分子标记技术
SSR标记技术和ISSR 标记技术雷世勇 2.1 SSR 标记技术。在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星DNA ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA。小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。定义：SSR （全称为简单序列长度多态性标记）也称微卫星DNA ,是一类由几个多为1～5 个碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即 CA n和 TG n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。 SSR分子标记的应用举例
――鹅掌楸种属及杂种的分子标记北美鹅掌楸EST序列中开发的EST-SSR引物引物筛选物种特异性扩增引物特异性验证 SSR 标记技术的特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。SSR 标记的应用目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、
水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域。 2.2 ISSR 标记技术 ISSR 即（内部简单重复序列）,是一种新兴的分子标记技术。它是建立在1994年发展的一种微卫星基础上的分子标记。已经广泛应用于各种动植物的品种鉴定、遗传图谱建立、遗传多样性的研究等方面。几个重要的名词： ISSR：他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR 扩增。这类标记又被称为 ASSR或AMP-PCR。RAMP: 在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR 引物,另一个是随机引物。如果一个是5′端加锚的ASSR 引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP 技术。 ISSR分子标记的优点 2实验成本低； 3操作简单；4实验稳定性高； 5物种间通用； 6多态性较高； 1记录方便； 7精确度高； 8检测方便； 9开发费用低。 ISSR 标记技术原理：用于ISSR-PCR 扩增的引物通常为16～18 个碱基序列,由1～4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA 中SSR 的5′或3′末端结合,通过PCR 反应扩增SSR 之间的DNA 片段。SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR-PCR 可以检测基因组许多位点的差异。 ISSR的应用举例
――攀枝花苏铁遗传多样性的ISSR分析 PCR扩增及产物检测：从
所有引物中筛选出扩增条带晰、稳定性好、特异性强的引物对48个DNA 样品进行PCR扩增。引物筛选：从100个ISSR引物中筛选出扩增产物条带清晰的13条引物。遗传多样性分析：筛选出的13条引物共产生104条清晰条带，其中多态性条带94条，多态百分率为90.38% ，平均每个引物扩增条带数为8条。结果显示，ISSR 分子标记对攀枝花苏铁多样性的研究效果很好。第三代分子标记技术
章丽 SNP的检测方法测序法酶切法荧光PCR法 DNA芯片法质谱法分子标记技术的应用张文青丛峰遗传多样性（genetic diversity）一般指品种间及品种内个体在DNA水平上的差异。通过对遗传多样性的评估，可以了解品种的遗传结构及遗传关系。在经济动物育种过程中，可以准确地鉴定和筛选具有优良遗传变异的个体，这是育种工作的前提。在水产动物中，由于海洋生物生活环境的特殊性，要弄清海洋生物的遗传结构及遗传边界相对来说比较困难。但随着具有高多态性、分析过程快、位点丰富的DNA分子标记技术的出现，水产动物群体遗传学的分析变得简单快捷。
应用举例 AFLP分析大黄鱼野生种群和养殖群体养殖群体的多态片段比例和个体间的遗传差异度均低于野生种群，其遗传多样性水平较低，遗传变异贫乏。 2.RAPD技术对3个中国花鲈群体4个日本鲈鱼群体进行了遗传分化研究，结果进一步从分子水平上支持将中国产花鲈和日本的鲈鱼划分为2个种的观点，并且RAPD数据表明花
鲈和鲈鱼群体内都出现了明显的遗传分化。 3. 微卫星技术对东南亚海区鲈鱼进行分析，推翻了东亚地区只有1种鲈鱼的说法。在现代动物育种中，由于要利用各种亲属的表型信息，准确地系谱记录是十分重要的。在海洋生物育种中必须搞清楚亲子关系，这样才能利于根据亲属信息准确选留个体并能防止群体近交的发生。利用DNA分子标记位点的多态性，以多个标记位点在一定群体中各等位基因的频率为基础，计算父子关系相对机会 RCP 来进行血缘鉴定和血缘控制。应用举例 1.微卫星标记分析表明4个微卫星标记可以鉴定95％的后裔，5个微卫星座位的累积排除率可以达到96％以上，所以微卫星标记可以应用于中国对虾的家系鉴定。连锁图谱（linkage map），又称遗传图谱（genetic map）或遗传连锁图谱（genetic linkage map），是指基因或DNA分子标记在染色体上的相对位置。构建遗传图谱的意义：确定不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，为作物种质资源收集、目标基因定位、基因克隆、育种规模大小及相应育种方法的确定等提供理论依据。绘制遗传连锁图的方法有很多，但是 DNA多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着DNA多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态性标志有RFLP 限制性酶切片段长度多态性、RAPD 随机引物扩增多态性DNA 、AFLP 扩增片段长度多态性；80年代后出现的有STR 短串联重复序列，又称微卫星 DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP 单个核苷酸的多态性分析。绘制遗传连锁图谱的目的是要揭示动物所携带遗传信息的内容，准确确
