DNA甲基化功能
Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond DNA甲基化功能：岛，起始位点，基因体和其他
peter a. jones
摘要 DNA甲基化通常被描述为一个“沉默”的表观遗传标记，的确，5-甲基胞嘧啶的功能最初是在20世纪70年代提出。现在，归功于甲基化绘图的基因组规模的改良，我们可以评估在不同的基因组背景下的DNA甲基化：在基因体上，在调控元件和重复序列上，转录起始位点有或者没有CpG岛。新出现的图片是DNA甲基化功能似乎随背景而改变，DNA甲基化和转录的关系比我们最先认识到的更为微妙。有必要提高我们对DNA甲基化的功能的理解，为了解释这个疾病标记中观察到的变化，比如癌症。
两篇重要的文章在1975年分别表示胞嘧啶残基的甲基化在CpG二核苷酸背景中能作为表观遗传标记。这些文章提出序列可以被重新甲基化，即甲基化通过一种机制的体细胞分裂能够被遗传，包括一种能识别半甲基化CpG回文的酶，甲基基团的存在，可以由DNA结合蛋白和DNA甲基化直接沉默基因解释。虽然这些关键原则中的几个被证明是正确的，解开DNA甲基化与基因沉默的关系已被证明是具有挑战性的。
在CpG序列背景下，在动物身上的大部分工作都集中在5-甲基胞嘧啶（5mC）。据报道，在哺乳动物的其他序列的甲基化广泛分布在植物和一些真菌中。在哺乳动物中，非CpG甲基化的功能目前未知。在这里我主要集中在哺乳动物基因组中的CpG甲基化，包括在其他动物和植物中观察到的差异的讨论。
理解DNA甲基化的功能需要通过基因组考虑甲基化的分布。超过一半的基因脊椎动物的基因组包含短（约1 kb）CpG丰富的区域称为CpG岛（CGIS），其余的基因组因为CpGs而耗尽。当5mC通过自发或酶胸腺嘧啶脱氨基作用被转换成胸腺嘧啶，认为基因组的损失是由于甲基化的序列在种族中的脱氨基；认为CGI存在是因为他们可能是从来没有或只有瞬时甲基化。然而，有很多关于准确定义CGI是什么的讨论，虽然在
哺乳动物基因组中的启动子的CpG密度有双峰分布，有中等CpG密度存在的区域。直到最近，很多对DNA甲基化的研究集中在CGIs转录起始位点（TSSs），正是这种工作这往往塑造了对DNA甲基化功能的广泛认同。
基因组甲基化研究的最新方法（图1）-例如，使用亚硫酸氢盐处理DNA（它能检测到5mC和羟甲基胞嘧啶；见图1）-强调的是甲基化在转录单位中的位置，影响其与基因控制的关系。例如,在TSS区附近的甲基化开始，但是在基因体中的甲基化不堵塞，甚至可能刺激转录延伸，和令人兴奋的新的证据表明，基因体的甲基化可能对剪接有影响。如着丝粒重复区域的甲基化对染色体稳定性很重要（例如，在有丝分裂中的染色体分离），也有可能抑制转座因子的表达从而有一个基因组稳定性的作用。在改变增强子、绝缘子和其他调控原件的活性方面，甲基化的作用才开始受到重视。
然而虽然有很多在TSSs上的甲基化的CpGs 与一些沉默基因有联系的证据，重新甲基化和基因沉默的时间现在开始得到阐明。
DNA甲基化的功能本质上链接到建立、维护和移除甲基组的机制上，这些机制到处可见，但是一些关键点需要铭记在心。它已经知道很多年，DNA甲基转移酶，包括所谓的DNA重新甲基化转移酶Dnmt3a和Dnmt3b，是早期发展建立的DNA甲基化模式的本质。我们弄明白这是如何发生的有很大的帮助，在某些情况下，核小体DNA是重新甲基化酶的底物。基底的重新甲基化，核小体内的组蛋白修饰深刻地影响这些酶诱导从头甲基化能力。这是以前认为的存在本身能维持建立DNA甲基化的模式，但现在我们知道这是不真实的， DNMT3A和DNMT3B持续的参与是对甲基化的维。三个DNMTs 中的每一个都是胚胎或新生儿的成长所必需的，完全缺乏的甲基化与体细胞或者癌细胞的发育能力是不相容的，但不是胚胎干细胞（ESCs）17。DNMT3A最近已被证明对造血干细胞的分化很重要，又指着5mC在脊椎动物分化的基础。关于基因沉默重新甲基
化的时间，又进入一个的范围。提出直接作为riggs2和霍利迪和pugh1不可能是基因沉默的主要途径。
被动或主动删除5mC意味着建立后续基因表达能接受的状态。DNA去甲基化酶的研究已经很长时间了，已经充满了许多失败的开始，但现在更广泛接受的是去甲基化酶的存在。最近，大量的文献表明，主动去甲基化是可以实现的，虽然这需要一种机制，最终涉及细胞分化或者DNA修复和碱基的切除而不是甲基群直接从5mc 组成成分中移除。比如（TET）甲基胞嘧啶双加氧酶参与，活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶（AID）和胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）活性和被甲基化和在基因中的激活现在已经阐明。事实上， TET3的缺乏导致脱甲基CpG位点在关键基因的失败比如Oct4（也称为Pou5f1）或在父亲基因组上的Nanog和延误胚胎发育。
DNA甲基化的改变是现在已知的遗传事件和包括在人类致癌中。因此，了解DNA 甲基化的作用对于理解生病过程是必不可少的。在本文中，我对背景中无关紧要的基因组中的DNA甲基化的功能进行了评估，与特定的重点与转录的关系（已知和未知的重点总结在表2）。然后我介绍了可能的机制，DNA甲基化可能用到，例如，通过改变蛋白结合，我思考了剩下的问题。
在转录起始位点
模式在 CpG岛的转录起始位点。大多数的CGIs维持了体细胞中的非甲基化。当有CGIs的基因在TSS是活跃的，它们的启动子通常有在TSS上的NDRs表示的特征，而这些NDRs通常是两侧的含有组蛋白变体H2A. Z的核小体。是用在赖氨酸 4（H3K4me3）上的组蛋白H3标记的。基因表达的水平被转录因子控制。CGI的启动子被抑制有不同的机理，比如由多梳蛋白调节的启动子。例如，胚胎发育的主要调节基因编码被在ESCs和分化的细胞里的不能表达这些基因的多梳蛋白抑制，如肌源性的
分化1（MyoD1）或者修补盒6（Pax6），他们有在TSS上的核小体和被H3K27me3标记，和失活的基因有关系。
然而，一些被抑制的基因使启动子CGIS甲基化。启动子CGISs的甲基化通常限制抑制状态的长期稳定的基因。例子包括印记基因，位于失活的X染色体基因与专门表达生殖细胞的基因和假设在体细胞中表达不合适的基因。能持续100多年寿命CGIs的DNA甲基化抑制的稳定性对CGIs的生存无影响。因为在体细胞中的这些区域中任何脱氨基事件不会传递种系给后代。我们仍然没有完全弄明白为什么少数CpG岛甲基化，而不是大多数。
在非CpG岛的TSS的模式。和他们的TSSs上的有CGIs基因相比，在TSS上CpG很弱的基因是大幅波动发生在启动子甲基化水平的基因。非CGI TSS的基因在原始生殖细胞基因中表达的是在TSS上的非甲基化，因此在ESCs上专门表达的基因或者在精子细胞的组织特异性基因经常显示甲基化而不是在卵母细胞或者体细胞中表达。众所周知的例子是Oct4和Nanog基因编码的转录因子，维持干细胞状态是必不可少的。最近的研究表明，Oct4 和NANOG启动子可能被AID和/或者TET3活化甲基化。然而，一些组织特异性的基因在精子和ESCs中显示甲基化，仅仅显示在被表达的基因中特异性组织的脱甲基化。
