双荧光素酶报告基因检测系统

双荧光素酶报告基因检测: 一种结合萤火虫和海肾荧光素酶

检测的先进辅助报告基因技术

（原文在Promega notes 57第2页）

摘要

在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验误差。但是，传统的辅助报告基因(例如，CAT,β-Gal或GUS)却不够便利,因为各自的检测化学,操作要求,测量特点有很多不同之处。普洛麦格公司提供一种先进的双报告基因技术,是萤火虫荧光素酶检测和海肾荧光素酶检测的组合。使用双荧光素酶报告基因检测系统,再结合一套pRL（或phRL、phRG）载体系统，即表达第二个报告基因海肾荧光素酶的载体系统,就可以在单管中进行双荧光素酶报告基因的检测,极为快速、灵敏、简便。系统还提供被动裂解液（PLB）,用来裂解在多孔板中培养的哺乳动物细胞并定量溶解两种荧光素酶,不必要对每一个样品分别进行单独操作。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员，双荧光素酶报告基因检测系统将使他们立即体会到该系统的便利。

介绍

两个报告基因用在一个实验系统中，是为了进行相互测量，或称为比率测量。通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的测量结果正态化。在测量基因表达时，双报告基因通常用于培养细胞的瞬时转染，即：一个含有实验用报告基因的载体与第二个作内对照的，含不同报告基因的载体共同转染培养细胞。一般是将实验用报告基因与调控启动子偶联在一起,研究被调控基因表达的结构或生理基础。报告基因表达活性的相对改变与偶联的调控启动子的转录活性的改变相关。为了提供一个转录活性的内对照, 第二个报告基因与一个组成型启动子偶联，这个启动子不受各种实验条件变化的干扰。通过这种方法, 有可能把可能削弱实验准确性的内在因素的变化降到最小, 这些内在因素包括：培养细胞的数目和健康状况的差别, 细胞转染和裂解效率的差别等。

使用萤火虫荧光素酶, 结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因, 近几年已普遍使用。然而，这些辅助报告基因组合却削弱了荧光素酶的性能优势。比如荧光素酶的检测和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS的检测是末端检测，在定量前需要长时间的温育。另外,这些除荧光素酶以外的报告基因仅有有限的灵敏度和线性应答范围, 实验时必须小心，不要超过这些范围。细胞内源活性也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达, 不利于准确定量报告基因表达。还有，内源去乙酰酶活性也干扰CAT的活性检测。尽管在高温下预处理细胞裂解液(1,2), 可以降低内源性β-Gal和CAT对检测的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。因此,在此类双报告基因测量实验中, 必须分开，并以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。

理想的双报告基因方法应该使使用者能够以检测萤火虫荧光素酶的速度,灵敏度和线性范围，对同一样品中的两个报告基因进行检测。这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS，因其检测化学,操作要求所固有的局限，是不可能做到的。相反,通过组合萤火虫(Photinus pyralis)和海肾(Renilla reniformis)两种荧光素酶，普洛麦格公司的双荧光素酶报告基因检测(DLR)系统

以一体化的单管配方，满足了这些要求。

双荧光素酶报告基因检测化学

虽然荧火虫和海肾荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的检测特点, 但它们却具有完全不同的进化起源, 因而它们的酶结构和底物要求完全不同。我们利用这些差别发展了DLR 检测化学, 选择性地区别这两种发光报告基因的活性。萤火虫荧光素酶是一个61kDa单亚基蛋白质, 酶活性不需翻译后修饰(3,4)。因此，一旦翻译完成即具有遗传报告基因的功能。在ATP, Mg2+和O2存在下，通过甲虫荧光素的氧化反应放出光子(图1) 。在传统反应条件下, 荧光素的氧化要经过一个荧光素-AMP中间体, 转换非常缓慢。结果, 这种检测化学在底物和酶混合后产生一种"闪烁"光, 并迅速衰减。现在，普洛麦格公司在获得专利的定量检测萤火虫荧光素酶活性的试剂中加入了辅酶A (CoA), 通过加快酶转换(5)提供改进的反应动力学, 从而得到延长的"辉光"荧光信号(图2) 。

