重组质粒的原核表达

实验九表达质粒的构建与诱导表达

第一节原核表达概述

基因工程的研究一方面是获得基因的表达产物，另一方面是研究基因结构与功能的关系，最终都涉及目的基因的表达问题。表达载体（express vector）是指本身携带有宿主细胞基因表达所需的调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内进行转录与翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用。外源基因在宿主（受体）细胞内是否表达以及表达水平受到许多因素（调控元件）的制约：

1．正确的阅读框架

为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致。阅读框架是由每三个核苷酸为一组连接起来的编码序列，外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中，从而表达融合蛋白，使外源蛋白与宿主蛋白相融合。

2．目的基因有效转录的启动子

启动子(promoter) 是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，

它是基因表达不可缺少的重要调控序列。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成的，分别称为一35区和一10区。一35区的序列为TTGACA，一10区序列为TATAAT。此两序列之间的最佳间距为17 bp。可与RNA聚合酶结合，并指导该酶在正确的转录部位开始合成mRNA。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体必须用原核启动子带动真核基因在原核生物中转录。原核表达载体启动子的转录常常是可以控制的，即一般情况下不转录，而受诱导剂诱导时就能转录，带动外源基因的高效表达。

目前常用的启动子：如大肠杆菌的lac启动子是乳糖操纵子的启动子，受la cⅠ编码的阻遏蛋白调节控制；trp 等启动子是色氨酸操纵子启动子，受trp R编码的阻遏蛋白调节控制；tac启动子，由lac启动子的一l0区和trp 启动子的一35区融合而成，汇合了lac和trp两者优点，是一个很强的启动子，受lacⅠ编码的阻遏蛋白调节；lacUV 5启动子是经紫外线诱变改造后的lac启动子，该启动子失去CAP和cAMP的正调控，只要有乳糖或IPTG 存在时就能够启动转录；噬菌体的λP L、R启动子是λ噬菌体左、右向启动子，是一个温度敏感的阻遏蛋白受温度调控的很强的启动子；T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多，并且十分专一，只被T7 RNA聚合酶所识别；SV40启动子、多角蛋白启动子以及花椰菜花叶病毒（CaMV）启动子。

3．转录终止子

构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因干扰表达载体的稳定性，一般要在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA转录终止子(terminator)。否则合成的

mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，而且容易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。原核基因的转录终止序列包括依赖Rho蛋白和不依赖Rho蛋白两种。不依赖Rho的终止信号序列都含发夹结构，末端为一连串T 及YRTCTG。

4．mRNA有效翻译的SD序列

在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)也调节着mRNA的翻译，一个是起始密码(AUG或GUG)，另一个是位于起始密码上游3～11个核苷酸处的由3～9个核苷酸组成的一段保守序列AGGAGGU，这段序列富含嘌呤核苷酸，称为SD序列。而核糖体和mRNA的结合是由SD序列以及与起始密码子AUG之间的距离决定的。因此，SD序列和它的起始密码子AUG之间的距离是影响外源基因在原核生物中表达量高低的重要因素。SD序列与AUG间隔9个碱基最为合适，其间距离过长或过短都会影响目的基因的表达，有时由于这种距离的影响，蛋白质合成水平会相差2 000倍以上。且SD序列与AUG之间的碱基最好是A或U，一3位最好是A。

5．转录、翻译后的适当修饰和加工

真核生物基因表达的产物往往需要进行适当的修饰加工，但由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工系统相当不完善，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或糖基化修饰。并且不同宿主其修饰系统也不一样，所以选择宿主时应注意。

6．信号序列(signal sequence)

在原核细胞中，合成的蛋白能否分泌到细胞外与mRNA编码区上游的一段信号序列有关。这段编码序列翻译的15～30个氨基酸为蛋白质N端的信号肽，它能携带蛋白质跨膜并分泌到细胞外。脂双层和负电荷的质膜通过和信号肽的疏水相互作用以及电荷的吸引是信号肽能跨膜分泌的主要原因。当信号肽携带后面的蛋白质跨膜分泌后，信号肽即被质膜上的信号肽酶切除得到有功能的成熟蛋白质。

因此根据不同的需要，人们构建了不同的在原核细胞中高效表达的载体，这些载体通常具有以下几个特点：①有一个强的原核启动子及两侧的调控序列；②位于读码框上游的SD序列与起始密码子AUG之间有合适的距离；③在外源基因和启动子之间有正确的阅读框架；④外源基因下游应加入不依赖ρ因子的转录终止区。一般表达载体都具有多克隆位点，对表达载体和外源基因用相同的两种酶双酶切后，再用T4 DNA连接酶把外源片段连入表达载体中，通过酶切、PCR鉴定，如果插入的片段大小和方向与外源基因一致，则成功构建了重组子。

将克隆的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

原核表达载体通常为质粒，典型的原核表达载体应具有以下几种元件：

（1）选择标记的编码序列；

（2）可控转录的启动子；

（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；

（4）一个多种单一限制性内切酶位点序列；

（5）宿主体内自主复制的序列

原核表达的一般程序：

1 获得目的基因

2 准备表达载体

3 将目的基因插入表达载体中（测序验证）——表达质粒的构建

4 表达质粒转化相应的宿主菌

5 外源基因的诱导表达（诱导靶蛋白的表达）

6 表达蛋白的分析

原核表达的基本操作步骤举例：

一、试剂准备

1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中, 0.22 μm 滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤

（一）获得目的基因

1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达质粒

1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。

（三）获得含重组表达质粒的表达菌种

1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

（四）诱导表达

1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2 ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300 ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3 h）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4 mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。

4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30 S收获沉淀，用100μL 1%SDS重悬，混匀, 70℃10 min。

5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。

三、注意事项

1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。

2、在构建表达质粒时，要注意使外源基因与载体DNA的起始密码相吻合时，使其处于正确的阅读框架之中。

3、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。

四、评议

1．表达质粒的构建的实验操作基本上与扩增质粒的构建相同，只是构建表达质粒时为了高

效表达外源基因，一般目的基因应与载体的相关DNA片段相融合。融合蛋白在大肠杆菌中的表达的优点如下：融合蛋白N端由正常的大肠杆菌本身序列所控制。容易获得高效表达；融合蛋白往往不被大肠杆菌视为异己蛋白，更为稳定。

2．表达载体与目标基因在体外重组完成后，必须导人特定的受体细胞如：BL21(DE3)，使之无性繁殖，直接改变其遗传性状。

3．在外源基因克隆到表达载体时，应注意其序列的ORF的正确与否，它直接决定其编码

的氨基酸序列，并且直接影响蛋白质的功能。如果ORF内碱基对发生缺失突变或插入突变，即插入或缺失非3的倍数的碱基对，那么ORF就可能发生改变，而得到一个截然不同的蛋白质产物，这种变化就是移码突变。如果发生突变形成了终止密码子，就会产生提前终止的、不完整的蛋白质，即无意义突变。其可分三种情况：琥珀突变(amber)，原来的密码子突变为UAG；赭石突变(ochre)，原来的密码子突变为UAA；乳白石突变(opal)，原来的密码子突变为UGA。

4．为了使外源基因在原核细胞中高效表达应利用蛋白酶缺陷型的宿主，如用lon营养缺陷

型减少外源蛋白的降解。因为黄嘌呤核苷(1on)是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底物。lon营养缺陷型宿主不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶。

第二节外源基因的诱导表达

一、实验目的

了解诱导外源基因表达的基本原理，学习和掌握诱导外源基因表达的常用的方法，为SDS-PAGE分析做准备。

二、实验原理

外源基因在原核生物中高效表达除了有适合的载体外，还必须有适合的宿主菌以及一定的诱导因素。宿主菌的选择对外源基因的表达是至关重要的，因为外源基因(特别是真核基因)在细菌中的表达往往不够稳定，常常被细菌中的蛋白酶降解。因此有必要对细菌菌株进行改造，使其蛋白酶的合成受阻，从而使表达的蛋白得到保护。实验中常用的宿主菌是经过改造的JMl09、BL21等大肠杆菌菌株。

通常表达质粒不应使外源基因始终处于转录和翻译之中，因为某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细菌的生长。为此，宿主细胞的生长和外源基因的表达是分成两个阶段进行的，第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长．以获得足够量的细胞；第二阶段是启动调节开关，使所有细胞的外源基因同时高效表达，产生大量有价值的基因表达产物。

在原核基因表达调控中，阻遏蛋白与操纵基因系统起着重要的开关调节作用，当阻遏蛋白与操纵基因结合时，阻止基因的转录。加入诱导物后；使其与阻遏蛋白结合，解除阻遏，从而启动基因转录。

根据表达载体的不同，外源基因表达常采用化学诱导与温度诱导两种方法。pET及pBV系列表达载体是近年来被广泛应用的两种诱导方式的代表性原核表达系统。

1．化学诱导

对于pET系列表达载体，当目的基因被克隆在T7转录和翻译信号控制的正确相位后，加入IPTG进行诱导，使宿主菌表达T7 RNA聚合酶，进而诱导目的基因以融合蛋白的形式进行表达，该系统以其独特的优势，在基因表达中应用较为广泛。

载体pET由于

带有来自大肠杆菌

的乳糖操纵子，它

由启动基因、分解

产物基因活化蛋白

(CAP)结合位点、操

纵基因及部分半乳

糖酶结构基因组

成，受分解代谢系

统的正调控和阻遏

物的负调控。正调

控是通过

CAP(catabolite

gene activation

protein)因子和

cAMP来激活启动

子，促使转录；负

调控则是由调节基

因(la cⅠ)产生Iac

阻遏蛋白与操纵子

结合，阻遏外源基

因的转录和表达，

此时细胞大量生长

繁殖。乳糖的存在

可解除这种阻遏，

另外IPTG是β一

半乳糖苷酶底物类

似物，具有很强的

诱导能力，能与阻遏蛋白结合，使操纵子游离，诱导lac Z启动子转录，于是外源基因被诱导而高效转录和表达。所以可以通过在培养基中添加IPTG诱导基因的表达。

2．温度诱导

pBV系列表达载体，重组插入P L、R启动子下游的目的基因直接表达受温度变化调控，以非融合蛋白的形式进行表达，该系统尤其适合表达对细胞有毒害的蛋白。

当用P L、R启动子构建表达质粒时，P L、R启动子受λ噬菌体cI基因的负调控，cI基因产生的阻遏蛋白结合在操纵基因上，阻止转录的进行。目前利用cI的温度敏感突变基因

