土壤微生物的分离纯化与鉴定

——土壤微生物的分离纯化与鉴定

目录

摘要 (3)

关键词 (3)

前言 (3)

实验目的 (3)

实验原理 (4)

一、经典分类鉴定方法 (4)

二、现代分类鉴定方法 (5)

实验仪器及材料 (6)

实验步骤 (7)

A.细菌的筛选，分离纯化及鉴定 (7)

1. 细菌的筛选 (7)

2.细菌的分离纯化 (8)

3. 细菌的基本形态及运动性鉴定 (8)

4. 细菌的生理生化试验 (11)

5. 土壤中分解果胶细菌种类和数目的测定及纯化细菌菌属鉴定 (12)

B.霉菌的筛选，分离纯化及鉴定 (12)

1. 霉菌的筛选 (12)

2.霉菌的分离纯化 (13)

3. 小室培养法鉴定霉菌 (13)

实验结果 (14)

A.细菌部分 (14)

B.霉菌部分 (21)

摘要

利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化，得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌。根据菌落形态观察，革兰氏染色结果，芽孢有无及位置，运动性以及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。

关键词

土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养

前言

在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。

分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。

实验目的

1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的

方法；

2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法；

3.学习测定土壤中细菌数目，种类的方法；

4.根据菌落形态，染色结果，运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室

培养法观察鉴定未知真菌。

实验原理

一、经典分类鉴定方法

以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程，因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察，染色，生理生化试验，免疫学试验等对其进行逐步定位。

二、现代分类鉴定方法

1．微生物遗传型的鉴定

（1） DNA碱基比例的测定（G+C）mol%以下为该方法的关键因素：

*解链温度法（Tm值）

*(G+C)mol%值只能做否定判断；

*（G+C）mol%值差别>5，属不同的种；

差别>10，属不同的属。

（2）核酸分子杂交法

*DNA-DNA分子杂交原理：DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专

一性。

结论：

I DNA同源性≥ 60% （同种）

II DNA同源性≥ 70% （同亚种）

III DNA同源性60~ 70% （不同亚种）

IV DNA同源性20~ 60% （同属）

（3）16s rRNA作为细菌进化的计时器

本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制，主要以微生物形态鉴定以及

生理生化指标鉴定为主。

实验整体思路：

在确定取样环境之后，对微生物原样进行梯度稀释，产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数；

通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化，用平板划线法多次划线得到纯种；

对得到的纯种细菌染色并镜检，利用形态学方法以及运动性对微生物做一粗略的定位；

根据镜检设计相关生理生化试验作进一步定位；

运用小室培养法观察霉菌形态并对其进行鉴定；

根据以上获得的信息确定微生物类群并加以定位。

实验仪器及材料

1.土样：18号土样

2.试剂及培养基

a)培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分

离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培

养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基

b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95%

乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等

3.仪器

锥形瓶（500mL×2；300mL×2；100mL×3）、培养皿（20套）、试管（20

支）、移液管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮

纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等

实验步骤

A.细菌的筛选，分离纯化及鉴定

1.细菌的筛选

a)土样处理

i.配制生理盐水：在烧杯中配置200ml0.85％的生理盐水，用移液

管各移取9ml于五支洁净试管，再移取90ml配置好的生理盐水于

三角烧瓶，并放入少许玻璃珠，包好灭菌；

ii.加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中，充分震荡摇匀，然后放在30℃恒

温培养箱中静置15min。

b)果胶酶菌种筛选

i.梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌

水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3两

种稀释度的土壤溶液（如下图）；

ii.涂布：配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，分别写上10-1、10-3两种

稀释度字样，每稀释度标记三皿，然后用无菌吸管分别由10-3、10-1

两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位

置，每皿准确放入0.2ml，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布

均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分

布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；

iii. 培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；

iv.

果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿，用0.5％的刚果红染色15-20min 后，倒掉刚果红，用1mol/L 的NaCl 脱色几分钟至观察到透明圈，则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力； v.

