微生物酶的分离与纯化研究

微生物酶的分离与纯化研究第一章引言

微生物酶是微生物体内可溶酶，是不可或缺的重要物质。微生物酶可以作为生化催化剂，在很多生物反应和化学反应中起重要作用。通过分离和纯化微生物酶，可以进一步研究其酶学特性和生物学功能，并为酶工业的发展提供理论基础和技术支持。

第二章微生物酶的分离

微生物酶的分离主要采用离心、过滤、电泳、柱层析等方法进行。其中离心法是一种最基础的分离方法，可以根据微生物酶的密度差异将其分离出来，但是分离效率较低，只适用于部分微生物酶的离心分离。过滤法可以通过滤纸、滤膜等过滤介质，在不同尺寸的孔隙上阻挡微生物酶颗粒进而实现分离。电泳法可以将微生物酶在电场中进行运动，根据它们的电荷差异实现分离，缺点是操作复杂、缺乏适当的纯化。

柱层析是对微生物酶进行有效纯化的方法之一。常用的柱层析方法包括离子交换层析、分子筛层析、凝胶层析和亲和层析等。离子交换层析是利用固定带电基团的树脂与微生物酶在离子交换反应中的瞬时电荷相互作用进行分离。分子筛层析是通过利用分子组分之间的大小差异，采用具有特定孔径的化合物质来固定和分离微生物酶。凝胶层析是根据微生物酶和基质分子间的物理/化

学作用发生分子筛分离的方法。亲和层析是利用微生物酶与某种特定物质之间的亲和作用而进行的纯化。

第三章微生物酶的纯化

通过上述柱层析等分离方法可以获得部分纯化的微生物酶，但是还需要进一步去除可能的干扰物质，提高纯化效率。常用的纯化方法包括酸碱沉淀、复相分离、隔离放大和薄层电泳等。

酸碱沉淀是利用微生物酶与水分子或离子，以及pH等物理化学因素的差异来进行沉淀分离的方法。复相分离是利用微生物酶和其它物质在两种互不溶的介质边界上，因为光学性质、密度、表面张力等物理或化学现象而被分离出来的方法。隔离放大是利用单倍体和同源染色体、化学诱变和选择等方法对微生物酶进行筛选和提纯的方法。薄层电泳是对微生物酶进行电泳分离后通过薄层电泳进行纯化的方法，常用于分离组分相似、分子量相近的试样。

第四章微生物酶的应用

微生物酶广泛应用于生物技术、制药、食品加工、环境保护等各个领域。在生物技术领域，微生物酶可以用来加速基因组DNA 的水解、RNA转录、双链DNA剪切等反应，为基因工程和基因组学研究提供技术支持。在制药领域，微生物酶可以用于合成生产抗生素、肽类化合物等药物。在食品加工领域，微生物酶可以

被应用于蛋白质、淀粉类等成分的水解和转化，以及某些食品的调味和加工等方面。在环境保护领域，微生物酶可以用于污水处理、固体废物处理和环境监测等方面。

第五章结论

通过分离和纯化微生物酶，可以深入了解其物理化学性质和生物学功能，并应用于各个领域中。未来，微生物酶的分离和纯化技术将不断发展和创新，推动其在更多领域的应用和发展。

酶的分离纯化方法介绍

酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。

酶学第三章酶活性的测定及分离纯化

第三章酶活性的测定及分离纯化 在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。 3.1 酶活性单位 酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶蛋白的浓度有关，又与酶分子的催化能力大小有关。酶活性用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即u/ml或u/mg。 3.1.1 实用单位 不同的酶采用不同的标准。如DNA聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下，30分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA（三氯乙酸）不溶物所需的酶量；又如T4 DNA连接酶的单位定义为：在20μl反应体积中，16℃，30分钟内，将50%的HindⅢ酶切的λDNA片段重新连接起来所需的酶量。ACC合成酶的单位是：30℃，1小时转化SAM生成1nmol ACC所需的酶量。 3.1.2 国际酶活性单位 1961年，国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准，即在特定的条件下，1分钟转化1μmol底物，或转化1μN底物有关基团所需的酶量为1个单位(u)。这是酶活性的国际单位。 3.1.3 Katal 1972年，国际酶学委员会提出了一个新的酶活单位，叫katal(kat)，katal是一个很大的酶活单位，1 katal是指1秒钟转化1mol底物，或转化1N底物有关基团所需的酶量。1 katal＝6×10u。 3.1.4 转换数 在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在1分钟内转换底物成产物的μmol数，可 表示为： 1/Kp称为一个催化循环，单位为分钟。 3.1.5 比活性 酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位

