引物设计流程
2010级动科2班杨教童222010328210151
1.引物设计的原理和步骤
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核苷酸片段，其中在扩增的DNA片断5'端的引物对应于有意链DNA序列，3'端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
1.引物设计的原则
（1）碱基组成：
GC含量应在40%-60%（45%-55% ）之间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等；
（2）引物长度：
引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。
（3）重复或自身互补序列：
形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。
（4）上下引物的互补性：
一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。
当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端都不能和其他任何引物互补。
（5）解链温度（Tm 值）：
计算出来的两个引物的Tm 值相差不能大于5 ℃，扩增产物的Tm 值与引物的Tm 值相差不能大于10 ℃；引物的Tm 值一般为50-70℃。
这些特性保证了扩增产物在每一个PCR 循环可有效变性。
（6）3’末端
3’末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；
（7）5’端序列添加限制性酶切位点：
2.用Primer Premier 5.0 软件设计两对引物
（1）在网页上找到要制作引物的一段序列，最好在1000左右，比如：ORIGIN
1 atgaatccaa atcaaaagat aataacaatt ggttctgttt ctctcatcat tgccacaata
61 tgtttcctta tgcaaattgc tatcctagta actactgtaa cattacattt caagcagcat
121 gactacaact cccccgcaaa caaccaagca atgctgtgta aaccaacaat aatagaaaga
181 aacacaacag agattgtgta tttgaccaac accaccatag agaaagaaat atgccccaaa
241 ctagtagaat atagaaactg gtcaaagccg caatgtaaca ttacagggtt tgcacctttt 301 tccaaggaca attcaattcg gctttctgct ggtggggaca tctgggtgac aagagaacct
361 tatgtgtcat gcgatcctga caagtgttat caatttgccc ttgggcaggg aacaacatta
421 aacaacggac attcaaataa cactgtacat gataggaccc cttatcgaac cctattgatg
481 aatgaattgg gtgttccatt tcatttagga accaggcaag tgtgcatggc atggtccagc 541 tcaagttgtc acgatggaaa agcatggctg catgtttgta taactgggga tgatagcaat 601 gcaacagcta gcttcattta caatgggagg cttgtagata gtattggttc atggtccaaa 661 aatatactca gaacccagga gtcggaatgc gtctgtatca atggaacctg tacagtagta
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1081 tggatgggaa ggacaatcaa cgagacgtta cgcttaggtt atgaaacctt caaagtcatt
1141 gaaggctggt ccaaagctaa ctccaaatta cagacaaata gacaagtcat agttgaaaag
1201 ggcgacaggt ccggttattc tggtattttc tccgttgaag gcaaaagctg catcaatcgg 1261 tgcttttatg tggagttgat aaggggaagg aaagaggaaa ctaaagtctg gtggacctca
1321 aacagtattg ttgtgttttg tggcacctca ggtacatatg gaacaggctc atggcctgat 1381 ggagcggata tcaatctcat gcctatataa
（2）将序列粘贴到制作区域
（3）点击Primer后点击Search开始搜索引物，如：
上述设计得如下一对引物
5’CCTAAGCGTAACGTCTCGT
3’TGGGAG GCTTGTAGATAGT
优点：转化率为80%，产物长度比较长，为495bp.能够很到限度的利用所选序列的，在5’端没有A或者多聚A结构，引物的Tm值的差距小于5，GC含量在45%到55%之间。