菌落描述：取此菌进行菌落形态描述，就菌落的大小（大、中，小），颜色（白，黄，粉红等），干湿（干、湿），边缘（整齐，不整齐），表面（光滑，粗糙，有无突起等）分别进行阐述并详细记录；

2. 细菌的分离纯化

a) 划线分离：制备果胶酶划线培养基，

灭菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌种，第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离，划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：不能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在

上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。操作完毕后对接种针进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，再如图所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划线完毕后盖盖平放；

b) 纯种保藏：再配制一份普通细菌培养基，分装试管后灭菌，制得斜面，将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定。

3. 细菌的基本形态及运动性鉴定

a) 纯种果胶酶水解能力的测定

图 细菌的划线分离示意图

配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，将分离纯化的细菌点种于平板上（注

意：点种的量不宜过多，以3～4个为宜），在30℃培养箱中培养1～2

天，取培养后的平皿用0.5％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果

红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，测量并记录透明圈

的大小

b)简单染色步骤

i.涂片

取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；

（注意取菌不要太多）

ii.干燥与固定

涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；

iii.染色

将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1.5min

iv.水洗

倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太

大，至洗出水无色为止；

v.干燥

用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；

vi.镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。

c)革兰氏染色步骤

i.涂片

先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域，在另一侧四个区域的位

置分别滴加半滴无菌水。分别取四种活跃生长期菌种（大肠杆菌，金黄

色葡萄球菌，枯草杆菌和一种自选菌）按常规方法涂片（不宜过厚），用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固

定。

ii.初染

滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色1.5min后水洗；

iii.媒染

先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min后水洗；

iv.脱色

先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗；

v.复染

先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染1.5min后水洗；

vi.镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果。

d)芽孢染色步骤

i.涂片，加热干燥及固定

在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水，分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌。然后按照常规方法加热干燥及固定；

ii.孔雀绿加热染色

用木夹夹住载玻片，向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位，然后在酒精灯上微微加热（孔雀绿着色能力强，加热可使较难染色的芽孢染成绿色，且再难洗脱）至染液冒蒸汽开始计时并维持5min，注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜，过热或加热不足均会影响观察效果，且加热时在载玻片上随时补加染液，切勿让涂片干涸；

iii.水洗

水洗一定要等载玻片冷却后进行，否则可能导致载玻片的破裂。具体水洗按常规方法进行；

iv.复染

用0.5%番红水溶液复染2min；

v.水洗并干燥

按常规方法水洗后自然干燥；

vi.镜检

先在低倍镜下寻找视野范围，然后换用高倍镜调焦，最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢。

e)半固体穿刺法观察细菌运动性

i.配制培养基

配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基，分装于4支试管内，110度灭菌

20-30分钟，正立于烧杯中冷却至室温；

ii.在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近(但勿触及)试管底,然后循原路退出。如图所示：

iii.接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性。

4.细菌的生理生化试验

a)淀粉水解试验

i.培养基制备

配制淀粉培养基，灭菌后将冷却至50℃左右，无菌操作制成平板；

ii.接种

用记号笔将平板划成四部分，将所鉴定的菌种在不同位置点种。（注：由于四种菌对淀粉的水解程度不同，为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠，宜采用点种的方式，如下图）。接种完成后贴好标签；

iii.培养

将上述已接种的平板倒置于30℃培养箱中培养48小时。

b)葡萄糖发酵试验

i.培养基配制

将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。

ii.接种

用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。

iii.培养

将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。

c)乳糖发酵试验

i.培养基配制

将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。

ii.接种

用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。取盛有乳糖发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。

iii.培养

将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。

d)吲哚试验

i.培养基的配制

将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。

ii.接种

用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有蛋白胨水培养基的试管2支，接种鉴定的菌种。

iii.培养

将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。

e)甲基红试验

i.培养基的配制

将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。

ii.接种

用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有蛋白胨水培养基的试管2支，接种鉴定的菌种。

iii.培养

将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。

5.土壤中分解果胶细菌种类和数目的测定及纯化细菌菌属鉴定

取培养三天的菌液1000倍稀释涂布平板3个，观察不同形态菌落的数目以及总菌落数，并记录，求3个平板的总菌数平均值来计算1g土壤中分解果胶的细菌数目。

根据以上细菌的形态，革兰氏染色结果，芽孢的位置，运动性以及生理生化试验结果查看伯杰手册对纯种细菌做出鉴定。

B.霉菌的筛选，分离纯化及鉴定

1.霉菌的筛选

a)涂布

配制几丁质酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却至不烫手，无菌操作加链霉素（1mL/1000mL）倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标

记，分别写上100、10-2两种稀释度字样，每稀释度标记三皿，然后用无菌吸管分别由100、10-2两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置，每皿准确放入0.2ml ，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次； b) 培养