定控制数量性状座位（QTL）在基因组中的位置。借助与QTL连锁的分子标记，在育种中人们就能够对有关QTL的遗传进行追踪，提高对数量性状优良基因型选择的准确性和预见性。大量的QTL 已经被绘制出来并表现出了水产养殖种类的特性。在虹鳟的研究中，高温耐受力、产卵时间以及胚胎发育的速度等这些QTL已经成功被绘制出来。在罗非鱼中，以色列和美国的一个合作团队的科学家已经培育出了杂交罗非鱼亲本，以便研究其连锁图谱和进行QTL分析。另外，一些有害等位基因和被破坏的性别比例、控制特色和性别决定的QTL，已经控制大量与先天免疫有关的生物化学参数的QTL也已经在罗非鱼中得到了确定。这些都是分子标记技术在绘制遗传图谱及QTL 定位中的运用。分子标记辅助选择（Marker Assisted Selection，缩写为MAS）是将分子标记应用于生物品种改良过程中进行选择的一种辅助手段。长期以来，植物育种都是依植株的表型性状进行选择的。DNA标记的出现使植物育种从表型选择过渡到分子育种的新阶段。其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的。常规育种过程中需通过大量的基因重组、筛选过程，还掺杂有筛选遗漏问题。其周期长，工作量大。而利用分子标记辅助选择技术大大减少了其连锁累赘现象，增加了目标性，在回交低世代即可找到其目标材料。目前看来，分子标记辅助育种技术还不成熟、不完善。利用分子标记辅助选择技术能作为
一种快速、准确、有效的选择手段。但是，分子标记辅助育种技术只有与常规育种相结合，才能更快地并且定向地同步改良农作物的产量、品质、抗逆性。因此，利用分子标记辅助选择技术得到的优异种质仍要通过常规育种方法选择培育，才可真正用到育种中去，尽快在生产上产生经济效益。总之，分子标记辅助育种的优越性只有通过常规育种才可表现出来。基因组DNA 的提取引物筛选遗传多样性分析引物最新的分子标记技术 1. RGAs 标记 Resistance Gene Analogs ,抗病基因类似物 2. 3. 4. 1.什么是SNP? 2.SNP的分类 3. SNP的检测方法 SNP SNP: Single nucleotide polymorphism 个体间基因组DNA序列同一位置单个核苷酸变异替换、插入或缺失所引起的多态性。 SNP 基因编码区SNPs（cSNPs）基因周边SNPs （pSNPs）基因间SNPs（iSNPs）同义cSNP synonymous cSNP 非同义cSNP non-synonymous cSNP 2.SNP的分类针对目标SNP位点，直接设计合适引物扩增得到含突变位点的PCR产物，经序列测定得到位点信息，属SNP分析的金标准。 SNP-HRM（High Resolution Melt）熔解曲线分析技术检测技术原理：
在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。纯合子的扩增曲线杂合子的扩增曲线 EST 1.什么是EST 2. EST的技术路线 3. EST的应用 4. EST的测序及分析过程EST EST 表达序列标签,Expressed Squence tags 是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因
的一小部分,在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等,平均长度为360 ±120bp 。EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文库,因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。上个世界90年代Graig Venter提出了EST的概念，并进行了609条人脑组织的EST，宣布了cDNA大规模测序的时代的开始（Adams et al..1991） AAAAAA AAAAAA mRNA Primer/Reverse transcriptase 获取EST的技术路线 5’ staggered length cDNAs due to polymerase processivity Cloning and sequencing cDNAs 3’ EST 5’EST An overview of how ESTs are generated ESTs are generated by sequencing cDNA, which itself is synthesized from the mRNA molecules in a cell. The mRNAs in a cell are copies of the genes that are being expressed. mRNA does not contain sequences from the regions between genes, nor from the non-coding introns that are present within many interesting parts of the genome. ◆基因表达系列分析 Serial Analysis of Gene Expression, SAGE