一个全基因组研究假定在非CGIs和表达之间的甲基化没有相反的关系存在，但是数据的再分析表明表达和甲基化之间的这种关系事实上显然是全基因组。由于长期关注CGIs，我们仍然不知道在控制非CGI TSS甲基化作用的细节。
甲基化转录起始沉默吗？
在上面描述的一些抑制的TSS甲基化观察， DNA甲基化和转录起始之间的功能关系是什么？有确凿的证据，在TSSs的CGIs甲基化在DNA装配进核小体后不能启动转
录。然而，是沉默还是甲基化的问题在这个领域首先就进行了长时间的讨论。洛克等人的早期实验。清楚地表明，失活的X染色体上的Hprt基因的甲基化发生在染色体灭活之后。换句话说，甲基化似乎是“锁定”加强先前沉默状态的X连锁基因。虽然在常染色体基因上的大多数的 CGIs在体细胞上保持非甲基化，少数（＜10%）在正常组织和细胞中甲基化，但关于沉默的重新甲基化方面的期限没有深入的研究。如上所述，最近发现DNMT3的作用对造血干细胞分化的提高怀疑长期“锁定”模型普遍性。由于作者的研究结果表明，甲基化酶对相当短命的细胞类型分化非常重要，看来可能是DNA甲基化在启动时有一个更有指导意义而不是加强沉默。
然而，在癌细胞的基因组范围研究，表明被多梳蛋白复合物沉默的CGI的启动子基因比在癌症中的其他基因更可能甲基化：即甲基化之前的沉默状态。因此，似乎沉默之前的甲基化是一般机制，但数据尚未成熟到肯定的程度。除了改变自己在CpG岛，组织特异性的改变发生在它们周围的边上。然而，对这些变化还不了解。关于DNA甲基化的期限的证据有一致的想法，甲基化增加了一个表观遗传状态的稳定性水平。
有趣的是，它不是要求在一些物种中为达到这个目的，包括黑腹果蝇和酵母。
转录和重新甲基化之间的关系。DNA甲基化可能不作为一个初始的沉默机制的原因正开始被理解。欧意等人的开创性工作表明，细胞表达DNMT3L中的重新甲基化过程（这是一个有活性的同源DNMT3A和DNMT3B的催化剂）是通过DNMT3A2和DNMT3L 的每一个两个分子的四聚体复合物完成的，还需要一个核小体。活跃的TSS是废弃的核小体和因此缺乏重新甲基化的底物。最近，我们通过测试在胚胎中用维甲酸诱导癌细胞分化OCT4沉默的动力学来直接测试了启动重新甲基化的核小体的作用。这些实验表明，在Oct4的远端增强子和Nanog启动子上，分化后，第一个核小体出现了，
然后核小体被新生成的DNMT3A跟随，随后，重新甲基化发生了。在不表达DNMT3L的
细胞中是否有一个事件的相
似序列发生尚未知晓。
此外，Ooi等人研究表明
重新甲基化不能发生在一个
与活性基因相关联的接受
H3K4me2或者H3K4me2标记的
核小体上。核小体侧翼废弃
核小体启动子通常包含的标
记H3K4m组蛋白和变体H2A 组蛋白。两者都与DNA甲基化强烈的反相关。在小鼠的h3k4me3mark的发生可能通过CXXC（cxxc1；也被称为cfp1）手指蛋白1保持，重新生成的H3K4甲基转移酶的标记和重新甲基化不相容。CpG岛的未甲基化的状态也可能来保证TET1蛋白的存在，这个是在一个TSS的高比例的CpG含量高的启动子中发现的。据推测，Tet1使任何在这个区域可能变成5-羟甲基胞嘧啶的5mC转变。有活性的CGIs分子结构因此可以解释为什么他们可以抵抗甲基化。
当然，并不是所有的CGI的启动子基因在胚胎干细胞中表达，和许多被多梳复合物抑制，因此为什么这些不重新甲基化？答案可能就在于他们包含对抗性的H3K4me3的事实（参考文献和H2A），也势必受到Tet1束缚，这将确保他们保持5mC-自由。有趣的是，这种保护似乎在永生化期间被打破，这些CGIs变成非常容易受到重新甲基化影响，致癌基因转化后甲基化增高。
该模型预测，较高水平的表达，一个CGI变成重新甲基化不太可能。支持这个预测的直接证据最近来自几个激动人心的论文表明，CGIS的单等位基因甲基化优先发生在少于高表达的等位基因上。例如，Hitchins等人。研究表明MLH1基因的一个等位基因包含一个启动子的单核苷酸变异等位基因，转染实验中的这个启动子比普通等位基因活性更低，更可能使癌症影响得家族体细胞甲基化。换句话说，不活跃的等位基因也更容易获得重新甲基化。另一种情况下，是由boumber等人研究的。他们发现没有多态性的等位基因比创造了另外的转录因子Sp1结合位点或者sp3的启动子多态性的RIL的等位基因（也称为Pdlim4）更容易甲基化。因此，额外的sp1位点赋予了该等位基因重新甲基化的阻力，虽然作者不能显示额外的转录因子结合位点增强的基因表达。
基因体甲基化
大多数的基因体是弱CpG ，基因体甲基化是广泛的甲基化，包含多个重复和可换位的成分。在基因外显子上的CpG位点甲基化是C→T转换突变的主要原因，在生殖细胞肿瘤引起疾病突变和在体细胞中导致致癌突变。重要的是认识到，虽然许多CGI 是位于基因的启动子上，CGIs也在基因体细胞和基因沙漠上存在。虽然他们的功能在这里仍然不明，Adrian Bird认为这些地区代表“孤儿启动子”。可以用在发展的早期阶段和甲基化在生殖细胞逃脱以便他们保持 CpG的高密度。
基因体甲基化与抑制不相关。从早期的DNA甲基化研究中知道基因体的甲基化是基因转录的一个特点。有活性的转录和基因体甲基化之间的广泛的正相关的关系，最近被证实在有活性的X染色体上和通过鸟枪法用亚硫酸盐对植物和动物基因组测序。大多数基因体不是CGIs，当没有杂质的CGIs位于基因内的区域，认为他们保持非甲基化。然而，最近的实验改变这种看法：例如，在人脑中，有34%的CGI片段是
甲基化的。这种甲基化的作用是否是组织特异性，目前还不清楚。这是耐人寻味的，特别是因为TSSs在很大程度上仍然没有甲基化。癌症的甲基化，基因内的 CGIs也可以是优先的位点。
即使基因本体CGIS可以广泛的甲基化，
这不会阻止转录的延伸。尽管这是事实，甲
基化的SGIs被H3K9me3标记和被甲基-CpG-
结合蛋白束缚，当他们在TSS上的时候，甲
基-CpG-结合蛋白是和抑制转录相关的染色
质的特征。这导致一个明显的悖论，在启动
子的甲基化与表达呈负相关，而在基因体甲
基化表达呈正相关。因此，在哺乳动物中，
它是转录的起始，而不是对DNA甲基化沉默
敏感的转录的延伸。相比之下，CpG上胞嘧啶
甲基化和其他序列的背景下霉菌的延伸而不
是开始。因此，它不仅是一个存在5mC标志
本身存在，而是管理它的转录关系而不是解
释特定基因组和细胞背景的标志。
基因体甲基化的可能功能。在CGIs外的基因体甲基化功能是什么？最初，人们认为这是沉默的重复的DNA成分甲基化的主要机制，如逆转录病毒、线元素，Alu元素等，已得到证据来证实这种观点。这些元素甲基化块开始转录的同时允许宿主基因的转录贯穿他们。它也被提出，转录衍射的过程本身可能自身刺激了DNA甲基化和，和延伸相关而不是开始的H3K36me3可能包括在DNMTs的生成中。然而，全基因组研
究表明，在基因体中对DNA甲基化的还有其他的功能。这项研究表明，外显子比内含子更高度甲基化，发生在外显子–内含子边界的甲基化程度的转录可能表明了在调节剪切中甲基化的一个功能。事实上，全基因组核小体定位数据也表明，与内含子相比核小体的占有水平提高了，核小体是DNA甲基化的优先位点。最近的一项研究表明，CTCF结合（可通过DNA甲基化调节，见下面）在RNA聚合酶2(RNAP2)暂停时发生。当RNAP2的运动动力学影响剪接时，这可能使DNA甲基化与剪切相连。这些研究表明之前没有认识到DNA甲基化在转录中的作用，可能导致替代剪接。因此，看起来最可能是在基因体的DNA甲基化使结果超出在基因内的重复DNA序列的沉默中已经认识到的功能。
