DNA甲基化
人类基因组单体型图细胞株中与遗传和基因表达变化有关的DNA甲基化模型
摘要
背景：DNA甲基化是参与基因调控和疾病的一种重要表观遗传学机制，但很
少人知道在个体间甲基化机制存在差异。在这，我们从77个图约鲁巴人的人类基因组单体中测量了22,290 CpG二核苷酸的淋巴母细胞系的甲基化水平，同时也使用了全基因组的基因表达和基因型数据。
结果：通过对超过三百万常见的单核苷酸多态性（SNP）位点的甲基化水平关联的分析，我们确定在173个基因的180个CpG双核苷酸位点与附近的单核苷酸多态性（独联体通常在5 KB内）的错误发现率为10％。在迪斯科相互
作用蛋白2的同源基因B（DIP2B，以前推测在DNA甲基化中发挥作用）中发现SNP rs10876043是最有趣的传输信号，全基因范围内的信号与第一组分的甲基化模式是有联系的。而且我们发现在整体信号联系中只有少量的反式作用。正如预期的那样，通过测量的RNA序列，我们发现基因的启动子甲基化和基因表达水平呈负相关关系。最后，发现有一个显着的SNP位点重叠，均与甲基化与基因的表达水平有关。
结论：我们的研究结果显示在个体间的差异在DNA甲基化方面有很强的遗传成
分。此外，丰富的单核苷酸多态性会影响甲基化和基因表达，为共享机制的一小部分的基因提供了证据。
背景：D NA甲基化在真核生物的基因组起着重要的调节作用。甲基化的改变可以影响转录和表型的变化[1]，但DNA甲基化本身的变化根源，现在仍然知之甚少。大量证据确实存在DNA甲基化的个体差异随着年龄的增长[2,3]，组织[4,5]，物种[6]。在哺乳动物中，DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶（转移酶）介导的，是在复制过程中负责重新甲基化和维持甲基化模式。参与合成的甲基化和DNA去甲基化的基因也可以影响甲基化的变化。例如，突变的甲基转移酶DNMT3L[7]和亚甲基四氢酸还原酶MTHFR[8]基因可导致人的血液中DNA低甲基化。这些变化发生在全基因组水平，与遗传变异是不同的，而是有针对性的对基因组区域影响DNA甲基化变异，例如，在H19/IGF2位点的差异性甲基化与遗传多态性有关9]。
最近的证据表明，DNA甲基化的依赖所在基因的序列含量[10?12]。在对家庭与双胞胎甲基化模式的研究中发现有很强的遗传效应，但随机因素和环境因素也有可能发挥重要作用2,14]。最近的工作表明，基因变异可能对所在的甲基化模式有重大影响[5,15-18]，但影响甲基化的遗传变异是何种程度，机制尚不清楚。此外，在DNA甲基化变化的基础上对个体基因表达影响到何种程度，仍然是未知之数。
DNA甲基化一直被认为是基因表达的一个关键调节器。基因表达的遗传基础已经通过组织[19]和人口[20]进行了研究。两条证据都表明与基因表达变化有关的遗传变异主要位于启动子转录起始位点附近。然而，很少人知道遗传变异改变基因表达的确切的机制。通过结合遗传特性、表观遗传学和基因表达数据，可以知道这些过程之间的基本关系，但这样的研究是在基因组范围内是罕见的。最近的两项研究已经检测出人脑样品中DNA甲基化和基因表达之间的联系[5,18]。这两项研究都发现每个表型都有相当数量的位点，但只有的少数几个位点有较强的基因甲基化和表达的变化。
为了更好地理解遗传变异在控制DNA甲基化的变化的作用，以及其对基因表达变化带来的影响，我们从人类基因组单体型图采集了77个人的淋巴母细胞系（LCLs）并研究了DNA启动子甲基化。这些细胞系代表一种独特的资源，因为它们已经是人类基因组单体型图中密集的基因型21]，并且正在基因组计划中测序。另外，这些细胞系的基因表达和RNA测序[23,24]已经使用微矩阵研究了许多组，以及更小的变化研究染色质辅助功能和PolII的结合[25,26]。最后，一个单体型图细胞株，现在正在紧张研究的ENCODE项目[27]。这种融合来自同一个细胞株的全基因组数据的不同类型的遗传变异会影响基因调控的机制，最终实现更清晰的认识。
结果：DNA启动子甲基化模式的特征
为了研究个体间变异的甲基化图谱，我们测量了77个图约鲁巴人的淋巴母细胞系（LCLs）的整个基因组甲基化水平，这些样本来自无关从人类基因组单体型语（YRI）收集的个人。对于这些样品，我们也有
可公开获得的基因型[21]，以及估计的RNA测序的77个样本中的69个基因的表达水平[24]。在重复使用的Illumina公司HumanMethylation27 DNA分析微珠的芯片的检测，这是基于对基因分型的bisulfiteconverted进行甲基化图谱个人的CpG-网站提供的定量测量DNA甲基化的基因组DNA。TheIllumina阵列探测目标27,578 CpGsites。然而，我们有限的探头，以绘制出独特的基因组中，并没有包含已知的序列变异分析，留给我们的一个数据集的22,290的13,236个基因的启动子区域的CpG位点（见方法）。杂交后，甲基化水平估计作为比强度得到的信号从被甲基化了的甲基化和非甲基化的等位基因的信号强度的总和的等位基因。继杂交，甲基化水平估计所得的甲基化的等位基因甲基化和unmethylated 等位基因强度信号的总和超过强度信号的比率。甲基化水平通过两次复制被标准化确定分为点。。我们测试统计了潜在的混杂变量，可能会影响甲基化水平的淋巴瘤细胞白血病的相关性[29]，如LCL细胞的生长率，Epstein-Barr病毒的拷贝数变异生物和其他措施（见附件1），60个人在我们的研究[30];这些变化没有显着解释在我们的样本中的甲基化水平（图S1在此1）。然而，我们观察HapMap项目的影响的阶段（从阶段1/2和3的样品）中的常染色体显性遗传的数据的第一主成分载荷的分布，提示第一甲基化部分主要组件可能会捕捉技术变化，可能相关的LCL文化的。然而，我们观察到HapMap 阶段（从第1/2 阶段vs 3 样本）对分布在常染色体显性遗传的数据中，第一次主成分荷载的的影响表明甲基化的第一个主要组件部分可捕捉潜在相关的拼箱文化的技术变化。在下游的关
联映射分析，我们采用了修正，采用主成分分析回归前三个主成分占不可测量的干扰因素，提高功率检测数量性状位点。
甲基化的总体模式
位于常染色体，X染色体上，并在附近的印记基因（图1a）CpGsites不同的甲基化模式进行观察。大部分（71.4％），常染色体显性遗传的CpG位点主要是未甲基化（观察到的甲基化比例<0.3），15.6％为半甲基化（分数的甲基化是在0.3和0.7之间），13％的甲基化。正如预期的那样，这些模式与以前观察到的全基因组水平启动子附近低甲基化水平附是一致的[4,31]。我们没有发现证据的性别特异性的常染色体显性遗传的甲基化模式，与以前的报告一致[4]。与此相反，用CpG的网站的X染色体上具有高度显着的性别特异性差异（图S2）与半甲基化模式符合女性X-染色体失活。类似的峰半甲基化的CpG位点附近的转录
开始的网站（TSSS）已知的常染色体显性遗传印记基因在整个样本。
我们观察到一个先前报道[4]在位于1 kB的TSSS中（图1b）的CpG位点的甲基化水平下降。已启动子甲基化水平的改变CpG岛[32]。with respect to关于我们发现，虽然距离CpG岛（CGI）边界[33]（包括CpG基海岸[34]）没有显著影响甲基化水平，的CpG位点位于CGI的甲基化和变量（Wilcoxonrank和检验P <2.2×10-16）相比，外部网站的CGI程序（图1，图S3的其他文件1）。
甲基化通常是发现在1-2KB基因区域是有关的规模要跨越基因组区域相关[4,35]。我们调查是否常染色体甲基化程度（共-甲基化）之间的相关性依赖于CpG的站点之间的距离。我们观察到，在位于靠近探头的甲基化水平（2 KB）有高度相关性（图1c）内的细胞类型相关，这表明，个人之间的甲基化水平的变化。我们观察到的甲基化级别为位于邻近的探测器(相距达2 kb) 高度相关的（图 1 c），指示该个人之间的甲基化水平的变化相关内单元格类型。图1c还表明，对CpG的网站，均在一个CGI表现出更大的比对其中至少一个的CpG 位点以外的CGI，控制距离合作-甲基化的证据，这意味着DNA甲基化的CpG 岛的微分调节内部和外部的CGI程序[32]。1 c 还显示两人都在CGI 内的中央人民政府网站对表明co-methylation 比对中央人民政府网站，至少一个是CGI 以外的更多证据的距离，暗示的DNA 甲基化Cpg 的内部和外部希捷[32] 差异调节控制。
DNA甲基化与转录，组蛋白修饰
早已被牵连甲基化在基因表达的调控。为了研究甲基化在基因表达变化的作用，我们比较了甲基化水平的估计基因表达的基础上RNAsequencing（图2a）。在个人，我们发现了一个显着的负相关关系，甲基化和跨越11,657个基因的基因表达水平（图S4的其他文件1）（平均秩相关系数r =-0.454）。我们分为四分位值从高至低基因表达的基因，并观察附近的甲基化水平的TSS下降（图1b），只出现在中高表达的基因（图2b）。我们还问，是否在不同的个体的甲基化水