?基因表达系列分析是一种用于定量，高通量基因表达分析的实验方法 Velculescu et al., 1995 。SAGE的原理就是分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应的基因的表达丰度。
◆? DNA微阵列或基因芯片的研究
高密度寡核苷酸cDNA 芯片或cDNA微阵列是一种新的大规模检测基
因表达的技术，具有高通量分析的优点。在许多情况下，cDNA芯片
的探针来源于3'EST? Duggan et al., 1999 ，所以EST序列的分
析有助于芯片探针的设计。 AAAAAA TTTTTT AAAAAA TTTTTT AAAAAA TTTTTT GTAC AAAAAA TTTTTT GTAC AAAAAA TTTTTT GTAC CATG AAAAAA TTTTTT GTAC A CATG AAAAAA TTTTTT GTAC B CATG GTAC A CATG GTAC
B CATG CATG GTA
C A GTAC B A B A B CATG GTAC CATG GTAC GTAC CATG CATG CATG Sage 图解基因芯片或微阵列技术流程 4大应用领域一、遗传多样性的分析二、亲缘关系的研究三、遗传连锁图谱的构建四、分子标记辅助选育 * * 什么是遗传标记？遗传标记genetic marker:指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传
递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识
别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记的类型形态学标记（morphological marker）细
胞学标记 cytological marker 生化标记 biochemical marker 分子标记 molecular marker ：DNA分子遗传标记，或DNA标记。形
态学标记形态标记即个体的外部形态特征。形态标记简单直观、
经济方便；但其数量在多数有限、多态性较差，表现易受环境影响，
并且有一些标记与不良性状连锁。此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。主要在早期使用。细胞遗传标
记细胞学标记即植物细胞染色体的变异。包括染色体核型（染色
体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G
带等）的变化。与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些
重要基因的染色体或染色体区域定位。细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。生化标记生化标记包括同工酶和等位酶标记。（以酶作为标记）同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对生物经济性状一般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。生化标记的应用有限：一是可用标记数量少，二是染色方法和电泳技术有一定难度。分子标记分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。分子标记的优越性表现为：（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。分子标记的三个阶段随着分子生物学技术发展和研究水平的深入，分子标记的发展经历了三个阶段，也称为三代DNA分子标记。第一代分子标记：RFLP;RAPD;AFLP；mtDNA分子标记第二代分子标记：微卫星（ms）微卫星DNA ；ISSR 第三代分子标记：SNP 单核苷酸
多态性；EST 目前的分子标记类型目前的分子标记有三类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括RFLP、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）、原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、简单序列重复标记SSR或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）、扩展片段长度多态性标记AFLP、序标位STS、序列特征化扩增区域SCAR等；第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等。 1、RFLP 基本原理：特定生物类型的基因组DNA经限制性内切酶切后，产生分子量不同的同源等位片段，再通过电泳的方法分离和检测这些片段。限制性内切酶识别DNA中特殊的核苷酸序列不同个体中的酶切位点不同，所以，种群具有限制性片段多态性。用特异性的限制性内切酶进行酶切，得到不同长度的DNA片段，这些片段在跑电泳中会分离。限制性片段长度多态性通常被人们用来标记目的基因。特点：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。 2、RAPD 基本原理：用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。 RAPD标记的特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性