缺点：引物转化率不够高，而且极易发生三类结合错误，首先，易形成引物内互补结构，形成自身互补序列，阻碍了引物与所选序列的配对；其次，两个引物之间容易形成两类不完全配对，形成引物二聚体，这样引物便不容易和DNA学列结合，减少扩增速度。最后，两条产物链的温差大于10度，这也不利于PCR循环扩增。
此外，另外一对引物如下：
5’ATCTGACACCAGGAAATCG 3’AGTCGGAATGCGTCTGTAT
优点：比较高的转化率，GC含量为在合理的范围之内，复合引物设计原则，Tm 值是一样的，也符合引物设计原则。
缺点：容易形成引物二聚体，5’末端有A，当末端碱基为A 时，错配时引发链合成的效率大大降低；引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位
链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间。
引物设计步骤与要点
引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
质粒测序引物设计
质粒测序引物设计 随着基因研究的不断深入，质粒测序成为了分析基因信息的重要工具之一，同时，为了获得更真实、更准确的序列，准确设计序列特异性强的引物是非常重要的。本文将重点讲述质粒测序所需的引物设计流程及其注意事项，以期为大家提供参考。 1. 引物设计的基本原则引物是一种在PCR反应体系中使DNA聚合酶特异性扩增所需的寡核苷酸。正确认识引物的作用和特点，对于准确设计合适的引物具有很重要的意义。引物的主要特点有以下几个方面： （1）序列特异性：引物应特异性地与目标序列结合，确保扩增出的片段为所需的序列，而非与其它非靶DNA结合。 （2）稳定性：使其与模板DNA的双链DNA进行稳定的配对。 （3）温度特异性：引物与模板结合的温度应该略低于生产它们的反应体系的温度。 基于以上特点，我们需要基于引物设计的原则进行质粒测序引物的设计。具体来说，主要考虑以下几个方面：（1）序列特异性：引物应设计成特异性的，避免产生与目标序列无关的PCR产物。其特异性应通过序列比对和BLAST进行验证，以确保最终设计出的引物能够对所需的目
标序列特异性扩增。在引物设计时，还应注意要在引物中避开GC/AT区域和重复序列的部位。 （2）长度优化：引物的长度应该合适，过短容易导致扩增不全，过长则容易出现引物间的竞争关系，同时也容易产生温度特异性方面的问题。一般来说，引物长度应该控制在20个核苷酸左右，但是对于某些特殊的情况，比如复杂基因组、高度变异基因等，可能需要设计更长的引物。 （3）序列特征：引物中不应含有重复结构、长程序列、寡聚物或者常见的RNA序列，这些都可能导致不特异扩增、引物二聚或聚合酶滞留等问题。 2. 引物设计流程 在对质粒进行测序之前，需要先设计合适的引物，紧密契合上述引物设计原则，具体流程如下： （1）数据获取：首先需要获取目标DNA序列，并确定所需要进行的PCR扩增区域。 （2）引物设计：根据目标区域，按照上述设计原则进行引物的设计。一般来说，可以利用一些公共的软件或者在线工具进行引物设计，比如Primer 3、OligoCalc、Primer Premier等。 （3）引物评估：设计好的引物需要进行验证，包括序列特异性、设计可靠性等方面。可以利用序列比对、
引物设计流程
2010级动科2班杨教童222010328210151 1.引物设计的原理和步骤 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核苷酸片段，其中在扩增的DNA片断5'端的引物对应于有意链DNA序列，3'端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。 1.引物设计的原则 （1）碱基组成： GC含量应在40%-60%（45%-55% ）之间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等； （2）引物长度： 引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。 （3）重复或自身互补序列：
形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。 （4）上下引物的互补性： 一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。 当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端都不能和其他任何引物互补。 （5）解链温度（Tm 值）： 计算出来的两个引物的Tm 值相差不能大于5 ℃，扩增产物的Tm 值与引物的Tm 值相差不能大于10 ℃；引物的Tm 值一般为50-70℃。 这些特性保证了扩增产物在每一个PCR 循环可有效变性。 （6）3’末端 3’末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A； （7）5’端序列添加限制性酶切位点： 2.用Primer Premier 5.0 软件设计两对引物 （1）在网页上找到要制作引物的一段序列，最好在1000左右，比如：ORIGIN 1 atgaatccaa atcaaaagat aataacaatt ggttctgttt ctctcatcat tgccacaata 61 tgtttcctta tgcaaattgc tatcctagta actactgtaa cattacattt caagcagcat