微生物酯酶的分离纯化技术及应用研究进展

微生物酯酶的分离纯化技术及应用研究进展 酯酶，又称羧酸酯酶，是一类能够对羧酸酯酯键作用的水解酶，可在水分子的参与下，经由水解作用，将酯类切割成酸类与醇类。酯酶普遍存在于动物、植物和微生物中，在水分子的参与下能够催化裂解酯键形成相应的醇和酸。微生物酯酶作为生物催化剂，具有很高的催化功能、底物特异性和反应特异性，利用其水解反应、酯转换以及酯合成反应广泛应用于食品、化工、环保等领域。在自然界中能产生酯酶的微生物资源是非常丰富的，主要来源是真菌，真菌中主要是青霉、镰孢霉、红曲霉、黑曲霉、黄曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁头霉、须霉、白地霉和核盘菌等l2属，其次是细菌，细菌主要是假单胞菌、粘质赛氏杆菌、无色杆菌和葡萄球菌等。另外，放线菌中的个别种类也能产生一定量的酯酶。 对于微生物的胞外酯酶，发酵液经离心或过滤去除细胞，将上清液用超滤、盐析或有机溶剂沉淀等方法浓缩粗提;胞内酯酶则需进行细胞破碎再分离，大多数采用盐析或有机溶剂沉淀的方法进行粗提，为了获得更高的纯度，再用凝胶过滤或亲和层析等方法进行细分离。 1. 微生物酯酶的常规分离纯化技术 1.1超滤超滤是利用压力或离心力，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化，根据蛋白质分子大小的不同而选择不同分子量的膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，从而使蛋白质得到分离。 1.2盐析法 盐析一般是指溶液中加入无机盐类，蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。一般粗抽提物常用该法进行粗分。 1.3 有机溶剂沉淀法 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法。有机溶剂能降低溶液的介电常数，削弱溶剂分子与蛋白分子间的作用力，从而增加蛋白质分子上带电粒子的相互吸引力，致使蛋白分子聚合沉淀;另有机溶剂溶解于水的同时，能从蛋白质周围的水化层中夺走水分子，破坏水化层，从而使蛋白质沉淀析出。 1.4凝胶层析 混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，溶液中各物质因分子大小不同而被分离，在洗脱过程中，分子质量最大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，分子量最小的物质能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。凝胶层析是一种快速而简便的分离分析技术，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处，对于高分子物质有很好的分离效果。因此被生物化学、分子生物学、生物工程以及医药学等领域广泛应用。陈宁等利用Sephadex G-25凝胶层析柱和反相柱对核桃蛋白酶解物，获得抗氧化能力最强的多肽序列Ala-Gly-Gly-Ala。张志强等，采用硫酸钠盐析法与凝胶层析法对卵黄进一步纯化，得到纯度为97%的IgY。 1.5亲和层析

产酶微生物的分离、纯化与

产蛋白酶芽孢杆菌的基本研究 生物科学与工程学院生物工程111 第四组 【摘要】：芽孢杆菌（Bacillus），细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌（bacillus）杆菌科的一属细菌。许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。 【关键字】：蛋白酶芽孢杆菌水解圈紫外线 【引言】：酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。 1、培养基：1．酪素培养基：牛肉膏0.3g、NaCl 0.5g，酪素1.0g，琼脂2.0g，水100mL， pH 7.6-8.0。配制方法：称取酪素1g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。 2、材料与方法 2.1、仪器： 显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒；1 mL 无菌吸管、玻璃涂棒、血细胞计数板、显微镜、紫外线等（15W）、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器； 2.2、样品： 土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；蛋白酶的产生菌株、溶液和试剂、碘液、无菌生理盐水、无菌水试管等； 2.3实验方法： 2.3.1蛋白酶产生菌的分离与纯化 （1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液； （2）取1：10土壤悬液5ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌； （3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h； （4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。

常用的微生物分离纯化方法

常用的微生物分离纯化方法 微生物的分离纯化是微生物学研究中的一个非常重要的环节。通过分 离纯化，可以获得纯种微生物，使得后续的鉴定、分类、生理生化特性研究、基因克隆等工作能够更准确地进行。下面介绍常用的微生物分离纯化 方法。 1.传统分离法： 传统的微生物分离纯化方法主要是基于细菌的形态、结构、生长速率 等特征进行分离纯化。常用的包括刷板法、涂布法、易于纯化的染色体构 造筛选法、微量稀释分离法等方法。 -刷板法：将样品直接涂布在含有适当培养基的试验板上，通过细菌 的生长特性，如形态、色素、生长速率等特征，选择出目标菌落进行分离。 -涂布法：将样品平铺于含有适当培养基的试验板上，通过菌落形态 的差异，选择出目标菌落进行分离。 -易于纯化的染色体构造筛选法：通过构建含有易于纯化的基因分子 标记的染色体，如荧光蛋白基因等，在含有特定培养条件的培养基上分离 纯化目标微生物。 -微量稀释分离法：将待分离的微生物悬浮液进行稀释，然后分别取 一定体积的稀释液接种于培养基上，根据稀释液中的目标菌落数目，计算 出目标微生物的浓度。 2.筛选培养基法：