自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。 3、AFLP 基本原理：AFLP 标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。 AFLP标记的特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。。此外，在RAPD和RFLP 技术基础上建立了SCAR Sequence characterized amplified regions，序列特异性扩增区域，CPAS Cleaved polymorphic amplified sequence，酶切扩增多态序列和DAF DNA amplified finger prints，DNA扩增指纹等标记技术。这些技术的出现，进一步丰富和完善了第一代分子标记，增加了DNA多态性的研究手段。SSR 标记技术的基本原理鹅掌楸基因组 DNA的提取引物筛选物种特异性扩增引物特异性验证随机选取鹅掌、楸北美鹅掌楸各四个样本 176对引物 PCR扩增挑选选留扩增条带清晰且有明显多态性片段的引物引物8对用鹅掌楸、北美鹅掌楸、杂交鹅掌楸各30个基因型再次筛选一对特异性引物筛选的一对引物鹅掌楸基因北美鹅掌楸基因 190bp 180bp 特异性扩增鹅掌楸杂交鹅掌楸
北美鹅掌楸 190bp 190bp和180bp 180bp 与一对引物特异性扩增 * *
分子标记技术的种类
分子标记技术的种类-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性； ②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速； ⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们 均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原
分子标记技术综述
分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显
DNA分子标记技术及其应用
DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；
分子印迹技术原理及其在分离提纯上的应用
. . 生物分离的新技术——分子印迹 —创新论坛—工业生物技术专家报告会 2008级生命学院3班微生物与生化药学专业 2008001243 宋汉臣
目录 1分子印迹技术的原理与方法 (3) 1.1 MIP的制备过程 (3) 1.2制备MIP的方法 (3) 1.2.1预组装法——共价键作用 (4) 1.2.2自组装法——非共价作用 (4) 1.2.3 共价作用与非共价作用联合法 (5) 2 分子印迹技术在分离上的应用 (5) 2.1 MIP作为固定相的分离技术 (6) 2.1.1MIP作为固定相分离天然产物 (6) 2.1.2MIP作为固定相检测食品中药物的残留 (7) 2.2分子印迹膜(MIM)分离技术 (7) 3问题与展望 (8) 4 参考文献 (9)
摘要：分子印迹技术[1](Molecular Imprinting technique，MIT)是一种新的、很有发展潜力的分离技术。由于其具有选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用围广等优点，分子印迹聚合物已广泛应用于生物工程、临床医学、环境监测及食品工业等众多领域，在分离提纯、免疫分析、酶模型以及生物模拟传感器等许多方面显示出良好的应用前景，引起了人们的广泛关注，其有望在三聚氰胺的快速痕量检测上发挥作用。 关键字：分子印迹生物分离分子印迹聚合物
前言： 分子印迹技术最初出现源于 20世纪 40年代的免疫学，当时Pauling[3]首次提出抗体形成学说为分子印迹理论的产生奠定了基础， 1993年Mosbach等人有关茶碱分子印迹聚合物的研究报道，使这一技术在生物传感器、人工抗体模拟及色谱固相分离等方面有了新的发展，得到世界注目并迅速发展。基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用围广等特点,因此分子印迹技术在许多领域，如色谱分离、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析、膜分离等领域得到日益广泛的研究和开发，有望在生物工程、临床医学、天然药物、食品工业、环境监测等行业形成产业规模化的应用。目前，全世界[3]至少有包括瑞典、日本、德国、美国、中国、澳大利亚、法国在的 10多个国家、100个以上的学术机构和企事业团体在从事分子印迹聚合物的研究和开发。
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术
分子印迹技术原理及其在分离提纯上的应用
. . . . 生物分离的新技术——分子印迹 —创新论坛—工业生物技术专家报告会 2008级生命学院3班微生物与生化药学专业 2008001243 宋汉臣