全基因扩增的引物设计步骤
全基因扩增的引物设计步骤 引言 全基因扩增（Whole Genome Amplification，WGA）是一种将整个基因组进行扩增的技术，可以从极少量的DNA样本中获得足够的DNA量进行后续实验。在全基因扩增过程中，引物设计是至关重要的一步，它直接影响扩增效率和特异性。本文将详细介绍全基因扩增的引物设计步骤。 引物设计步骤 1. 确定扩增目标 在进行全基因扩增之前，首先需要确定扩增的目标。可以是整个基因组的扩增，也可以是特定区域的扩增。根据扩增目标的不同，可以选择不同的引物设计策略。 2. 引物长度选择 引物的长度对扩增效率和特异性有重要影响。通常，引物的长度在18-30个碱基对之间。较短的引物可以提高扩增效率，但可能会导致非特异性扩增产物的产生；较长的引物可以提高特异性，但可能会降低扩增效率。 3. 引物序列选择 引物序列的选择是引物设计中最关键的一步。以下是引物序列选择的几个要点： - 引物应具有足够的特异性，避免非特异性扩增产物的产生。可以通过比对基因组数据库或使用引物设计软件来评估引物的特异性。 - 引物的GC含量应适中，一般在40-60%之间。过高或过低的GC含量可能会影响扩增效率。 - 引物的3’端应尽量避免出现重复序列或富含AT或GC碱基对的序列，以减少扩增的非特异性。 - 引物的3’端还可以加入一些特定的序列，如限制性酶切位点、引物标签等，以方便后续实验操作。
4. 引物的互补性检查 在引物设计完成后，需要进行引物的互补性检查。引物之间的互补性可能会导致二聚体的形成，影响扩增效率和特异性。可以使用引物设计软件或进行体外实验来检查引物之间的互补性。 5. 引物的合成 合成引物时，可以选择商业合成或自行合成。在合成引物时，需要注意以下几个问题： - 引物的纯度要求较高，以避免污染对扩增结果的影响。 - 引物的浓度要适中，一般在10-100 μM之间。 引物设计实例 以下是一个全基因扩增引物设计的实例： 1.扩增目标：整个基因组的扩增。 2.引物长度选择：选择长度为20个碱基对的引物。 3.引物序列选择：使用引物设计软件进行引物序列选择，确保引物具有足够的 特异性和适当的GC含量。选择的引物序列如下： –引物1：5’-AGCTGATCGATCGATCGATC-3’ –引物2：5’-GATCGATCGATCGATCGATC-3’ 4.引物的互补性检查：使用引物设计软件进行引物的互补性检查，确保引物之 间没有互补性。 5.引物的合成：选择商业合成引物，并确保引物的纯度和浓度符合要求。 结论 全基因扩增的引物设计是全基因扩增技术中至关重要的一步。通过合理选择引物的长度和序列，并进行互补性检查和合成，可以提高扩增效率和特异性。合理的引物设计可以为后续实验提供可靠的基础，并推动全基因扩增技术的应用和发展。 参考文献 1.Paez JG, et al. (2004) Whole genome amplification generates stable and reproducible genotyping data. Genome Res. 14(3): 603-8. 2.Dean FB, et al. (2002) Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc Natl Acad Sci U S A. 99(8): 5261-6.
引物合成的步骤及方法介绍
引物合成的步骤及方法介绍 引物合成是生物学研究中常见的实验技术之一，用来扩增和检测特定DNA序列。该技术涉及到合成适当长度、序列和特异性的引物，以便在聚 合酶链反应（PCR）和DNA测序等实验中使用。下面将详细介绍引物合成 的步骤及方法。 1.设计引物：首先，需要根据所需扩增或检测的DNA序列设计合适的 引物。引物一般包括前向引物和反向引物，前向引物与DNA序列的5'端 互补，反向引物与DNA序列的3'端互补。引物的设计需要考虑引物长度、GC含量和特异性等因素。 2.引物合成：引物的合成可以通过两种主要方法实现：化学合成和聚 合酶链反应。 -化学合成：化学合成是目前最常用的引物合成方法。这种方法通过 合成和耦合核苷酸单元来逐个扩展引物的序列。化学合成具有可靠性高、 纯度高的优点，但长度限制在50到70个核苷酸。 -聚合酶链反应：聚合酶链反应（PCR）也可以用于引物的合成。在PCR反应中，引物作为DNA模板经过扩增产生。这种方法可以合成较短的 序列，并且相对简单快捷。 3.纯化和质检：合成的引物需要进行纯化和质检，以确保其纯度和特 异性。 -纯化：合成的引物可能包含残留的化学试剂或其他杂质，需要通过 凝胶电泳、高效液相色谱（HPLC）或其他纯化方法进行纯化。
-质检：质检通常包括测序、电泳和光谱测定等。测序可以确定引物的确切序列，电泳可以检测纯度，光谱测定可以检测引物在特定波长下的吸收率和浓度。 4.鉴定引物：最后，需要通过相关实验验证引物的特异性和效果。 1. Fmoc合成法：Fmoc（9-氟米多阿琥珀酸）合成法是一种丙氨酸衍生物的合成方法，通过此法合成的引物质量好、分离方便。 2. H-phosphonate合成法：H-磷酸酯合成法通过对进行缩合反应，利用磷酸二酯法的原理合成引物。 3. Phosphoramidite合成法：Phosphoramidite方法是一种化学合成引物的常用方法，利用磷酸二酯法合成引物。 4.聚合酶链反应：PCR引物的合成通过PCR反应合成。PCR反应利用DNA模板和引物，在DNA聚合酶的催化下进行引物的合成。 5.套式PCR法：套式PCR法是对引物的扩增，通常用于扩增一些特定基因或序列的特异性引物。 总结起来，引物合成是生物学领域中常用的实验技术之一，用于扩增和检测特定的DNA序列，包括前向引物和反向引物。引物的合成可以通过化学合成和PCR方法实现，合成的引物需要进行纯化和质检以确保其质量和特异性。选择合适的引物设计和合成方法对于实现准确的实验结果至关重要。