平的变化与在基因表达水平的变化的相关性。在基因水平上69个人之间的比较表明温和但显着过剩的负相关基因（排列P <0.0001）。
被认为是DNA甲基化与组蛋白修饰相互作用过程中基因表达的调节[36,37]。我们在我们的样本中的甲基化水平比较与组蛋白修饰ChIP-seq测序的数据，从CEPH研究中心人类基因组单体型图的直线加速器相干光源（GM12878）的
ENCODE编码项目。我们发现DNA甲基化水平和活性基因（图1d，图S3和S5的其他文件1）的组蛋白标记的目标存在较强的负相关性。例如，DNA甲基化是在H3K27ac峰，这是指示性的促进剂[38]，以前被转录水平呈正相关[39]和DNA甲基化水平呈负相关[31]。同样，转录标记H3K4me3和H3K9ac了：DNA甲基化水平呈负相关。我们也观察到较低的甲基化水平的转录因子结合位点预测的CENTIPEDE算法，采用细胞类型的具体数据包括DNase1测序读[40]，甲基化的情况下是非常重要的转录因子结合的期望相一致。
基因组关联的SNP基因型与DNA甲基化
接下来，我们评估遗传变异是否有助于个体间变异DNA甲基化水平，我们首先测试是否有SNP位点与整体的DNA甲基化模式，测量通过主成分分析（见方法）。最有趣的信号，获得的SNP rs10876043，其中有一个第一主成分的甲基化在基因组范围的重大变化与（P= 4.5×10-9），这也表明一个温和与平均的全基因组甲基化水平（P =4.0×10-5）（表S1中的其他文件1）。这个SNP位于内含子内的的基因DIP2B的，其中包含了DMAP1结合结构域，与先前已提出要发挥的作用在DNA甲基化[41]。
A ssociations in trans传动装置
个SNP位点的可能性，可以有全基因组整体甲基化模式的影响进行评估后，我们接下来将甲基化数据回归的三个主要组成部分（见方法），因为我们曾发现，这个过程可以大大减少数据中的噪声，提高数量性状位点（QTL）定位[24]
（[42,43]）。在全基因组的错误发现率（FDR）的10％（P= 2.1×10-10），
甲基化水平的证据表明在37的CpG位点SNP基因型与（表S2中的附加文件1）。大多数的这些中央人民政府网站（2737）假定顺的关联信号，那就是最显着的SNP是在50 KB的测量CpG位点（图S6的其他文件1）。我们观察到一个适度的富集远端协会（假定跨协会），这是主要是由于信号在10个CpG位点（图S7的其他文件1）。然后，我们检查远端协会的SNP位点甲基化（表S3中的其他文件1）在此前被牵连，并发现了一个显着的近端协会之间的SNP rs8075575，这是150 kb的基因ZBTB4甲基化的DNA结合，和甲基化在探头cg24181591在基因EIF5A的编码翻译起始因子。三报道[5]也观察到了显着的远端协会为SNP rs7225527（38 kb的基因RHBDL3的）和甲基化在探头cg17704839在泛素样蛋白编码的基因UBL5，（106 kb的基因DDX11）单核苷酸多态性rs2638971和rs17804971（49 kb的基因DDX12）和甲基在探头cg18906795在基因RANBP6，这可能作为核运输受体作用于细胞核蛋白进口。协会还观察到在SNP位点165 kb的编码基因的甲基结合蛋白MBD2，22 kb的甲基转移酶基因DNMT1，192 KB的甲基转移酶基因DNMT3B，并在3个位点与以前的证据的关联，但不同的地区[16]（图S8的其他文件1）。不过总的来说，我们获得了相对较弱的证据，协会在反和弱到中等富集反关联信号，在较为宽松的意义阈值的候选地区的利益。
Associations in cis
由于大多数近端到相应的CpG位点的全基因组关联信号，我们接下来内集中检测单核苷酸多态性的关联50 kb的各CpG的站点（图3）。FDR在全基因组的10％（P = 2.0×10-5）有180的CpG位点与顺甲基化的数量性状位点
（meQTLs），。相关性最强的信号（P =8.0×10-18），获得单核苷酸多态性rs2187102与探针cg27519424在通过介导的组蛋白生物素化[44]，被认为是参与generegulation基因调控的的基因HLCS，。解释方差的比例介于22％和63％的甲基化数据的meQTLs归。如果影响DNA甲基化的机制，一般的距离大约为2 KB（图1c），然后单核苷酸多态性影响甲基化检测为meQTLs在附近的CpG 位点。我们观察到，与甲基化的单核苷酸多态性的关联，也丰富了额外的CpG 位点内最相关的CpG-2 KB的最显着的P-值（图3b），表明一个单一的基因变异往往会影响甲基化在许多附近的CpG位点。
先前已被遗传变异相关联甲基化，在特定的印迹区[1]。180的CpG位点与meQTLs在我们的数据是最近的TSS的173个基因，其中2MEST和CPA4的印记基因，被称为是。以前的观测表明，eQTL和印记的影响可能是性别特异性[45]，提高的可能性，一些的meQTLs可能在性别依赖性。的CpG位点的近端meQTLs的180个协会，27个先前报告的人脑样本[5]。
鲜为人知的是，有关的生物学机制，可依据meQTL的影响。为此，我们应用了贝叶斯层次模型[22]来测试的丰富的meQTLs在转录因子结合位点，在组蛋白修饰类别，并且在相关联的探针的周边。我们发现，最接近的探针的SNP 位点，尤其在紧接包围探头5 kb的，显着富集meQTLs（图3c）。转录因子结合位点，包括CTCF结合位点，呈温和，但，显着富集meQTLs的（图S9的其他文件1）。
甲基化QTL的丰富表达的QTL
最后，我们研究的重叠监管的变化，影响到甲基化和基因表达水平，利用RNA 测序数据[24]。我们假定，由于DNA甲基化可以调节基因的表达，影响甲基化的变异，经常有随之而来的对基因表达的影响。在此，我们期待的是第一种方式设置的180单核苷酸多态性，meQTLs FDR <10％（只取最显着的单核苷酸多态性为每个meQTL）。然后，我们测试每个这些单核苷酸多态性与附近的基因的表达水平（图4a中，红色的点）。有一个明确的富集与表达水平相比，零假设（黑线）和套控制单核苷酸多态性的等位基因频率与探头距离的分布（黑点）进行匹配。
的SNP rs8133082，既是一个meQTL和eQTL基因C21orf56的一个例子示出在图5中。当我们回归甲基化，这完全删除该SNP与基因表达的相关性（图5a，B，C，D）。我们验证了甲基化检测结果C21orf56由重亚硫酸盐，在我们的研究中，在8个样本中的甲基化测序探针区域，四从每个纯合子基因型类的SNP（图5f）。这两个甲基化探针C21orf56有顺meQTLs，和重叠可能启动子区域的组蛋白修饰（图5e），这表明在该地区的遗传变异可能影响染色质的结构。c21orf56调制人类LCLS烷化剂的反应出现，并可能作为个体间差异的基因组的预测响应于DNA损伤剂[46]。
为了进一步研究之间的重叠eQTLs和meQTLs，我们重新分析了的eQTL 数据结合甲基化基因特异性协变量。如果甲基化变化的基础在基因表达的变化，我们观察到的eQTLs中残留的甲基化的基因表达数据的数量下降。在FDR为10％（P =2.5×10-5），原始的eQTLs有484和463甲基残留eQTLs的，其中439 eQTLs重叠，45 eQTLs是目前只有在原始数据中，24个新的eQTLs目前仅在甲基化残留物（图4b）。有趣的是，单核苷酸多态性的45个甲基化残留物信号的减少，eQTLs丰富了显著着的甲基化协会（图S10 inAdditional的文件1），
这表明这些都为真，的底层meQTLs，遗传变异影响甲基化，这反过来又调节基因的表达[5,18]。在摘要我们的结果表明，单核苷酸多态性，同时影响甲基化和基因表达显着富集，提示一个共享的机制（例如，增加DNA甲基化可能驱动下基因的表达）。但是，基因，显示这样的信号的数目是一个温和的分数meQTLs 的总数。
讨论
我们的报告在全基因组水平的遗传和基因表达变化的DNA甲基化之间的关联。我们已经确定QTL的全基因组甲基化，其中大部分在很短的距离，即小于5 kb 的行动。此外，个人的距离大约为2 KB，并结合本内一般共变的甲基化模式，meQTLs常累及多个相邻的CpG位点。我们的研究结果是一致的与以前的甲基化协会[5,16,18]，家族聚集性[13,14]，与本地序列的相关性[10]，allelespecific 甲基化特异性[15,17]，和组蛋白修饰的影响[47]。鲜为人知的是的生物学机制所依据meQTL的影响，但是，这是一个重要的途径，以确定如何遗传变异会影响基因调控。
我们发现一个整体的富集显着协会的遗传变异与甲基化的CpG位点，从两个最近的调查报告QTL的人脑样本的全基因组甲基化的结果是一致的[5,18]。总体而言，基因组范围的重大meQTLs的的数量各不相同的三份研究报告，这很可能是由于样本大小的差异，在多个顺区间的的测试修正和定义的差异，并存在组织特异性DNA甲基化与差异组织特异性meQTLs。在一般情况下，将取决于许多因素，包括样品的功率检测meQTLs规模，覆盖全基因组的遗传变异，覆盖全基因组甲基化变化，以及规模效应的遗传变异与利益的组织的甲基化变化。