海肾荧光素酶是一个36 kDa单亚基蛋白质，纯化自自然界来源的Renilla reniformis(6)，含有3%的碳水化合物。如同萤火虫荧光素酶，海肾荧光素酶的活性也不需要翻译后修饰，一旦翻译完成即可行使遗传报告基因的功能。海肾荧光素酶利用O2和腔肠荧光素(coelenterazine)催化发光反应(图1)。当应用DLR检测化学操作时，海肾荧光素酶的反应动力学产生辉光型荧光信号，并在测量过程中缓慢地衰减(图2)。

在DLR检测系统中，萤火虫和海肾荧光素酶的活性是从同一裂解液中分步测量的。在完成萤火虫荧光素酶活性("实验"报告基因)的测量后，萤火虫荧光被快速淬灭，并在这同时激活海肾荧光素酶的荧光反应 ("对照" 报告基因的活性)。因此，DLR检测系统综合了两个检测化学，对来自转染细胞裂解液或无细胞转录/翻译反应中共同表达的两个报告基因快速地提供定量结果。

萤火虫荧光素酶检测的线性范围延伸达酶浓度的8个数量级，可检测≤1fg (大约10-20摩尔)的实验报告基因酶(图3A)。用双荧光素酶报告基因检测系统，海肾荧光素酶的线性范围达酶浓度的7个数量级，对照报告基因酶检测的底限≤10fg (大约3×10-19摩尔) (图3B)。此外，这两个酶表现的特异性活性相似。

图1. 由萤火虫和海肾荧光素酶所催化的生物发光反应

图 2. 用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测到的萤火虫和海肾荧光素酶产生的荧光。用pGL3 -Control和pRL-SV40载体DNA共同转染CHO细胞(1×10 6个细胞/60mm培养皿)。细胞用PBS洗涤后，加入400μl的 PLB 并刮下细胞，制成裂解液。分出20μl的细胞裂解液，并将其和100μl的荧光素酶检测试剂II(LARII)混合，立即用荧光发光计测量萤火虫荧光素酶的活性(绿线)。然后，在荧光发光计试管中加入100μl 的Stop &Glo TM 试剂，以淬灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活海肾荧光素酶反应，并立即测量海肾荧光素酶的活性(蓝线)。此实验使用Turner Designs 型号20e荧光发光计，配合一台计算机来示踪在12秒钟检测时间段内的荧光发射情况。

图3. 萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶发光反应的线性范围。纯化的萤火虫和海肾荧光素酶经含有1mg/ml BSA 的1×PLB缓冲液连续稀释。使用配有计算机的Turner Designs荧光发光计20e型，在经过一个初始2秒的预读延迟后，确定两种荧光素酶在各种不同浓度时，在10秒钟内的总荧光。

图4. 用手动操作的荧光发光计，或配有一支试剂进样器的荧光发光计进行双荧光素酶检测的方法。如果荧光发光计配有两个进样器，则将裂解的样品预先分装到荧光发光计的试管中，随后按次序自动加入Luciferase Assay Reagent II(LAR II) 和Stop & Glo TM试剂。

双荧光素酶报告基因的检测方法

对两个荧光素酶报告基因的定量可在细胞裂解之后立即进行，而不需要等分样品或对样品做其它处理。因为海肾和萤火虫荧光素酶都表现辉光型反应动力学，因此进行双荧光素酶报告基因检测的荧光发光计不需要配备试剂进样器。

图4表示一个典型的DLR检测，需要30秒时间完成。将一份裂解物与萤火虫检测试剂II (LAR II)混合，即启动萤火虫荧光素酶报告基因检测。萤火虫荧光素酶报告基因检测一旦结束，就向样品试管中加入Stop&Glo?试剂，这个试剂可即刻淬灭萤火虫荧光并同时激发海肾荧光。Stop&Glo?试剂可在1秒内淬灭>105倍的来自萤火虫反应的荧光信号(图5)。海肾荧光素酶的同时激活过程也在1秒内完成。