blast引物设计流程
blast引物设计流程 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 引物设计是分子生物 学研究中一个非常重要的步骤。它用于通过比对已知的DNA或RNA序列来 选择特定区域的引物，以进行PCR（聚合酶链式反应）、RT-qPCR（逆转 录定量聚合酶链式反应）和荧光原位杂交等实验技术。在本文中，我们 将详细介绍设计BLAST 引物的流程。 1.收集目标序列数据： 首先，我们需要收集目标序列的数据。目标序列可以是基因序列、mRNA序列或其他DNA/RNA序列。这些数据可以从公共数据库（如GenBank）或实验室内部的数据库获得。 2.确定引物长度： 下一步是确定引物的长度。通常，引物的长度在18到25个碱基对之间，相对长度和GC含量对于PCR引物尤为重要。 3.构建BLAST数据库： 在设计引物之前，我们需要构建一个BLAST数据库。选择适当的引物 长度和需要比对的目标序列，将这些序列导入数据库中。BLAST数据库可 以通过使用NCBI（National Center for Biotechnology Information） 或其他Bioinformatics软件来构建。 4.查询引物序列： 使用BLAST软件，将具有已收集的目标序列信息的引物序列输入到BLAST数据库中。BLAST会在数据库中寻找与引物序列相似的序列。基于 比对结果，可以评估引物的特异性和亲合性。
5.分析BLAST结果： 根据BLAST比对的结果，需要对引物进行评估和筛选。主要考虑以下 几个方面： -特异性:引物应该与目标序列非常特异性地结合，而不会与其他非靶DNA或RNA结合。特异性可以通过比对结果中的E值（期望值）和匹配长 度来评估。 -互补性:引物应与目标序列互补，以便正确结合并形成PCR产物。通 过比对结果来评估引物序列与目标序列的互补性。 - 引物结构: 引物应具有适当的物理参数，如长度、GC含量和熔解 温度等。这些特征可以使用Bioinformatics工具来评估和优化。 -引物间干扰:由于PCR反应中DNA链扩增的特性，引物的设计应避免 自身或互相干扰。通过比对结果和引物序列比对可以评估引物的干扰性。6.优化和验证引物： 一旦筛选出潜在的引物，可以进一步优化和验证引物的性能。这可以 通过实验验证引物的特异性、亲合性、扩增效率和特定的PCR条件来完成。 7.设计控制引物： 除了目标引物，还需要设计一些控制引物来确保实验的质量和准确性。控制引物可能包括正对照、阴性对照、副产物检测引物和内参对照引物等。 8.引物合成和实验：
基因克隆引物设计步骤
基因克隆引物设计步骤 基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中转移到另一个生物体中 的过程。在基因克隆中，引物是必不可少的工具，它们作为DNA扩增的起 始序列，帮助将目标基因扩增出来。引物的设计是基因克隆的关键步骤之一，下面是基因克隆引物设计的详细步骤。 1.确定目标基因序列：首先要确定你想要克隆的基因序列。可以根据 已有的序列资料获得，也可以通过测序等技术获得此序列。 2.选择扩增方法：根据实验需求选择适合的扩增方法。常见的扩增方 法有PCR、RT-PCR、RACE等。 3.获取引物序列：根据目标基因序列，设计引物序列。引物通常由两 个部分组成：前向引物和反向引物。前向引物与目标序列的上游区域互补，反向引物与目标序列的下游区域互补。引物长度通常为18-22个碱基对。4.引物设计原则： -引物长度：引物长度应在18-22个碱基对之间，过短则会导致特异 性降低，过长则会导致引物的结构稳定性下降。 -GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低的GC含量 会导致引物的熔解温度变化，降低引物与目标序列的互补性。 -特异性：引物应具有高度的特异性，避免与其他基因或非目标序列 发生互补。 5.避免引物二聚体和髙聚物的形成：
-引物二聚体：引物二聚体是指两个引物之间通过碱基配对形成的复 合物。二聚体的形成会导致PCR扩增效率降低甚至完全失败。要避免引物 二聚体的形成，可以使用引物设计软件进行计算和优化。 -引物髙聚物：引物髙聚物是指引物之间互相结合形成的长链。髙聚 物的形成会抑制PCR扩增的产物的生成，同样可使用引物设计软件进行计 算和优化。 6.核酸序列分析软件的使用：核酸序列分析软件可以帮助你检查设计 引物的性能，如特异性、互补性等。常用的软件有Primer3、Oligo Analyzer等。 7.引物合成：找到合适的引物序列后，可以将其提交给寡核苷酸合成 机构进行合成。合成的引物会被送到实验室进行后续的基因克隆实验。 总结起来，基因克隆引物设计的关键是确定目标基因序列、选择合适 的扩增方法、根据引物设计原则设计引物、避免引物二聚体和髙聚物的形成，并使用核酸序列分析软件进行验证。通过这些步骤的合理设计和优化，可以提高基因克隆的成功率。
引物设计流程之基因编码区(CDS)扩增引物设计