此外，我们的分析是根据Epstein-Barr病毒转化的类淋巴母细胞系。细胞类型的选择将影响所观察到的全基因组DNA的甲基化模式，尤其是，高- 传代LCLS可能随着时间的推移[29]呈现的甲基化改变。例如，研究了LCLS和外周血细胞之间的全基因组DNA甲基化的差异（PBCs），3723常染色体DNA的甲基化位点的甲基化模式有显着的不同类型的细胞之间。在这方面，它是预期的一个子集，我们的结果反映LCL-特定事件。我们已经测试了潜在的混杂变量，可能会影响甲基化水平，尤其是在LCLS[30]，但没有观察到显着的影响，这些在我们的数据对整体DNA甲基化模式。然而，甲基化变异在人类基因组单体型图略有不同阶段的1/2个样本HapMap项目“阶段3个样本相比，这表明技术的变异有关LCL文化的，可能影响DNA甲基化。我们把这个时考虑到所有下游的甲基化QTL分析，并与以往的研究结果，在原代细胞我们的未修正的甲基化模式的分析是一致的[4,31,35]。
DNA甲基化与潜在的长期影响范围从跨突出几个位点的分析，我们得到有趣的结果。此外，一个有趣的单核苷酸多态性关联内的内含子DIP2B，其中包含了DMAP1结合结构域，与第一主成分的常染色体的甲基化模式显示了新的全基因组甲基化变异的影响。但是，我们并没有观察到强效的多态性在众多的候选甲基化调控基因甲基化特异性探针的总体模式。在研究中使用的样本量限制了我们的力量来检测反式信号，使这些分析更难以解释。在一般情况下，在所有三个全基因组的甲基化研究中使用的样本大小适中迄今不容许为检测对甲基化变异的遗传变异的微妙的影响，并相应地，在所有研究中测定的甲基化位点的大多数仍然无法解释的GWAS全基因组关联研究（Genome Wide Association Studies,GW AS）是一种检测特定物种中不同个体间的全部或大部分基因，从而了解不同个体
间的基因变化有多大的一种方法。分析。然而，调查结果表明，甲基化是复杂的基因调控表达或表型变异。
有关遗传变异的DNA甲基化和基因表达变化，揭示了复杂的图案。我们观察到显着的重叠之间meQTLseQTLs顺监管的变种。这些研究结果时，我们都完全集中上meQTL单核苷酸多态性（图4a）和层次模型框架eQTLs（图S9的其他文件1）所有SNP分类，我们比较基因组meQTL的结果。观测表明共享在一小部分的基因调控机制的证据。然而，在重新分析的eQTL考虑到帐户DNA 甲基化的数据，只有10％的eQTLs的单核苷酸多态性的遗传效应的表达的影响，通过控制进行甲基化，表明只有一小部分的变化的甲基化帐户基因表达水平的变化。这可能有几个解释。首先，覆盖的甲基化阵列提供了一个相对较低的分辨率的全基因组DNA的甲基化模式的快照。第二，稳定状态下的基因表达水平（RNA测序）受许多其他因素的控制，除了DNA甲基化，如转录因子结合，包括组蛋白标记的小分子RNA的核小体定位和调节染色质状态。最后，我们研究的样本量提供了适度的权力，无论是对eQTL和meQTL映射。然而，相对于以前的研究，解决这一问题[5,18]，我们找到更有说服力的证据meQTL和eQTL重叠的。例如，张某等人。[18]发现10的情况下与甲基化和表达相关的基因变异，但他们只有不到100个基因，研究基因表达数据的一个子集的样本在这些比较中，而吉布斯等人。[5]研究发现，在他们的研究中，约5％的单核苷酸多态性都meQTLs和eQTLs具有重要意义。我们的数据中获得较大的重叠，一个可能的解释是，我们的研究检查一个类型的细胞异质细胞在人脑组织样本在其他研究中都使用比较[5,18]。甲基化及其关联特征的遗传控制基因表达的调节是一个重要的研究领域，我们了解复杂的生命系统如何调控的关键。我们的研究有可能帮助疾病测绘的研究中，这种变化告知表型的影响。总之，18个基因的173个基因的近端meQTLs在我们的研究中，以前报告的差异甲基化在癌症，其他疾病，或在多个组织（见表S4的其他文件1）。此外，30的meQTL协会的报告在我们的研究中也观察到人脑样本[5]。这些发现提供了一个框架，以帮助GWAS全基因组关联分析(Genome Wide Association Study研究结果的解释和提高我们的理解，在多种复杂的表型的基本生物学
结论
我们的研究结果，再加上最近的研究成果可遗传的等位基因特异的染色质修饰[25,47]和转录因子结合[26,49]，在表观遗传和染色质的署名个体间的变化表现出很强的遗传成分，也有可能对下游转录和表型影响。更重要的是，我们发现了一个单核苷酸多态性影响甲基化和基因表达的富集，这意味着一个单一的因果机制，其中一个SNP可能会影响这两个过程，虽然这种共享的QTL都meQTLs 和eQTLs少数。我们的数据也有一定的影响机制的遗传变异与疾病相关协会的功能解释
材料与方法
甲基化数据
淋巴母细胞系DNA提取的约鲁巴族（YRI）从国际人类基因组单体型图计划（60人类基因组单体型图阶段1/2一期与二期和17个单体型图计划第一阶段
的3个人）的人口从77个人。淋巴母细胞系中先前建立的EB病毒转化外周血单个核细胞，用phytohemagluttinin。我们得到了转化细胞系，从的卡瑞尔细胞储存库。甲基化数据，使用Illumina HumanMethylation27 DNA分析BeadChip 分析。甲基化检测估算使用两个技术复制，每个人的甲基化水平分量标准化的
整个复制[28]的。在每个站点的CpG的甲基化水平为上演出息b，这是分数信号得到的甲基化和非甲基化的珠信号的总和的甲基化的珠。我们考虑了不同的方法来正常化间的值，以及复制的比b的甲基化的非甲基化的信号，而不是使用日志，发现结果强大的正常化过程中，甲基化测量，及技术复制（见Additionalfile1）。甲基化数据是公开的，[50]，并已提交给的的NCBI基因的表达OMNIBUS精选集[51]下加入。[GSE26133]。我们映射的27,578 Illumina公司的人类基因组序列（hg18）探针，利用BLAT[52]和MAQ[53]丙酸甲酯。我们选择了26690个探针，明确地映射到在人类基因组的单一位置，在100％的序列同一性的，丢弃探针，映射到多个位置，最多两个错配。我们排除了4,400探头所包含的序列变异，包括单核苷酸多态性（3,960探头的1000基因组项目[54]，2009年7月发布，YRI人口）和440探头重叠拷贝数变异[55]。这导致22,290探头（21,289常染色体显性遗传探针），用于进一步分析的最后一组。22,290探针最接近13,236 数据库Ensembl人类的TSS基因的12,901个基因，其中至少有一个甲基化的CpG-2 KB的TSS内。
八个人在C21orf56地区进行亚硫酸氢盐测序。DNA亚硫酸氢盐转化使用的EZ DNA甲基化的金的套件（ZYMO研究）的。使用共411 bp的扩增的C21orf56基因的5'非编码区中的从HumanMethylation27阵列和在该区域最接近的CpG岛（使用甲基Primer Express（引物设计）从Applied Biosystems）的CpG网站cg07747299的设计的引物进行PCR扩增。PCR产物进行测序和胞嘧啶峰高，峰高整体被称为4Peaks软件。
基因表达数据
RNA测序数据，获得了LCLS，在我们的研究[24]从69个人。甲基化和RNA 测序数据来自相同的培养的直线加速器相干光源。RNA测序基因表达值作为GC-校正的读取映射到在个体中的基因，该基因的长度除以数。我们分裂的基因的甲基化基因表达的比较位数的基础上，平均每个基因的基因表达。对于eQTL分析，RNAsequencing数据进行校正，完全如在[24]和规范化。在最初的研究中的22683个基因中，有10,167个常染色体基因有两个基因的表达计数和甲基化的CpG位点在2 KB的TSS。
关联分析
全基因组关联使用的甲基化值在每个站点的CpG-表型和常染色体SNP基因型3000000。我们使用最小平方线性回归单轨迹添加剂效应模型，其中我们估计甲基化水平的增加的影响，轻微的SNP等位基因。之前的关联分析，我们标准化的甲基化值在每个站点的CpG-N（0，1），并采用了修正，采用主成分分析后，考虑到不可测量的混杂因素回归前三个主成分类似的方法来表达的异质性降低基因表达实验（见附件1）[24,42,43]。性别的具体分析作为协变量的使用性和评估性添加剂QTL的交互项的意义。我们评估了丰富的联想，以前甲基化[7,8,15-18]和单核苷酸多态性与200 kb的基因影响DNA甲基化（表S3中的其他文件1）在SNP位点和探头。我们还比较了遗传变异的标准化负荷的主要
组成部分为常染色体显性遗传的甲基化数据（见附件1）的变化。结果提供从180顺meQTLs的是在线[50]。
FDR错误发生率计算