将平板倒置于30℃恒温箱中培养2-3天；

2. 霉菌的分离纯化

a) 划线分离：制备几丁质酶划线培养基，灭

菌后倒平板，挑取长出的菌种，第一次划线分离培养2-3天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离，划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：不能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落

一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。操作完毕后对接种针进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，再如图所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划线完毕后盖盖平放；

b) 再配制一份PDA 培养基，分装试管后灭菌，制得斜面，将纯种划线接种在

斜面上培养保存并进行下一步的鉴定。 3. 小室培养法鉴定霉菌

a) 灭菌准备

制作4个平皿，在每个平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一U 形玻棒，其上放一洁净载玻片和四块盖玻片，盖上皿盖、再与1个空平皿一起用牛皮纸包好；在100mL 锥形瓶中用甘油配制20%的甘油，加塞包好；最后取10mL 移液管两支用牛皮纸包好。

b) 灭菌

图 霉菌的划线分离示意图

将上述用牛皮纸包好的仪器与试剂连同配好的PDA培养基一并放入灭菌锅中110℃灭菌30min（由于培养基中有葡萄糖，为防止由于高温而使糖发生糊化而变质，灭菌温度不宜过高）。

c)制作琼脂薄片

在无菌操作台上分别取已灭菌并溶化冷却至约50℃的马铃薯琼脂培养基6～7mL 注入两个灭菌空平皿中，使之凝固成薄层。在两个凝固后的平板背部用记号笔画下约1～1.2cm×1～1.2cm的方格，通过无菌操作，用解剖刀沿画下的方格线将其切成方形的琼脂块。（注：解剖刀使用前应先在酒精中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，冷却后再进行切割操作）

d)接种

在无菌操作台上，先用镊子将载玻片放于U型玻璃管上，然后用解剖刀取一小块儿琼脂块，置于载玻片上（注意：镊子与解剖刀每次使用前都应先在酒精中浸泡，灼烧冷却后再进行下一步的操作），用接种环分别从斜面培养物上挑取很少量的鉴定菌的孢子，分别接种于培养小室中琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。最后用移液管在培养小室中的圆滤纸上加3ml 灭菌的20 %的甘油（用于保持平皿内的湿度 ) ，盖上皿盖并贴标签，每一种菌接种两个小室。

e)恒温培养

将接种后的平皿正置于28℃培养箱中恒温培养3～4天。

f)镜检

在显微镜下直接观察小室培养后的载玻片，用低倍镜即可较为清晰的观察到霉菌的菌丝体及孢子，根据真菌手册对所得的菌进行鉴定。

实验结果

A.细菌部分

1.1000倍稀释平板的细菌种类和数目

表1细菌种类及数目的测定

1g 土壤中细菌的总数目：

22×1000×100/(0.2×10)=1.1×106（个）

表2目标菌菌落形态描述

2.水解圈的检测（见图）：

表3 水解圈大小测量数据

3.细菌的基本形态（见图）

图1目标菌的简单染色

4.细菌的革兰氏染色（见图）

图2 大肠杆菌的革兰氏染色结果

图4 目标菌的革兰氏染色结果

图 3金黄色葡萄球菌的革兰氏染色结果

由图对比可知，目标菌为革兰氏阳性菌 5.芽孢染色结果：

图5 目标菌芽孢染色结果

6. 生理生化试验

a) 淀粉水解试验:

表1.淀粉水解试验结果(“+”表示阳性，“—”表示阴性)

芽孢

图6 淀粉水解实验结果

b)葡萄糖发酵培养基：

表2. 葡萄糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）

c)乳糖发酵培养基:

表3. 乳糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）

图 7葡萄糖酵解试验示意图图8 乳糖酵解实验室意图

d) 吲哚试验:

表4.吲哚试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）

e) 甲基红试验:

表5. 甲基红试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）

图9 吲哚试验示意图

图10 甲基红试验示意图

7.半固体穿刺

由图可知，该细菌具有运动性，则具有鞭毛。

土壤微生物的分离纯化与鉴定

土壤微生物的分离纯化 与鉴定 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】

目录

摘要 利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化，得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌。根据菌落形态观察，革兰氏染色结果，芽孢有无及位置，运动性以及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。 关键词 土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养 前言 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的 1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的 方法； 2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法； 3.学习测定土壤中细菌数目，种类的方法； 4.根据菌落形态，染色结果，运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室 培养法观察鉴定未知真菌。