(cIts 857)调节这种阻遏。当在28～30℃培养时，该突变体产生有活性的阻遏蛋白，阻遏

P L、R转录，细菌大量生长。在获得足够量菌体后，使温度上升至42℃．造成阻遏蛋白失活， P L、R解除阻遏，启动外源基因的高效转录和表达，从而合成大量有价值的外源蛋白。

三、注意事项

1．在进行诱导实验中要注意应以含有空载体的宿主菌株以及IPTG诱导前的含有重组子的宿主菌株做对照。t 2．IPTG诱导的最终浓度为0.3～1 mmol／L。；

3．诱导后的培养时间一般不超过3 h。i

4．有些工程菌，在IPTG诱导后，其发酵温度降低为30℃，则可产生诱导蛋白。!

四、评议!

1．在配制SDS上样缓冲液中，可用8％的β一巯基乙醇替代其中的400 mmol／L DTT。；

2．异源基因融合表达后面临着蛋白质降解问题。在大肠杆菌细胞中有两个结构影响蛋白质的稳定性：①大肠杆菌细胞中，凡蛋白质N端为精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)等残基的稳定性差，半衰期约2min，而N端如果不是这些氨基酸残基，半衰期可长达10 h。②蛋白质N端内部附近如含有赖氨酸残基，其是泛素蛋白的受体，易被依赖于泛素蛋白的蛋白酶降解。‘

3．分析被检测基因在细胞中转录和翻译的情况有以下方法：①Northern杂交，检查细胞中是否含有特定的mRNA；②SDS-PAGE分析诱导前后细胞中目的蛋白质的表达水平；③在Western杂交中用特异性抗体分析目的蛋白质的存在及含量；④利用ELISA等免疫学方法，检测基因表达的强度；⑤直接测定目的蛋白的生物活性，根据活性的大小估计蛋白质的表达量⑥也可将报告基因( 如la c Z) 克隆在目的基因的下游，根据报告基因的转录或翻译情况，估计目的蛋白的表达量。

4．从目的基因的碱基数目推算其表达的蛋白质的相对分子质量。；

计算方法一：Mr一115×n÷3 (其中n是基因的碱基数)。如表达的基因为1.7 kb，其表达蛋白质的相对分子质量大约为：Mr：115×n÷3 = 115×1700÷3 = 64 833≈65×10。

计算方法二：1.0 kb DNA相当于333氨基酸，即相对分子质量大约为37×103的蛋白质。如表达的基因为1.7 kb，其表达蛋白质的相对分子质量大约为：Mr = 1.7×37—63×103。

5．诱导表达蛋白时应注意凋整诱导培养的温度，不同的蛋白可能有不同的要求。

第三节表达蛋白的SDS--PAGE分析

一、实验目的

利用SDS—PAGE检测表达蛋白，确定蛋白质的相对分子质量，并掌握其原理与方法。

二、实验原理

电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象，影响泳动速度的因素主要有颗粒的性质、电场强度和溶液的性质等。①颗粒直径、形状以及所带的静电荷量对泳动速度都有较大影响。一般来说，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就越快。反之则越慢。②电场强度对电泳速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动速度就越快，反之则越慢。③溶液性质主要是指电极溶液和蛋白质样品溶液的pH、离子强度和黏度等。溶液的pH决定带电颗粒的解离程度，也即决定其净电荷的量。对蛋白质而言，溶液的pH离其等电点愈远，则其带净电荷量就愈大，从而泳动速度就愈快。反之则愈慢。一般溶液的离子强度在0.02～0.2之间时。电泳较合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动度。其原因是，带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层，这种静电引力作用的结果，导致颗粒泳动度降低，若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液pH变化而影响泳动度的速率。溶液黏度与泳动度成反比例关系。溶液的性质还通过影响带电颗粒的空间构象而影响其电泳行为。

聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由单体丙烯酰胺(acrylamide) 和交联共聚单位(双体)

N’N-甲叉双丙烯酰胺(N，N-methylene-bis-acrylaimide) 为材料，在引发剂过硫酸铵(APS)和增速剂N，N，N’，N’一四甲基乙二胺TEMED (N，N，N’，N-tetramethylene diamine)的作用下聚合交联形成含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之间通过甲叉桥连接而形成的三维网状结构物质。聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小与链长度和交联度有关，无论丙烯酰胺的量的多少，当N，N-甲又双丙烯酰胺的量为总丙烯酰胺的5％时，其平均孔径最小，因此一般将N，N’-甲又双丙烯酰胺的含量固定于总量的5％，然后通过改变丙烯酰胺的总量来调节孔径的大小，即有效孔径随着丙烯酰胺的总量的增加而减少。