我们进行了全基因组排列的全基因组关联最小二乘线性回归分析的结果，评估的意义。我们进行排列为21,289常染色体探针（表型）的甲基化值，21,289序列改变和标准化的表型进行全基因组关联，10（顺式-分析）或1，并重复此过程（transanalyses）复制，每个重复选择的最好的信号，每个探头。结果在FDR的10％，这意味着约10％的meQTLs的误报。额外的FDR阈值的结果显示在附加文件1。FDR计算作为显著检索结果分数，在置换后的相对于在一个给定的P-值的阈值的观测数据，所有常染色体主成分和CpG位点的甲基化数据，并为常染色体基因中的RNA测序数据进行关联分析和FDR计算。
层次模型
我们装上了贝叶斯层次模型[22]，以测试是否meQTLs中所占比例过高的转录因子结合位点，组蛋白修饰，以及与对距离的探测。我们延长该模型以适合的甲基化数据，其中的参考点的位置的甲基化探针。每个注释类别包含在模型中，我们研究会计距离的影响。
基因组注释
基因组的注释数据来自加州大学圣克鲁兹分校（hg18）。组蛋白修饰ChIP-seq的数据是从读取ENCODE项目（伯恩斯坦实验室）GM12878七组蛋白标记。组蛋白修饰类是基于估计的峰值的读取深度分销（见附件1）。估计使用的算法CENTIPEDE[40,57]。这里的结果，蜈蚣开始通过识别基因组中的所有比赛了大量的转录因子获得从TRANSFAC和JASPAR数据库的的结合基序。然后，它估计实际占用的潜在结合位点的转录因子在LCLS，通过将输入数据序列保守性，位置与附近的基因，并cellspecific的实验数据，包括DNA酶I数据。1136620非重叠的网站从751转录因子重叠1,913的CpG位点的主题比赛。
附加的材料
其他文件1：补充材料。包含辅助方法和结果，补充图1-11和补充表1-4。
缩略语
CEPH：CENTRE D'练习曲杜Polymorphisme Humain CGI：CpG岛; ChIP-seq 的：
其次是染色质免疫沉淀测序;的CpG：cytosinephosphate -
鸟嘌呤; DIP2B：迪斯科相互作用蛋白2的同源基因B;
DNMT：DNA甲基转移酶; eQTL表达数量性状位点; FDR：
虚假的发现率; LCL：淋巴母细胞系; meQTL：甲基化
数量性状基因座QTL：数量性状位点SNP：单核苷酸
多态性; TSS：转录起始位点，加州大学圣克鲁兹分校：加州大学
圣克鲁斯基因组浏览器YRI：约鲁巴语。
DNA甲基化和肿瘤的关系
DNA 甲基化与肿瘤 一、DNA甲基化与基因表达 5-甲基胞嘧啶是天然存在的修饰碱基，甲基化的 mCpG ，在DNA 双链中对称出现。哺乳类动物基因组约60 %的表达基因5′端启动子存在未被甲基化的CpG岛,而启动子区域外的CpG岛大都为 mCpG。正常情况下，非活化的X染色体、印迹基因等的启动子区域的CpG岛为甲基化状态，而看家基因的 CpG岛则是去甲基化状态。 DNA 甲基化状态与基因表达呈负相关。其调控作用主要在转录水平抑制基因表达。 DNA甲基化的检测方法 经过亚硫酸盐处理后的DNA中胞嘧啶（C）转变为胸腺嘧啶（T）,但是甲基化的中的CpG二核苷酸C 未转变为T，而无甲基化的CpG二核苷酸则发生这种转变，由此可以推断DNA是否发生甲基化。TATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGG CCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTTAGTAT TGTTTGGTGAAATGGTACGTGTTTATAATTTTAGTTATTTAG GAGGTTGAGGTAGGAGGATTTTTTGAGTTTAGGAGTTTAA GTTTAGTTTGGGTAATATAGTTTAGTGGTTATATTAAAAAA AGTAAAATAGTCGGGCGCGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTA GTATTTTGGGAGGTCGAGGCGGGTGGATTACGAGGTTAGG AGGTTGAGATTATTTTAAGGGCAAT
DNA 甲基化抑制基因转录的分子机制 ①DNA 双螺旋结构的大沟为DNA 与多种转录因子的作用部位，mCpG的甲基化胞嘧啶突入大沟，抑制转录因子的结合而抑制转录。②mCpG 激活阻遏蛋白因子，如DMAP1、TSG101、 Mi2等，通过阻遏蛋白因子的作用抑制转录。③DNA甲基化与组蛋白乙酰化的研究发现，组蛋白H3、H4 的赖氨酸去乙酰化后带负电荷,与带正电荷的DNA 结合更紧密,不利于转录过程中的聚合物解聚，从而抑制基因转录。甲基化的CpG 结合蛋白(MeCPs) 与DNA 的mCpG结合,并与组氨酸去乙酰化酶(HDAC) 形成复合物共同抑制转录。 二、DNA甲基化与肿瘤 以往的研究认为癌基因激活、抑癌基因失活主要是基因突变、缺失导致的DNA 序列改变。在肿瘤研究中，检测到许多肿瘤的重要基因并未发生突变、缺失，基因表达的异常主要通过DNA 甲基化实现。癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化状态，可导致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改变是肿瘤细胞的一个重要特征。 DNA 甲基化状态的改变导致基因结构和功能的异常，与肿瘤发生的关系是近年来研究的热点。 DNA甲基化的异常与基因突变、缺失等基因组异常也有密切的关系
DNA甲基化_去甲基化与癌症
收稿日期：2012-10-04 第一作者：周建生(1988-)，男，硕士生，E-mail: zhoujiansheng0902@https://www.sodocs.net/doc/9b11869735.html, *通信作者：焦炳华(1962-)，男，博士，教授， E-mail: jiaobh@https://www.sodocs.net/doc/9b11869735.html, DNA 甲基化/去甲基化与癌症 周建生，杨生生，缪明永，焦炳华* (第二军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，上海 200433) 摘要：DNA 甲基化是真核细胞基因组中常见的可遗传的表观遗传修饰，在调节细胞增殖、分化、个体发育等方面起重要作用，并且DNA 甲基化水平异常与肿瘤的发生发展密切相关。DNA 甲基化及被动去甲基化主要是在DNA 甲基转移酶家族参与下完成的，而DNA 的主动去甲基化机制尚不是很明确。在肿瘤细胞中DNA 的整体甲基化水平显著降低，但抑癌基因的启动子区域却出现高甲基化。目前尽管有DNA 去甲基化药物用于癌症的临床治疗，但药物特异性较差，因而研究特定基因的主动去甲基化机制有助于研发特异性高的药物用于癌症的治疗。 关键词：DNA 甲基化；DNA 去甲基化；癌症；表观遗传治疗 Relationship between DNA methylation/demethylation and cancer ZHOU Jiansheng, YANG Shengsheng, MIAO Mingyong, JIAO Binghua * (Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Sciences, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China) Abstract: DNA methylation, the most common heritable epigenetic marker of eukaryote genome, plays a critical role in cell proliferation, differentiation, and development. Aberrant DNA methylation is correlated with the onset and progression of cancer. It is well accepted that DNA methylation and DNA passive demethylation are mainly catalyzed by the family of DNA methyltransferases. However, the mechanism of DNA active demethylation is unclear. In cancer cells, the global genomic levels of DNA methylation are lower, but the promoter methylation levels of tumor suppressor genes are higher than in normal tissues. Several demethylating agents have been applied for the clinical treatment of cancer, but these agents are lack of specificity for target genes. So studying the mechanism of active demethylation of specific genes avails the research and development of high-specificity agents for the treatment of cancer.Key words: DNA methylation; DNA demethylation; cancer; epigenetic therapy 表观遗传的概念最初是由Conrad Hal Waddington 于1942年提出的，他认为基因型通过一些偶然的、不确定的机制决定了不同的表现型[1]；1987年Holliday 将这一表观遗传概念用于DNA 甲基化水平改变引起基因表达活性改变现象[2]；现代表观遗传是指在基因的DNA 序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可以遗传的表型。