筛选培养基法是根据微生物对不同物质的利用和代谢差异，选择特定 的培养基来纯化目标微生物。常见的筛选培养基包括选择性培养基和差异 培养基。 -选择性培养基：通过在培养基中添加特定的抑制剂、抗生素等物质，抑制非目标微生物的生长，从而选择出目标微生物。 -差异培养基：在培养基中添加特定物质，使得目标微生物与非目标 微生物在生长特性、代谢产物等方面产生差异，从而选择出目标微生物。 3.高效液体色谱分离法： 高效液体色谱分离法是一种利用固相萃取柱和高效液相色谱仪进行微 生物纯化的方法。该方法可以根据微生物的代谢产物、代谢物组成等特征 进行纯化。 4.免疫分离法： 免疫分离法是利用特异性抗体与目标微生物结合，从而将目标微生物 与其他微生物分离开来的方法。通过配体-受体相互作用，可以将微生物 从样品中特异性地富集，然后利用免疫分析等方法对其进行纯化。 5.分子生物学方法： 分子生物学方法中的PCR、DNA酶切、DNA序列测定、基因克隆等技 术可以帮助实现微生物的分离纯化。通过自主生长封闭技术，可以将目标 微生物从其他微生物中分离出来，然后进行后续的测序和基因克隆工作。 总之，微生物分离纯化是微生物学研究中的重要环节。通过选择合适 的分离纯化方法，可以获得纯种微生物，为后续的微生物学研究提供可靠 的基础。

酶的分离与纯化技术的研究进展

酶的分离与纯化技术的研究进展酶是生命体内一类具有生物催化作用的大分子有机物，可以作 为催化反应的媒介，在化学合成、生产和仿生学等领域发挥作用。随着酶的应用越来越广泛，酶的分离和纯化技术也越来越成为人 们关注的焦点。本文将对酶的分离和纯化技术的研究进展进行介绍。 第一部分：酶的分离技术 酶的分离技术是指将混合物中的酶分离出来的技术方法。这些 方法主要包括分子筛分离、离子交换、凝胶过滤、亲和层析和直 接电泳法等。 1.分子筛分离 分子筛分离是一种常见的酶分离技术，它利用不同分子大小和 形状的分子在孔径大小的分子筛中分离。该方法适用于分离分子 量较大、结构紧密的酶，在分离过程中不需要进行任何化学反应。 2.离子交换

离子交换是将酶从混合物中分离出来的一种常见方法。该方法利用了酶和分离质子或离子的亲合性，通过离子交换柱，使酶不被拦截然后与其他离子结合。 3.凝胶过滤 凝胶过滤是利用了凝胶过滤管中孔隙的差异分离酶分子大小不同的技术方法。凝胶过滤是分离纯化酶的最常用方法之一，专家们在其上广泛地进行研究和实践。 4.亲和层析 亲和层析是最常用的酶分离方法之一，通过分离目标蛋白质与杂质分子的亲和性不同来达到分离纯化的目的。亲和层析技术还可以用于分离两种亲和力不同的酶，以避免使用血清中含有的抗体来纯化酶，避免污染。 5.直接电泳法

直接电泳法是一种新型的酶分离方法，它的主要原理是利用酶分子的电性差异，在电场作用下，通过电泳可使酶分子在凝胶中移动、分离和纯化，它逐渐得到了广泛的应用。 第二部分：酶的纯化技术 酶的纯化技术是指将酶从分离出来的混合物中除去杂质，使其达到一定纯度的技术方法。通常采用的方法包括差凝、溶剂法、沉淀法、分配系数法、电泳法和微生物处理等。 1.差凝 差凝是酶分离纯化中最常用的方法之一，它是通过将混合物中的有机组分与水分离，使有机组分与酶溶液分开平衡，从而达到分离杂质的目的。 2.溶剂法

土壤中产淀粉酶微生物分离纯化的研究

土壤中产淀粉酶微生物分离纯化的研究 土壤是微生物的自然栖息地，其中存在着大量的微生物群体。其中，淀粉酶微生物是土壤中的一种重要群体。淀粉酶微生物可以利用土壤中的淀粉为能源，将淀粉水解成葡萄糖等单糖，为土壤中的其他微生物提供了能量。此外，淀粉酶微生物还能够分解淀粉质的残留物，促进土壤的有机质分解，有助于土壤肥力的提高。 因此，分离纯化土壤中的淀粉酶微生物对于了解土壤微生物群体的结构和功能，以及发掘土壤微生物资源具有重要意义。本文将从土壤中分离淀粉酶微生物的方法、淀粉酶微生物的特性以及淀粉酶微生物的应用等方面进行探讨。 一、土壤中分离淀粉酶微生物的方法 土壤中淀粉酶微生物的分离是一个相对复杂的过程。一般来说，可以采用筛选法、培养法、分子生物学技术等方法。 筛选法是一种最常用的土壤淀粉酶微生物分离方法。其原理是利用淀粉为唯一碳源，在含有淀粉的培养基上筛选出淀粉酶微生物。具体操作步骤为：将土壤样品通过筛网筛选后，制备不同浓度的稀释液，分别接种到含有淀粉的培养基上，进行培养。待出现淀粉水解圈后，将圈内菌落进行分离、筛选，最终获得淀粉酶微生物。 培养法是通过将土壤样品接种到含有淀粉的液体或固体培养基中，