什么时候是一个基因体的起始位点？人们常常假设TSSs和基因体是两个独立的基因组特征。然而，大多数基因至少有两个TSSs，所以下游的起始位点在上游启动子的转录单位内。这些可供选择的启动子可能是CGIs或非CGI，或者可能是上游非CGI 和下游的CGI的联合体，反之亦然。这些可选择的起始位点使表达和甲基化相联系的实验的解释更复杂，因为测量表达的探针经常检测到外放的启动子，但在给定的细胞类型中可能只有一个有活性。下游启动子的甲基化阻止转录，它将从上游启动子体现出来，允许转录的延伸。事实上，DNA甲基化可能对控制可选择的启动子的用途是一个有益的机理。
其他调控位点
在增强子中的甲基化。增强子和启动子之间的距离是可变的，是发展和功能中控制基因表达的关键。他们大多是弱CpG，他们的甲基化状态被全甲基化谱分析（在植物和哺乳动物中）在一般情况下，这些区域往往有相当变量的甲基化。事实上，在此基础上斯塔德勒等人鉴定了在小鼠基因组的增强子，它们不是100%的甲基化或未甲
基化区域，而是称为低甲基化区域（LMRS）。因为一个被给定的胞嘧啶要么是完全甲基化，要么是未甲基化，可变甲基化是这些二进制状态的平均结果。这可能表明，CpG 位点是在一个动态的状态，在给定的时间有的甲基化和其他没有甲基化，归因于竞争的甲基化和反甲基化事件。另外，每一个CpG的DNA甲基化状态在细胞分化期间可能不会精确地保持，所以LMR状态可能是由于低效的继承。在不同的T细胞亚群、Schmidl 等子集中。在不同的特定基因的增强子内，也发现了大量的有差别的甲基化区域（DMRS）。在功能方面，这项研究表明，这些CpG 位点甲基化可能导致降低增强子在报告者实验中的活性。
一个增强子甲基化状态和功能是密切相关的观点得到了在这些区域中调整甲基化的几个观察蛋白的支持。例如，对糖皮质激素受体连接远端调控元件的结合分析表明，CpG能去甲基化，增强子可能因为这个受体的存在而有活性。 25年前saluz等人最先报道了相似的发现。他们证明了重叠的雌二醇的反甲基化和用雌二醇处理的公鸡的糖皮质激素受体结合位点。此外，5-羟甲基胞嘧啶和 TET蛋白在这些成分中可以检测到。然而，CpG甲基化和转录因子结合关系是复杂的（见下文），所以我们理解包含在这些调控区域中的弱CpG增强子甲基化的机理之前，我们还有很长的路要走。
绝缘子的甲基化。绝缘子可以定义为阻止增强子和启动子之间相互活动的元素。大多数研究的例子是被CTCF蛋白束缚的DNA序列，CTCF蛋白结合到某一个异构的基序。一个案例是 CFCF结合到IGF2-H19核心的印记，其中， CTCF结合控制增强子和启动子相互影响的存在与否。它已经表明，一个 CTCF结合位点的甲基化在这个CTCF 的结合的快轨迹中，所以DNA甲基化具有控制核心的重要作用。最近的研究同样表明，CTCF结合到基因编码CD45的外显子上是被DNA甲基化遗传的，从而影响剪切。然而，全球研究小鼠胚胎干细胞和分化细胞表明CTCF结合在弱CpG区域内基本不被甲基化
结合位点的影响。但是结合了自身开始的本地去甲基化。因此，可能没有对CTCF位点甲基化影响的普遍规律（这倾向于退化）和结合？在这方面，需要注意的是，有七个潜在的CTCF结合位点在人类的H19启动子，其中只有一个显示了不同的父母起源甲基化。
可能的机理
被DNA甲基化保持在一个稳定的抑制状态的有活性的CGI启动子的这个机理很好理解，也得到了广泛的认可。甲基化的启动子使核小体在TSS上，甲基化的DNA粘合蛋白加固了TSS,TSS产生了抑制H3K9me3标记和甲基化的DNA粘合蛋白依次生成了组蛋白去乙酰化酶到这个区域。
稳定无活性非CGI启动子基因表达状态的甲基化变化的因果关系问题一直备受争议，这个问题尚未得到妥善解决。因为转录因子能很强的结合到DNA甲基化序列上，随后导致这些区域被甲基化。它并不总是清楚甲基化的改变是不是转录的结果，是否他们稳定转录无能状态。非CGI区域甲基化对转录因子的结合靶点的直接影响。
事实上，这个事情已经知道一段时间了，MYC结合到它的同源序列直接因为5Mc84的存在受到抑制。然而SP1的结合没有标明那种关系。然而，如转录因子结合位点甲基化，在层粘连蛋白β3（LAMB3），相关转录因子2（Runx2）34or Oct4启动子（参考文献），可降低转染实验的基因表达。
最近的全基因组的研究表明它们的识别序列上的CpG位点的甲基化强烈地影响转录因子结合。这些实验指明了TSS的CpG甲基化和基因表达之间的因果关系，但这个可能机制仍然存在问题。例如，一个令人费解的现象是我们发现人的ESCs，在0CT4靶点上几乎总是有没有Oct4 束缚。靶位点序列的每侧上有100 bp的DNA甲基化。作为Oct4识别序列不含有CpG序列，它是很难假设一个机制可以解释这种位点附近的
CpG甲基化和缺乏结合之间的强烈关系。然而，事实上，在CpG位点侧翼的Oct4结合位点的甲基化的变量比在CGIs上的更多，今后的调查研究的这个邻居可能是富有成效的领域，直到现在在很大程度上被忽略。
结论
全基因组的方法给了我们一个甲基化的详细的观点，表明超出TSSs以外的甲基化模式远比之前更多欣赏动态。既然我们有了这些模式，我们需要解决它们的潜在作用机制-甲基化位点之外，TSS显然不只是“乘客”而是以前假设（图1).相比于在TSS 上的CGIs，TSS是一般非甲基化，似乎大多TSSs甲基化是未了保证长期沉默，基因组CpG废弃区域的协同模式的基因组区更有趣。虽然我们很清楚我们不了解详细的增强子甲基化的机制，绝缘子和基因体影响基因调节蛋白的结合功能，似乎在质疑对发展、分化，甚至细胞活力的重要性。然而，一些物种没有甲基化还能够生存，而哺乳动物需要三个 DNMTs；发现为什么这个问题有助于解释其功能。TET基因的鉴定和TET 蛋白对调控区域的定位是5mC动态周转的高度暗示，这与它具有控制功能的基因表达一致。
因为关注癌症中不正常CGI甲基化而在很大程度上忽略了人类疾病中的超出CGI 启动子以外的甲基化的潜在参与。未来的工作，旨在提供详细的在正常和疾病状态的表观基因组图谱是我们理解许多人类疾病的关键（框3）。如果我们要发展战略和药物去针对表观遗传、针对这些疾病，那么这是非常必要的。
DNA甲基化和肿瘤的关系
DNA 甲基化与肿瘤 一、DNA甲基化与基因表达 5-甲基胞嘧啶是天然存在的修饰碱基，甲基化的 mCpG ，在DNA 双链中对称出现。哺乳类动物基因组约60 %的表达基因5′端启动子存在未被甲基化的CpG岛,而启动子区域外的CpG岛大都为 mCpG。正常情况下，非活化的X染色体、印迹基因等的启动子区域的CpG岛为甲基化状态，而看家基因的 CpG岛则是去甲基化状态。 DNA 甲基化状态与基因表达呈负相关。其调控作用主要在转录水平抑制基因表达。 DNA甲基化的检测方法 经过亚硫酸盐处理后的DNA中胞嘧啶（C）转变为胸腺嘧啶（T）,但是甲基化的中的CpG二核苷酸C 未转变为T，而无甲基化的CpG二核苷酸则发生这种转变，由此可以推断DNA是否发生甲基化。TATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGG CCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTTAGTAT TGTTTGGTGAAATGGTACGTGTTTATAATTTTAGTTATTTAG GAGGTTGAGGTAGGAGGATTTTTTGAGTTTAGGAGTTTAA GTTTAGTTTGGGTAATATAGTTTAGTGGTTATATTAAAAAA AGTAAAATAGTCGGGCGCGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTA GTATTTTGGGAGGTCGAGGCGGGTGGATTACGAGGTTAGG AGGTTGAGATTATTTTAAGGGCAAT