主要的表观遗传标记存在于染色体的不 同水平，包括DNA 和组蛋白修饰、组蛋白多样性、直接结合于DNA 或组蛋白上的染色体非组蛋白修饰、核内RNA(nuclear RNA, nRNA)、染色体高度有序的结构及位置效应等。其中，DNA 甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，参与许多生物过程，包括基因转录调控、转座子沉默、基因印记、X 染色体失活及癌症的发生发展等。本文主要综述DNA 甲基化/去甲基化机制及DNA 甲基化/去
DNA甲基化功能汇总
Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond DNA甲基化功能：岛，起始位点，基因体和其他 peter a. jones 摘要 DNA甲基化通常被描述为一个“沉默”的表观遗传标记，的确，5-甲基胞嘧啶的功能最初是在20世纪70年代提出。现在，归功于甲基化绘图的基因组规模的改良，我们可以评估在不同的基因组背景下的DNA甲基化：在基因体上，在调控元件和重复序列上，转录起始位点有或者没有CpG岛。新出现的图片是DNA甲基化功能似乎随背景而改变，DNA甲基化和转录的关系比我们最先认识到的更为微妙。有必要提高我们对DNA甲基化的功能的理解，为了解释这个疾病标记中观察到的变化，比如癌症。 两篇重要的文章在1975年分别表示胞嘧啶残基的甲基化在CpG二核苷酸背景中能作为表观遗传标记。这些文章提出序列可以被重新甲基化，即甲基化通过一种机制的体细胞分裂能够被遗传，包括一种能识别半甲基化CpG回文的酶，甲基基团的存在，可以由DNA结合蛋白和DNA甲基化直接沉默基因解释。虽然这些关键原则中的几个被证明是正确的，解开DNA甲基化与基因沉默的关系已被证明是具有挑战性的。 在CpG序列背景下，在动物身上的大部分工作都集中在5-甲基胞嘧啶（5mC）。据报道，在哺乳动物的其他序列的甲基化广泛分布在植物和一些真菌中。在哺乳动物中，非CpG甲基化的功能目前未知。在这里我主要集中在哺乳动物基因组中的CpG甲基化，包括在其他动物和植物中观察到的差异的讨论。 理解DNA甲基化的功能需要通过基因组考虑甲基化的分布。超过一半的基因脊椎动物的基因组包含短（约1 kb）CpG丰富的区域称为CpG岛（CGIS），其余的基因组因为CpGs而耗尽。当5mC通过自发或酶胸腺嘧啶脱氨基作用被转换成胸腺嘧啶，认为基因组的损失是由于甲基化的序列在种族中的脱氨基；认为CGI存在是因为他们可能是从来没有或只有瞬时甲基化。然而，有很多关于准确定义CGI是什么的讨论，虽然在
DNA甲基化
DNA甲基化概述 在哺乳动物基因组中，甲基化是一种表观遗传机制，包括将甲基转移到胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通过招募参与基因抑制的蛋白或通过抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达。在发育过程中，DNA甲基化的模式在基因组中发生变化，这是DNA从头甲基化和去甲基化的动态过程的结果。 DNA甲基化是被一个甲基转移酶家族所催化，转移S腺苷甲硫氨酸(SAM)的一个甲基到第五个碳胞嘧啶残基形成5mc , Dnmt3a和Dnmt3b可以建立一个新的DNA甲基化模式来去修饰DNA，被称为从头甲基化。另一方面，Dnmt1在DNA复制过程中起作用，将亲代DNA链上的甲基化模式复制到新合成的子链上。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。当细胞到达终末分化时，Dnmt的表达大大降低。这似乎表明有丝分裂后细胞的DNA甲基化模式是稳定的。 大部分DNA的甲基化发生在鸟嘌呤核苷酸或CpG位点之前的胞嘧啶上。总的来说，哺乳动物基因组中CpG位点的减少可能是由于5 - mc可脱氨成胸腺嘧啶的诱变潜力。剩余的CpG位点分布在整个基因组中，除了CpG岛外，它们都被严重甲基化。DNA甲基化对沉默逆转录病毒分子、调节组织特异性基因表达、基因印记和X染色体失活至关重要。不同基因组区域的DNA甲基化可能根据潜在的遗传序列对基因活动产生不同的影响。 一、DNA甲基化的位置 1.1 基因间区 大约45%的哺乳动物基因组由转座因子和病毒因子组成，这些因子被大量甲基化而沉默。这些元素中的绝大多数是通过DNA甲基化或随着时间的推移由于5mC的破坏而产生的突变而失活的。如果表达，这些元素是潜在的有害的，因为它们的复制和插入可以导致基因损坏和DNA突变。胞内颗粒(IAP)是小鼠基因组中最具侵袭性的逆转录病毒之一。在整个生命过程中，IAP在配子形成、发育和成年阶段都被高度甲基化。甚至在胚胎内部，当基因组其余部分相对低甲基化时，Dnmtl维持对IAP元件的抑制。当Dnmtl被基因突变耗尽，导致广泛的低甲基化时，IAP元素被表达。这表明，在基因间区，DNA甲基化的主要作用之一是抑制潜在有害基因元素的表达。 1.2 CpG岛 CpG岛是大约1000个碱基对长度的DNA延伸，它们的CpG密度比基因组的其他部分高，但通常不会甲基化。大多数基因启动子，大约70%，在CpG岛。特别是，管家基因的启动子常常嵌入到CpG岛。CpG岛，尤其是那些与启动子相关的基因在小鼠和人类之间高度保守。在整个进化过程中，CpG岛屿的位置和保存意味着这些区域具有重要的功能。 CpG岛通过调控染色质结构和转录因子的结合来促进基因表达。DNA有规律地包裹在组蛋白周围，形成被称为核小体的小段。DNA与组蛋白的联系越紧密，对基因表达的宽容程度就越低。CpG岛的一个共同特征是，它们比其他DNA片段包含更少的核团。与CpG 岛相关的少数核小体常含有组蛋白，其修饰涉及增强基因表达。尽管约50%的CpG岛包含已知的转录起始位点，但CpG岛往往缺乏常见的启动子元件，如TATA boxes 。由于许多转录因子结合位点富含GC, CpG岛可能会增强对转录起始位点的结合。CpG岛虽然缺乏共同的启动子元件，但却能增强DNA的可达性，促进转录因子的结合。 CpG岛的甲基化导致了稳定的基因表达沉默。在配子发生和胚胎早期发育期间，CpG 岛经历了差异甲基化。通过CpG岛调控基因表达的甲基化能力对建立很重要。印迹基因仅由两个遗传亲本染色体中的一个表达，它们的表达由遗传亲本决定。除了印迹基因外，CpG
DNA甲基化
DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。 近15年来，人们越来越认识到DNA甲基化研究的重要性，开发出一系列检测DNA的方法。根据研究目的这些方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。 DNA甲基化的分析方法很多，可分为总基因组甲基化的检测和单基因序列特异性甲基化分析的研究。总基因组甲基化的检测又分为全基因组序列特异性甲基化分析和基因组非特异性甲基化水平的研究。前者包括甲基化差异性杂交显示(differential methylation hybridization，DMH)、寡核苷酸微阵列法和基因组限制性酶切扫描法(restriction landmarkgenomescanning，RLGS)；后者包括3H—SAM掺人后液闪检测法和高压液相色谱法。 