聚丙烯酰胺凝胶的强度好，有弹性、透明化学性质稳定，在不同pH和温度下变化较小，在很多溶剂中不溶，为非离子型。没有吸附和电渗作用，是一种极好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、上样量大、回收的样品较纯等特点，但它操作麻烦，且不能分离较大的分子。通常用它分析蛋白质以及分析和制备小于 1 kb 的DNA或RNA片段。主要用于分离蛋白质和测定蛋白质亚基相对分子质量。但应注意丙烯酰胺是一种潜在的神经毒素，其作用效应能积累，操作时应戴手套。

SDS—PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)，主要用于分离蛋白质和测定蛋白质亚基相对分子质量。SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键和疏水键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；强还原剂，如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚成单个亚基。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带有负电荷的蛋白质-SDS胶束。所带的负电荷大大超过了蛋白分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。使蛋白质分子的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质或亚基相对分子质量的大小。

SDS电泳成功的关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质和SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：①溶液中SDS单体的浓度。SDS在水溶液中是以单体和SDS一多肽胶束(SDS—polypeptide micelles)混合形式存在的，能与蛋白质分子结合的是单体。单体的浓度与SDS总浓度、温度、和离子强度有关。由于SDS与蛋白质结合是按重量成比例的，即在一定温度和离子强度下，当SDS总浓度增加到某一定值时，溶液中的SDS浓度不再随SDS总浓度的增加而升高。当SDS单体浓度大于1 mmol／L时，大多数蛋白质与SDS 结合的重量比为1：1.4，如果SDS单体浓度降到0.5 mmol／L以下时，二者的结合比仅为1：0.4。这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，也就不能进行相对分子质量测定。为了保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应为1：4或1：3。高温有利于SDS与蛋白质的结合，样品处理时常在沸水浴中保温。②样品缓冲液的离子强度。因为SDS结合到蛋白质分子上的量仅决定于平衡时SDS的单体浓度。不是总浓度，而只在低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。所以SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10～100 mmol／L。

③二硫键是否完全被还原。只有二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和相对分子质量对数的线性关系。因此电泳时蛋白质分子的迁移速度仅取决于分子的大小，可根据大小蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳速度不同即可分离蛋白质，并测出它们的相对分子质量。当蛋白质相对分子质量在(12～165)×103之间，蛋白质分子的迁移率与相对分子质量的对数呈直线关系，符合logMr= K－bx。(Mr为相对分子质量，x为迁移率，K、b均为常数)。

SDS—PAGE还有以下特征：

1)浓缩效应：

在不连续缓冲系统中，样品在进入分离胶以前，先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被浓缩至一极窄的区带。其作用原理是在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在接近其pK a的pH时，任何时候都只有一部分分子带负电。如样品和浓缩胶均用pH 6.7的Tris～HCl缓冲液，电极液用Tris-甘氨酸缓冲液。此时，甘氨酸很少解离，其有效泳动率很低，而氯离子却有很高的泳动率，蛋白质分子的泳动率介于氯离子和甘氨酸之间。一旦加上电压，作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，并加速甘氨酸的泳动，使其赶上氯离子，建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动率乘积的相等的稳定态，使这些带电颗粒以相同速度泳动，两种离子之间具有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进人浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，在界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质泳动速度比氯离子低，因此氯离子能迅速通过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳动速度比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，浓缩为一狭窄的区带。蛋白质在

移动界面中的浓缩作用进取决于样品和浓缩胶中的Tris—Hcl浓度，而与样品中的蛋白质的最初浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶，故对样品没有分子筛作用。

2)分子筛效应：

当夹在快离子和慢离子中间的蛋白质由浓缩胶进入分离胶时，pH和凝胶孔径突然改变。分离胶选用pH 8.9的Tris-HCl缓冲液，与甘氨酸的pK a接近，导致甘氨酸的大量解离。此时甘氨酸的有效泳动率增加，使它越过蛋白质并直接在氯离子后移动。随之高电场强度消失。同时由于凝胶孔径变小，使蛋白质分子的迁移率减小。于是，蛋白质样品就在均一的电场强度和pH条件下通过一定孔径的分离胶。当蛋白质的相对分子质量或构型不同时，通过分离胶所受到的摩擦力和阻滞程度就不同，最终表现出的泳动率也不相同，也就是分子筛效应。即使蛋白质的净电荷相似，也会因分子筛效应在分离胶中被分开。

3)电荷效应：

由于每种蛋白质分子所带的有效电荷不同，故泳动率不同，所以样品经过分离胶电泳后，就以带状按电荷顺序排列起来。

缓冲系统的选择：由于SDS对蛋白质的溶解性能以及负电荷的包裹作用，所以在选择SDS电流缓冲系统时要比常规聚丙烯酰胺凝胶电泳简单得多。一般来说，在被分析的蛋白

质稳定的pH范

围，凡不与SDS

发生相互作用的

缓冲液都可以使

用，但缓冲液的

选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。

含有SDS的不连续缓冲系统现在被广泛地用于蛋白质亚基相对分子质量以及纯度的测定。其中目前使用最多的缓冲系统是Tris一甘氨酸系统。在SDS不连续电泳中，样品缓冲液和凝胶缓冲液常采用同一种系统，只是pH和离子强度不同。

凝胶浓度的选择：由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS一蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。如果凝胶浓度太大，孔径太小，电泳时样品分子不能进入凝胶。如果凝胶浓度太小，孔径太大，则样品中各种蛋白质分子均随着缓冲液流向前推而不能得以很好地分离。不同相对分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。

