紫外诱变育种方案

紫外诱变大肠杆菌str(链霉素)抗性突变株的筛选

一、目的要求

1 、观察紫外线对链霉素产生抗性的诱变效应

2 、学习并掌握物理诱变育种的方法。

二、基本原理

紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。

经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。三、实验材料

(一) 菌种

大肠杆菌

(二) 培养基（完全培养基）

1. 肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏 0.5 g

蛋白胨 1.0 g

NaCl 0.5 g

水 100 mL

pH 7.2

100 KPa 、121℃高压蒸汽灭菌20min。

如配制固体培养基需加琼脂1.5%～2%。

如配制半固体培养基则加琼脂0.7%～0.8%。

(三) 主要药品

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、链霉素。

(四) 主要器皿

试管30支、移液管1mL10支、5mL3支、10mL1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。

四、实验内容

(一) 诱变

1. 菌悬液的制备

出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16～24h。

取已培养20 h 的活化大肠杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，取4mL 于5mL离心管中离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块制成单菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。

2. 平板制作

将肉膏蛋白胨培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板。待平板完全冷却后，取0.1mL 链霉素用无菌棒涂布于平板上。其中留三块平板不涂布链霉素作为对照。

3. 诱变处理

(1) 预热正式照射前开启紫外灯预热30 min。

(2) 搅拌取制备好的菌悬液5 mL 移入6 cm 的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌捧，置磁力搅拌器上，20 W 紫外灯下30 cm 处。

(3) 照射然后打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为5s，10s，15s。可以累积照射，照射完毕先关上皿盖再关闭搅拌和灯。所有操作必须在红灯下进行。

4. 稀释涂平板

在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5mL 进行适当稀释分离。取最后3 个稀释度的稀释液涂于肉膏蛋白胨平板上，每个稀释度涂3 个平板，每个平板加稀释液0.1 mL，用无菌玻璃刮棒涂匀，37℃培养48 h(用黑布包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别。

(二) 计篡存活率及致死率

1. 存活率

将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。

存活率 =处理后1 mL 菌液中活菌数÷对照1 mL 菌液中活菌数

2. 致死率

致死率 =（对照1 mL 菌液中活菌数—处理后1 mL 菌液中活菌数）/对照1 mL 菌液中活菌数

3.突变率

自发突变率＝诱变前样品中Str抗性菌数/诱变前活菌数

突变率＝后培养以后样品中Str抗性菌数/后培养以后样品中的活菌数

同样计算用紫外线处理5s、10s、15s、后的存活细胞数及致死率。

（三）诱变后培养

1.取1mL诱变处理好的菌悬液接入肉膏蛋白胨液体培养基中进行后培养，37℃120rpm摇瓶避光培养；

2.对后培养的菌悬液进行平板菌落计数。

（四）菌株的筛选

1.将经过诱变后培养的菌悬液适当稀释后，分别涂布于含最小抑制浓度的链霉素培养基平板上，37℃培养长出的菌落即为链霉素抗性突变株。

2.计抗性菌落数，计算诱发突变率，观察紫外诱变的效果。

五、实验数据记录与处理

（一）将实验结果按表要求如实填入，并分别算出存活率，致死率。

表1 紫外线处理后枯草芽孢杆菌的存活率及致死率

对照组

微生物的诱变育种 作者：佚名来源：生物秀时间：2008-4-18 实验仪器大全实验试剂大全 一、实验目的和内容 目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。 内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。 2．用紫外线进行诱变处理。 3．用平板透明圈法进行两次初筛。 4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。 二、实验材料和用具 米曲霉斜面菌种； 豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白； 三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、操作步骤 (一)出发菌株的选择及菌悬液制备 1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2. 菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。 (二)诱变处理 用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。 1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。 2．稀释菌悬液按10 倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。 (三)优良菌株的筛选 1. 初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。 2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。3．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，

诱变育种流程及紫外诱变育 种的详细步骤 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

诱变育种的一般步骤： 1.首先是天然菌种的选育： 调查研究及查阅充分的资料 ↓ 设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境 采样 ↓确定特定的增殖条件 增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法 平板分离 ↓ 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选 ↓ 初筛（1株1瓶） ↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶） ↓ 3～5株 ↓ 单株纯种分离 生产性能试验 →毒性试验 菌种鉴定 2.诱变菌种：

出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。 诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。2)挑选优良的出发菌株。最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。4)处理单细胞或孢子悬液。单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。5)选用合适的诱变剂量。一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。6)选用高效的筛选方法。 紫外线诱变育种： 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253- 265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不

紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株 一、实验目的 1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。 2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。 二、实验原理 紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。 三、实验材料 1.菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌 2.器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10m L离心管、（1、5、10m L）吸管、250m L三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球 3.培养基和试剂 ①无菌水、75%酒精 ②0.5％碘液碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200m L，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。 ③选择培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，N a C l0.5g，琼脂2g，蒸馏水100m L，p H6.8～ 7.0，121℃灭菌20m i n。 ④肉汤培养基牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，N a C l0.5g，蒸馏水100m L，p H7.2～7.4，121℃灭菌20m i n。 四、实验步骤 1.菌体培养取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20m L肉汤培养基的250m L三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。 2.菌悬液的制备取5m L发酵液于10m L离心管中，以3000r/m i n离心10m i n，弃去上清液。加入无菌水9m L，振荡洗涤，离心10m i n，弃去上清液。加入无菌水9m L，振荡均匀。 3.诱变处理将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30c m）照射0.5-1m i n。 4.取0.1-0.2m L诱变后菌悬液于选择培养基平板上，用涂布器涂匀。置37℃暗箱培养48h。 5.在长出菌落的周围滴加碘液，观察并测定透明圈直径（C）和菌落直径（H），挑选C/H 值最大者接入斜面保藏。 五、注意事项 1.紫外线对人体的细胞，尤其是人的眼睛和皮肤有伤害，长时间与紫外线接触会造成灼伤。故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。 2.空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。臭氧过高，会引起人不舒服，同时也会影响菌体的成活率。臭氧在空气中的含量不能超过0.1％-1％。 六、结果与讨论 1.利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?

实验三紫外线的诱变育种（学时：4） 一、目的要求 通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。 二、基本原理 紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。 三、菌种与仪器 菌种：枯草芽孢杆菌； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四、操作步骤 1.菌悬液的制备 A、取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。 B、将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。 C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。 2.平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。 3.紫外线处理 A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟。 B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。 C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。 4.稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。 5.涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。 6.培养 将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。 7.计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。 8.观察诱变效应

蛋白酶产生菌的紫外诱变育种 xxxx大学生命科学学院生物工程第一组 前言: 因为自发突变率小，以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是紫外，紫外诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。 本次实验通过比较对照组和紫外诱变1min、5min、10min的实验组菌落的生长情况和水解圈的情况，可以很好的了解紫外诱变的效果。初步的说明诱变育种为筛选高效，稳定的菌种提供了有效可能的方法。 1 实验材料与方法 1.1 材料 1.1.1样品：老师提供的生长较好的菌液 1.1.2培养基及其配制 1）液体培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，NaCl 1.0g，pH7.0～7.5，H2O 定容至100ml。配好50ml/三角瓶，分装两瓶每瓶50ml.包扎112℃，灭菌30min。 2）固体培养基（300ml）:牛肉膏0.9g，蛋白胨3g，NaCl 3g，H2O 定容300ml，pH值7.0。配好后，按100ml/瓶分装三瓶, 分别称取1.5g琼脂条塞入三角瓶，包扎，112℃，灭菌30min。 取牛奶粉25g用250ml水溶解，包扎，116℃，灭菌15min。按10%分别加入上述3个三角瓶中，每个三角瓶10ml。混匀后，倒平板。 1.1.3生理盐水：取Nacl 1.8g 溶解在200ml的水中，即配制0.9%的生理盐水。 1）每支试管中加入4.5ml蒸馏水，塞上试管塞，22支试管分4组分别包扎； 2）剩下的生理盐水装入三角瓶包扎； 112℃灭菌30min。 1.1.4器材 血球计数板，显微镜，紫外诱变箱，红灯泡， 移液管，涂布棒，含有7颗玻璃珠的空三角瓶等，112℃灭菌30min。 1.2 方法 1.2.1 菌株的培养 从老师给的菌悬液各取50ul接入2个液体培养基，37°C，220rpm，震荡培养过夜。 1.2.2出发菌株菌悬液的制备 1）取出发酵培养基，从生长良好的一瓶取20ml倒入50ml离心管中5000转离心5分钟，弃上清，倒扣离心管于滤纸上吸干残留培养基； 2）加30ml无菌生理盐水，重新震荡悬浮菌体，再离心，弃去上清；重复一次； 3）重复上述步骤加入5ml生理盐水恢复成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，逐步添加生理盐水调整细胞浓度为108/mL； 4) 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡10~20min，以打散细胞； 5）取0.5ml 菌悬液进行10-1——10-7稀释分离，取10-5、10-6、10-7三个稀释度，每一梯度取100ul