对单基因序列特异性甲基化分析包括传统的甲基化敏感的限制性内切酶(methylation sensitive restriction endonucleases，MSREs)分析、比较简洁的甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)、全面反映甲基化情况的亚硫酸氢钠变性后测序(bisulfitegenomic sequencing)、甲基化敏感性单核苷酸引物扩增(methylation sensitive single nucleotide primer extension，Ms—SnuPE)、较新颖的甲基化荧光检测(methylight)、结合亚硫酸氢钠变性的限制性酶分析(combined bisulfite restrictionan alysis，COBRA)、酶的区域性甲基化特异性分析(enzymatic regional methylation assay，ERMA)和变性高压液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)。 甲基化敏感的单核苷酸的扩增(Ms—SnuPE) Ms—SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。 先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms—SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms—SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。这样，如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端；若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C／T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况。 甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)法 methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶，目前至少已发现320种。此类酶如在其切割位点中含有一个甲基化碱基，则它们中的绝大多数就不能切割DNA。MSRE法是基于甲基化敏感Ⅱ型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理。用甲基敏感Ⅱ型内切酶及其同工酶(对甲基化不敏感)切割含有一个或多个甲基化CpG序列的片段，然后用DNA印迹法分析。此法
DNA甲基化实验操作原理及方法-Hxg
DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION） 实验操作原理及方法 一、实验目的： 通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。 二、实验原理： DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。 DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。 重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。 BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
DNA甲基化的总结
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下,将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域,在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系,例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女性侵袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默,基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8],都会导致细胞癌变。 甲基化作用是转录水平上表达调控的基本方式之一。由于宿主细胞基因组DNA中不 同位点的甲基化程度存在某种平衡，并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征，破坏后的结构便成为宿主基因组防御系统识别的信号，使新整合的DNA 序列发生不同程度的甲基化，甲基化基因序列则通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MeCP2)的结合而抑制转录的顺利进行Ⅲo。在拟南芥中发现了DNA甲基化可以导致基因沉默汹埘]。在基因沉默过程中，外源或内源性信号引起部分DNA序列中CpG的甲基化，甲基化CpG结合域蛋白2(MeCP2)结合到甲基化的胞嘧啶上聚集HDACs使组蛋白去乙酰化，该蛋白与去乙酰化的组蛋白通过聚集更多的DNA 甲基转移酶来加强沉默信号，从而引起基因沉默H?。 ?。DNA甲基化对染色质结构和基因表达的作用很可能是通过一组蛋白介导的，这些蛋白可能含有共同的高度保守的甲基化的CpG结合结构域(MBD)L45 J。DNA甲基化在基因印记、x染色体失活、某些疾病的发生发展中发挥重要作用。其直接作用机制可能是CpG岛甲基化干扰了一些转录因子(transcription factor，TF)与基因调控区的结合，使甲基从DNA分子大沟中突出，从而阻止转录 因子与基因相互作用。间接机制可能是由于甲基化DNA与甲基化DNA结合蛋白结合或DNA甲基化改变染色质结构，这2种情况都间接阻碍TF与DNA结合从而抑制转录m1。DNA甲基化一般是通过转录抑制机制来调节特定基因的，具体的机制可能有：5一MeC伸入DNA双螺旋大沟，影响转录因子的结合；序列特异的甲基化DNA结合蛋白(MDBP一1，MDBP一2)与甲基化的启动子序列特异性结合而抑制转录因子与靶序列的结合；甲基化CpG结合蛋白(MeCPl，MeCP2)与甲基化的二核苷酸CpG结合，发挥类似转录抑制蛋白的作用H“。一般DNA甲基化会通过干扰转录因子与识别位点结合和招募组蛋白乙酰转移酶(histon acefltransfeI"SeS，HATs)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)形成辅助阻遏复合体，使基因沉默而抑制其表达，而去甲基化则使沉默的基因重新激活Ⅲ卜 ＤＮＡ甲基化尤其是基因启动子区ＣｐＧ岛的高甲基化，会导致基因表达的下降或沉默。甲基化抑制基因的表达目前认为要有两个方面，一方面甲基化引起的基因结构改变可直接阻碍一些转录因子与其结合位的结合；另一方面可能与一些甲基化
DNA甲基化研究综述
DNA甲基化研究综述 The summarize of the research on DNA methylation 郭文媛 （生物技术 1353227） 摘要：DNA 甲基化是真核生物表观遗传学中一种重要的基因表达调控方式，是一种酶催化的修饰过程。其是在DNA 甲基转移酶催化下，将甲基基团转移到胞嘧啶的5 位碳原子上，使之转变成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程。在人类和其他哺乳动物中，此修饰过程通常发生在5'-CpG-'二核苷酸的胞嘧啶上。大量相关研究表明，DNA 甲基化与人类疾病密切相关。 Abstract:DNA methylation is an important epigenetic regulation of gene expression in eukaryotes．It is a kind of enzyme catalysis modification process: refers to the chemical modification process of DNA methyltransferase catalysis，the transfer of methyl groups onto cytosine carbon atom 5，making them into 5-methyl cytosine．In humans and other mammals，the modification process usually occurs in 5＇CpG -＇dinucleotide cytosine．A large number of relevant studies have shown that DNA methylation is closely related to human diseases． 