DNA 甲基化抑制基因转录的分子机制 ①DNA 双螺旋结构的大沟为DNA 与多种转录因子的作用部位，mCpG的甲基化胞嘧啶突入大沟，抑制转录因子的结合而抑制转录。②mCpG 激活阻遏蛋白因子，如DMAP1、TSG101、 Mi2等，通过阻遏蛋白因子的作用抑制转录。③DNA甲基化与组蛋白乙酰化的研究发现，组蛋白H3、H4 的赖氨酸去乙酰化后带负电荷,与带正电荷的DNA 结合更紧密,不利于转录过程中的聚合物解聚，从而抑制基因转录。甲基化的CpG 结合蛋白(MeCPs) 与DNA 的mCpG结合,并与组氨酸去乙酰化酶(HDAC) 形成复合物共同抑制转录。 二、DNA甲基化与肿瘤 以往的研究认为癌基因激活、抑癌基因失活主要是基因突变、缺失导致的DNA 序列改变。在肿瘤研究中，检测到许多肿瘤的重要基因并未发生突变、缺失，基因表达的异常主要通过DNA 甲基化实现。癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化状态，可导致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改变是肿瘤细胞的一个重要特征。 DNA 甲基化状态的改变导致基因结构和功能的异常，与肿瘤发生的关系是近年来研究的热点。 DNA甲基化的异常与基因突变、缺失等基因组异常也有密切的关系
DNA甲基化功能汇总
Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond DNA甲基化功能：岛，起始位点，基因体和其他 peter a. jones 摘要 DNA甲基化通常被描述为一个“沉默”的表观遗传标记，的确，5-甲基胞嘧啶的功能最初是在20世纪70年代提出。现在，归功于甲基化绘图的基因组规模的改良，我们可以评估在不同的基因组背景下的DNA甲基化：在基因体上，在调控元件和重复序列上，转录起始位点有或者没有CpG岛。新出现的图片是DNA甲基化功能似乎随背景而改变，DNA甲基化和转录的关系比我们最先认识到的更为微妙。有必要提高我们对DNA甲基化的功能的理解，为了解释这个疾病标记中观察到的变化，比如癌症。 两篇重要的文章在1975年分别表示胞嘧啶残基的甲基化在CpG二核苷酸背景中能作为表观遗传标记。这些文章提出序列可以被重新甲基化，即甲基化通过一种机制的体细胞分裂能够被遗传，包括一种能识别半甲基化CpG回文的酶，甲基基团的存在，可以由DNA结合蛋白和DNA甲基化直接沉默基因解释。虽然这些关键原则中的几个被证明是正确的，解开DNA甲基化与基因沉默的关系已被证明是具有挑战性的。 在CpG序列背景下，在动物身上的大部分工作都集中在5-甲基胞嘧啶（5mC）。据报道，在哺乳动物的其他序列的甲基化广泛分布在植物和一些真菌中。在哺乳动物中，非CpG甲基化的功能目前未知。在这里我主要集中在哺乳动物基因组中的CpG甲基化，包括在其他动物和植物中观察到的差异的讨论。 理解DNA甲基化的功能需要通过基因组考虑甲基化的分布。超过一半的基因脊椎动物的基因组包含短（约1 kb）CpG丰富的区域称为CpG岛（CGIS），其余的基因组因为CpGs而耗尽。当5mC通过自发或酶胸腺嘧啶脱氨基作用被转换成胸腺嘧啶，认为基因组的损失是由于甲基化的序列在种族中的脱氨基；认为CGI存在是因为他们可能是从来没有或只有瞬时甲基化。然而，有很多关于准确定义CGI是什么的讨论，虽然在
DNA甲基化
DNA甲基化概述 在哺乳动物基因组中，甲基化是一种表观遗传机制，包括将甲基转移到胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通过招募参与基因抑制的蛋白或通过抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达。在发育过程中，DNA甲基化的模式在基因组中发生变化，这是DNA从头甲基化和去甲基化的动态过程的结果。 DNA甲基化是被一个甲基转移酶家族所催化，转移S腺苷甲硫氨酸(SAM)的一个甲基到第五个碳胞嘧啶残基形成5mc , Dnmt3a和Dnmt3b可以建立一个新的DNA甲基化模式来去修饰DNA，被称为从头甲基化。另一方面，Dnmt1在DNA复制过程中起作用，将亲代DNA链上的甲基化模式复制到新合成的子链上。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。当细胞到达终末分化时，Dnmt的表达大大降低。这似乎表明有丝分裂后细胞的DNA甲基化模式是稳定的。 大部分DNA的甲基化发生在鸟嘌呤核苷酸或CpG位点之前的胞嘧啶上。总的来说，哺乳动物基因组中CpG位点的减少可能是由于5 - mc可脱氨成胸腺嘧啶的诱变潜力。剩余的CpG位点分布在整个基因组中，除了CpG岛外，它们都被严重甲基化。DNA甲基化对沉默逆转录病毒分子、调节组织特异性基因表达、基因印记和X染色体失活至关重要。不同基因组区域的DNA甲基化可能根据潜在的遗传序列对基因活动产生不同的影响。 一、DNA甲基化的位置 1.1 基因间区 大约45%的哺乳动物基因组由转座因子和病毒因子组成，这些因子被大量甲基化而沉默。这些元素中的绝大多数是通过DNA甲基化或随着时间的推移由于5mC的破坏而产生的突变而失活的。如果表达，这些元素是潜在的有害的，因为它们的复制和插入可以导致基因损坏和DNA突变。胞内颗粒(IAP)是小鼠基因组中最具侵袭性的逆转录病毒之一。在整个生命过程中，IAP在配子形成、发育和成年阶段都被高度甲基化。甚至在胚胎内部，当基因组其余部分相对低甲基化时，Dnmtl维持对IAP元件的抑制。当Dnmtl被基因突变耗尽，导致广泛的低甲基化时，IAP元素被表达。这表明，在基因间区，DNA甲基化的主要作用之一是抑制潜在有害基因元素的表达。 1.2 CpG岛 CpG岛是大约1000个碱基对长度的DNA延伸，它们的CpG密度比基因组的其他部分高，但通常不会甲基化。大多数基因启动子，大约70%，在CpG岛。特别是，管家基因的启动子常常嵌入到CpG岛。CpG岛，尤其是那些与启动子相关的基因在小鼠和人类之间高度保守。在整个进化过程中，CpG岛屿的位置和保存意味着这些区域具有重要的功能。 CpG岛通过调控染色质结构和转录因子的结合来促进基因表达。DNA有规律地包裹在组蛋白周围，形成被称为核小体的小段。DNA与组蛋白的联系越紧密，对基因表达的宽容程度就越低。CpG岛的一个共同特征是，它们比其他DNA片段包含更少的核团。与CpG 岛相关的少数核小体常含有组蛋白，其修饰涉及增强基因表达。尽管约50%的CpG岛包含已知的转录起始位点，但CpG岛往往缺乏常见的启动子元件，如TATA boxes 。由于许多转录因子结合位点富含GC, CpG岛可能会增强对转录起始位点的结合。CpG岛虽然缺乏共同的启动子元件，但却能增强DNA的可达性，促进转录因子的结合。 CpG岛的甲基化导致了稳定的基因表达沉默。在配子发生和胚胎早期发育期间，CpG 岛经历了差异甲基化。通过CpG岛调控基因表达的甲基化能力对建立很重要。印迹基因仅由两个遗传亲本染色体中的一个表达，它们的表达由遗传亲本决定。除了印迹基因外，CpG