图5. 双荧光素酶报告基因检测系统淬灭萤火虫荧光素酶荧光并激活海肾荧光素酶荧光。已被共同转染了pGL3 -Control和pRL-SV40载体DNA的CHO细胞裂解液按图2所描述制备。萤火虫荧光素酶（报告基因 #1）和海肾荧光素酶(报告基因 #2) 活性在2秒钟预读延迟之后，由荧光发光计在10秒钟时间段内检测荧光。为了显示Stop & Glo TM试剂淬灭报告基因 #1的高效率，在检测萤火虫荧光素酶活性后，在样品中添加等体积的Stop & Glo TM缓冲液(缓冲液中缺少腔肠荧光素，因而无法激活海肾荧光素酶反应)，以淬灭萤火虫荧光素酶荧光却不激活海肾荧光素酶荧光。在这一实验中，淬灭的萤火虫荧光素酶反应的残留荧光小于未淬灭反应值的0.0004%

被动裂解液(Passive Lysis Buffer)

被动裂解液 (PLB)，经特别设计可有效裂解培养的哺乳动物细胞，而不必刮下贴壁细胞或作冻融循环。尽管PLB被设计应用于被动裂解中，但它可靠的裂解效果同样有益于用传统样品处理方法制备的裂解液。无论使用何种裂解方法，对培养的哺乳动物细胞而言，释放到PLB 裂解液中的萤火虫和海肾荧光素酶的报告基因酶都是可靠而定量的(图6)。被动裂解液的一个明显优点，是可以抑制低水平的非酶促荧光(自发荧光)，自发荧光是腔肠荧光素在水溶液中的固有特点。普遍使用的一些制备细胞裂解液的试剂可增强腔肠荧光素的自发荧光，这些试剂包括Triton?X-100, 普洛麦格公司的细胞培养裂解试剂 (CCLR) 和报告基因裂解试剂 (RLB)。另外，这些试剂还会显著抑制海肾荧光素酶的荧光反应。PLB经特别设计，可最大程度地增强荧光素酶活力，并使自发荧光减弱到最低，以提供最优的检测灵敏度，定量很低水平的海肾荧光素酶(图7)。除去以上优点外，PLB支持萤火虫和海肾荧光素酶这些报告基因酶在哺乳动物细胞裂解液中的长期稳定性(图8)。而且，PLB抑制样品泡沫，非常适合于高通量应用，可将培养在一系列多孔板中的细胞制备成裂解液，在自动化系统中进行检测。

pRL家族的海肾荧光素酶对照载体

pRL载体系列是为在哺乳动物细胞中组成性地表达海肾荧光素酶而设计的。这些载体含有克隆自Renilla reniformis(7)的海肾荧光素酶cDNA(Rluc)，在Rluc基因中导入了3个碱基替换以消除其内部的Bgl II, BamH I和Nar I 酶切位点。但这些突变没有改变所表达海肾荧光素酶的氨基酸序列。现有的pRL载体有几种启动子构型，可同任一萤火虫荧光素酶实验载体组合，

作为实验报告基因活性的内对照。

图6. 使用PLB和被动或主动裂解方法裂解哺乳动物细胞的效率。用pGL3-Control 和pRL-SV40载体DNA 共同转染图示类型的哺乳细胞培养物。用两种方法制备裂解液：向贴壁细胞加入PLB后，或温和摇动培养液15分钟(被动细胞裂解)；或从培养皿中刮下贴壁细胞，在-80℃进行1次冻/融循环(主动细胞裂解)。萤火虫和海肾荧光素酶的活性用DLR检测确定，如图4所示。为了便于比较，用主动裂解方法处理的细胞所测得的报告基因活性被定为基准100%。图A：萤火虫荧光素酶报告基因活性。图B：海肾荧光素酶报告基因活性。

图7. 裂解缓冲液组份对腔肠荧光素自发荧光的影响。未经转染的对照(NTC)CHO细胞分别用CCLR (目录号#E1531)， RLB (目录号#E3971)或PLB制备裂解液，然后按图2所描述的方法，用DLR 检测系统检测等量各样品自发荧光情况。腔肠荧光素的自发荧光在加入Stop & Glo TM试剂(含腔肠荧光素)后在10秒钟时间段内测量。在没有Stop & Glo TM试剂时，未能检测到荧光(数据未显示)。

pRL-TK

载体pRL-TK (图9)在Rluc上游含有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶 (HSV-TK) 的启动子区域。HSV-TK启动子在胚胎和成熟的哺乳动物组织细胞中，都可低水平、组成性地进行表达(8, 9)。