紫外线诱变育种高产纤维素菌 实验方案 诱变方案：纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验. 实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱变出高产纤维素酶的菌种。 实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。 材料和器皿： （1）菌种：木霉单孢子 （2）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。 （3）器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml）,150ml三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。 （4）仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。 实验步骤： 紫外线诱变育种 单孢子悬液制备：用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散30min，4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。

稀释对照菌液（未照射菌液） 将未经照射的菌液稀释成10-1~10-6，然后从10-5,10-6两管中各吸取0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于32度条件下培养过夜，第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。 UV 诱变：取单孢子悬液5mL 于直径9cm 的培养皿内， 同时放入无菌搅拌子，在磁力搅拌器 ．．．．．的搅拌下置于15W 紫外线灭菌灯下30cm 处分别处理0s.30s、1min、2min、3min、5min、7min、9min、11min。在红灯下稀释适当倍数，0.1mL 涂PDA 平板，30℃避光培养过夜。诱变致死率检测：分别取等量的不同诱变时间的菌液和未诱变菌液涂布于PDA 平板，30℃培养72h。以未诱变菌液培养后的菌落数为基准计算 不同诱变时间的致死率，选择致死率较高的诱变菌液继续检测其产纤维素酶的能力。致死率(％)=（对照皿的菌落总数-诱变处理后的菌落总数）／对照皿的菌落总数×100 筛选培养基的选择 ．．．．．．．．:．挑取孢子接种到PDA 斜面培养基上活化，28℃ 培养72h。通过点样法分别接种于平板筛选培养基1和培养基2 上，28℃培养72h。观察不同培养基上纤维素酶生产菌的透明圈大小，以确定合适的选择培养基，为进一步筛选做准备. 最佳筛选培养基的确定（对比） 经观察，如果发现平板筛选培养基1 中透明圈较小，平板筛选培养基2（改良培养基）中菌落周围透明圈较明显，因此选择平

