聚合。在包埋块保留最大切面条件下做粗略的修整,将样本用玻璃刀切制成1μm厚的半薄切片,进行光镜观察。根据观察结果选择适宜的包埋块依反光定位修块法做精确的修整和进行超薄切片。
小鼠部分组织的石蜡切片制作
小鼠部分组织的石蜡切片制作 一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包 埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其 组织结构。 二、材料与用具 1 ?材料：小鼠肝脏、脾脏等。 2 ?用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 三、实验内容与步骤 1 .取材及固定 取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm的组 织块。用先用0.85%的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污 物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀 或其他器具刮之。 由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr。如果是 管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 取下的材料马上进行固定，采用FAA固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1 , 固定时间2 hr以上，超过24hr时可继续浸泡或转入70%酒精中保存。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2 .冲洗 固定后的组织块在进行脱水前用70%酒精洗去固定液。 3 .脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换 出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。 常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30%> 5C%> 7%> 80%> 9%> 95%> 10（% （I ）> 10（% （n ） 组织块在各级较低浓酒精（小于70% ）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过 0.5立方厘米的组织块脱水时间为6?12 hr，在高浓度酒精中（大于70%）脱水时间为3 hr 左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆 的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15?30 min左右。在脱水瓶中酒 精的量与组织块之比约为50:1。 简化步骤如下： 70% （一夜）——80% （1 hr）——90% （30 分）——95% （30 分）——100% （15 分）——酒精+二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+二甲苯（30分）——石蜡（80分） 4 .透明 透明是石蜡切片法切片前必经的一步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒 精，以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。经
常规组织切片技术
常规组织切片技术一.(A1型题)10%福尔马林固定组织的原理A A使蛋白质发生凝固. B使蛋白质发生交联. C沉淀核蛋白. D使蛋白质沉淀. E凝固脂肪 二.(X型题)标本取材的注意事项ABCDE A选择恰当的取材部位 B避免组织受挤压变形 C大小适当 D根据组织.器官的不同选择正确的切面方向 E正确记录并做好组织块标记 三(A1型题)病理标本应及时固定,常用的固定液是D A 95%酒精 B丙酮 C戊二醛 D 10%xx E A-F液(乙醇.甲醛液) 四(X型题)常规组织切片的质量标准是ABCDE A切片完整
B薄厚均匀,厚度4-6微米 C无皱褶.无刀痕 D切片无污染 E捞片位置适当.美观 五(A2型题)送检标本中如鼻咽.淋巴结等组织常需要做免疫组化检查,应选用的固定液是CA 10%福尔马林 B 95%酒精 C中性甲醛缓冲液 D Zenker固定液 E丙酮 六(A3型题)临床送检组织的处理包括取材.固定.脱水.透明.浸蜡与包埋 1送检组织保存时固定液体积与组织体积比为E A 2倍 B 4倍 C 6倍 D 8倍 E 10倍 2脱水用酒精浓度应从低到高,脱水的作用D A将组织进一步固定 B减少组织的硬度 C去除细胞内沉淀物
D置换组织内的水分 E去除细胞内未结合的固定剂 3组织石蜡切片最常用的透明剂是E A酒精 B丙酮 C异丙醇 D正丁醇 E二甲苯 七(A4型题)在常规组织切片过程中经常会碰到各种问题 1制作好的石蜡组织块放一段时间后,组织发生凹陷,原因是D A没有用蜡封组织块 B制作蜡快时透明时间过长 C浸蜡时间短 D脱水时间不够 E组织块过大 2组织脱水后透明时间过长切片时会出现A A切片易碎成粉面 B切片与切片刀粘附 C切片薄厚不均或间歇出片 D不能成连续切片 E切片打卷
小鼠部分组织的石蜡切片制作