实验原理 一、经典分类鉴定方法 以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程，因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察，染色，生理生化试验，免疫学试验等对其进行逐步定位。 二、现代分类鉴定方法 1．微生物遗传型的鉴定 （1） DNA碱基比例的测定（G+C）mol%以下为该方法的关键因素： *解链温度法（Tm值） *(G+C)mol%值只能做否定判断； *（G+C）mol%值差别>5，属不同的种； 差别>10，属不同的属。 （2）核酸分子杂交法 *DNA-DNA分子杂交原理：DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专 一性。 结论： I DNA同源性≥ 60% （同种） II DNA同源性≥ 70% （同亚种） III DNA同源性60~ 70% （不同亚种） IV DNA同源性20~ 60% （同属） （3）16s rRNA作为细菌进化的计时器 本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制，主要以微生物形态鉴定以及生理生化指标鉴定为主。 实验整体思路： 在确定取样环境之后，对微生物原样进行梯度稀释，产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数； 通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化，用平板划线法多次划线得到纯种；

微生物菌种的分离和纯化方法

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，

土壤中的微生物

1．土壤是微生物生长和栖息的良好基地 土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地：其原因在于土壤舍有丰富的动植物和微生物残体，可供微生物作为碳源、氮源和能源。土壤台有大量而全面的矿质元素，供微生物生命活动所需。土壤中的水分都可满足微生物对水分的需求。不论通气条件如何，都可适宜某些微生物类群的生长。通气条件好可为好氧性微生物创造生活条件；通气条件差，处于厌氧状态时又成了厌氧性微生物发育的理想环境。土壤中的通气状况变化时，生活其问的微生物各类群之间的相对数量也起变化。土壤的pH值范围。3．5～10．0之间，多数在5.5～8．5之间，而大多数微生物的适宜生长pH也在这一范围。即使在较酸或较碱性的土壤中．也有较耐酸、喜酸或较耐碱、喜碱的微生物发育繁殖，各得其所地生活着。土壤温度变化幅度小而缓慢．夏季比空气温度低，而冬季又比空气温度高，这一特性极有利于微生物的生长。土壤的温度范围恰是中温性和低温性微生物生长的适宜范围。 因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。事实上，许多对人类有重大影响的微生物种大多是从土壤中分离获得的，如大多数产生抗生素的放线菌就是分离自土壤。 2．土壤中的微生物数量与分布 土壤中微生物的类群、数量与分布，由于土壤质地发育母质、发育历史、肥力、季节、作物种埴状况、土壤深度和层次等等不同而有很大差异。lg肥沃的菜园土中常可含有108个甚至更多的微生物，而在贫瘠土壤如生荒土中仅有103～107个微生物，甚至更低。土壤微生物中细菌最多，作用强度和影响最大，放线菌和真菌类次之，藻类和原生动物等数量较少，影响也小。 (1)细菌 土壤中细菌可占土壤微生物总量的70％～90％，其生物量可占土壤重量的 1/10000左右。但它们数量大，个体小，与土壤接触的表面积特别大，是土壤中最大的生命活动面，也是土壤中最活跃的生物因素．推动着土壤中的各种物质循环。细菌占土壤有机质的1％左右。土壤中的细菌大多为异养型细菌，少数为自养型细菌。土壤细菌有许多不同的生理类群，如固氮细菌、氨化细菌、纤维分解细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫酸盐还原细菌、产甲烷细菌等在土壤中都有存在。细茼在土壤中的分布方式一般是黏附于土壤团粒表面，形成菌落或菌团，也有一部分散布于土壤溶液中，且大多处于代谢活动活跃的营养体状态。但由于它们本身的特点和土壤状况不一样．其分布也很不一样。 细菌积极参与着有机物的分解、腐殖质的合成和各种矿质元素的转化； (2)放线菌 土壤中放线菌的数量仅次于细菌．它们以分枝丝状营养体缠绕于有机物或土粒表面，并伸是于土壤孔隙中。1g土壤中的放线菌孢子可达107～108个．占土壤微生物总数的5％～30%．在有机物含量丰富和偏碱性土壤中这个比例更高。