DNA甲基化
DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。 近15年来，人们越来越认识到DNA甲基化研究的重要性，开发出一系列检测DNA的方法。根据研究目的这些方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。 DNA甲基化的分析方法很多，可分为总基因组甲基化的检测和单基因序列特异性甲基化分析的研究。总基因组甲基化的检测又分为全基因组序列特异性甲基化分析和基因组非特异性甲基化水平的研究。前者包括甲基化差异性杂交显示(differential methylation hybridization，DMH)、寡核苷酸微阵列法和基因组限制性酶切扫描法(restriction landmarkgenomescanning，RLGS)；后者包括3H—SAM掺人后液闪检测法和高压液相色谱法。 对单基因序列特异性甲基化分析包括传统的甲基化敏感的限制性内切酶(methylation sensitive restriction endonucleases，MSREs)分析、比较简洁的甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)、全面反映甲基化情况的亚硫酸氢钠变性后测序(bisulfitegenomic sequencing)、甲基化敏感性单核苷酸引物扩增(methylation sensitive single nucleotide primer extension，Ms—SnuPE)、较新颖的甲基化荧光检测(methylight)、结合亚硫酸氢钠变性的限制性酶分析(combined bisulfite restrictionan alysis，COBRA)、酶的区域性甲基化特异性分析(enzymatic regional methylation assay，ERMA)和变性高压液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)。 甲基化敏感的单核苷酸的扩增(Ms—SnuPE) Ms—SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。 先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms—SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms—SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。这样，如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端；若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C／T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况。 甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)法 methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶，目前至少已发现320种。此类酶如在其切割位点中含有一个甲基化碱基，则它们中的绝大多数就不能切割DNA。MSRE法是基于甲基化敏感Ⅱ型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理。用甲基敏感Ⅱ型内切酶及其同工酶(对甲基化不敏感)切割含有一个或多个甲基化CpG序列的片段，然后用DNA印迹法分析。此法
DNA甲基化的总结
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下,将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域,在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系,例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女性侵袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默,基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8],都会导致细胞癌变。 甲基化作用是转录水平上表达调控的基本方式之一。由于宿主细胞基因组DNA中不 同位点的甲基化程度存在某种平衡，并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征，破坏后的结构便成为宿主基因组防御系统识别的信号，使新整合的DNA 序列发生不同程度的甲基化，甲基化基因序列则通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MeCP2)的结合而抑制转录的顺利进行Ⅲo。在拟南芥中发现了DNA甲基化可以导致基因沉默汹埘]。在基因沉默过程中，外源或内源性信号引起部分DNA序列中CpG的甲基化，甲基化CpG结合域蛋白2(MeCP2)结合到甲基化的胞嘧啶上聚集HDACs使组蛋白去乙酰化，该蛋白与去乙酰化的组蛋白通过聚集更多的DNA 甲基转移酶来加强沉默信号，从而引起基因沉默H?。 ?。DNA甲基化对染色质结构和基因表达的作用很可能是通过一组蛋白介导的，这些蛋白可能含有共同的高度保守的甲基化的CpG结合结构域(MBD)L45 J。DNA甲基化在基因印记、x染色体失活、某些疾病的发生发展中发挥重要作用。其直接作用机制可能是CpG岛甲基化干扰了一些转录因子(transcription factor，TF)与基因调控区的结合，使甲基从DNA分子大沟中突出，从而阻止转录 因子与基因相互作用。间接机制可能是由于甲基化DNA与甲基化DNA结合蛋白结合或DNA甲基化改变染色质结构，这2种情况都间接阻碍TF与DNA结合从而抑制转录m1。DNA甲基化一般是通过转录抑制机制来调节特定基因的，具体的机制可能有：5一MeC伸入DNA双螺旋大沟，影响转录因子的结合；序列特异的甲基化DNA结合蛋白(MDBP一1，MDBP一2)与甲基化的启动子序列特异性结合而抑制转录因子与靶序列的结合；甲基化CpG结合蛋白(MeCPl，MeCP2)与甲基化的二核苷酸CpG结合，发挥类似转录抑制蛋白的作用H“。一般DNA甲基化会通过干扰转录因子与识别位点结合和招募组蛋白乙酰转移酶(histon acefltransfeI"SeS，HATs)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)形成辅助阻遏复合体，使基因沉默而抑制其表达，而去甲基化则使沉默的基因重新激活Ⅲ卜 ＤＮＡ甲基化尤其是基因启动子区ＣｐＧ岛的高甲基化，会导致基因表达的下降或沉默。甲基化抑制基因的表达目前认为要有两个方面，一方面甲基化引起的基因结构改变可直接阻碍一些转录因子与其结合位的结合；另一方面可能与一些甲基化