小鼠部分组织的石蜡切片制作一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其组织结构。 二、材料与用具1．材料：小鼠肝脏、脾脏等。 2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 三、实验内容与步骤 1．取材及固定取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm 的组织块。用先用0.85 ％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。 由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr 。如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 取下的材料马上进行固定，采用FAA 固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1 ，固定时间2 hr 以上，超过24hr 时可继续浸泡或转入70% 酒精中保存。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2．冲洗固定后的组织块在进行脱水前用70% 酒精洗去固定液。 3．脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30 % 50 % 70 % 80 % > 90 % > 95 % > 100 % （I ）100 % （n ） 组织块在各级较低浓酒精（小于70 ％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过
组织切片制作步骤
如何做出一张合格的组织切片？ 一般要先取材→固定→透明→包埋→切片，最后进行染色组化等操作。本文着重叙述取材以后如何进行包埋和切片。 包埋可分为OCT包埋（冰冻切片）与石蜡包埋。 .冰冻切片对于组织的抗原性保留比较好，但是形态保留比较差，一般用来做原位杂交ISH，免疫荧光IF。冰冻切片较厚一般厚度8~15μm。冰冻包埋步骤较为简洁，固定之后，直接用镊子将样品放置到样品托上，挤压OCT完全包裹组织，放入冷冻机待OCT凝固即可。凝固后就可以直接切片。如果不能及时切片，用锡箔纸包装好，放入-80℃存放。 .石蜡切片，一般用来做HE染色或者免疫组织化学IHC。厚度更薄，一般为4um，工艺较为复杂并且制作样本的好坏取决于不同组织的种类和组成，更加依赖制作者的经验，需要在实验过程中不断优化才能得到最佳的实验条件。 下面是石蜡包埋和切片的具体步骤： 一、实验材料
动物组织，4%多聚甲醛（PFA），PBS，ddH2O，二甲苯，梯度乙醇，石蜡，石蜡包埋机。 二、实验步骤 1、取材：针对各组织部位规范化取新鲜组织，并用刀片单向切割成约3-4mm大小组织块，不要超过5mm。 2、固定：将切好的组织块放入4%多聚甲醛（PFA）中固定，以组织块与4%多聚甲醛体积比1：7为宜。PFA最好现用现配，一般在4度固定24~48h即可，固定时间因组织而异。冰冻切片可以直接用丙酮固定。其他固定液比如缓冲福尔马林PBS配的福尔马林含有K+和Na+，PH=7.4。 固定的原理是采用蛋白质凝固剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构、位置和除水以外的物质的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构和生活时相仿。 关于固定液的选择可以参考这篇文章[1]。 3、洗去PFA：固定完毕后，流水冲洗3次，每次5分钟。 4、脱水透明：此步骤应根据不同组织设置合适时间，基本流程如下
第二章 组织切片技术
第二章组织切片技术 王永忠 第一节取材及固定 一、动物致死法 1. 麻醉法可将浸有乙醚或氯仿的棉球连同小动物一起密封于钟罩或有盖玻璃瓶内进行麻醉。也可用4%(戊巴比妥作静脉注射，剂量一般按动物体重每公斤1毫升，或用20%氨基甲酸乙酯(尿烷或乌拉坦)作腹腔注射，剂量一股按动物体重每公斤5毫升． 2. 空气栓塞法如兔可用50毫升注射器将空气由耳静脉推入，使动物很快死亡。 3. 击头法如大、小鼠，可用重物猛击头后部或将其头后部猛撞桌沿，最好一击而死。 4. 断头法青蛙、小鼠等小动物，可用剪刀剪去其头部，如反射尚未消失，则可用探针插入椎管中，破坏脊髓。较大动物如兔等，可用斧头迅速砍头致死。 5. 股动脉放血法动物经吸入乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切开股动脉放血。 无论何种致死法，都要求动作迅速，因为动物一旦死亡，其组织与细胞即开始自溶。组织学检查，特别是细胞学观察，要求材料新鲜。 二、取材注意事项 1. 材料新鲜最好是动物的心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内．脏器的上皮组织最易变质，应争取在死后半小时内处理完毕． 2. 组织块力求小而薄科研使用的组织块厚度以不超过5毫米为宜，较理想的厚度为2毫米左右．不仅要考虑厚度，而且其长度与宽度，在可能范围内也应力求短小。以使固定液能迅速而均匀地渗入组织块内部。 3. 勿使组织块受挤压切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回挫动。夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损仿组织，细胞。取材时，组织块可稍取大一点，以便在固定后，将组织块的挤压或损伤部位修去。