大肠杆菌紫外诱变实验 【实验目的】初步掌握诱变方案的设计和紫外诱变的实验手段。理解自发突变和紫外诱变的机理，分析不同诱变目的、诱变手段和诱变筛选在诱变应用中的关系。了解诱变育种在微生物工业中的作用。 【实验原理】微生物菌种质量优劣对发酵工业具有至关重要的作用，由于自然界中的菌种一般在生产上都有不同程度的缺陷，而且自然突变频率低，突变幅度小，单纯依靠自然界中微生物群体来进行的自然选择有很大的局限性，往往不能满足实际生产的需要。因此现在的微生物发酵生产菌种绝大多数都是经过人工改造的，而菌种改造有诱变改造和基因改造两方面。虽然现在基因工程菌已经成为越来越重要的菌种改造方式，但通过物理化学诱变对菌种品质进行改造仍然是工业生产菌重要的来源。 诱变分为物理诱变和化学诱变。物理诱变采用紫外光、X射线、射线、射线、射线、快中子和超声波等，其中紫外光诱变因其效果好、实验设备简单等优点而成为应用最广泛的物理诱变剂。 而化学诱变则是采用一些可以和DNA起作用，改变其分子结构，最终引起遗传改变的化学物质对诱变对象进行处理，得到诱变菌种的方法。实验室中常用的有亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝酸胍等（这3种诱变剂诱变效果依次增加，毒性也依次增大）。 物理诱变往往被分为电离辐射和非电离辐射，常用的电离辐射有X射线、射线、射线、快中子等。电离辐射的特点是穿透力强，对生物作用分为直接作用和间接作用。辐射的直接作用是指辐射所产生的直接物理损伤，是由于能量量子直接与染色体作用而造成的原始损伤，是一种物理作用；而辐射的间接作用则是一种化学作用，是由于生物细胞中的水分子受到辐射作用产生各种自由基，这些自由基和溶质分子或直接和染色体发生作用产生遗传损伤。 由于不同作用的时效差别，辐射的作用过程大体可分为物理、物理化学、化学和生物学效应等4个阶段，时效发生可以从10-12s到几年。辐射中常采用的剂量单位为伦琴（R）。一个伦琴相当于在00C及101325Pa（760mmHg）下，每立方厘米干燥空气中能产生个离子对的电离剂量。 此外还有拉德（rad）、尔格（erg）、居里（Ci）等单位。其换算关系如下： 1rad=100erg/g=10- 次衰变/秒 非电离辐射最典型的就是紫外线，其电磁波谱位置为40~390nm。而由于DNA分子的紫外吸收峰位于260 nm。因而波长在200~300 nm之间的紫外线被用于紫外诱变。紫外诱变时的剂量与所用紫外灯管的功率以及照射距离和照射时间相关，实验中往往采用改变照射时间来改变照射剂量。由于照射致死率在95%~99%的时候回复突变株出现率最高，因而实践中多用70%~80%的致死率进行诱变。 化学诱变和物理诱变相比主要的差别是诱变的特异性强，往往专一作用于DNA分子的特定结构。化学诱变主要分为4大类：碱基类似物、烷化剂、移码突变剂和其他类。 由于不同的化学诱变剂性能差别很大，在使用前必须对影响其效果的温度、PH值、光照、溶剂等做清楚的分析，同时对其半衰期、毒性及防护也要充分了解，这样才能保证使用的有效性和人体安全性。化学诱变的剂量是由使用浓度和处理时间决定的，操作中可以根据需要选择高浓度短时间处理或是低浓度长时间处理。 在诱变中制定好诱变方案是很重要的，诱变育种包括诱变和筛选两步。首先制定一个明确的筛选目标，因为诱变是不定向的，我们必须采用定向的筛选方法将我们所需要的菌株从原始菌和突变株中分离出来，同时还应考虑选出的菌种在生长速度、温度适应、产孢子等方面不能产生过多不适应生产的变化。 在充分考虑了实验的工作量要求后结合本实验室的人力、物力和时间要求提出诱变和筛选方案。在筛选方法选择中要考虑到兼顾筛选色工作量和可信度。当筛选方法可信度高时，往往检测方法是比较繁琐的（尤其是涉及一些蛋白质或氨基酸含量变化的突变类型）。这时为了提高筛选工作量往往降低筛选的可信度，减少筛选的繁琐程度，而在复筛中进一步加以确定。根据筛选目的和实验室条件选用合适的诱变剂。筛选方案确定后，不要经常改变，保持工作的稳定性，这样有利于总结提高。 本实验以大肠杆菌为材料，选择紫外线为诱变剂，进行诱变处理：筛选青霉素抗性菌，绘制致死曲线并计算诱变率。

实验十一紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 Ⅰ、紫外诱变技术 一实验目的 以紫外线处理细菌细胞为例,学习微生物诱变育种的基本技术。了解紫外线对细菌细胞的作用。 二实验材料与用具 菌株:大肠杆菌(Escherichia coli) 培养基:营养肉汤(nutrient broth)固体与液体培养基 生理盐水等 器皿:10ml及1ml的移液管,无菌试管,无菌培养皿,无菌三角瓶(内有无菌的玻璃珠20~40粒),无菌漏斗(内有两层擦镜纸),无菌离心管,离心机,紫外诱变箱等。 三实验原理 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小,一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率,可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效就是UV,UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯,其光谱比较集中在253、7nm处,这与DNA的吸收波长一致,可引起DNA分子结构发生变化,特别就是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体,从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产与科研中可利用此法获得突变株。 四实验内容 1、对出发菌株进行处理,制备单细胞悬液; 2、紫外线进行处理; 3、用平板菌落计数法测定致死率;

五 操作步骤 (一)出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基,37℃培养16~24h; 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基,37℃ 110rpm 振荡培养过夜(约16h),第二天,以 20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基,继续培养2~4h; 3. 取4ml 培养液与5ml 离心管中,10000rpm 离心3~5min,弃去上清液,加4ml 无菌生理 盐水,重新悬浮菌体,再离心,弃去上清,重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液; 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内,振荡20~30min,以打散细胞; 5. 取诱变前的0、5ml 菌悬液进行适当稀释分离,取三个合适的稀释度倾注肉汤平板, 每一梯度倾注两皿,每皿加1ml 菌液,37℃倒置培养24~36h,进行平板菌落计数。 (二)UV 诱变 1. 将紫外灯打开,预热30min; 2. 取直径6cm 的无菌培养皿(含转子),加入菌悬液5ml,控制细胞密度为107~108个/ml; 3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上,静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋 纽进行搅拌,然后打开皿盖,分别处理5s 、10s 、15s 、30s 、45s,照射完毕后先盖上皿盖,再关闭搅拌与紫外灯; 4. 取0、5ml 处理后的菌液进行适当稀释分离,取三个合适的稀释度倾注肉汤平板进 行计数(避光培养)。 六 实验结果 对平板菌落进行计数,并计算死亡率。 %100///?-=ml ml ml 照射前活菌数照射后活菌数照射前活菌数死亡率