目录 1分子印迹技术的原理与方法 (3) 1.1 MIP的制备过程 (3) 1.2制备MIP的方法 (3) 1.2.1预组装法——共价键作用 (4) 1.2.2自组装法——非共价作用 (4) 1.2.3 共价作用与非共价作用联合法 (5) 2 分子印迹技术在分离上的应用 (5) 2.1 MIP作为固定相的分离技术 (6) 2.1.1MIP作为固定相分离天然产物 (6) 2.1.2MIP作为固定相检测食品中药物的残留 (7) 2.2分子印迹膜(MIM)分离技术 (7) 3问题与展望 (8) 4 参考文献 (9)
摘要：分子印迹技术[1](Molecular Imprinting technique，MIT)是一种新的、很有发展潜力的分离技术。由于其具有选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等优点，分子印迹聚合物已广泛应用于生物工程、临床医学、环境监测及食品工业等众多领域，在分离提纯、免疫分析、酶模型以及生物模拟传感器等许多方面显示出良好的应用前景，引起了人们的广泛关注，其有望在三聚氰胺的快速痕量检测上发挥作用。 关键字：分子印迹生物分离分子印迹聚合物
前言： 分子印迹技术最初出现源于 20世纪 40年代的免疫学，当时Pauling[3]首次提出抗体形成学说为分子印迹理论的产生奠定了基础， 1993年Mosbach等人有关茶碱分子印迹聚合物的研究报道，使这一技术在生物传感器、人工抗体模拟及色谱固相分离等方面有了新的发展，得到世界注目并迅速发展。基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等特点,因此分子印迹技术在许多领域，如色谱分离、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析、膜分离等领域得到日益广泛的研究和开发，有望在生物工程、临床医学、天然药物、食品工业、环境监测等行业形成产业规模化的应用。目前，全世界[3]至少有包括瑞典、日本、德国、美国、中国、澳大利亚、法国在内的 10多个国家、100个以上的学术机构和企事业团体在从事分子印迹聚合物的研究和开发。
分子标记技术
分子标记技术 摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助 一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。 关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用 引言 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 一．常用分子标记原理 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝
分子印迹技术及应用
分子印迹技术及应用 林凯城１李永莲２ （１．揭阳职业技术学院化学工程系广东揭阳 ５２２０００；２．广东轻工职业技术学院科研处广东广州５１０３００） 摘 要：分子印迹技术是构建高分子聚合物的有效方法，这种方法简便、成熟。所构建的纳米孔穴与印迹分子在空间形 状、大小以及作用点上相匹配，所以能被印迹分子高效地选择性识别出来。目前已广泛应用于各种离子、小分子、大分子等 的印迹。文中阐明了分子印迹技术的基本原理，简述了分子印迹技术的主要制备方法，并展望了光子晶体的应用前景。 关键词：分子印迹；聚合方法；应用 中图分类号:Ｑ５０３文献标识码:Ｂ 文章编号:１６７４－４８９６（２０１２）１２－００２６－０５ 分子印迹技术最先应用于２０世纪４０年代Ｐａｕｌｉｎ首次提出抗体形成学说［１］，为后来分子印迹理论的产生和发展奠定了理论基础。１９７２年，Ｗｕｌｆｆ在分子印迹技术方面的研究取得了突破性进 展，首次成功制备出分子印记聚合物（MIPs ）[2]。 １９９３年Ｍｏｓｂａｃｈ开展的有关茶碱分子的分子印迹聚合物的研究也取得巨大成就，并在《Ｎａｔｕｒｅ》上发表了相关的论文。从此，分子印迹聚合物引起了人们的广泛关注，因为其具有高度专一性和普适性，并且广泛地应用于化学和生物学交叉的新兴领域，如模拟酶、药物分析、催化剂、色谱分析与色谱分离、仿生传感器等方面，受到世界关注并迅速发展。 高分子聚合物的合成，在合成之前将印迹分子加入到功能单体之中，两者之间发生化学作用，与此同时，加入交联剂及引发剂，通过一系列的聚合反应形成一个固态高分子化合物，这个化合物是高度交联的，接着将印迹分子从高分子中移除，这个可以利用化学或物理的方法移除，经过这个步骤之后，大量的空腔结构就在高分子化合物的内部形成并存在了，通过这些空腔结构内各官能团的位置以及它们各自的形状，空腔结构可以与印迹高分子进行互补，并且还能发生具有特殊性能的作用。分子印迹技术各方面的研究也正是利 用这一原理开展工作的。功能单体和印迹分子之间存在的化学作用方式主要有两种，一是共价键，另外一个是非共价键，其中又以非共价键作用方式的应用较多，它包括离子键作用、疏水作用、氢键作用等。 图1典型的分子印迹步骤[3] 当前，利用分子印迹技术合成的聚合物，由于其具有广泛的通用性和惊人的立体专一识别性，全世界进行ＭＩＰｓ的研究与开发的国家至少有１０多个国家，包括日本、美国、德国、中国等，另外还有企事业单位和学术机构，其总数也不少于１００个。但是， 由于目前所利用的制备聚合物的分子印 收稿日期：２０１２－０９－０４作者简介：林凯城（１９８３－），男，广东揭阳人，助教，研究方向：化学传感材料。 第５卷第６期２０１２年１２月清远职业技术学院学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＱｉｎｇｙｕａｎＰｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃVol.5,No.6Dec.2012 ２６
分子标记技术的种类Word版