4. 尽量保持组织的原有形态新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形; 神经，肌肉组织等，则可将其两端用线扎在木片或硬纸片上固定。 5. 要熟悉取材的部位要能准确地按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的胰腺尾部; 脊髓取腰膨大与颈膨大处，肺应取有细支气管及带有软骨片的小支气管部位等。 6. 动物品种的选择如观察肥大细胞，以大、小鼠皮下组织为佳。 7. 选好组织块的切面熟悉某些器官的组织结构，然后决定其切面的走向; 纵切或横切往往是显示组织结构明晰的关键。如一长管状器官以横切面较好。 8. 保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用生理盐水冲洗，然后再入固定液，但要注意防止组织损伤。 9. 切除不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉, 否则将给固定、脱水、浸蜡、切片等带来一些不必要的问题。 三、组织固定法 固定是组织学制片的重要步骤。即使取材很好，若固定不当，也得不到好的切片。 1. 蒸气固定法比较细小而薄的标本，可用锇酸或甲醛蒸气固定。主要用于血液或细胞涂片以及某些薄膜组织等的固定。具体操作时，应先准备有盖培养皿一个，其中滴入1～2％锇酸水溶液2～3滴，将血液涂片放置其中。固定30秒钟至1分钟左右，立即水洗后进行染色，然后封片或其它保存处理。 2．注射、灌注固定法某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，这时宜采用注射或灌注固定法，将固定液注入血管，经血管分枝到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。 局部灌注固定如肺可将固定液从气管或支气管注入。肝、肾等脏器则可从肝、肾动脉注入固定液，同时，切断其静脉以便血液排出，使固定液充分进入。脑的固定，须在动物麻醉后，暴露颈动脉，
病理组织切片制作过程详解
病理组织切片制作过程详解 -森贝伽生物实验代做中心 公司中心实验室建设有病理学，分子生物学，细胞生物学，免疫学，蛋白质组学，实验动物模型构建，生物芯片，生物信息学等实验技术服务平台。此外，还提供技术咨询培训，课题合作设计与申报，论文翻译润色等实验技术服务。 1．取材 取材的好坏，直接影响切片的质量。取材时，首先要有一把锋利的取材刀，在切割组织时要避免取材刀来回拖拉，切取的组织块厚薄要均匀，一般厚度以0.2 ～0.3cm 为适，较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌组织等可适当厚一点，而脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些；淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织，如碰到不可避免的钙化组织，一定要非常小心。在切取纤维组织、肌肉组织、胃肠道时，应注意纤维及肌肉的走向，取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。 (1）材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。 (2）组织块的大小：所取组织块较理想的体积为2.0cm ×2.0cm ×0.2cm ，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm 即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3 ～0.5cm ，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。 （3）勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。 （4）规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。 （5）选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。 南京森贝伽生物科技有限公司 实验技术服务，代做实验
动物组织切片观察
光学显微镜的使用及动物组织切片观察 丁曦钰 141140015 一、实验目的 1、了解显微镜的工作原理，学习光学显微镜的使用。 2、基本组织切片的观察与记录。 3、实验报告的书写要求。 4、生物量级、生物系统及生物类别。 二、实验原理 1.光学显微镜的工作原理：标本经物镜和管镜放大后，形成倒立的实像： 实像经目镜再次放大后，形成放大的虚像。 2.光学显微镜的使用：先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转 动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在最高点。如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。 聚光镜下的虹彩光圈应调到适当的大小，以控制射入光线的量，整理增加明暗差。 3.生物量级：残基（氨基酸，核苷酸，脂肪酸，甘油）→生物大分子→亚 细胞结构（subcellular structure）→细胞器→细胞→组织（器官）→系统→种群→群落→生态系统→生物圈 物理量级：基本粒子（夸克，轻子）→电子（自旋反平行）→质子→原子→分子（物体：生物量级）→天体→星系→星云→宇宙→宇宙膜 4.各胚层细胞发育走向 1）外胚层：神经系统（脑、脊髓、脊神经、自主神经、视网膜、耳、肾上腺髓质），表皮（毛发、汗腺、油脂腺、乳腺、晶体、口腔黏膜）2）中胚层：肌肉、骨骼、血液、真皮、心脏血管系统、泌尿生殖系统以及结缔组织（固有结缔组织、骨与软骨、血液） 3）胚层：消化系统、呼吸系统的上皮和有关腺体（胰，肝）、膀胱上皮 5．分辨力：能分辨最小间隔的能力，单位距离（人眼距目标物25cm处） R=Kλ nsin(a 2) K是透镜品质，光镜在0.61~1.0之间，λ光波波长或电子波长，n是光镜介质折射率，a是镜口角（样本对物镜的镜口角，一般<180度），sina/2<1。 三、动物与器材 1.实验材料：13组织标本 2.实验设备：光学显微镜（生物显微镜） 四、方法与步骤 1.实验分组 2.实验原理讲解 3.实验报告要求介绍 4.使用显微镜进行操作观察 1）安放显微镜