毕业论文开题报告 环境工程 紫外线诱变改善酵母菌细胞表面性质研究 一、选题的背景与意义 紫外线是常用的物理诱变因子, 是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力,最大的吸收峰在260nm。紫外辐射能作用于DNA ,因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。对于紫外的作用已有多种解释,但研究的比较清楚的一个作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体,即两个相邻的嘧啶共价连接[。二聚体出现会减弱双键间氢键的作用,并引起双链结构扭曲变形,阻碍碱基间的正常配对,从而有可能引起突变或死亡。二聚体的形成，会妨碍双链的解开,因而影响DNA的复制和转录。紫外辐射可以引起转换、颠换、移码突变或缺失等。 日本于20世纪70年代就有人进行了利用酵母茵处理废水的探索性研究。并于90年代成功地实现了酵母茵废水处理技术的工程应用。日本一制油厂利用酵母处理高含油废水，对于平均含油量达11900mg/L的废水，除油率可达99%。此外，通过在反应器中接入功能菌株能增加目标底物的降解，降低其毒性。同时也可以缩短降解时间，酵母已被成功应用于处理高浓度含油废水以及石油的脱蜡等。然而，在酵母菌处理废水的实际运行中，酵母菌对废水的处理效果往往受到其表面性质的影响而不够理想。因此，可利用紫外诱变得到疏水性好、乳化能力强、絮凝性好的酵母菌菌株，并进行连续培养得到遗传性状稳定的菌株。从而使酵母菌对废水中COD的去除率提高。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 基本内容： 1．综述紫外诱变育种（微生物）的方法和技术路线； 2．设计实验，诱变酵母菌细胞； 3．考察诱变后酵母细胞表面性质的变化；细胞表面性质：疏水性、絮凝性、乳化能力等； 4．筛选对于废水处理有益的诱变菌株，主要是COD降解能力高、絮凝性好等特点。 拟解决的主要问题: 通过紫外线照射酵母菌对其进行诱变，再以相应的分析方法分析诱变所得菌株的疏水性、絮凝性以及乳化能力，筛选出COD降解能力强、絮凝性好的对废水处理有益的酵母菌菌株。 三、研究的方法与技术路线： 1、技术路线： ①构建紫外诱变酵母菌实验台，对培养所得的酵母菌进行紫外诱变。 ②建立对诱变所得的酵母菌菌株进行表面性质的定性定量分析方法，主要分析酵母菌的疏水性、

紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 姓名：张鑫淼班级：生工1301 一．实验目的 以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。 了解细菌抗药性突变株的筛选方法 二．实验材料 菌株：大肠杆菌（Escherichia coli） 培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基 试剂：2mg/ml链霉素，（Str）母液，无菌生理盐水。 仪器：1ml的移液管17个，10ml移液管11个，无菌试管9个，无菌培养皿15个，无菌三角瓶7个（其中一个内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管1个，离心机，紫外诱变箱等 营养肉汤蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH 7.4 营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL 三．实验原理 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。 链霉素属氮基糖昔类抗生素，其杀菌机理是作用于核糖体小亚基，使其不能与大亚基结合组成有活性的核糖体，从而阻断细菌蛋白质的合成。细菌对链霉素产生抗药性的作用机理一般是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其他基因发生突变，导致相应的核糖体蛋白发生改变，是蛋白质合成不再受链霉素抑制。 四．实验内容与操作步骤 （一）出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h； 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h； 3. 取1ml培养液与1.5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液； 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内（预先加入9ml无菌生理盐水），振荡20~30min，以打散细胞； 5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。同时选取合适浓度的菌悬液0.1ml涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h,进行诱变前抗药菌落计数。 （二）UV诱变 1. 将紫外灯打开，预热30min； 2. 取直径6cm的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml，控制细胞密度为107~108个/ml；