三、注意事项

1．β-巯基乙醇吞服可致命，吸入或通过皮肤吸收可致伤。高浓度时对黏膜、上呼吸道、皮肤和眼睛有破坏作用。操作时应注意防护措施。

2．两种丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物并容易吸附于皮肤，作用有累积性，操作时要

小心并戴手套。如果皮肤接触了丙烯酰胺的粉末或溶液，立即用肥皂水冲洗。未聚合的丙烯酰胺应用过量催化剂以固体废物形式处理。

3．制备浓缩胶中，添加10％APS和TEMED前，应均匀地混合，一旦加入APS和TEMED

后应快速地旋转混合加入制胶层，因为浓缩胶很快就会聚合凝固。

4．将凝胶灌入制备好的平板内，留出灌注浓缩胶所需空间(梳齿的齿长再加1 cm)。且制备

浓缩胶前，应先准备好梳子。

5．上槽中应加入新鲜的电极缓冲液，而下槽中则可用旧的电极缓冲液。

6．如果没有数目足够的样品，应在加样孔中加上样缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近带的扩散。在加入不同的样品之前，一定要用电泳缓冲液或蒸馏水冲洗注射器。

7．在凝胶与玻璃板之间插入一根长注射针头将水缓缓注入，在注入水的过程中，针头逐渐

向前伸入，使凝胶与玻璃板分离，注意不要损伤胶面。

8．10％APS尽量使用时现配现用，4℃保存两周内用完，最多不能超过一个月。-20℃可

保存两个月，但一旦解冻后尽快用完。

四、评议

1．根据SDS电泳的原理，样品缓冲液中必须含有3～4倍于蛋白的SDS和足以断裂二硫键

的还原试剂(2％二硫苏糖醇或5％β-巯基乙醇)。

2．电泳中出现不规则的蛋白质迁移带是因为电泳不稳定，其他原因还包括样品加量太多、

样品中的盐浓度太高、边缘效应。如果在凝胶边缘电泳条带出现“微笑”状的样品(运动速度减慢)，可能是因为凝胶的中间比两侧更热，应降低电压。

3．电泳结束后，在进行染色前可用固定液处理对凝胶进行20 min处理，其SDS—PAGE的

分析效果会更好。固定液：454 mI的50％甲醇水溶液，46 mI的冰醋酸。

4．除了用考马斯亮蓝染色(其灵敏度较差，最低含量为100 n g蛋白质，但操作容易)，还可

用银染色，其灵敏度高，可比考马斯亮蓝染色法提高100倍，可检测2 ng的蛋白质。银染的机制是将蛋白带上的AgNO3 (Ag＋)还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。用银染蛋白的吸光度对浓度作图呈现不同的斜率，表明染色的程度是与蛋白中的一些特殊基团有关。在银染过程中，蛋白质首先需要被固定。固定有两个作用，第一是把蛋白固定在凝胶中或至少是阻滞它们在凝胶中的扩散，第二是为了去除干扰染色过程的物质，如去污剂，还原试剂和缓冲液的成分(如甘氨酸)。常用的固定剂有戊二醛，乙醇，甲醛、醋酸以及三氯醋酸，然后将凝胶放在银染溶液中染色。

银染色法：

1)将从制胶板上剥下的凝胶放入50 mL甲醛中固定液，旋转摇床中缓慢摇动10 min以上。2)倒去固定液，用水洗两次，每次5 min，缓慢摇动5min。

3)倒去水，凝胶浸泡在0.2 g／L Na2S203溶液中1 min缓慢移动。

4)倒去Na2S203溶液，用水洗胶2次，每次20 s。

5)倒去水，将凝胶浸泡在50 mL 0.1 %的AgNO3中10 min，缓慢移动。

6)倒去AgNO3，用水洗胶，然后用小量体积的硫代硫酸盐显影液洗。

7)将凝胶浸泡在50 mL新配制的硫代硫酸盐显影液中，缓慢摇动，直至获得足够的条带现

色强度(约1min)。

试剂：

1％硝酸银、0.2g／L的Na2S203。

甲醛固定液：40％甲醇、0.5 mL 37％甲醛。

硫代硫酸盐显影液：3% Na2CO3、0．000 4 % Na2S203、0.5 mL 37％的福尔马林(临用前加入)，不加福尔马林的溶液可于室温中长期保存。

第四节原核表达蛋白的分离与纯化

大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7 RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得超表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白2 %以上，有些甚至高达50 %。

一、可溶性产物的纯化（融合T7·Tag的表达蛋白）操作举例

（一）试剂准备

采用T7· Tag Affinity Purification Kit

1．T7·Tag抗体琼脂。

2．B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。

4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。

5. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。

1. PEG 20000。

（二）操作步骤

1. 100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。

2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。

3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。

4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。

5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。

6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。

7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。

8. 用PEG 20000浓缩蛋白。

（三）注意事项

蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。

二、包涵体的纯化

包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。

（一）试剂配制

1．缓冲液A：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。

2．缓冲液B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。

3．缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。

4．缓冲液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。

1．缓冲液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。

5．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脱氧胆酸钠。

（二）操作步骤

1．用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）, 离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。