利用淀粉为唯一碳源，诱导淀粉酶微生物生长和繁殖。培养法的优点是可以获得纯种菌株，但是其缺点是存在一定的选择性，不能完全反映土壤微生物群体的整体结构。 分子生物学技术是一种新型的土壤微生物分离方法。其原理是通过对土壤样品中微生物的DNA序列进行分析，筛选出含有淀粉酶基因的微生物。该方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点，但其操作难度较大，需要专业技术支持。 二、淀粉酶微生物的特性 淀粉酶微生物是一类能够分解淀粉的微生物群体。淀粉酶微生物广泛存在于土壤中，并具有以下特性： 1.多样性。淀粉酶微生物包括细菌、真菌、放线菌等多种微生物群体，具有较高的多样性。 2.分解效率高。淀粉酶微生物能够高效地将淀粉水解为葡萄糖等单糖，其分解效率高于一般的微生物群体。 3.适应性强。淀粉酶微生物对环境的适应性强，能够在不同的土壤环境中生长和繁殖。 4.应用广泛。淀粉酶微生物不仅是土壤微生物群体中的重要成员，其在医药、食品、饲料、纺织、造纸等行业中也有广泛应用。

微生物分离与纯化实验报告

微生物分离与纯化实验报告 微生物分离与纯化实验报告 引言： 微生物是一类极小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。微生物的分离与纯化 是微生物学研究中的重要步骤，它可以帮助研究者从复杂的微生物群落中获取 纯种菌株，以便进一步研究其生理特性和应用价值。本实验旨在通过分离与纯 化微生物的实验操作，掌握微生物分离纯化的基本原理和方法。 材料与方法： 1. 样品采集：从自然环境中采集样品，如土壤、水体等。 2. 稀释：将样品进行适当的稀释，以降低微生物的浓度，避免过于密集的菌落。 3. 培养基制备：制备适合微生物生长的培养基，如琼脂培养基、液体培养基等。 4. 涂布法分离：取适量的稀释液，用铁环或棉签均匀涂布在培养基表面。 5. 培养条件：将培养基培养于适宜的温度和湿度条件下，利于微生物生长。 6. 菌落观察：观察培养基上的菌落形态、颜色、大小等特征，选择目标菌落。 7. 纯化：将目标菌落进行传代培养，以获得纯种菌株。 结果与讨论： 本实验采集了来自土壤样品的微生物，并进行了分离与纯化实验。经过稀释和 涂布法分离，我们观察到了多个菌落形成在琼脂培养基上。根据菌落的形态、 颜色和大小等特征，我们选取了几个目标菌落进行纯化。 经过传代培养，我们成功地获得了纯种菌株。通过显微镜观察，我们发现这些 菌株具有不同的形态特征。有的菌株呈圆形，有的呈梭形，还有的呈链状。这 些形态特征与微生物的分类有关，也可以为进一步研究提供线索。

在纯化的过程中，我们还进行了一些生理特性的初步鉴定。通过对菌株的代谢产物进行检测，我们发现其中一株菌株能够产生抗生素。这为进一步研究该菌株的抗生素合成基因提供了方向。 微生物的分离与纯化在微生物学研究中具有重要的意义。通过分离纯化，我们可以获得纯种菌株，进一步研究其生理特性、代谢产物和应用价值。同时，纯化的菌株也可以用于微生物鉴定和分类，为微生物多样性研究提供数据支持。结论： 通过本实验，我们成功地进行了微生物的分离与纯化实验。通过稀释和涂布法分离，我们获得了多个菌落，并通过纯化获得了纯种菌株。这些菌株具有不同的形态特征和生理特性，为进一步研究提供了基础。微生物的分离与纯化是微生物学研究中必不可少的步骤，它可以帮助我们更好地了解微生物的多样性和功能。