紫外线诱变育种 摘要：紫外线诱变操作简单、对实验设备要求低，是目前被广泛运用的一种物理诱变剂，人们利用紫外线诱变得到了大量的优秀菌种。本文论述了紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围及研究进展。 关键词：紫外线诱变育种微生物 目前微生物发酵技术被广泛的应用到许多生产行业，如生产啤酒、白酒、乳制品、酶制剂、抗生素等行业，同时微生物在解决人类的粮食能源、健康、资源和环境保护等问题中正显露出越来越重要且不可替代的独特作用[1]。但就目前被投入工业化使用的工业菌大多在生长周期、培养基、产率等方面不能满足工业生产的需求。理想的工业菌种必须具备: 遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存等特性。诱变是最早在抗生素上应用的一种育种技术, 它通过物理、化学、生物因素作用于抗生菌, 人为的使其遗传物质发生变异, 从中选育高产菌株[2]。紫外线诱变属于一种物理诱变剂，它是在微生物发酵技术育种中最早使用的一种诱变方法。紫外线诱变可以用于大量不同的菌种育种中，如芽孢杆菌、链霉菌、镰刀菌等，通过紫外线对微生物进行诱变，得到了大量比较优秀的工业菌种。由于紫外线诱变育种简便易行、对条件和设备要求较低并能较好地提高代谢产物的产量，故在微生物育种中仍广泛应用［3］。本文对紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围、研究进展进行了概述。

一、紫外线诱变的原理 紫外线属于一种物理诱变剂，它能使被照射的物质的分子或原子中的内层电子提高能级。主要生化反应：1.DNA链和氢键的断裂 2.DNA分子间（内）的交联 3.嘧啶的水合作用 4.形成胸腺嘧啶二聚体 5.造成碱基对转换 6.修复后造成差错和缺失。 紫外线诱变处理的有效波长为200- 300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。DNA和 RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA 分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用[4]，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA 的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变[5]，从而引起上述的生化反应。 二、紫外线诱变的操作流程 1、测定菌种的生长曲线 首先对需要进行诱变的实验菌种进行纯化，然后将菌种接到培养基中培养。在不同的时间取适量的培养液，用分光光度计检测其中菌体浓度的OD值，通常是每两个小时检测一次[6]。根据不同时间的OD值绘制实验菌种的生长曲线，找到其对数生长期。 2、对处于对数期的菌种进行诱变 将实验菌种接到培养基中，根据其生长曲线培养到对数期的中期。然后离心分离得到菌体，用生理盐水把菌体制成菌悬液，调节菌悬液使菌体浓度在108个/ml左右。各取5mL 菌悬液移入18 个无菌培养皿中，置于距30W 紫外灯30cm 处

基因突变和诱变育种 1. 内容 1.基因突变 （1）基因突变的定义：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换，而导致的遗传变化称为基因突变(gene mutation)，其发生变化的范围很小，所以又称点突变(point mutati on)或狭义的突变。广义的突变又称染色体畸变(chromosomal aberration)，包括大段染色体的缺失、重复、倒位。 （2）基因突变的特点：自发性、不对应性、稀有性、独立性、可诱变性、稳定性 （3）基因突变的类型 ?按发生方式：自发、诱发； ?按突变表型：营养缺陷型、抗药性突变型、条件致死突变型、形态突变型； ?按遗传物质的结构改变：染色体畸变、基因突变； ?按碱基变化与遗传信息的改变：同义突变、错义突变、无义突变、移码突变。 （4）基因突变自发性和不对应性的证明实验：Luria的变量实验、Newcombe的涂布实验、Lederberg等的影印平板实验。 （5）紫外线对DNA损伤及修复 紫外线对DNA损伤：嘧啶对紫外线比嘌呤敏感得多，其光化学反应产物主要是嘧啶二聚体和水合物，相邻嘧啶形成二聚体后，造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变。 紫外线对DNA损伤的修复：光复活作用、切除修复。 2.诱变育种 ?诱变育种原则：简便有效诱变剂、优良出发菌株、单孢处理、最适诱变量、利用复合处理的协同效应、注意形态生理和产量的相关指标、设计高产筛选方案、运用高效筛选方法。 突变株筛选方法：产量突变株筛选、抗药突变株筛选、营养缺陷型筛选。 2. 练习 一、选择 1. 已知DNA的碱基序列为CATCATCAT，什么类型的突变可产生如下碱基序列的改变： CACCATCAT？（） A.缺失 B.插入 C.颠换 D.转换 答案：D 2. 以下碱基序列中哪个最易受紫外线破坏？（） A.AGGCAA B.CTTTGA C.GUAAAU D.CGGAGA