微生物的分离和纯化

实验十四微生物的分离和纯化 一、目的要求 掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。 二、基本原理 在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。 三、器材 高氏1号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。 四、操作步骤 1．稀释涂布平板法 （1）倒平板将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至55—60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每毫升培养基中含链霉素30μg。然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板，如图Ⅶ-1所示。最好是将平板放室温2—3天，或 37℃培养24小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。 （2）制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从

微生物--土壤放线菌的分离与鉴定

土壤放线菌的分离与鉴定实验设计报告 学院：生命科学学院 班级： 2013级生科2班 组长：刘瑜 2013506076 组员：汤界世 2013506070 李宇秀 2013506071 于淑婷 2013506075 陈洁作 2013506079

郑国梁 2013506083 2015年10月15日 一、实验目的 1、了解采集土样的要求和方法。 2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。 3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。 4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。 二、实验原理 土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特

殊培养基的方法，来获得放线菌。

放线菌菌丝由基内菌丝，气生菌丝和孢子丝组成。其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。基内菌丝体大部分呈黄、橙、蓝、紫、绿、徽，但也有无色在显微镜下观察时，气生菌丝体颜色较深，且较基内菌丝体粗两倍左右。气生菌丝体发育到一定阶段，在它上面形成孢子丝。孢子丝形状有直、波曲、螺旋、轮生之分。螺旋有松、紧、大、小之分，其螺旋的方向也有左旋与右旋之分，大多数种为左旋，少数为右旋。孢子具有不同的形状，有球形、椭球形、杆状、柱状，在光学显微镜下就能看清楚。根据菌体基内菌丝，气生菌丝和孢子丝的这些特征即可判断出分离出的菌体为放线菌。 三、实验材料试剂与仪器设备 1、材料：土壤样品（采集生科院门前草地土壤、16号楼内花圃土壤各500g） 2、试剂：1）培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.4

大学土壤微生物分离实验报告

从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定 实验报告 生物科学与技术系 09食品（2）班 姓名：xxx 学号：xxx

从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定 【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。 【关键词】细菌放线菌霉菌划线分离培养基的配制高压蒸汽灭菌 前言： 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出 具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原 有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的： 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握微生物的鉴定方法。 3、对提取的土样进行微生物分离、纯化培养，根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。实验原理： 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。通过如下几种方法可以分离纯化微生物：稀释倒平板法(pour plate method)、涂布平板法(spread plate method)、稀释摇管法(dilution shake culture method)、平板划线分离法（stesak plate method）。 此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细

模板土壤微生物的分离培养技术实验报告.doc

重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称： 实验指导教师： 学院： 专业及类别： 学号： 姓名： 实验日期： 成绩： 重庆大学研究生院制

一、实验目的 1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法； 2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；； 3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能； 4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。 二、实验原理 1、培养基的种类 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。 已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。 培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。 2、接种方法与无菌接种 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。 划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。

实验二微生物的分离、纯化和接种

实验二微生物的分离、纯化和接种 微生物的分离、纯化 1、目的要求 1.1了解微生物分离和纯化的原理 1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法 2、基本原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。 3、实验材料 3.1培养基 肉汤培养基（固体）。

3.2溶液或试剂 盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。 3.3仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。 4流程 倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。 5、步骤 5.1平板划线分离法 5.1.1倒平板 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。 5.1.2划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。

大学土壤微生物分离实验报告

从土壤中分离纯化培养微生物并作初步观察鉴定 【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据细菌在选择培养基的存活情况，确定该菌种的固氮解磷解钾属性。 【关键词】细菌芽孢杆菌培养基、选择培养基的配制高压蒸汽灭菌 前言： 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的： 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握微生物的鉴定方法。 3、对提取的土样进行微生物选择培养、分离、纯化，根据菌落的存活状况来判断未知 菌的属性。 实验原理： 菌种来源:选择无机磷农药含量较高的土壤,有机磷农药化工厂 旁边的土壤和排污口区的污水. 培养基的选取：五组选择培养基，分别以辛硫磷、甲胺磷、敌敌畏、草甘膦及五种有机磷农药混合为微生物生长的唯一氮源磷源。 分离纯化微生物：稀释倒平板法、涂布平板法、稀释摇管法、平板划线分离法。 此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部