2．将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。

3．将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g 离心收集包涵体沉淀。

4．包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。

5．溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。

第五节水稻瘤矮病毒（RGDV）S10组分的原核表达

一、原理

细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。

二、材料和试剂

1、重组质粒：将RGDV的S10组分，共1198 bp构建到原核表达载体pET-28b（＋）上，得到原核表达质粒pET-

S10。

2、将pET- S10转化到BL21(DE3)宿主菌中，进行诱导表达。

3、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容

至100ml, 棕色瓶存于室温。

4、1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100 ml。

5、1 M Tris-HCl (pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100 ml。

6、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶, 浓盐酸调至pH 7.2,定容至100 ml。

7、10?电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。

8、10%过硫酸铵（APS）：1g APS加ddH2O至10ml。

9、2?SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5 ml，β-巯基乙醇1.0 ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚

兰 1.0 ml，ddH2O 3.5 ml。

10、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰（R-250或G-250）0.25 g，甲醇225 ml，冰醋酸46 ml，ddH2O 225 ml。

11、脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成（也可以用0.5 mol/L的NaCL作为脱色液，在50～60℃

脱色0.5～1小时）。

12、观察结果，照相保存。此时的PAGE胶在短时间内可以放在蒸馏水中保存。

三、操作步骤

A 诱导表达

1、挑取含重组质粒的BL21(DE3)宿主菌单斑至2 ml LB（含Kan 50μg/ml，Cam 34μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般是将100μL菌加入到含10 mL LB培养基的培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600

≌0.6~0.8（最好为0.6）（3～4小时）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组, 余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组,两组继续37℃诱导培

养3～7小时r。

B SDS-PAGE电泳分析（采用垂直式电泳槽装置）

（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制

1、分离胶(12 %)的配制: 10 ml

ddH2O 3.3 ml

30%储备胶 4.0ml

1.5M Tris-HCl（pH 8.8）

2.5ml

10% SDS 0.1ml

10% APS 0.1ml

TEMED 0.004 ml

TEMED: N,N,N’,N’-四甲基乙二胺。

各成分混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面持平。凝胶完全聚合需30～60 min。

2、层积胶（5%）的配制：5 ml

ddH2O 3.4 ml

30%储备胶0.83 ml

1M Tris-HCl（pH 6.8）0.63 ml

10%SDS 0.05ml

10%AP 0.05 ml

TEMED 0.005 ml

分离胶凝固后，将其上的水吸去, 加入积层胶混合液, 立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-～0min。（二）样品处理

取经诱导的菌液1.5 ml, 12000g离心1 min收获沉淀，将样品加入一半体积的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3～5min，12000g离心1min，取上清作SDS-PAGE分析。

（三）上样

取15～20μl诱导与未诱导的处理后的样品用微量注射器加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。

（三）电泳

在电泳槽中加入1 电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压80V, 分离胶电压120V, 电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需4hr）。

（四）染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4～6 hr。

（五）脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰，观察有无49 Kda的特异蛋白条带出现。（六）凝胶摄像和保存

在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。

四、注意事项

1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。

2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10% AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。

3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。

五、思考题

1．在基因工程中克隆载体与表达载体各起什么作用?各需要具备哪些基本遗传元件?

2．简述诱导外源基因表达的基本原理。

3．如何确保外源基因在宿主中正常表达?怎样得到好的表达效果？

4．蛋白质电泳制胶要注意哪些方面?

5．比较核酸电泳与蛋白质电泳的异同之处。

原核&真核表达载体构建

原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起

重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选

重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转 染EMT6细胞株的筛选 作者：徐腾飞, 张文卿, 于红, 李丹 【摘要】目的: 构建人表皮生长因子受体（HER2）胞外区（1 896 bp）基因的真核表达质粒（pcDNA6/v5his HER2）, 转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）, 获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2)。方法: 用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列; 经酶切、连接构建pcDNA6/v5his HER2; 转化大肠杆菌DH5α, 筛选阳性克隆, 对其进行酶切及测序鉴定; 以PEI法将pcDNA6/v5his HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞, 经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周, 获得抗性克隆EMT6/HER2; 用RT PCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA, 免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。结果: PCR产物与预期片段大小一致; pcDNA6/v5his HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后, 可见与PCR产物大小相同的片段; DNA测序结果显示, pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确; 用RT PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA, 免疫组化法证实, EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。结论: 成功地构建了HER2胞外区真核表达载体, 获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株, 为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。

【关键词】HER2; 真核表达; 转染 ［Abstract］AIM: To construct an eukaryotic vector encoding extracellular domain of human epidermal growth factor receptors (HER2), pcDNA6/v5his HER2, and to screen HER2 positive clones from mouse breast cancer cell line EMT6. METHODS: The extracellular domain of HER2 was amplified from pcDNA3.1HER2 by PCR. pcDNA6/v5 his HER2 was prepared by inserting the fragment into the plasmid pcDNA6/v5his. Then the recombinant vector was identified by restriction enzyme and sequencing. Next, pcDNA6/v5his HER2 was transfected into the EMT6 cell line and the positive clones (EMT6/HER2) were screened with blasticidin. Finally, the expression of HER2 in EMT6/HER2 was detected by RT PCR and immunohistochemistry. RESULTS: The fragment of HER2 was amplified and pcDNA6/v5his HER2 was prepared successfully. No errors were found both in the sequence and ORF of the acquired fragment. The expected fragment of HER2 (1896 bp) was amplified from EMT6/HER2 by RT PCR and positive signals of HER2 were detected in EMT6/HER2 by immunohistochemistry. CONCLUSION: An eukaryotic plasmid encoding HER2 (pcDNA6/v5 his HER2) has been constructed and a cell line expressing HER2 stably has been prepared successfully.