1.首先是天然菌种的选育： 调查研究及查阅充分的资料 ↓ 设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境 采样 ↓确定特定的增殖条件 增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法 平板分离 ↓ 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选 ↓ 初筛（1株1瓶） ↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶） ↓ 3～5株 ↓ 单株纯种分离 生产性能试验 →毒性试验 菌种鉴定 2.诱变菌种： 出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子

----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。 诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。2)挑选优良的出发菌株。最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。4)处理单细胞或孢子悬液。单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。5)选用合适的诱变剂量。一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。6)选用高效的筛选方法。 紫外线诱变育种： 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约～厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。

2.3.3 单孢子悬液的制备用生理盐水从成熟的孢子斜面上洗下孢子，倒入装有玻璃珠的三角瓶中，置摇床上振荡打散30min，经四层无菌擦镜纸过滤，得单孢子悬液。 2.3.4 紫外诱变 取孢子悬浮液5ml，置于Φ90mm无菌平皿中，打开皿盖，在磁力搅拌状态下用紫外灯（波长253.7nm，功率20W，照射距离30cm）照射，时间分别为0 s、4 s、8 s、12 s、16 s和20s，取不同照射剂量的处理液0.1ml适当稀释涂皿，37℃避光培养5d，待菌落长出，进行活菌计数。以未经过诱变饱子悬浮液的活菌数为基准，然后以照射时间为横坐标，致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。 按照与致死率测定相同的办法，将孢子悬液照射一定时间后，取0.1ml诱变处理液适当稀释涂皿，37℃避光培养5d。 2.4.3 紫外线对KN-16孢子的诱变 紫外线是一种使用最早沿用最久最广泛效果最明显的微生物诱变剂，其诱变频率高而且不易回复，紫外线可以引起微生物菌体的DNA突变，形成嘧啶二聚体。光照会断开嘧啶二聚体，所以紫外线诱变时要在避光条件下进行。以前认为致死率在90%～99.9%效果好。但是目前的报道认为致死率在70%～80%有利于正突变型的产生，且筛选的菌株遗传稳定性好。本实验对出发菌株KN-16进行紫外线照射0 s，4 s，8 s，12 s，16 s，20s结果如下： 2.4. 3.1 紫外线对出发菌株KN-16的致死曲线 KN-16菌株的孢子对紫外线的照射极其敏感（如图7所示），孢子致死率随照射时间的延长而增加，其中处理时间为4s时致死率为34.5%，8s时为73.4%，12s时为88.5%，16s时为93.4%，20s时为97.4%。8 s～20s 处理致死率上升缓慢。

诱变育种的一般步骤： 1.首先是天然菌种的选育： 调查研究及查阅充分的资料 ↓ 设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境 采样 ↓确定特定的增殖条件 增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法平板分离 ↓ 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选 ↓ 初筛（1株1瓶） ↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶） ↓ 3～5株 ↓ 单株纯种分离 生产性能试验 →毒性试验 菌种鉴定 2.诱变菌种：

出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。 诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。2)挑选优良的出发菌株。最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。4)处理单细胞或孢子悬液。单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。5)选用合适的诱变剂量。一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。6)选用高效的筛选方法。 紫外线诱变育种： 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个/ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要

紫外诱变大肠杆菌str(链霉素)抗性突变株的筛选 一、目的要求 1 、观察紫外线对链霉素产生抗性的诱变效应 2 、学习并掌握物理诱变育种的方法。 二、基本原理 紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。 经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。三、实验材料 (一) 菌种 大肠杆菌 (二) 培养基（完全培养基） 1. 肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 0.5 g 蛋白胨 1.0 g NaCl 0.5 g 水 100 mL pH 7.2 100 KPa 、121℃高压蒸汽灭菌20min。 如配制固体培养基需加琼脂1.5%～2%。 如配制半固体培养基则加琼脂0.7%～0.8%。 (三) 主要药品 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、链霉素。