分不需要的微生物。（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。 微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。 1. 实验器材、试剂与实验方法： 1.1器材： 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、培养皿、自动立式压力蒸汽灭菌器、烘箱、玻璃珠、移液枪、枪头、称量纸、药匙、试管架、接种环、酒精灯、超净工作台, 粉碎机，接种环，移液枪配枪头。 1.2试剂： 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、NaCl、95%乙醇、75%酒精，草甘膦，甲甘磷，敌敌畏，辛硫磷。 1.3土样、样品： 取自二十三冶草莓园的土壤，建设北路的大棚蔬菜菜地土壤，化工厂污水口。 1.4 实验方法 1.4.1配制培养基： (一）配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基200ml(用2个100ml三角瓶和2支试管分装）牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。 配方如下：牛肉膏 0.6g 蛋白胨 2g NaCl 1g 琼脂 3~4g 水 200ml pH 7.4-7.6 1、称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白 胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2、加热溶解在烧杯中加入少于所需的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用 玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。 3、调pH 用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH， 边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用１mol/l HCL进行调节。 pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的

土壤微生物的分离、培养、鉴定及菌落数的测定

吉林化工学院 科技性论文 题目：土壤微生物的分离、培养、鉴定及菌落数的 测定 学号：12130117 姓名：张金磊 年级：2012级 学院：化工与生物技术学院 专业：生物工程 指导教师：谢莹，许崇利（讲师） 完成日期：2014年3月20 日

摘要 土壤是矿物质、有机质和活的有机体以及水分和空气等的混合体。按重量计，矿物质占到固相部分（土壤干重）的90~95%或更多，有机质约占1~10%，可见土壤成分以矿物质为主。土壤有机质就是土壤中以各种形态存在的有机化合物。除此之外还有土壤溶液，它是土壤水分及其所含的溶解物质和悬浮物质的总称。土壤溶液是植物和微生物从土壤中吸收营养物的媒介。土壤微生物就是土壤中主要的有机生命体，土壤微生物是指生活在土壤中的细菌、真菌、放线菌、藻类的总称。其个体微小，一般以微米或毫微米来计算，通常1克土壤中有106～109个，其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质的分解和养分的转化。 本次实验是研究土壤中细菌、真菌、放线菌的数目。我们利用选择培养基，以便在土壤水溶液中选出目的菌种，在用分浓度梯度法在选择培养基上培养出但菌落，以便计数。计数时可以根据不同菌种的不同形态学特征来分辨，如果出现与上述三种以外特性的菌种可以用革兰氏染色鉴别。 关键词：土壤微生物选择培养计数

Abstract Soil is a mixture of minerals, organic matter and living organisms as well as water and air. By weight, for solid mineral (soil dry weight) of 90~95% or more, organic matter accounted for about 1~10%, visible in mineral soil composition. Organic compounds in soil organic matter is the soil in various forms. In addition to the soil solution, it is the floorboard of soil moisture and the contained dissolved substances and suspended substances. Soil solution is to absorb the nutrients in plants and microorganisms in soil medium. Organic life is the main soil microorganism, soil microbial refers to live in soil bacteria, fungi, actinomycetes, algae. The individual small, general with micron or nanometer to calculate, usually 1 grams of soil in 106 ~ 109, its species and quantity as soil environment and soil depth varies. They are oxidation, nitration, ammoniation, nitrogen fixation, curing process in the soil, promote the transformation of soil organic matter decomposition and nutrient. This experiment is to study the number of soil bacteria, fungi, actinomycetes. We use the selective culture medium, in order to choose to bacteria in the soil solution in the culture medium, but colonies on selection by density gradient method,

土壤微生物的分离鉴定

土壤微生物的分离鉴定 实验报告 09级生科一班（周一下午组） 安明玉 同组者：陈汶灿、程彬、陈肖然、高琳璐、秦瑶 一、实验摘要 利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。 二、实验目的 1.学会设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。掌握倒平板和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。 2.巩固练习显微镜使用方法。 3.明确培养基的配制原理，复习配制培养基及消毒灭菌的一般原理和操作步骤。 4.复习掌握细菌稀释分离和划线分离技术，平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌的培养条件和培养时间，复习平板菌落计数法。 5.复习掌握细菌的简单染色、鞭毛染色、革兰氏染色的基本原理和操作方法。 6.学习并掌握过氧化氢酶测定、细胞色素氧化酶测定和糖发酵与氧化试验的实验原理及其操作方法。 三、实验原理 1.对土壤中微生物的分离筛选及鉴定 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程成为微生物的分离与纯化，常用的方法有简易的细胞挑取法和平板分离法。 本实验采用平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化，其原理包括以下两个方面： (1)在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂形成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物； (2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得纯培养，获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。 但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的大本营，它所含有的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的微生物菌株。 2. 显微镜的使用及细胞的简单染色和革兰氏染色 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常称为复试显微镜。 在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，对微生物学研究最为重要，直接影响显微镜的分辨率。 与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间滴加香柏油。这样做