关键词: DNA 甲基化; 甲基转移酶;表观遗传学; CpG 岛; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b; 基因沉默; DNA甲基化结合蛋白; 人类表观基因组计划 Key words:DNA methylation; Methyltransferase; Epigenetics; CpG island; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b ; Gene Silencing ;MBD; human epigenomeproject 表观遗传学研究的是不改变DNA 的一级结构而改变表型的一种基因表达调控机制，主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色体重构、RNA 干扰等。 DNA甲基化是重要的表观遗传修饰之一，在大多数真核生物中广泛存在。DNA 甲基化水平受到环境、疾病、年龄和性别等因素的影响，处于动态的变化过程中。不同的细胞、组织或个体之间，甚至同一细胞或个体的不同发育时期，其DNA 甲基化状态和程度都可能存有差异。 2003 年10 月，人类表观基因组计划委员会正式宣布投资和启动人类表观基因组计划( human epigenomeproject，HEP) 。HEP 的主要目标是研究人类所有基因在主要组织以及200 多种细胞中正常和疾病状态下的甲基化模式，并在基因组水平绘制不同组织正常和疾病状态时的甲基化变异位点图谱[4]，本文结合2013年至今DNA甲基化研究文献，综述了DNA甲基化分布特点和与疾病关系等方面的研究情况。 1.DNA甲基化 1.1DNA甲基化与DNA去甲基化 DNA 甲基化是表观遗传( Epigenetic) 的一种重要表现方式，指在DNA 甲基转移酶( DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s －腺苷甲硫氨酸( SAM) 为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。 DNA 去甲基化也被称为DNA 甲基化丢失(lossof DNA methylation), 即甲基基团从胞嘧 啶上消失的过程。包含主动去甲基化与被动去甲基化2 种模式。 1.2DNA甲基化分布 DNA 甲基化在生物体内的分布并不是随机的，而是呈现一定的规律性。
DNA甲基化原理
DNA甲基化 甲基化检测服务-亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite genomic sequencing PCR, BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠发生脱氨基变为尿嘧啶的原理，用两一特异性引物扩增后测序。测序法克服了只能针对单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测。 甲基特异性的PCR扩增（MS-PCR）示意图 DNA甲基化（英语：DNA methylation） DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。为外遗传编码（epigenetic code）的一部分，是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上：这种5'方向的DNA甲基化方式可见於所有脊椎动物。在人类细胞内，大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生於CpG双核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化则於胚胎干细胞中较为常见。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG（或CpNpG），或是不对称的CpNpNp形式（C与G是碱基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。特定胞嘧碇受甲基化的情形，可利用亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing）方式测定。DNA甲基化可能使基因沉默化，进而使其失去功能。此外，也有一些生物体内不存在DNA甲基化作用。
DNA甲基化详解
提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT 这四种碱基的排列顺序中。然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为
表观遗传学 DNA主动去甲基化的Science之路
表观遗传学 DNA主动去甲基化的Science之路 (中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海 200031) 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)被认为是哺乳动物基因组中除腺嘌呤(adenine)、胸腺嘧啶(thymine)、胞嘧啶(cytosine)及鸟嘌呤(guanine)之外的第五种碱基。它与染色质的另外一种重要组分组蛋白及其翻译后修饰的组合决定了特定基因组区域染色质的结构及基因转录活性，从而形成了一层叠加于碱基序列上的表观遗传信息。胞嘧啶甲基化，也称为DNA甲基化，参与了诸多生物学过程，包括基因印迹、X染色体的失活、基因组稳定性的维持、转座子及逆转录转座子的沉默及组织特异性基因的沉默等[1-2]。 在哺乳动物的个体发育中，DNA甲基化谱式主要经历了两次大规模的重编程过程，一次发生在从受精至着床的早期胚胎发育时期，另一次发生在配子发生过程中[3-4]。这两次重编程都涉及了基因组范围的主动去甲基化反应(global demethylation)。相对于基因组范围内的大规模主动去甲基化，在体细胞中会发生局部的、高度位点特异性的主动去甲基化[5-6]。DNA的去甲基化与DNA甲基化这两个过程相互平衡，维持了DNA甲基化谱式的稳定。任何一方的失调都会导致DNA甲基化谱式的紊乱，进而引起多种神经退行性疾病、免疫系统疾病以及癌症[7-8]。特别是两次基因组范围的主动去甲基化事件对于生命的起始以及生命的传承具有非常重要的意义。 DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase)催化完成，那DNA去甲基化是如何完成的呢？也存在类似于DNA甲基转移酶的DNA去甲基化酶(DNA demethylase)，抑或是其他的机制呢？就此，著名的华人生物学家、美国科学院院士朱健康教授在一篇综述中提出以下几种DNA去甲基化的可能方式(图1) [5]。(1)存在特异性识别并切除5mC的糖苷酶(glycosylase)，切除5mC产生AP 位点(apurinic/apyrimidinic site)，进而启动碱基切除修复途径(base excision repair, BER)，用没有修饰的胞嘧啶取代原有的甲基胞嘧啶，最终完成DNA的去甲基化。(2)存在特异性识别5mC的脱氨酶(deaminase)，通过脱氨作用将5mC转变成胸腺嘧啶，形成G/T错配。进而由识别G/T错配的糖苷酶，如TDG、MBD4等，启动BER途径，完成DNA的去甲基化。(3)通过核苷酸切除修复途径(nucleotide excision repair, NER)切除含有5mC的一段DNA，并用含有未修饰胞嘧啶的同样序列进行替换，进而完成DNA的去甲基化。(4)通过氧化作用将甲基基团氧化成羧基基团，再通过脱羧作用完成DNA去甲基化。 (5)通过水解作用直接将甲基基团去掉。朱健康教授实验室发现在拟南芥中存在着一种由DNA 糖苷酶(DME、DML2、DML3和ROS1等)介导的主动去甲基化机制。ROS1等可以切除5-甲基胞嘧啶，启动碱基切除-修复途径(base excision repair, BER)完成DNA去甲基化[5]。但在哺乳动物中并没有鉴定到这
DNA甲基化综述
分子生物学综述 题目：DNA甲基化的研究方法与技术姓名： 班级： 学号：
摘要：DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。 关键字：表观遗传学；DNA甲基化；甲基化研究方法 1 导言 早在1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R. Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断，也就是人们现在比较统一的认识[1]，即在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA甲基化最为常见。其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱，即不同组织与疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱，以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用[2]。DNA甲基化的研究，逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。让我一一介绍现有的大部分DNA甲基化研究方法，并对其相关特性进行简要分析与总结。