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。 蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。 1）促表达/促溶标签 2）信标标签

3）纯化标签 我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。 4）酶切位点 以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。 标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。 在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。

原核蛋白表达常见问题解析

原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？ 在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为 包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的 培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达？ 跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前 众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个 原因： 跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式 的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与 信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞 一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌 这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可 能完成的任务。 另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水 性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物 自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌？

4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？ 答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶 回收三类。 1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化 获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白， 亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。 （1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去 工具酶。此方法能快速得到蛋白。 （2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方 法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏 度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么？ 答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性 的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯 化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形 成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。

真核表达载体

真核细胞常见表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug

原核表达载体的重要调控元件

原核表达载体的重要调控元件 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s 亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 （1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP 来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 （2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。 （3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac 操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。

原核表达步骤

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

载体与表达系统

载体与表达系统 0001--pIRES --BD Co--真核表达--yshu3507 0002--pECFP-C1--BD Co--真核表达--yshu3507 0003--pShuttle--/--/--victoh 0004--pSBR322--/--/--chujun_hust 0005--pcDNA3.1(+)/CAT--invitrogen--真核表达--wangjun2002274 0006--pQEx--Qiagen--原核表达--wangjun2002274 0007--pIVEX2.3--Roche--体外转录翻译--wangjun2002274 0008--pIRES-EGFP--/--/--luoqingli2003 0009--pET-28a（+）--Novagen--原核表达--wangjun2002274 0010--pSUPER Vector--oligoengine--siRNA--zyh961171 0011--pET-32a(+)--novagen--原核表达--Crazyvirus 0012--pBK-CMV--/--原核表达、真核表达--zrzhong6519 0013--pcDNA3.1/Zeo (+)--invitrogen--原核表达--Crazyvirus 0014--pcDNA3--invitrogen--真核表达--kras 0015--pfastbac1--invitrogene--昆虫表达--cox2wj 0016--pEGFP-C3--clontech--真核表达--smilely 0017--pSecTag2--invitrogen--真核表达--kenmed 0018--PYX212--/--真核表达--Gmail 0019--pET20b--Novagen--原核表达--Gmail 0020--pEGFP-1--BD BIO--转录调控--wyh 0021--pEGFP/U6 --/--siRNA--songbinn

想和大家讨论讨论原核表达载体

【建议】想和大家讨论讨论原核表达载体 原核表达载体，如pet系列，型号从小到大，那么多，往往让新手选择起来不知所措。所以希望和大家讨论讨论到底他们是怎么演变的，每个的优缺点，是不是号越大的就越好等新手们往往困惑不已的问题。 希望下面的讨论分系列进行，如pet系列、pgex系列等 这篇文章是我从网上找的关于pet载体的介绍，只要你耐心的看完，相信能有个基本的了解关于pet载体及应用。更详细的内容请高手进行补充 pET，原核表达金标准（转） pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein V ector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体 标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。

基因表达载体和重组质粒的区别

载体，质粒，基因表达载体3者有何不同？ 载体是一种运输工具，细胞膜上的蛋白质也是一种载体，其识别很单一，也因此有了选择透过性。 质粒是一种小型环状DNA，广泛存在于微生物中，一般的基因工程中，质粒被用来当做目的基因的运载体，也是一种运输工具。 基因表达载体是目的基因和运载体连接后的产物。 基因表达载体和重组质粒的区别 基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体， 首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。这个重组的DNA分子也叫重组质粒。 就是这样。简单的说，重组质粒是基因表达载体的一种。 生物学上marker是什么意思 从文字上说，标记（Marker），染色体上一个可以被识别的区域（比如限制性内切酶的酶切点，基因的位置等）。标记的遗传能够被检测出来。标记可以是染色体上有表达功能的部分（比如基因），也可以是没有编码蛋白质功能但遗传特性能够被检测出来的部分 从实验上说，marker有两种，一种是基因marker，一种是蛋白质marker。两种marker分别是进行琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE（蛋白质电泳）所用的标准参照物，用以指示目的基因或者蛋白的大小。 一般常称呼的marker都是指基因marker，即DNA marker DNA Marker 作为一种分子标记(Marker)，构建分子图谱。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。 DNA Marker 是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。 现在常用的DNA MARKER有两种，一种是病毒等DNA经过酶切获得的，分子量大小有零有整，另外一种是固定数值的，比如100BP，200BP等。 两种MARKER都不难制作，对于第一种，稍微难一些，主要是要获得病毒等大的基因组片段，然后用适当的酶切，切割完全以后，就能得到相应的图谱。第二中实际上很简单，如果你手头有任何一个载体，而且它的序列完全清楚，那么可以采用PCR的方法获得一系列大小不同的片段，比如上游引物可以使用一个，然后用数数的方法确定下游100BP处的下游引物，扩增出的就是100BP的片段，200BP处的引物就是200BP的片段，依此类推，可以获得一系列不同大小的片段，扩增后，把它们放到一起，就获得了自制的MARKER了