(四) 主要器皿 试管30支、移液管1mL10支、5mL3支、10mL1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。 四、实验内容 (一) 诱变 1. 菌悬液的制备 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16～24h。 取已培养20 h 的活化大肠杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，取4mL 于5mL离心管中离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块制成单菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。 2. 平板制作 将肉膏蛋白胨培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板。待平板完全冷却后，取0.1mL 链霉素用无菌棒涂布于平板上。其中留三块平板不涂布链霉素作为对照。 3. 诱变处理 (1) 预热正式照射前开启紫外灯预热30 min。 (2) 搅拌取制备好的菌悬液5 mL 移入6 cm 的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌捧，置磁力搅拌器上，20 W 紫外灯下30 cm 处。 (3) 照射然后打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为5s，10s，15s。可以累积照射，照射完毕先关上皿盖再关闭搅拌和灯。所有操作必须在红灯下进行。 4. 稀释涂平板 在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5mL 进行适当稀释分离。取最后3 个稀释度的稀释液涂于肉膏蛋白胨平板上，每个稀释度涂3 个平板，每个平板加稀释液0.1 mL，用无菌玻璃刮棒涂匀，37℃培养48 h(用黑布包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别。 (二) 计篡存活率及致死率 1. 存活率 将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。

紫外诱变方法 宋炜等：高产脂肪酶酵母菌株的分离筛选及紫外诱变中南林业科技大学学报，2009，29(3)：55-64 1．2．4 紫外诱变 1．2．4．1 紫外诱变处理 取2 mL处于对数生长期的菌液于直径75 mm 的无菌培养皿中，置于30 w 紫外灯下30 cm处，分别照射处理：30 S、45 S、90 S、120 S、180 S、240 S、300 S，每个处理重复3次，用罗丹明B平板计算存活率，得出诱变致死曲线。每次紫外照射后在黑暗培养箱中静置30 min，然后在黑暗中稀释至1O-4、10-5倍，分别取0.1 mL涂于罗丹明B平板上，每级稀释液涂抹3个平板，以不进行照射作对照，紫外线照射以后的操作都在黑暗中进行，防止光修复。将涂匀的平板，用黑布裹好，置于28℃恒温培养箱中避光培养4 d。 1．2．4．2 突变菌株的初筛 将培养好的平板取出进行菌落计数，计算致死率。致死率(%)=100一(处理后每0.2 mL菌落数／对照每0.2 mL菌落数)×100。同时测量透明圈直径(D)和菌落直径(d)，用接种针挑取经不同剂量诱变的直径较大菌落，将相同处理剂量D／d比值大于对照D／d的菌落穿刺于同一个罗丹明B培养皿上，每皿点6个，黑暗条件下培养4 d。 1．2．4．3 突变菌株的摇瓶复筛 从相同处理时间的初筛平皿中选取D／d最大突变菌株，28℃摇瓶培养72 h，离心取上清液测酶活力． 孙同毅等：高产碱性蛋白酶菌株HAP26选育氨基酸和生物资源2007，29(2)：20～22 1．2．1诱变 (1)NTG诱变处理 将在10 g·L～N一甲基一硝基一N一亚硝基呱(NTG)溶液中浸泡过的滤纸片(‘p1．5 cm)放在涂满嗜碱芽孢杆菌HAP26的培养皿中央。 (2)N+离子注入条件 本试验采用由郑州大学提供的离子注入机。注入离子能量为30 Kev，单次脉冲时间为6 s，间隔时间为60 s，单次注入离子能量为×1014N+个数／cm2，真空度为5～6×10-3Kpa。每个无菌平板加入0.1 mL孢子悬液，涂布均匀，无菌风吹干(每一注入剂量做一个真空对照)，注入剂量分别为3、8、l0、30、50、80、100、200(离子束单位为×1014N+个数／cm2)。将诱变孢子适当稀释涂布于高氏培养基平板上，计数。 李祖明等高产碱性蛋白酶菌株的选育及其固态发酵条件的优化食品科技 2008,(4):5-8 1．3 诱变育种 将活化后的出发菌株接人固体斜面培养基中，30℃，培养一段时间后，用生理盐水将菌苔洗下，制备菌悬液，菌数约为lO8 cfu／mL。取菌悬液4 mL加入到直径6 cm培养皿内，以紫外灯(20 W，距离30cm)照射不同时间。菌液稀释后涂布于平板分离培养基上，30 ℃避光培养一段时间后，分别倒人适量10％三氯乙酸，静置l0 min，测定菌落周围出现的透明圈直径(d／cm)和菌落直径fd／cm)并计算比值(HC值)，与未处理的进行对照，选取HC值较大的单菌落编号并移接到斜面保藏培养基上，保存于4℃冰箱，待固态发酵复筛。 刘鑫等：高产酸性蛋白酶黑曲霉菌种选育四川大学学报(自然科学版) , 2005, Vo1.42 NO.1