DNA甲基化研究综述
DNA甲基化研究综述 The summarize of the research on DNA methylation 郭文媛 （生物技术 1353227） 摘要：DNA 甲基化是真核生物表观遗传学中一种重要的基因表达调控方式，是一种酶催化的修饰过程。其是在DNA 甲基转移酶催化下，将甲基基团转移到胞嘧啶的5 位碳原子上，使之转变成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程。在人类和其他哺乳动物中，此修饰过程通常发生在5'-CpG-'二核苷酸的胞嘧啶上。大量相关研究表明，DNA 甲基化与人类疾病密切相关。 Abstract:DNA methylation is an important epigenetic regulation of gene expression in eukaryotes．It is a kind of enzyme catalysis modification process: refers to the chemical modification process of DNA methyltransferase catalysis，the transfer of methyl groups onto cytosine carbon atom 5，making them into 5-methyl cytosine．In humans and other mammals，the modification process usually occurs in 5＇CpG -＇dinucleotide cytosine．A large number of relevant studies have shown that DNA methylation is closely related to human diseases． 关键词: DNA 甲基化; 甲基转移酶;表观遗传学; CpG 岛; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b; 基因沉默; DNA甲基化结合蛋白; 人类表观基因组计划 Key words:DNA methylation; Methyltransferase; Epigenetics; CpG island; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b ; Gene Silencing ;MBD; human epigenomeproject 表观遗传学研究的是不改变DNA 的一级结构而改变表型的一种基因表达调控机制，主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色体重构、RNA 干扰等。 DNA甲基化是重要的表观遗传修饰之一，在大多数真核生物中广泛存在。DNA 甲基化水平受到环境、疾病、年龄和性别等因素的影响，处于动态的变化过程中。不同的细胞、组织或个体之间，甚至同一细胞或个体的不同发育时期，其DNA 甲基化状态和程度都可能存有差异。 2003 年10 月，人类表观基因组计划委员会正式宣布投资和启动人类表观基因组计划( human epigenomeproject，HEP) 。HEP 的主要目标是研究人类所有基因在主要组织以及200 多种细胞中正常和疾病状态下的甲基化模式，并在基因组水平绘制不同组织正常和疾病状态时的甲基化变异位点图谱[4]，本文结合2013年至今DNA甲基化研究文献，综述了DNA甲基化分布特点和与疾病关系等方面的研究情况。 1.DNA甲基化 1.1DNA甲基化与DNA去甲基化 DNA 甲基化是表观遗传( Epigenetic) 的一种重要表现方式，指在DNA 甲基转移酶( DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s －腺苷甲硫氨酸( SAM) 为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。 DNA 去甲基化也被称为DNA 甲基化丢失(lossof DNA methylation), 即甲基基团从胞嘧 啶上消失的过程。包含主动去甲基化与被动去甲基化2 种模式。 1.2DNA甲基化分布 DNA 甲基化在生物体内的分布并不是随机的，而是呈现一定的规律性。
DNA甲基化原理
DNA甲基化 甲基化检测服务-亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite genomic sequencing PCR, BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠发生脱氨基变为尿嘧啶的原理，用两一特异性引物扩增后测序。测序法克服了只能针对单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测。 甲基特异性的PCR扩增（MS-PCR）示意图 DNA甲基化（英语：DNA methylation） DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。为外遗传编码（epigenetic code）的一部分，是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上：这种5'方向的DNA甲基化方式可见於所有脊椎动物。在人类细胞内，大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生於CpG双核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化则於胚胎干细胞中较为常见。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG（或CpNpG），或是不对称的CpNpNp形式（C与G是碱基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。特定胞嘧碇受甲基化的情形，可利用亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing）方式测定。DNA甲基化可能使基因沉默化，进而使其失去功能。此外，也有一些生物体内不存在DNA甲基化作用。
DNA甲基化详解
提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT 这四种碱基的排列顺序中。然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为
