Western Blot实验步骤及关键分析解析

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1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后4°C保存。

4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后4°C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.

6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。

7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。PH8.3

9、转移缓冲液： 2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS(可不加)，200ml 甲醇(临用前加)，加水至总量1L。

10、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。

11、脱脂奶粉5%(w/v)。

12、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

4.2.4 22. 聚丙烯酰胺凝胶溶液：

分离胶12.5% ,PH8.8 5ml 10ml 15ml

超纯水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml

30%丙烯酰胺溶液 2.1 ml 4.2 ml 6.4 ml

pH8.8、1.5mol/LTris溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml

10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml

TEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml

10%过硫酸铵0.05ml 0.1 ml 0.15 ml

浓缩胶：5% ，pH6.8 2 ml 4 ml 6 ml

超纯水 1.4 ml 2.8 ml 4.1 ml

30%丙烯酰胺溶液0.3 ml 0.6 ml 1.0 ml

pH6.8、1.0mol/LTris溶液0.25 ml 0.5 ml 0.75 ml

10%SDS 0.02 ml 0.04 ml 0.06 ml

TEMED 0.002 ml 0.004 ml 0.006 ml

10%过硫酸铵0.02ml 0.04ml 0.06ml

一.配胶

1. 注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

2. 分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP及TEMED外)，过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡(否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟)，加入10%AP(0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100)及TEMED(分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000)即可

3. 封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度<10%时可用0.1%的SDS 封，浓度>10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。

4.灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡

进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正;若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。

二.样品处理

1.培养的细胞(定性)：

⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。

⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。

⑶100℃，1min。

⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。

⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。

⑹待样品恢复到室温后上样。

2.培养的细胞(定量)：

⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。

⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声(100~200w)3s，2次。

⑷12000g离心，4℃，2min。

⑸取少量上清进行定量。

⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。

3.组织：

⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg 加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。

⑵12000g离心，4℃，2min。

⑶取少量上清进行定量。

⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。

三.电泳

1.上样前将胶板下的气泡赶走。

2.所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。

2.以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。

3.在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。

四.转膜

1.电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：

湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g，M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。

浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。

2.取胶：

将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶(以便以后杂其他感兴趣的蛋白)，左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张(干转每侧三张)滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分(尤其是干转，以防止短路)

3.转膜：

湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。

干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。

五.封闭及杂交

1.封闭：

将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色(2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液)观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker 则可省略此步。

2.结合一抗：

一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。

反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。

3.洗涤：

一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4.结合二抗：

根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释(1:1000~1:10000)，室温轻摇一小时。

5.洗涤：

二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

六.发光鉴定

一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。

1.HRP-ECL发光法：

将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带(5min左右)后滤纸贴

角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

2.AP-NBT/BICP显色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体(如报纸)遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。

七.增强敏感性

若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：

1. 用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。

2. 将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。

3. 封闭40~60min

4. 一抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。

5. PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

6. 二抗杂交，37℃ 1h。

7. PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

8. 发光鉴定。

9. 若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。

10.三抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。

11.PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。

12.发光鉴定。

八.NC膜的多次使用

一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七.增强敏感性”相近。

1. 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液(10min×3次)后从一抗杂交开始，后续步骤同前。

2. 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用strip液(可用杂交袋)于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

3. 对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液(可用杂交袋)于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

Western的原理

几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。

样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)，样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

电泳丙烯酰胺凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯化效果。这种方法分离效果极好，可惜很难在不丧失精度情况下放大到制备规模，因为随着胶厚度的增加，电泳时的热效应会严重干扰蛋白的泳动。

Western bloting首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到NC膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质(10%-20%)。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比，这种方法要快(15-45 分钟)。

转移后的NC膜就称为一个印迹(blot),用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液(如10%的BSA或脱脂奶粉溶液)处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体(一抗)处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗体特定IgG的抗体(二抗)可以直接购买，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物;而辣根过氧化物酶可以将H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它探针如放射性标记的DNA，可以检测印迹中的DNA结合蛋白。

在Western bloting实验中，有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色。这种方法叫直接法，与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。

Western bloting要注意的一些问题

1、为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照(最好有标准品(比如β-actin，GAPDH)或阳性血清);阴性对照(测血时用相应小鼠未

免疫血清(即正常血);空白对照(不加一抗，用PBS代替);无关对照(用无关抗体)

2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景

3、实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。

4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡;积层胶与分离胶界面要水平;AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂;拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。

5、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高;转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡;尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。