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的 表达[3]。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体[4]。 1.2 DNA 甲基化的生物学作用 1.2.1 DNA 甲基化与遗传印记、胚胎发育 DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（Li 等1992年和Okano等1999年）[3]。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions,ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的[4]。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等[5]。
DNA甲基化
人类基因组单体型图细胞株中与遗传和基因表达变化有关的DNA甲基化模型 摘要 背景：DNA甲基化是参与基因调控和疾病的一种重要表观遗传学机制，但很 少人知道在个体间甲基化机制存在差异。在这，我们从77个图约鲁巴人的人类基因组单体中测量了22,290 CpG二核苷酸的淋巴母细胞系的甲基化水平，同时也使用了全基因组的基因表达和基因型数据。 结果：通过对超过三百万常见的单核苷酸多态性（SNP）位点的甲基化水平关联的分析，我们确定在173个基因的180个CpG双核苷酸位点与附近的单核苷酸多态性（独联体通常在5 KB内）的错误发现率为10％。在迪斯科相互 作用蛋白2的同源基因B（DIP2B，以前推测在DNA甲基化中发挥作用）中发现SNP rs10876043是最有趣的传输信号，全基因范围内的信号与第一组分的甲基化模式是有联系的。而且我们发现在整体信号联系中只有少量的反式作用。正如预期的那样，通过测量的RNA序列，我们发现基因的启动子甲基化和基因表达水平呈负相关关系。最后，发现有一个显着的SNP位点重叠，均与甲基化与基因的表达水平有关。 结论：我们的研究结果显示在个体间的差异在DNA甲基化方面有很强的遗传成 分。此外，丰富的单核苷酸多态性会影响甲基化和基因表达，为共享机制的一小部分的基因提供了证据。 背景：D NA甲基化在真核生物的基因组起着重要的调节作用。甲基化的改变可以影响转录和表型的变化[1]，但DNA甲基化本身的变化根源，现在仍然知之甚少。大量证据确实存在DNA甲基化的个体差异随着年龄的增长[2,3]，组织[4,5]，物种[6]。在哺乳动物中，DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶（转移酶）介导的，是在复制过程中负责重新甲基化和维持甲基化模式。参与合成的甲基化和DNA去甲基化的基因也可以影响甲基化的变化。例如，突变的甲基转移酶DNMT3L[7]和亚甲基四氢酸还原酶MTHFR[8]基因可导致人的血液中DNA低甲基化。这些变化发生在全基因组水平，与遗传变异是不同的，而是有针对性的对基因组区域影响DNA甲基化变异，例如，在H19/IGF2位点的差异性甲基化与遗传多态性有关9]。 最近的证据表明，DNA甲基化的依赖所在基因的序列含量[10?12]。在对家庭与双胞胎甲基化模式的研究中发现有很强的遗传效应，但随机因素和环境因素也有可能发挥重要作用2,14]。最近的工作表明，基因变异可能对所在的甲基化模式有重大影响[5,15-18]，但影响甲基化的遗传变异是何种程度，机制尚不清楚。此外，在DNA甲基化变化的基础上对个体基因表达影响到何种程度，仍然是未知之数。
DNA甲基化和去甲基化的研究现状及思考_邓大君
Hereditas (Beijing) 2014年5月, 36(5): 403―410 https://www.sodocs.net/doc/9b11869735.html, 综 述 收稿日期: 2014-01-07; 修回日期: 2014-01-27 基金项目:国家自然科学基金项目(编号：30921140311，31261140372)资助 作者简介:邓大君，教授，研究方向：肿瘤病因学和DNA 甲基化研究。E-mail ：dengdajun@https://www.sodocs.net/doc/9b11869735.html, DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0403 网络出版时间: 2014-3-3 12:41:25 URL: https://www.sodocs.net/doc/9b11869735.html,/kcms/detail/11.1913.R.20140303.1241.001.html DNA 甲基化和去甲基化的研究现状及思考 邓大君 北京大学肿瘤医院／研究所, 北京 100142 摘要: DNA 甲基化通过调节基因转录、印记、X 染色体灭活和防御外源性遗传物质入侵等, 在细胞分化、胚胎 发育、环境适应和疾病发生发展上发挥重要作用, 是当前表观遗传学研究的热点领域之一。文章介绍了在过去几年中TET 介导的DNA 羟甲基化及其在早期胚胎发育中的作用, DNA 主动去甲基化及其与被动去甲基化的关系, DNA 甲基化建立及其与组蛋白修饰、染色质构象、多梳蛋白和非编码RNA 结合等关系方面的重要研究进展和存在的问题以及DNA 甲基化的转化应用前景。 关键词: DNA 甲基化; 去甲基化; 表观遗传学; 稳态; 转化研究 DNA methylation and demethylation: current status and future per-spective Dajun Deng Peking University Cancer Hospital and Institute , Beijing 100142, China Abstract: DNA methylation plays important roles in cell differentiation, embryonic development, host adaptations to environmental factors, and pathogenesis through regulation of gene transcription and imprinting, X-inactivation, and de-fense of foreign genetic material invasion, is currently one of the hottest research fields on epigenetics. In the past few years, a number of important findings on DNA methylation have been achieved. These findings include discovery of TETs-catalyzed cytosine hydroxymethylation and its functions in the early embryonic development; the relationship be-tween active and passive DNA demethylation; establishment and maintenance of DNA methylation patterns and their asso-ciations with histone modifications, chromatin configuration, polycomb group proteins and non-coding RNA bindings. DNA methylation has become a new potential biomarker and therapy target. Keywords: DNA methylation; demethylation; epigenetics; homeostasis; translational research DNA 甲基化是指DNA 序列中的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)碱基在甲基化转移酶的催化下与甲基发生共价结合, 可在细胞分裂过程中传递给子细胞的表 观遗传现象。由DNA 腺嘌呤甲基化酶(DNA adenine methylase, DAM)催化形成的O 6-甲基腺嘌呤(6mA)是一种CTAG 序列复制后维持甲基化, 在细菌表观