酶的分离纯化

酶的分离纯化 摘要：本文概述了在实验中由于酶浓度、饱和度等不同条件下对酶进行分离纯化的适 用方法。酶的分离纯化有很多种方法，在纯化的工艺上有很大的不同，不同来源的酶在分 离纯化中表现出不同的洗脱特性。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的 差异而建立的。 关键词：酶；分离；纯化；方法 前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。酶的纯化过程在目前来说仍是一门实 验科学。一个特定酶的提纯往往需要经过多个实验的探索才能总结出一般经验规律。酶的 分离纯化又与其他蛋白质的纯化过程存在很大的差异，酶的分离纯化有其自己独有的特点：一是特定酶在细胞中的含量少，二是酶通过测定活力的方法可以加以跟踪，前者给实验带 来困难，后者为实验提供了捷径。正文： 1. 酶的分离与纯化的概念[1] 酶的分离与纯化是指将酶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从而获 得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程。 酶分离纯化的一般原则：①防止酶变性失活 1．）酶纯化一般在低温条件下进行（0~4℃） 2.）各种溶液应该用缓冲液，PH应调到使酶最稳定的PH 3.）各种溶液中还可以加 入酶保护剂 ②建立一个可靠和快速的测活方法方法专一、灵敏、精确、简便、经济③酶原料 的选取 选择目的酶含量丰富的原料，且要考虑取材方便、经济节约等因素 2. 酶的分离纯化 2.1 细胞破碎[2] 各种生物组织的细胞具有不同的特点，在采用破碎方法时，要根据细胞的性质，酶的 性质来选取合适的破碎方法。 1.）机械破碎法 通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有 如下几 种。 捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎。常 用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。此法在实验宝和生产规模均可采用。

微生物的分离与纯化实验报告

微生物的分离与纯化实验报告实验目的： 通过本次实验，我们旨在掌握微生物的分离与纯化技术，了解微生物在自然界 中的分布规律，培养对微生物的观察和分离能力，为后续微生物研究工作打下基础。 实验原理： 微生物的分离与纯化是通过将微生物样本分离出单一种类的微生物，并将其培 养成纯种，以便进行后续的鉴定和研究。该实验主要包括微生物的分离、纯化和鉴定三个步骤。首先，通过适当的分离培养基和条件，将混合微生物样本中的不同微生物分离开来；然后，通过多次传代培养，将目标微生物培养成纯种；最后，通过形态学、生理生化特性等方法对纯种微生物进行鉴定。 实验步骤： 1. 样品采集，从不同的自然环境中采集微生物样品，如土壤、水体、空气等。 2. 微生物分离，将样品按照一定的稀释倍数分别接种到不同的培养基上，利用 稀释涂布法进行微生物的分离。 3. 纯化培养，从分离得到的单一菌落中挑取代表性菌落进行传代培养，直至获 得纯种微生物。 4. 微生物鉴定，通过形态学观察、生理生化实验等方法对纯种微生物进行鉴定，确定其属种。 实验结果： 经过本次实验，我们成功地从不同环境样品中分离出了多种微生物，并将其中 的一种微生物培养成了纯种。在对纯种微生物进行鉴定后，我们确认其为一株革兰氏阳性菌，具有球形细胞，能够在无氧条件下生长等特点。

实验结论： 本次实验使我们初步掌握了微生物的分离与纯化技术，了解了微生物在自然界中的分布规律，培养了对微生物的观察和分离能力。同时，我们也认识到微生物的分离与纯化是微生物学研究中的重要基础工作，为后续的微生物鉴定和研究奠定了基础。 通过本次实验，我们不仅加深了对微生物学理论知识的理解，也提高了实际操作的能力，为今后的微生物研究工作打下了坚实的基础。希望在今后的学习和工作中，能够继续努力，不断提升自己的实验技能和科研能力，为微生物学领域的发展贡献自己的一份力量。

三种不同来源(植物、细菌和真菌)蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇

三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3 篇 三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及 应用研究1 蛋白酶是一类具有水解蛋白质能力的酶，广泛存在于细胞中并参与多种生物学过程。在生物制药等领域，蛋白酶的纯化、性质及应用研究具有重要的现实意义。本文将重点介绍来自植物、细菌和真菌三种不同来源的蛋白酶在纯化、性质和应用方面的研究进展。 一、植物蛋白酶的纯化、性质和应用 植物蛋白酶主要存在于种子、果实、根茎等植物组织中，其中的大多数是半胱氨酸蛋白酶。植物蛋白酶的纯化主要采用柱层析法和电泳法等技术。研究表明，植物蛋白酶的氨基酸序列存在着相似性和区别性，其中一些同源物可以分为家族或亚家族。此外，植物蛋白酶的活性受到温度、pH值和抑制剂等因素的 调节。 植物蛋白酶在食品加工和医药制品等方面可发挥重要作用。例如，灵芝多肽可以被植物蛋白酶水解成具有生物活性的多肽物质，这对于灵芝多肽的生产具有重要意义。另外，复合酶制剂SiOpro可以通过作用于面团中的酯酶、氧化酶和蛋白酶等多