DNA甲基化综述
分子生物学综述 题目：DNA甲基化的研究方法与技术姓名： 班级： 学号：
摘要：DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。 关键字：表观遗传学；DNA甲基化；甲基化研究方法 1 导言 早在1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R. Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断，也就是人们现在比较统一的认识[1]，即在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA甲基化最为常见。其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱，即不同组织与疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱，以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用[2]。DNA甲基化的研究，逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。让我一一介绍现有的大部分DNA甲基化研究方法，并对其相关特性进行简要分析与总结。
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的 表达[3]。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体[4]。 1.2 DNA 甲基化的生物学作用 1.2.1 DNA 甲基化与遗传印记、胚胎发育 DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（Li 等1992年和Okano等1999年）[3]。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions,ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的[4]。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等[5]。
DNA甲基化
人类基因组单体型图细胞株中与遗传和基因表达变化有关的DNA甲基化模型 摘要 背景：DNA甲基化是参与基因调控和疾病的一种重要表观遗传学机制，但很 少人知道在个体间甲基化机制存在差异。在这，我们从77个图约鲁巴人的人类基因组单体中测量了22,290 CpG二核苷酸的淋巴母细胞系的甲基化水平，同时也使用了全基因组的基因表达和基因型数据。 结果：通过对超过三百万常见的单核苷酸多态性（SNP）位点的甲基化水平关联的分析，我们确定在173个基因的180个CpG双核苷酸位点与附近的单核苷酸多态性（独联体通常在5 KB内）的错误发现率为10％。在迪斯科相互 作用蛋白2的同源基因B（DIP2B，以前推测在DNA甲基化中发挥作用）中发现SNP rs10876043是最有趣的传输信号，全基因范围内的信号与第一组分的甲基化模式是有联系的。而且我们发现在整体信号联系中只有少量的反式作用。正如预期的那样，通过测量的RNA序列，我们发现基因的启动子甲基化和基因表达水平呈负相关关系。最后，发现有一个显着的SNP位点重叠，均与甲基化与基因的表达水平有关。 结论：我们的研究结果显示在个体间的差异在DNA甲基化方面有很强的遗传成 分。此外，丰富的单核苷酸多态性会影响甲基化和基因表达，为共享机制的一小部分的基因提供了证据。 背景：D NA甲基化在真核生物的基因组起着重要的调节作用。甲基化的改变可以影响转录和表型的变化[1]，但DNA甲基化本身的变化根源，现在仍然知之甚少。大量证据确实存在DNA甲基化的个体差异随着年龄的增长[2,3]，组织[4,5]，物种[6]。在哺乳动物中，DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶（转移酶）介导的，是在复制过程中负责重新甲基化和维持甲基化模式。参与合成的甲基化和DNA去甲基化的基因也可以影响甲基化的变化。例如，突变的甲基转移酶DNMT3L[7]和亚甲基四氢酸还原酶MTHFR[8]基因可导致人的血液中DNA低甲基化。这些变化发生在全基因组水平，与遗传变异是不同的，而是有针对性的对基因组区域影响DNA甲基化变异，例如，在H19/IGF2位点的差异性甲基化与遗传多态性有关9]。 最近的证据表明，DNA甲基化的依赖所在基因的序列含量[10?12]。在对家庭与双胞胎甲基化模式的研究中发现有很强的遗传效应，但随机因素和环境因素也有可能发挥重要作用2,14]。最近的工作表明，基因变异可能对所在的甲基化模式有重大影响[5,15-18]，但影响甲基化的遗传变异是何种程度，机制尚不清楚。此外，在DNA甲基化变化的基础上对个体基因表达影响到何种程度，仍然是未知之数。
DNA甲基化和去甲基化的研究现状及思考_邓大君
Hereditas (Beijing) 2014年5月, 36(5): 403―410 https://www.sodocs.net/doc/df1922586.html, 综 述 收稿日期: 2014-01-07; 修回日期: 2014-01-27 基金项目:国家自然科学基金项目(编号：30921140311，31261140372)资助 作者简介:邓大君，教授，研究方向：肿瘤病因学和DNA 甲基化研究。E-mail ：dengdajun@https://www.sodocs.net/doc/df1922586.html, DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0403 网络出版时间: 2014-3-3 12:41:25 URL: https://www.sodocs.net/doc/df1922586.html,/kcms/detail/11.1913.R.20140303.1241.001.html DNA 甲基化和去甲基化的研究现状及思考 邓大君 北京大学肿瘤医院／研究所, 北京 100142 摘要: DNA 甲基化通过调节基因转录、印记、X 染色体灭活和防御外源性遗传物质入侵等, 在细胞分化、胚胎 发育、环境适应和疾病发生发展上发挥重要作用, 是当前表观遗传学研究的热点领域之一。文章介绍了在过去几年中TET 介导的DNA 羟甲基化及其在早期胚胎发育中的作用, DNA 主动去甲基化及其与被动去甲基化的关系, DNA 甲基化建立及其与组蛋白修饰、染色质构象、多梳蛋白和非编码RNA 结合等关系方面的重要研究进展和存在的问题以及DNA 甲基化的转化应用前景。 