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

原核表达操作步骤及注意事项

原核表达操作步骤及注意事项 时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体自主复制的序列。 原核表达一般程序如下： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测 一、试剂准备 1、LB培养基。 2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

真核生物与原核生物基因表达调控的区别

原核生物和真核生物基因表达调控特点的比较1.相同点:转录起始是基因表达调控的关键环节2.不同点:A.原核基因的表达调控主要包括转录和翻译水平 真核基因的表达调 控主要包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次B.原核基因表达调控主要为负调控,真核主要为正调控C.原核转录不需要转录因子,RNA聚合酶直接结合启 动子,由sita因子决定基因表的的特异性 真核基因转录起始需要基础特异两类转录因子 依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用 调控转录激活D.原核基因表达调控主要采用操纵子模型 转录出多顺反子RNA 实现协调调节 真核基因转录产物为单顺反子RNA 功能相关蛋白的协调表达机制更为复杂。真核生物基因表达调控的环节主要在转录水平 其次是翻译水平。原核生物基因以操纵子的形式存在。转录水平调控涉及到启动子、sita因子 与RNA聚合酶结合 、阻遏蛋白 负调控 、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等。翻译水平的调控涉及SD序列、mRNA的稳定性 不稳定(5’端和3’端的发夹结构可保护不被酶水解mRNA的5’端与核糖体结合 可明显提高稳定性)、翻译产物及小分子RNA的调控作用。真核生物基因表达的调控环节较多 在DNA水平上可以通过染色体 丢失、基因扩增、基因重排、DNA甲基化、染色体结构改变影响基因表达。在转录水平主要通过反式作用因子调控转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与转录因子-DNA复合物的结合及转录起始复合物的形成。在转录后水平主要通过RNA修饰、剪接及mRNA运输的控制来影响基因表达。在翻译水平有影响起始翻译的阻遏蛋白、5’AUG、5’端非编码区长度、mRNA 的稳定性调节及小分子RNA。真核基因调控中最重要的环节是基因转录 真核生物基因表达需要转录因子、启动子、沉默子和增强子。葡萄糖存在 乳糖不存在 此时无诱导剂

E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的构建

E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的构建 【摘要】目的克隆E3泛素连接酶（homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3，HECTD3）基因及构建真核表达质粒。方法提取人卵巢癌细胞SKOV-3细胞RNA，并逆转录为cDNA，以此作为模板PCR法扩增HECTD3基因，将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+），测序验证构建质粒中包含HECTD3基因。结论HECTD3基因克隆及真核表达质粒构建成功，可以用于后续卵巢癌发生发展的分子生物学研究。 【关键词】E3泛素连接酶；卵巢癌；真核表达质粒 泛素化是一种蛋白质的翻译后修饰，参与调控多种生物学过程，其系统功能的紊乱与癌症发展进程密切相关[1]。HECTD3 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3）是一个功能目前尚未阐述清楚的新的E3泛素连接酶。有报道指出该基因可能在乳腺癌和宫颈癌中介导顺铂的化疗耐受[2]，但是目前尚未有人报道HECTD3在卵巢癌中的作用。且卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，仅2011年1年就导致全世界140000人死亡[3]。因此本文拟克隆HECTD3基因，并构建该基因真核表达质粒，对进一步研究HECTD3基因在卵巢癌发生发展中的作用提供有力的工具和手段。 1 实验材料 卵巢癌细胞SKOV-3、真核表达载体pCDNA3.1、大肠杆菌DH5α感受态由本室保存。RPMI-1640、胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司。PrimeSTARHS DNA Polimerase with GC Buffer、EcoR I和Nhe I限制性外切酶购自TaKaRa公司。Gel Extraction Kit购自omega公司，DL2000、1Kb DNA Marker购自天根生化科技有限公司。引物由invitrogen公司合成，测序也由该公司完成。其余试剂购自广州威佳生物有限公司。 2 试验方法 2. 1 HECTD3基因的扩增采用Trizol法提取SKOV-3细胞RNA，并逆转录成cDNA。以该cDNA为模板进行HECTD3基因的扩增，Forward Primer：5’-GGCgctagcATGGCGGGTCC-TGGCCCGG-3’，Reverse Primer：5’-GGCgaattcTCACTCCTCCCAAGGGCTCATGTCA-3’，其中小写黑体的序列表示酶切位点。PCR结果用1%琼脂糖凝胶检测。将扩增的目的条带用胶回收试剂盒回收，具体操作见说明书。 2. 2 pcDNA-HECTD3重组质粒的构建利用限制性内切酶NheI和EcoRI，37℃2 h消化真核表达载体pcDNA 3.1（+）和PCR扩增得到的HECTD3基因片段，回收载体和基因片段的酶切产物。T4 DNA Ligase 于16℃连接载体和基因片段。连接过夜后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆送invitrogen公司测序。