种酶的协同作用，达到改善松软度、延长保质期等目的。 二、细菌蛋白酶的纯化、性质和应用 细菌蛋白酶主要可分为内质网蛋白酶和外源性蛋白酶两种。前者在细胞内、后者在菌体周围均有分布。细菌蛋白酶的纯化常常采用柱层析技术和亲和层析技术等，具有高效、快速、经济等优势。 细菌蛋白酶在医药、食品及皮革制品等方面应用广泛。例如，基于外源性蛋白酶的制剂Accutase是用于脱离培养细胞的酶，具有无细胞毒性、操作简单等特点；生产蛋白药物方面，葡萄球菌的外源性蛋白酶已被用于制备重组蛋白；在食品加工过程中，外源性蛋白酶可以提高油脂的提取效率和品质。 三、真菌蛋白酶的纯化、性质和应用 真菌蛋白酶可分为胶原酶和无胶原酶两大类。前者主要用于胶原的加工，后者则广泛应用于食品加工、纸张制品、色谱等领域。 真菌蛋白酶的纯化方法有很多种，包括柱层析、电泳、反向相色谱法等。真菌蛋白酶在pH值、温度、金属离子和阻碍剂等 条件下均表现出不同的活性和特异性。例如，水解菊粉酶具有良好的温度和酸碱度适应性，可用于生产寡糖等。 在应用方面，真菌蛋白酶具有广泛的使用价值。其中，胶原酶

《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计

《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计 一、实验目的 1. 学习进行微生物的分离纯化技术； 2. 了解产淀粉酶菌的特性及其分布情况； 3. 掌握酶活性的测定方法。 二、实验原理 1. 淀粉酶的作用原理：淀粉酶是一种酶，能够分解淀粉为糖类，在微生物领域中，主要用来测定产淀粉酶菌的酶活性。 2. 微生物的分离纯化：通过微生物分离鉴定方法可以筛选出产淀粉酶菌，并进行分离纯化，其中包括表面接种法、液体菌种鉴定法等。 三、实验步骤 1. 采样：采取合适的方法选择样品进行采取，如土壤样品、水样、废弃物等； 2. 培养：将采取的样品进行接种并培养于适宜的菌种培养基中，环境条件应符合产淀粉酶菌的生长需求； 3. 分离：通过常规分离方法进行分离，如表面接种法，可将菌落形态清晰的约8-10个菌落分别转移到其它培养基上，进行单菌落质量检查，然后进行挑选； 4. 鉴定：对于产淀粉酶菌的鉴定有多种方式，如细菌形态、生理生化反应等； 5. 纯化：将鉴定出的产淀粉酶菌进行分离纯化，可采用多种方法，如悬浮液稀释、柠檬酸-NaOH柱层析，以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 四、实验注意事项 1. 实验操作要严格遵守微生物的安全操作规范； 2. 实验过程中要严格控制温度、湿度等环境条件，以保证产淀粉酶菌的正常生长； 3. 实验设备、试剂应做好消毒处理； 4. 对实验中出现的不明菌落应及时进行鉴定和处理； 5. 实验后要做好设备及消毒剂的清洗工作。

五、实验结果分析 1. 产淀粉酶菌分离纯化后可进行酶活性测定，得出具体的酶活性值； 2. 酶活性值与产淀粉酶菌的菌种、产生淀粉酶的量等因素相关； 3. 实验结果可反映出产淀粉酶菌的分布情况及其产酶的峰值期等信息。 六、实验拓展 1. 可通过实验数据，筛选产酶量高的淀粉酶菌进行进一步研究开发； 2. 可实验条件、测定方法等进行改进，提高产淀粉酶菌的分离纯化效率及酶活性测定准确度。 七、实验结论 通过对产淀粉酶菌的分离纯化和酶活性测定，可以研究淀粉酶的特性及其在工业、农业等方面的应用，为淀粉酶的开发应用提供物质基础。

微生物的分离与纯化实验报告

微生物的分离与纯化实验报告 微生物的分离与纯化实验报告 引言： 微生物是一类非常微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、空气中，同时也存在于人体内。微生物对人类的生活和健康具有重要影响，有些微生物可以引起疾病，而另一些微生物则可以用于食品发酵、环境修复等方面。为了更好地研究微生物的特性和功能，需要对其进行分离与纯化实验。 材料与方法： 1. 样品采集：我们选择了土壤样品作为研究对象，从自然环境中采集了多个不同地点的土壤样品。 2. 稀释与接种：将采集到的土壤样品进行适当稀释，然后在琼脂平板上接种。 3. 培养与分离：将接种好的琼脂平板置于恒温箱中，以适当的温度和湿度进行培养。经过一段时间后，我们观察到在琼脂平板上形成了不同形状和颜色的菌落。 4. 单菌分离：选择单个菌落，用无菌的铂丝将其转移到新的琼脂平板上，进行二次培养。重复此过程，直到获得纯净的单菌培养物。 5. 形态观察：观察纯菌培养物的形态特征，包括菌落形状、颜色、透明度等，以及菌体形态特征，如细胞形状、大小等。 6. 生理生化特性检测：对纯菌培养物进行一系列生理生化特性检测，包括氧需求性、温度适应性、酸碱耐受性、产酶能力等。 7. 16S rRNA测序：对纯菌培养物进行16S rRNA基因测序，以确定其系统发育