PCR引物设计流程 （以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例） 一．流程图 二．确定模板 1.确定模板来源物种 近亲物种：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等 常用物种：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼） 一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。 2.利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列 A.进入NCBI主页https://www.sodocs.net/doc/a019221948.html,/，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得 到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。
B.点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。基因报告页面中部Refseq 条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。如下图。另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考https://www.sodocs.net/doc/a019221948.html,/refseq/about/。 C.需注意：对于同一基因的mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量选择同一 异构体（一般选择最长的异构体）。 D.如需得到该基因所在基因组的序列信息（如扩增启动子区域时），在基因报告页面上部Genomic regions， transcripts，and products 条目下，点击Go to nucleotide选项下FASTA按钮可进入基因组（组装）序列页面。 E.在基因组（组装）序列页面中，默认仅显示跳转前基因的序列，在Change region show 条目中修改设 置为Whole sequence得到基因组序列，在Send选项下保存即可。 3.整理下载的模板序列
引物设计的详细步骤
一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因,找到该基因的mRNA,在CDS选项中，找到编码区所在位置,在下面的origin中,Copy 该编码序列作为软件查询序列的候选对象. 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5,点击File—New—DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内(选择As），此窗口内,序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索"、“引物编辑"以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”,“Pairs”,设定搜索区域和引物长度和产物长度.在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300~500bp。 ③点击OK,软件即开始自动搜索引物，搜索完成后,会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中,显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况: 3'不要出现连续的3个碱基相连的情况,比如GGG或CCC，否则容易引起错配.此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间,GC％应该在45％～55％间,上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好.该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体和错误引发位置.若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构,即这几个按钮都显示为“None”为好.但有时很难找到各个条件都满足的引物,所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能,但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物,然后在菜单栏,选择 File-Print—Current pair,使用PDF虚拟打印机,即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息. 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中,该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框,输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可,而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。 ②Analyze中,第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的T m值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算,会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小些,最好不要超过9。 ③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析,可以选择上游引物或下游引物,分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的,即其Delta G值应该偏低,一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个.Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。 ④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样,Delta G值不要超过4。5kcal/mol,碱基对不要超过3个. Analyze中第四项为Composition and T m，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40%～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个,分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，T m值可以控制在50～70度之间。 第五项为False Priming Sites，即错误引发位点,在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率,一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话,比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
抗体引物设计
抗体引物设计 摘要： 一、抗体引物设计概述 二、抗体引物设计方法与步骤 1.抗原表位分析 2.抗体框架选择 3.抗体CDR 设计 4.评估抗体引物性能 三、抗体引物设计在生物制药中的应用 四、抗体引物设计的发展趋势与挑战 五、总结与展望 正文： 一、抗体引物设计概述 抗体引物设计是生物制药领域中关键的一环，它旨在构建具有特定抗原结合位点的高效、高特异性的抗体。抗体引物设计的核心是通过对抗原表位的深入分析，结合生物学、计算机模拟等技术，预测并设计出具有优异性能的抗体。 二、抗体引物设计方法与步骤 1.抗原表位分析：抗原表位是抗体识别并结合的关键区域。通过对抗原表位的分析，可以确定抗体引物的抗原结合位点，为后续设计提供依据。常用的抗原表位分析方法包括ELISA、表面等离子共振（SPR）等。
2.抗体框架选择：抗体框架是指抗体分子中与抗原结合部位以外的部分。选择合适的抗体框架有助于提高抗体引物的稳定性和生物活性。目前常用的抗体框架有κ、λ、γ等类型，可根据具体需求进行选择。 3.抗体CDR 设计：抗体互补决定区（CDR）是抗体抗原结合部位的关键区域，包含抗体识别抗原的特异性。抗体CDR设计主要通过计算机模拟和生物信息学方法，预测并设计出具有特定抗原结合能力的CDR序列。 4.评估抗体引物性能：抗体引物设计完成后，需对其性能进行评估。评估方法包括生物实验验证（如ELISA、SPR等）、分子动力学模拟、抗体表达与纯化等。 三、抗体引物设计在生物制药中的应用 抗体引物设计在生物制药领域具有广泛的应用，如治疗性抗体、诊断用抗体、生物制品研发等。通过抗体引物设计，可以获得具有较高亲和力、特异性和稳定性的抗体，为生物制药的发展提供有力支持。 四、抗体引物设计的发展趋势与挑战 随着生物信息学、计算机模拟等技术的发展，抗体引物设计将更加高效、精确。未来的挑战主要包括：高通量抗原表位筛选、抗体结构与功能预测、个性化抗体设计等。 五、总结与展望 抗体引物设计是生物制药领域的重要环节，其发展对于提高抗体药物的研究与开发具有重要意义。
引物设计的详细步骤
引物设计的详细步骤 详细步骤如下： 步骤一：了解引物设计的基本原理 引物设计是指为特定的DNA序列设计一对合适的引物，以便在PCR反应中扩增目标DNA序列。引物是PCR反应的关键组成部分，引物的选择和设计对于PCR扩增的成功率和特异性非常重要。因此，了解引物设计的基本原理对于有效设计合适的引物至关重要。 步骤二：确定PCR反应的目标序列 在设计引物之前，我们需要确定PCR反应的目标序列，即我们需要扩增的DNA区域。这个目标序列可以是已知的基因序列，也可以是未知的区域。确定目标序列后，我们可以继续设计引物。 步骤三：确定引物的一些基本参数 在设计引物之前，我们需要确定一些基本的参数，以便帮助我们选择合适的引物。这些参数包括引物的长度、GC含量、Tm值以及避免二聚体形成等。 引物长度：通常来说，引物的长度应在18-25个核苷酸之间。过长的引物可能导致不特异的扩增产物的形成，而过短的引物则可能导致低扩增效率。 GC含量：引物的GC含量对于引物的稳定性和特异性有影响。在正常情况下，引物的GC含量应在40%-60%之间。 Tm值：引物的Tm值是指引物在PCR反应中的解离温度。Tm值过低可能导致非特异的扩增产物的形成，而Tm值过高则可能导致低扩增效率。