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具 有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP 的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原来
分子印迹技术原理及其在分离提纯上的应用剖析
生物分离的新技术——分子印迹 —创新论坛—工业生物技术专家报告会 2008级生命学院3班微生物与生化药学专业 2008001243 宋汉臣
目录 1分子印迹技术的原理与方法 (3) 1.1 MIP的制备过程 (3) 1.2制备MIP的方法 (3) 1.2.1预组装法——共价键作用 (4) 1.2.2自组装法——非共价作用 (4) 1.2.3 共价作用与非共价作用联合法 (5) 2 分子印迹技术在分离上的应用 (5) 2.1 MIP作为固定相的分离技术 (6) 2.1.1MIP作为固定相分离天然产物 (6) 2.1.2MIP作为固定相检测食品中药物的残留 (7) 2.2分子印迹膜(MIM)分离技术 (7) 3问题与展望 (8) 4 参考文献 (9)
摘要：分子印迹技术[1](Molecular Imprinting technique，MIT)是一种新的、很有发展潜力的分离技术。由于其具有选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等优点，分子印迹聚合物已广泛应用于生物工程、临床医学、环境监测及食品工业等众多领域，在分离提纯、免疫分析、酶模型以及生物模拟传感器等许多方面显示出良好的应用前景，引起了人们的广泛关注，其有望在三聚氰胺的快速痕量检测上发挥作用。 关键字：分子印迹生物分离分子印迹聚合物
前言： 分子印迹技术最初出现源于 20世纪 40年代的免疫学，当时Pauling[3]首次提出抗体形成学说为分子印迹理论的产生奠定了基础， 1993年Mosbach等人有关茶碱分子印迹聚合物的研究报道，使这一技术在生物传感器、人工抗体模拟及色谱固相分离等方面有了新的发展，得到世界注目并迅速发展。基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等特点,因此分子印迹技术在许多领域，如色谱分离、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析、膜分离等领域得到日益广泛的研究和开发，有望在生物工程、临床医学、天然药物、食品工业、环境监测等行业形成产业规模化的应用。目前，全世界[3]至少有包括瑞典、日本、德国、美国、中国、澳大利亚、法国在内的 10多个国家、100个以上的学术机构和企事业团体在从事分子印迹聚合物的研究和开发。
SSR分子标记简介
微卫星DNA标记技术及其在遗传多样性研究中的应用 摘要微卫星DNA的高突变率、中性、共显性及其在真核基因组中的普遍性，使其成为居群遗传学研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析和图谱构建的优越的分子标记。本研究系统介绍了微卫星DNA在结构和功能上的特点，并对微卫星DNA标记技术应用的遗传学机理和一般方法进行了扼要的阐述。另外，本研究还探讨了微卫星DNA标记技术在遗传多样性研究中的应用现状，并进一步提出其发展前景。 关键词：微卫星DNA；微卫星DNA标记；遗传多样性 大量重复序列的存在是真核生物基因组的主要特点之一，而且这些重复序列的拷贝数可高达百万份以上。真核生物的基因组中，重复序列占有很大比重（＞50%）。按照重复序列在染色体上的分布方式，分为散布重复和串联重复（VNTR）两种类型。散布重复序列的拷贝数很多，在重复单位之间彼此常有序列的变化，难以用做分子标记。串联重复序列根据重复单元数目的大小又分为卫星序列(satellites)、小卫星序列(mini-satellites)和微卫星序列(microsatellites)3种类型。其中，卫星序列的重复单元大，一般分布在染色体的异染色质区，采用分子标记系统来揭示其多态性有一定的困难；小卫星序列主要存在于染色体近端粒处，通常以15~75个核苷酸为核心序列，长度从几十到几千个碱基不等；微卫星序列一般较短，属于以1~6个核苷酸为基本单元的简单串联重复。 微卫星DNA是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分。微卫星DNA也称简单串联重复序列（SSRs）或简单串联重复序列多态性（STRP）。这些位点由非常短的串联重复DNA 片段（1-5个碱基）组成。微卫星DNA 最早是在人类基因组研究中发现的，它极其丰富，分布在整个基因组中[1] 。人类基因组最普遍的微卫星是那些含有A、AC、AAAN、AAN 或AG（这里N 代表G、C或T）的序列。这5组重复序列大约占到人类基因组微卫星总量的75%。微卫星DNA 序列在大多数的其它动、植物基因组中也先后被发现，并且 通过聚合酶链式反应可以确定其类型[2] 。（AT）n和（ATT）n 是首先于大豆中发现的在不同的株系中长度有所不同的重复序列，它们也是第一个被定位的植物微卫星座位。Wang等[3]发现微卫星序列中所有的单、双和四核苷酸重复序列都分布在DNA非编码区，而含G-C 碱基对的三核苷酸重复序列有57%位于编码区。微卫星重复序列在植物中出现的几率比动物中少得多。在植物中，约29kb中有20bp的微卫星序列[4]，例如鹰嘴豆中（TAA）n、（GA）n和（CA）n 序列在平均60kb的长度中出现于12000个位点上[5]；而动物中，约每6kb中就有20bp的微卫星重复序列。另外，研究还发现植物中最丰富的微卫星是（A）n，其次是（AT）n，再次是（GA）n。 