图8. 用Passive Lysis Buffer 制备的细胞裂解物中萤火虫和海肾荧光素酶的稳定性。用pGL3-Control 和pRL-SV40载体DNA共同转染培养在标准6孔板中的CHO细胞 (2.5 ×105个细胞/孔) 。培养30小时后，将培养液吸干，每孔中的附着细胞用PBS洗涤一次。制备裂解液时向每一孔中加入500μl的Passive Lysis Buffer，在室温轻轻震荡15分钟。立即检测每一份裂解物中萤火虫和海肾荧光素酶的活性，然后分装，保存在22(

℃室温)、4℃，或-20℃。保存的样品在图示时间间隔重新检测。检测按图5所描述的方法进行；每一个竖条代表同样处理状况的3份细胞裂解样品检测所得的平均值，每一裂解样品经2次检测。

图9. pRL-TK载体的环形图。附加描述: 内含子的位置，R luc,编码海肾荧光素酶的cDNA，Amp?, 在E.coli中编码氯苄抗性的基因，ori,在E.coli中质粒复制起点。Rluc和Amp r基因中的箭头表示转录的方向。pRL- SV40

载体pRL- SV40含SV40早期增强子/启动子区域，在多种细胞中，可高强度、组成性地表达Rluc。载体pRL-SV40还含有SV40的复制起始点，可在诸如COS-1或COS-7这些表达SV40大T抗原的细胞中(10)，瞬时、附加体式地自我复制。

pRL-CMV

载体pRL-CMV含CMV早早期增强子/启动子区域，在多种细胞类型中，可高强度、组成性地表达Rluc。 CMV增强子/启动子的这种不区分细胞类型的特性可由转基因小鼠实验证

明，在检测的28种小鼠组织中，在24种组织中观察到由CMV增强子/启动子引导的转录行为(11)。

pRL-Null

载体pRL-null无真核启动子和/或增强子序列，在Rluc上游有一些单一酶切位点，以提供最大灵活性来克隆进所需的启动子序列，启动海肾荧光素酶的表达。

图9所显示的pRL-TK载体展示了所有pRL载体的共有特点。在每个pRL载体的指定启动子的紧下游是一个嵌合的内含子，这个内含子可增强海肾荧光素酶的表达。这个内含子的5'-供体剪切位点来自人beta-珠蛋白质内含子1，内含子的分枝点和3'-受体剪切位点来自免疫球蛋白基因重链可变区域的一个内含子(12)。供体和受体剪切位点的序列，以及分枝点的序列均经过改进，以匹配最佳剪切的共有序列(13)。在Rluc的紧上游是T7启动子序列，可在体外合成海肾荧光素酶的转录物。Rluc的下游是SV40晚期poly (A)序列, 提供有效的转录终止和进行mRNA多聚腺苷酸化(14)。pRL系列载体均含有原核复制起点和β-内酰胺酶基因，可在大肠杆菌中进行质粒的选择性扩增。

小结

在双遗传报告基因的应用中，一个报告基因活性的改变，与基因表达的特定实验条件相关，而第二个报告基因的组成性活性则提供内对照，使实验值可以正态化。普洛麦格公司的双报告基因检测系统，在单管中检测两个荧光素酶报告基因，这两个荧光素酶报告基因具有兼容的化学特性、操作条件、速度、灵敏度、线性范围、和仪器需要。荧火虫和海肾荧光素酶检测的组合，匹配pRL(或phRL，phRG)载体，提供了双遗传报告基因应用的理想检测系统。使用标准的荧光发光计可在30秒内手动完成检测。而且，特别设计的被动裂解液，可快速、高效地将培养在多孔板中的细胞裂解，并使萤火虫和海肾荧光素酶具有最佳检测灵敏度和稳定性。双报告基因检测系统做体内报告基因应用的优势，也同样体现在无细胞体系的应用，比如体外转录/翻译反应中。

参考文献

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