避免二聚体形成：在设计引物时，我们还需要考虑引物之间的互补性 以及避免引物形成二聚体。引物之间的互补性可能导致引物形成二聚体， 从而降低PCR反应的效率和特异性。 步骤四：选择合适的引物设计工具 目前有很多在线引物设计工具可供选择，例如NCBI Primer-BLAST、OligoAnalyzer等。这些工具可以根据输入的目标序列帮助我们快速选择 合适的引物。此外，还可以使用一些商业引物设计软件，如Primer Premier等。 步骤五：进行引物特异性分析 设计好引物后，我们需要进行引物特异性分析，确保引物只扩增目标 序列而不扩增其他非特异性产物。这可以通过BLAST或其他相似性工具来 完成。特异性分析的目的是排除可能存在的非特异性扩增产物，以确保PCR反应的准确性和特异性。 步骤六：合成和测试引物 在确定引物的特异性后，我们可以选择合成引物并进行实验室测试。 在PCR反应中使用合成的引物，检测扩增产物的特异性和效率，并进行优 化调整。 总结： 引物设计是PCR实验中至关重要的一步。通过了解引物设计的基本原理，确定PCR反应的目标序列和一些基本参数，选择合适的引物设计工具，进行引物的特异性分析，最后合成和测试引物，我们可以设计出合适的引物，从而实现对目标DNA序列的扩增。
引物设计方法
引物设计方法 1 引物设计前准备 引物设计是一种精准度极高的生物技术，常被应用于各种基因组学、分子生物学和医药生物学研究、检测、应用和开发等。引物设计作为一种技术性操作，不仅需要对内容高度专业，还需要完备的前期准备工作。 2 基因序列的收集 使用引物设计研究，需要首先收集某一物种的基因序列信息，这些基因序列将作为进行引物设计研究的实验基础。在引物设计之前，基因序列信息可以通过基因组学与定位分析软件获得，如Illumina、454、Solexa和芯片等识别基因产物，也可以通过数据库下载完整的基因序列信息，得到某一物种的基因序列，如Genbank、Ensembl等。 3 引物设计要求 在引物设计之前，有必要先将基因序列进行相应的预处理分析，选择有特定功能的备选序列进行引物设计分析，常用的备选序列包括基因本身的核苷酸序列以及其相应的同义密码子序列。接着引物设计时，也要根据实验反应条件，综合考虑引物组成、PCR条件、检测灵敏度、热稳定性和触媒活性等因素，确定最佳引物水平，并进行字母和实验性检验以确保其有效性和正确性。
4 软件及平台 常用的引物设计软件有DNA Star、PNPrimer、Primer3Plus、OLIGO、 Q Primer Design等，也可以采用各种免费在线分析软件进行引物设计，如primerBLAST等，除此之外还有Col.Bioinformatics开 发的Primer Specificity Analyzer，旨在提供计算机基因组学研究者检测酶切位点特异性和引物特异性等服务。 总之，引物设计是一项高精准技术，在引物设计之前要做足准备，收集完整的基因序列信息，选择与实验反应条件相匹配的引物设计软 件及平台，以此来确保最具效果得最佳引物，满足实验需求。
microRNA茎环法引物设计及过程原理说明
microRNA茎环法引物设计及过程原理说明微RNA (miRNA) 是一类短RNA分子，主要通过抑制靶基因的转录或 翻译来调控基因表达。茎环法是一种常用的方法，用于设计合成miRNA分 子的引物。 miRNA的茎环法引物设计过程包括以下几个步骤： 1. 确定目标miRNA序列：首先，需要确定要合成的目标miRNA分子 的序列。这通常可以通过测定和分析细胞中的miRNA表达来获得。 2. 寻找互补序列：在茎环法中，引物包括一个5'端和一个3'端，两 端分别与miRNA分子的5'端和3'端互补。因此，需要在目标miRNA序列 中找到一个互补的片段，作为引物的5'端。 3.添加限制性酶切位点：在引物的5'端添加一个限制性酶切位点， 以便在后续的实验中方便检测和克隆。 4.茎环结构设计：在引物的3'端设计一个茎环结构。这通常涉及到 在互补序列的两端添加一些碱基，以形成一个稳定的结构。茎环结构的设 计旨在增加引物的稳定性和特异性。 5.引物合成与纯化：设计好的引物可以通过化学合成的方法进行合成。在引物合成过程中，可以添加适当的保护基团，以避免引物和其他非目标 序列的交叉反应。合成后的引物通常需要经过纯化，以去除杂质和未反应 的试剂。 6. 引物验证：合成和纯化后的引物需要进行验证，以确保其与目标miRNA分子的特异性。常见的验证方法包括原位杂交、荧光探针或靶基因 表达的检测等。
茎环法引物设计的原理是基于miRNA与其靶基因的互补配对机制。miRNA通过与靶基因的mRNA片段互补配对形成复合物，并通过不同的机 制抑制靶基因的表达。由于miRNA分子的长度相对较短，使用整个miRNA 分子作为引物可能存在对非目标序列的互补配对，导致特异性降低。因此，在引物设计中，通过选择与目标miRNA互补的片段，并添加茎环结构，可 以提高引物的特异性和稳定性。 另外，茎环法引物设计还需要考虑引物的位置和长度。位置选择应该 使茎环结构能够稳定地形成，方便实验的进行。引物长度的选择应平衡特 异性和选择性，过长的引物可能会导致对非目标序列的互补配对，而过短 的引物可能会影响稳定性和特异性。 总之，茎环法是一种常用的miRNA引物设计方法，通过选择目标miRNA序列的互补片段，并添加茎环结构，可以提高引物的特异性和稳定性。这为进一步研究miRNA的功能和机制提供了有力的工具。