Weber[6]将微卫星分为3类：完全重复（无间隔）、不完全重复（有非重复单位的碱基间隔）和复合重复（2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现）。这些小的、串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其他未知的过程来改变它们的长度，从而导致微卫星在数量上的差异[7]。微卫星的突变率高：每代每个配子的每个位点有2.5×10-5~1×10-2突变，因此造成了它们的多态性。但微卫星周围的单拷贝序列一般不受其影响。Davierwala等对水稻及其近缘种利用（GATA）n和（AC）n微卫星两侧的序列合成的引物进行PCR扩增，再通过克隆、测序获得了大小不等的8个等位基因。测序分析的结果表明，不同等位基因的大小变异是由于微卫星重复数目的变异和微卫星两侧区域的序列的变异。 尽管目前对这些重复序列的功能和起源还不清楚，但许多研究已经证明，重复序列可以作为种或基因组水平的遗传标记，是分子水平上研究遗传多样性的一个有力工具。微卫星序列的重复单位小，而且这些重复单位的序列差异和数目变化能够形成丰富的多态性，因此得到了广泛的应用。微卫星通常是复等位的，代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。微卫
分子标记技术原理、方法及应用
分子标记技术原理、方法及应用 一、遗传标记的类型及发展 遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。 形态学标记：主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点: 形态学标记简单直观、经济方便。缺点: (1)数量在多数植物中是很有限的; (2) 多态性较差，表现易受环境影响; (3)有一些标记与不良性状连锁; (4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长 细胞学标记：植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大; (2) 有些变异难以用细胞学方法进行检测 生化标记：主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相当有限; (2)有些酶的染色方
法和电泳技术有一定难度 分子标记：主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异，也叫DNA标记。 (1)数量多，高多态性，信息量大(2)与生长发育无关，取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4)均匀分布于整个基因组(5)选择中性，不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7)成本低廉(8)稳定，重复性好(9)共显性遗传 在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类： 第一类是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记； 第二类是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记； 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST 标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。 几种主要的ＤＮＡ分子标记
分子标记技术简介
分子标记技术简介 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。
【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
分子印迹技术及其研究进展
分子印迹技术及其研究进展 Malikullidin iz kaldurux tehnikisi wa uning tarakkiyati 分子印迹技术 近年来分子印迹学作为一门新兴的科学门类得到巨大的发展。分子印迹技术是 一种模拟抗体- 抗原相互作用的人工生物模板技术。它可为人们提供具有期望结构和性质的分子组合体，因此，分子印迹技术已成为当今化学研究领域的热点课题之一。分子印迹的出现源于免疫学，早在20世纪40年代由诺贝尔奖获得者Pauling 根据抗体与抗原相互作用时空穴匹配的“锁匙”现象，提出了以抗原为模板来合成抗体的理论。直到1972年德国科学家Wulff [18]研究小组首次成功制备出分子印迹聚合物，使这方面的研究得到了飞速的发展。1993年Mosbach[19]研究小组在美国《自然杂志》（《Nature》）上发表有关分子印迹聚合物的报道，更加速了分子印迹在生物传感器[20-24]、人工抗体模拟[25]及色谱固定相[26-30]分离等方面的发展，并由此使其成为化学和生物学交叉的新兴领域之一，得到了世界注目并迅速发展。分子印迹技术的应用研究所涉及的领域非常广泛，包括环境、医药、食品、 军事等。 1.分子印迹技术的基本原理及特点 分子印迹聚合物是具有特定功能基团以及孔穴大小和形状的新型高分子材料。是具有高度交联的结构，稳定性好，能够在高温、高压、有机溶剂以及耐酸碱的分子识别材料。它的制备是通过以下方法实现的：首先用功能单体(functional monomer)(funkissial tana)和模板分子（template）(izi kaldurlidigan malikulla)以共价键或非共价键形成复合物,再加入适当的交联剂 (cross-linker)(tutaxturguqi)和引发剂在加热、紫外光或其它射线照射的条件下聚合, 从而使模板分子在空间固定下来；最后通过一定的方法把模板分子洗脱,将模板分子从聚合物中除去, 这样就在聚合物中留下一个与模板分子在空间结构上完