地位和亲缘关系。 结果与讨论： 经过分离与纯化实验，我们成功地获得了多个不同的微生物菌株。通过形态观察，我们发现这些菌株在菌落形状、颜色和透明度等方面存在显著差异。进一步的菌体形态观察发现，它们的细胞形状和大小也各不相同。 在生理生化特性检测中，我们发现不同菌株对氧的需求性、温度适应性和酸碱耐受性存在差异。有些菌株需要氧气才能生长，而另一些则可以在无氧条件下生长。对于温度适应性，有些菌株在低温下能够生长，而另一些则喜欢高温环境。此外，我们还发现一些菌株对酸性环境更耐受，而另一些则对碱性环境更适应。通过产酶能力的检测，我们发现一些菌株具有蛋白酶、淀粉酶等多种酶的产生能力，这对于它们在环境修复和食品工业中的应用具有重要意义。 通过16S rRNA基因测序，我们确定了这些微生物菌株的系统发育地位和亲缘关系。结果显示，这些菌株属于不同的细菌门，包括变形菌门、厚壁菌门等。这些结果为进一步研究微生物的功能和应用提供了重要的基础。 结论： 通过微生物的分离与纯化实验，我们成功地获得了多个不同的微生物菌株，并对其进行了形态观察、生理生化特性检测和16S rRNA基因测序。这些结果为进一步研究微生物的特性和功能提供了重要的基础。同时，这些微生物菌株的应用潜力也值得进一步探索和开发。

蛋白酶的分离纯化方法小结

酶的分离纯化方法小结 摘要：随着酶工程研究的进一步深化，酶的分离和纯化技术也有了日新月异的进步。本文简单介绍了酶分离纯化过程中的常用的一些方法，以纤维素酶为例，从最古老的沉淀法，离心法到色谱技术等都做了简略介绍。 1.沉淀法 目前，常用的酶大多数是蛋白质，因而其分离方法一般采用蛋白质的分离方法。下文中的蛋白类催化酶均以酶简称。 酶在溶液中的稳定性与分子大小、带电荷量和水化作用有一定的相关性，改变这些因素会对酶的稳定性有所影响。当酶的稳定性遭到破坏时就会沉淀析出。常见的沉淀法有盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属沉淀法及加热变性沉淀法，其中盐析法多用于酶的分离纯化。 1.1盐析沉淀 盐析沉淀法是根据不同酶在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。酶易溶于水，因为其分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于酶分子周围形成1~100nm大小的亲水胶体，从而削弱了酶分子之间的作用力。酶分子表面亲水基团越多，水化层越厚，酶分子与溶剂分子之间的亲和力就越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个，即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于酶分子的亲水性，当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对酶分子的极性基团的影响，使酶在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，酶表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是酶相互聚集而沉淀析出。 1.2等电点沉淀 利用酶在等电点时溶解度最低，而各种酶又具有不同的等电点来分离酶的方法，称为等电点沉淀法。酶的等电点(pI)即酶的净电荷为零时的pH值，由于等电点时的酶净电荷为零，因而失去了水化膜和分子间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，酶分子相互靠拢、聚集，最后形成沉淀析出。 1.3有机溶剂沉淀 有机溶剂沉淀法是指有机溶剂能使酶分子间极性基团的静电引力增加，与水作用能破坏酶的水化膜，而水化作用降低，促使酶聚集沉淀。常用的有机溶剂是

自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定.

自然界中产淀粉酶菌株分离 纯化及酶活测定 淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。 淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。 生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。 本实验拟从种植谷物的贫瘠土壤和平地肥沃土壤的5cm~25cm土层取土壤样品中分离土壤微生物，筛选能产生淀粉酶的菌种，并进行初步鉴定[8]。同时，拟进

溶菌酶结构特点及分离纯化的研究

溶菌酶结构特点及分离纯化的研究 摘要：本文对溶菌酶的结构特点和作用机制做了简单介绍，并对近年来溶菌酶分离纯化的方法,如结晶法、离子交换法、亲和层析法、膜处理技术、反胶团萃取法等进行了综述。 关键词：溶菌酶、结构特点、作用机制、分离纯化 1 前言 溶菌酶(1ysozyme;EC3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase),是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。 人们对溶菌酶的研究始于本世纪初,英国细菌学家弗莱明(Flem ing)在发现青霉素的前6年(1922年)发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。在自然界中,溶菌酶广泛存在于人体多种组织中,鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁体液、木瓜、大麦、无花果和卷心菜等植物中以及微生物中也含此酶[1],其中以蛋清含量最为丰富，约0.3%[2]。 2 溶菌酶的结构特点和作用机制 2.1 溶菌酶的类型 溶菌酶按其所作用的微生物不同分为两大类,即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶有两种,一种是作用于β-1.4糖苷键的细胞壁溶解酶,另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶[3]。 2.2 溶菌酶的结构 鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶,它由18种129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质,在分子中的4对含硫氨基酸Cys间形成4个S-S键。Phillips 等人1956年用X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构,溶菌酶分子近椭圆形,大小为4.5nm×3.0nm×3.0nm,其构象复杂,α螺旋仅占25％,在分子的一些区域有伸展着的β片层结构,研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的,疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用,其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙,这是溶菌酶的活性部位。 2.3 溶菌酶的性质