土壤微生物数量测定方法整理

土壤微生物的分离鉴定及数量测定 （一）培养基的制备 Ⅰ测定微生物总量培养基： 1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏Beefextract 5.0g 蛋白胨Peptone 10.0g NaCI 5.0g 蒸馏水H20 1000m1 琼脂15～20g PH 7.2~7.4 制备步骤： ⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解. ⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入 5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌. ⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL. ⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。 ⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。 ⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min. 2. 放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基） 可溶性淀粉20g KNO3 1g K2HPO40.5g MgSO4? 7H2O 0.5g NaCl 0.5g原0.05g FeSO4? 7H2O 0.01g pH 7.2-7.4 制备步骤： （1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。 （2）称量准确称量各种成分。 （3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。 （4）分装、包扎、灭菌。

微生物菌种的分离和纯化方法

微生物菌种的分离和纯 化方法 https://www.sodocs.net/doc/804609852.html,work Information Technology Company.2020YEAR

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。 1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法

不同水体中微生物的分离与鉴定

环境微生物 综合性实验实验报告 班级： 组员： 指导教师： 学年：2012 –2013 日期：2013-03-29

不同水体中微生物的分离与鉴定 摘要水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含一定数量的微生物。不同的水体由于受到物理、化学、生物等各个方面因素的影响,使其中所含微生物的种类和数量不同。本实验通过对雨水和湖泊水中微生物的培养、分离与鉴定，了解自然界中的不同水体中存在的微生物的种类和数量，比较两种水体中微生物群落的分布特点，进一步了解不同水体的清洁程度。 关键词微生物雨水鱼塘水种群 SOLATION AND IDENTIFICATION OF DIFFERENT MICRO-ORGANISMS IN WATER Abstract Water is the microorganism widely distributed natural environment. A variety of natural water often contains a number of micro-organisms. Different bodies of water due to the influence of the physical, chemical, biological and other factors, including the type and quantity of microorganisms contained in different. In this study, rain and lake water microbial cultivation, isolation and identification, understanding the distribution characteristics of the microbial community of the types and quantities of the different bodies of water in the nature of the micro-organisms, compare the two water bodies to learn more about the cleanliness of the different water bodies. Key words Microbial Rainwater Fish pond water Populations

土壤微生物的分离和纯化

土壤微生物的分离和纯化 一、实验目的 1、掌握从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学会根据微生物培养特征初步判断未知菌的类别。 3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。 二、实验原理 土壤是微生物生长和栖息的良好基地。土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，可用于培养细菌。链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，对酵母菌和霉菌不起作用。加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌。重铬酸钾或苯酚对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，可用于选择分离放线菌。 三、实验器材 1、材料：10cm左右深层土壤。 2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基 3、其他物品：试管、三角瓶、烧杯、量筒、电子天平、精密pH试纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、枪头、接种环、酒精灯、链霉素(1万单位/ml) 、10%苯酚、无菌水。 四、实验步骤 1、土样采集：取10cm左右深层土壤10g备用。 2、制备土壤稀释液：称取土壤1g，放入有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为稀释10－2的土壤悬液。然后进行十倍梯度稀释，依次制备10－ 3、10－ 4、10－ 5、10－ 6、10－7 稀释度的土壤稀释液。 3、培养基平板制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基各100ml。灭菌后分别倒3个平板。（高氏Ⅰ号培养基灭菌前加入10滴10%苯酚；马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和0.4ml 1万单位/ml链霉素） 4、接种：用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀。细菌选用10－4、10－ 5、10－6 三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，放线菌与霉菌选用10－2 、10－3、10－4三个稀释度，分别接种于高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基。（一个稀释度一个平板） 5、培养：细菌平板于37℃恒温培养1～2d，放线菌于30℃培养2～3d，霉菌于30℃培养3～5d ，观察。 6、计数：用稀释水样检测平板的菌落计数方法进行计数，报告细菌总数/(CFU·ml-1) 7、纯化：挑取典型菌落接种于相应平板，培养条件同上，培养纯化。 五、思考题