分子标记技术的种类
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础,DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP;第二类以PCR技术为核心,如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等;第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心,其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求:①具有高的多态性;②共显性遗传;③能够明确辨别等位基因;④分布于整个基因组中;⑤选择中性(即无基因多效性);⑥检测手段简单、快速;⑦开发成本与使用成本尽量低廉;⑧在实验室内与实验室间重复性好。目前,没有任何一种分子标记均满足以上的要求,它们均具有各自的优点与 不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP) 1974年,Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时,发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异,由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理就是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成),利用限制性内切酶酶解基因组DNA时,会产生长度不同的DNA 酶切片段,通过凝胶电泳将DNA片段按各自的长度分开,通过Southern印迹法,将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交,最后通过放射性自显影显示杂交带,即检出限制性片段长度多态性。进行RFLP时,酶切要彻底,注意内切酶的选择,对于亲缘关系很近的物种,可增加内切酶的使用种类。目前RFLP 的使用领域很广泛,其具有以下优点:①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异,理论上可覆盖整个基因组,能提供丰富的遗传信息;②标记不受组织、环境与发育阶段的影响;③呈共显性,即杂交时等位DNA片段均呈现带,能区分纯合基因型与杂合基因型,F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3],提供标记座位完全的遗传信息;④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠,重复性好。其缺点就是:①操作繁琐,费时;②酶切后的DNA质量要求高;③使用放射性同位素进行分子杂交,有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD) 20世纪80年代,基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年,Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法,即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理就是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物,以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量与大小发生改变,表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物,溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比,RAPD方便易行,DNA用量少,设备要求简单,不需DNA探针,设计引物也不需要预先进行序列分析,不依赖于种属特异性与基因组的结构;合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,并且不需使用同位素,安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低,易产生错配,故实验的稳定性与重复性差,且为显性标记,不能区分纯合子与杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感,这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制,即设计更长的引物。1993年,Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region,SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆与测序,设计一对互补于原来RAPD片段两端序列的24聚体的引物,扩增原来模板DNA,产生SCAR-DNA片段。相对于RAPD,SCAR由于使用更长的引物与