微生物的分离与纯化

微生物的分离与纯化 微生物是一类透过显微镜才能观察到的微小生命体，例如细菌、真菌、病毒等。它们具有极高的繁殖能力，可以在短时间内产生 大量的生物体。因此，微生物在食品、医药、环保等领域中具有 重要的应用价值。然而，大多数微生物都是一种混合体系，如何 有效地从混合物中分离出单一的微生物种群并进行纯化是微生物 研究中的重要问题。 微生物的分离通常是在富含微生物的样品中进行。微生物的样 品可以来源于土壤、水体、人体等各个领域。在实验室中，我们 通常采用培养基进行微生物分离。培养基是一种含有各种微量元 素和营养物质的生物体外环境，可以刺激微生物的繁殖。不同的 微生物具有不同的培养基选择性，我们可以利用培养基的选择性 来分离不同种类的微生物。例如，对于耐碱菌和普通菌的混合菌群，我们可以使用含有高碱性环境的培养基，这样愈合菌的生长 就会被抑制，普通菌则能够生长。 在分离过程中，通常会出现不同的微生物分离困难的情况。其 主要原因是不同的微生物种群有着不同的生长特性和养分需求， 需要加强培养条件或利用其他的分离方法。例如，某些细菌需要 高咸度的环境生长，因此我们可以使用含有高含盐量的培养基来

分离这些细菌。而某些厌氧菌则只能在无氧环境下生长，所以我 们需要使用无氧培养条件来分离这些菌。 当我们成功分离出目标微生物之后，需要进行纯化处理。纯化 可以使得单一微生物种群脱离混合物质环境，避免其他微生物种 群污染。在纯化过程中，我们可以采用传统的培养方法或现代的 生物技术方法。其中生物技术方法包括PCR扩增、限制性酶切和 基于DNA或RNA的杂交等。 总之，微生物的分离和纯化是微生物学研究中极为重要的环节。我们需要根据微生物的生长特性，通过选择合适的培养基和适当 的条件，有效地从混合微生物中分离出单一种群。纯化的过程则 可以保证研究中单一微生物种群的纯度和可重复性，确保研究数 据的准确性和可靠性。

酶的分离纯化方法

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酶的分离纯化方法 摘要酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。一个特定酶的提纯往往 需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。本文从酶原料 选择、酶的分离与纯化、酶纯度的评价三个方面进行总结，列举了一些常 用的分离纯化方法。 关键词酶、分离纯化、方法、纯度 中图分类号O6 酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：一是酶一般取自生物细胞，而特定的一种酶在细胞中的含量很少；二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪，前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。 1 酶原料选择 提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。但是由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 2 酶的分离纯化

由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍。 预处理及固液分离 2.1.1细胞破碎（c e ll d is ru p t i o n） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率，起码要将菌悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力，减少操作次数。但有人报道，当操作压力达到175M p a时，破碎率可达100%。当压力超过70M p a时，细胞破碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。 容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。具体做法是：溶壁微球菌(m ic r o co c cu s l ys o d e i kt i cu s)43k g，置于%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5%（干重），在35℃用0.68k g（干重）的蛋清处理 20min，得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去，再将乙醇浓度提高到75%（体积分数），可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。

酶的分离纯化

第三章酶的分离纯化 第三章酶的分离纯化 第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤 第二节细胞破碎 第三节酶的抽提 第四节酶的纯化 第五节酶的纯度与产量 第六节酶的剂型与保存 第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤 1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。 一、基本原则 二、酶分离纯化的基本步骤 为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则： 1. 防止酶变性失效 防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。常见的措施有： （1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。 二、酶分离纯化的步骤 酶分离纯化时，一般要经过如下步骤： 1. 细胞破碎： 除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。 2. 抽提 3. 纯化 下面分节对这三个基本环节加以介绍 第二节细胞破碎 细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。 一、机械破碎法二、物理破碎法 三、化学破碎法四、酶学破碎法：

通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。 1. 机械捣碎法： 利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。此法在实验宝和生产规模均可采用。 通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。物理破碎法包括如下几种方法； 1. 温度差破碎法： 通过温度的突然变化使细胞破碎。即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。 温度差破碎法对那些较脆弱易破的细胞破碎效果较好。 超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。同时受细胞浓度、溶液粘度，pH值、温度以及离子强度等因素的影响，必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。 一般操作条件为：音频10kHz或20kHz；功率100、150W；温度0～10℃；pH4~-7；处理时间3 ～10min，最好间隔几次操作；细胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破碎。 超声波破碎在实验室应用具有简便、快捷、效果好等特点，特别适用于微生物细胞的破碎。但要在大规模工业生产中应用，困难很多。 化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变而破坏的方法。 化学破碎法中，常用的化学试剂有： 有机溶剂和表面活性剂。 在一定条件下，通过外加的酶或细胞自身存在的酶的作用，使细胞破碎的方法称为酶学破碎法。