【实验】微生物的分离与纯化

微生物的实验室培养——自酿葡萄酒中酵母菌的分离与纯化 一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 （1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成） （2）分离纯化 实验 步骤 操作流程流程叙述操作目的、作用 接种方法一：点燃酒精灯 ↓ 1.灼烧接种 环并冷却 ↓ 2.沾取菌液 ↓ 3.平板划线 ↓ 4.转动培养 皿约70°角 ↓ 5.灼烧并冷 却接种环 ↓ 6.平板划线 ↓ 7．倒置培养 用火柴点燃酒精灯，保证实验操作在酒精 灯火焰进行 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红， 让接种环自然冷却 打开装有菌液的试管，塞子要拿在手上， 将试管口通过火焰灭菌，将冷却的接种环 伸入菌液中，沾取菌液。将试管口通过火 焰灭菌，用塞子塞住试管 左手将皿盖打开一条缝隙；右手把沾有菌 种的接种环迅速伸入平板内，划3到5条 平行线（不要划破培养基），盖上培养皿盖 逆时针旋转培养皿约70°角 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红让接 种环自然冷却 从第一区域划线的末端开始往第二区域划 线，重复以上操作，在三、四、五区域划 线，注意不要将最后一区的划线与 相连。（也可以用连续划“Z”字形线的方 法 倒置培养皿，放入培养箱中培养 避免周围环境中微生物的 污染 清除； 防止杀死菌种 防止塞子被污染； 清除的杂菌 接种到培养基表面 调整角度，准备第二区域 的划线 在琼脂固体培养基表面连 续划线的操作，将聚集的 菌种逐步稀释分散到培养 基的表面 减少培养基内的水分蒸 发，使培养基保持湿润； 防止水珠回流打散菌落 在右图所示 的培养皿内 用笔模拟接 种环画出两 种平板划线 法的划线轨 迹 接种 方法 二： 1.系列稀 释操作 准备六只试管 ↓ 分别加入4.5mL蒸馏水并灭菌，编号 ↓ 取 mL菌液放入第1支试管并混匀 ↓ 从第1支试管取0.5ml菌液放入第2只试管并 混匀 ↓ 重复步骤，直至最后一支试管 2.涂布平 板操作 滴加100μL菌液到培养基表面 ↓ 引燃涂布器，待酒精燃尽后，冷却8～10s ↓ 把培养皿打开一条缝 ↓ 在培养皿盖内侧进一步冷却涂布器，均匀涂布 菌液，转动培养皿，涂匀 ↓ 盖上皿盖,放置10min ↓ 倒置培养皿，放入培养箱中培养 清除涂布器上的杂菌 使菌液均匀分布在培 养基表面 使液体被充分吸收 结果 观察 观察划线平板和涂布平板上的菌落形态、颜 色、大小，可挑取少量菌落制成临时装片，显 微镜下观察。 对菌落进行初步鉴定 1

微生物菌种分离和鉴定技术

微生物菌种分离和鉴定技术 微生物纯培养分离技术获得纯培养物对微生物学研究至关重要。纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。液体培养基菌悬液连续稀释培养容器中仅含1个菌体单个菌体纯培养物固体培养基无菌土豆片1881年很多细菌不能在土豆上生长肉膏蛋白胨培养基明胶固化明胶高温易溶化不能37?C培养琼脂固体培养基1882年一直沿用至今方法冗长结果不稳定易污染微生物纯培养分离技术纯培养物分离方法固体培养基分离涂布平板法平板划线法平板倾注法稀释摇管法液体培养基分离单细胞孢子分离选择培养分离涂布平板法1、少量样品加到平板中央1mL2、玻璃三角涂棒浸入酒精3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面适当条件下培养平板划线法斜线法曲线法方格法放射法四格法平板划线法斜线法用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条再转动培养皿70?角并将接种环上剩余物烧掉待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。曲线法将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。平板倾注法对起始样品进行连续10倍稀释将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀培养后获得单菌落。培养基表面菌落为圆形而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。稀释摇管法适合厌氧菌的纯培养物分离无菌琼脂培养基试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50?左右待分离的菌种用这些试管进行梯度稀释摇匀、冷凝在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物培养后菌落形成在琼脂柱的中间液体培养基分离不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。在同一个稀释度的许多平行试管中大多数一般应超过95表现为不生长。单细胞孢子分离单细胞或单孢子分离法是采取显微分离法从混