关键词: DNA 甲基化; 去甲基化; 表观遗传学; 稳态; 转化研究 DNA methylation and demethylation: current status and future per-spective Dajun Deng Peking University Cancer Hospital and Institute , Beijing 100142, China Abstract: DNA methylation plays important roles in cell differentiation, embryonic development, host adaptations to environmental factors, and pathogenesis through regulation of gene transcription and imprinting, X-inactivation, and de-fense of foreign genetic material invasion, is currently one of the hottest research fields on epigenetics. In the past few years, a number of important findings on DNA methylation have been achieved. These findings include discovery of TETs-catalyzed cytosine hydroxymethylation and its functions in the early embryonic development; the relationship be-tween active and passive DNA demethylation; establishment and maintenance of DNA methylation patterns and their asso-ciations with histone modifications, chromatin configuration, polycomb group proteins and non-coding RNA bindings. DNA methylation has become a new potential biomarker and therapy target. Keywords: DNA methylation; demethylation; epigenetics; homeostasis; translational research DNA 甲基化是指DNA 序列中的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)碱基在甲基化转移酶的催化下与甲基发生共价结合, 可在细胞分裂过程中传递给子细胞的表 观遗传现象。由DNA 腺嘌呤甲基化酶(DNA adenine methylase, DAM)催化形成的O 6-甲基腺嘌呤(6mA)是一种CTAG 序列复制后维持甲基化, 在细菌表观
DNA甲基化
DNA甲基化 DNA甲基化（DNAmethylation）是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA 与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。 含义： 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5'端的非编码区，并成簇存在。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活，DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA 向Z-DNA的过渡，由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的原件缩入大沟而不利于转录的起始，导致基因失活。另外，序列特异性甲基化结合蛋白（MBD/MeCP）可与启动子区的甲基化CpG岛结合，阻止转录因子与启动子作用，从而阻抑基因转录过程。 DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG） 结构基因： 含有很多CpG结构，2CpG和2GPC中两个胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化，且两个甲基集团在DNA双链大沟中呈特定三维结构。基因组中
60%～90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。DNA甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点，以及DNA酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。 5位C甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶（C-T转换），由此可能导致基因置换突变，发生碱基错配，如果在细胞分裂过程中不被纠正，就会诱发遗传病或癌症。 酶的分类： 动物中DNA甲基转移酶有两种： 1）DNMT1，持续性DNA甲基转移酶——作用于仅有一条链甲基化的DNA 双链，使其完全甲基化，可参与DNA复制双链中的新合成链的甲基化，DNMT1可能直接与HDAC（组蛋白去乙酰基转移酶)联合作用阻断转录；2）DNMT3a、移酶可能参与细胞生长分化调控，其中DNMT3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用。 去甲基化 有两种方式：1）被动途径：由于核因子NF粘附甲基化的DNA，使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化，从而阻断DNMT1的作用；2）主动途径：是由去甲基酶的作用，将甲基基团移去的过程。在DNA甲基化阻遏基因表达的过程中，甲基化CpG粘附蛋白起着重要作用。虽然甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、AP2、CMycöMyn、NF2KB、Cmyb、Ets，使它们失去结合DNA的功能从而阻断转录，但是，
DNA甲基化实验操作原理及方法
DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION） 实验操作原理及方法 一、实验目的： 通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。 二、实验原理： DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。 DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。 重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基； 2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐； 3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。