idt设计引物步骤
idt设计引物步骤 1. 确定目标序列：首先，我们需要明确实验的目标，即我们想要扩增、克隆或测序的DNA序列。可以是一个基因、一个特定的DNA 片段或者是整个基因组。 2. 引物长度：接下来，我们需要确定引物的长度。引物是一小段DNA序列，通常由20-30个核苷酸组成。引物的长度应该足够短，以便在PCR扩增或测序过程中能够特异性地结合到目标序列上。 3. 引物设计原则：在设计引物时，有一些原则需要遵循。首先，引物的GC含量应在40-60%之间，这可以增加引物与目标序列的特异性结合。其次，引物的3'末端应以C或G为主，这有助于避免引物的5'末端的退火。此外，引物的Tm（退火温度）应在50-65℃之间，以确保引物能够稳定地结合到目标序列上。 4. 引物序列分析：在设计引物之前，我们需要对目标序列进行一些分析。可以使用一些生物信息学工具，如BLAST，来搜索类似的序列并进行比对。这可以帮助我们确定引物与目标序列的特异性。 5. 引物设计工具：现在有很多在线工具可以帮助我们设计引物。这些工具可以根据我们提供的目标序列自动生成合适的引物。其中一些工具还可以根据特定的实验要求，如PCR扩增、测序或突变分析，进行引物设计。
6. 引物合成：设计好引物后，我们需要将其发送给DNA合成公司进行合成。在合成引物时，我们需要提供引物的序列、长度和纯度要求。DNA合成公司将根据我们的要求合成引物，并将其以干燥的形式提供给我们。 7. 引物验证：在使用引物进行实验之前，我们需要对其进行验证。可以使用一些实验方法，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、比色法或测序等，来验证引物的纯度和特异性。 总结起来，设计引物是进行各种生物学实验的重要步骤之一。通过确定目标序列、确定引物长度、遵循引物设计原则、进行引物序列分析、使用引物设计工具、合成引物和验证引物等步骤，我们可以设计出高质量的引物，从而保证实验的成功。希望本文对你对IDT 设计引物有所了解。
过表达载体引物设计
过表达载体引物设计 过表达载体引物设计是基因工程技术中至关重要的环节，它旨在实现特定基因在生物体内的过量表达，从而研究该基因在生物体生理和代谢过程中的功能。本文将介绍过表达载体引物设计的基本原理及操作步骤，并提供一些实用建议。 一、过表达载体概述 过表达载体是一种将外源基因引入生物体细胞，并使其在细胞内稳定表达的载体。通常，过表达载体包含一个启动子、一个目的基因、一个选择标记和一些复制原点。启动子位于目的基因的上游，负责驱动目的基因的转录；选择标记则用于筛选携带目的基因的细胞；复制原点则确保载体在细胞内进行复制。 二、引物设计原理 引物是用于扩增目的基因的短DNA片段，通常分为正向引物和反向引物。正向引物位于目的基因的上游，反向引物位于目的基因的下游。引物设计的关键在于选择合适的引物序列，使扩增产物具有较高的特异性和可靠性。 三、过表达载体引物设计步骤 1.确定目标基因：根据研究需求，选择需要过表达的基因。 2.设计正向引物：在上游区域寻找合适的启动子，设计一个与启动子相邻的正向引物，长度一般为18-22个碱基对，GC含量适中，避免引物自身互补和发夹结构。 3.设计反向引物：在目的基因的下游区域设计一个反向引物，与正向引物
互补，长度和GC含量与正向引物相似。 4.引物筛选：利用生物信息学工具对设计的引物进行筛选，评估引物的特异性、扩增效率和相互干扰程度。 5.实验验证：合成设计好的引物，进行PCR扩增，检测引物的实际效果，优化引物序列。 四、注意事项 1.引物设计应充分考虑目标基因的结构特点，避免引物与非目标序列的扩增。 2.引物间的距离和方向要合理，避免引物间的相互干扰。 3.选择合适的退火温度，以保证引物与模板的结合稳定。 4.实验过程中注意引物的浓度和配比，避免引物过量或不足导致的扩增效果不佳。 通过以上步骤，您可以完成过表达载体引物设计。在实际应用中，引物设计的重要性不言而喻，它直接影响到基因表达效果和实验成果。
引物设计与检测全过程
如何在pubmed上查找一个蛋白质的基因序列 （1）打开https://www.sodocs.net/doc/a019221948.html,网址（百度上搜索NCBI也可找到此网址）。 （2）在搜索框中输入你要查找的蛋白名称或者序列号 （3）在搜索的选择范围下拉菜单中选择all database，然后点击搜索。 （4）在其中nucleiotide中可以查找你需要的蛋白，的核苷酸序列。 我在NCBI上找到很多C-myc的氨基酸序列，大小不一，不知道你说的C-myc标签的序列的氨基酸个数和具体序列，不知道多少KD. 其中我查到c-myc protein 氨基酸有419个，其mRNA序列为1307个核苷酸。20种氨基酸的平均分子量为128，所以419*128=53632Dalton=54KD。如种属不对，或序列数不对，你可以重新再NCBI上查找或者将你已知的C-MYC蛋白质序列输入到生物分析软件中计算也可以。 primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得 一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。