6、封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。

7、加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景;

容易忽视的问题主要在于过硫酸铵(AP)一定要新鲜——最好用小指管配AP(写日期)保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用

四.上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer(别小气，重复使用会降低缓冲能力的)。当预染的Marker 告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3 处，OK，电泳结束了。

电泳结果检查：如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢?能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot实验，很多人会选择省略掉这一步——同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。所以最经济实惠的方法是：丽春红S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。

转膜：经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜

的首要是选膜。

Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Blotting Membranes，NC)和PVDF膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力(也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量)，以及膜的孔径(也就是拦截蛋白的大小);b.不影响后续的显色检测(也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好);c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。

NC膜尼龙膜PVDF膜

灵敏度和分辨率高高高

背景低较高低

结合能力80-110 ug/cm2 >400 ug/cm2 125-200 ug/cm2(适合于SDS存在下与蛋白质的结合)

材料质地干的NC膜易脆软而结实机械强度高

溶剂耐受性无无有

操作程序缓冲液润湿,避免气泡缓冲液润湿使用前100%甲醇润湿

检测方式常规染色，可用放射性和非放射性检测不能用阴离子染料常规染色，比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测。

适用范围0.45um 一般蛋白

0.2um一分子量小于20kD蛋白

0.1um一分子量小于7kD蛋白低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸检测中) 糖蛋白检测和蛋白质测序

价格价格较便宜便宜较贵

1. 硝酸纤维素膜

硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光(Luminol类)、常规显色、染色和荧光显色;背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了;比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上

的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC膜——混有含醋酸纤维(CM)的NC膜结合力会有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%(据说0.05%效果最好)。一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，所以要增加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果NC膜搀杂一些醋化纤维素——这在前面已经提到，会影响蛋白质结合。Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著称的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。卷膜肯定是最实惠的选择，只不过要自己动手裁剪——切记，必须带手套操作。

2. PVDF膜

与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能。市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF 膜结合量是100-200μg/cm2(而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍!)。但是PVDF 膜最大的优点不仅于此：更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择;而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的，特别是需要做N端蛋白测序，在相当“严酷”的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理(不超过15秒)再用缓冲液平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理(不过要真出现这种问题也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识别呢)。PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。

卷膜经济实惠，裁剪剩下的边角料还可以用来做点杂交。再次强调的是，疏水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟，待膜变成半透明后用纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用。

二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

A：实际操作

1. 做胶前的准备

1)检查是否有足够的、干净的spacer、comb 和架子。

2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。

3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。

2. 制胶，电泳

1)装好架子。

2)配分离胶，在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。

3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶倒好后插入预先准备好的梳子。

4)上样，电泳。上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V 电压。电泳时间在1.5小时左右。

B ：注意事项及常遇到的问题

1)分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。

2)上样蛋白量不应超过30ug/mm2 (载荷面积：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) 。

3)gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或失效。

4)混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。

5)电泳中常出现的一些现象：

︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。

︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

拖尾：样品溶解不好。

纹理(纵向条纹)：样品中含有不溶性颗粒。

条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。

条带两边扩散：加样量过多。

五.三、转移

在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体(膜)上。

膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF 等。我们选用PVDF(聚偏二氟乙烯)，其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。

A 半干法

即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。

1 实验条件的选择

电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间

目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓度转移时间

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10 1.5

15--40 12 0.75

<20 15 0.5

2 实验操作

(1)滤纸和膜的准备(在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。

A. 将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buffer中。

B. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。

(2)转移

A. 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的湿润。

B. 将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上。

C. 剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。

D. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸。

E. 转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。

3 注意事项及常遇到的问题

1)滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。

2)滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。

3)因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润

4)滤纸可以重复利用，上层滤纸(靠膜)内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。

5)转移时间一般为1.5 小时，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。

B 转移后效果的鉴定

1.染胶

用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。

2.染膜

有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。

四、封闭(block)

封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合，我们一般用non-fat milk。

在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解)。转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。Block 4°C O/N，或RT 1小时。

五、孵育一抗

A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。

B. 配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释，最好采用梯度稀释。

C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。

注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。

六、洗涤

用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。

洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。

七、孵育二抗

孵育RT1 小时。一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。

二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。

注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗

八、洗涤

用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。

洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。

九、显色(HRP酶)

1.增强化学发光法(ECL)

Ecl 显色原理：鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP(辣根过氧化物酶)的作用下，发出荧光来。

试验步骤：

1)将两种显色底物1：1等体积混合(一般各1ml/membrane)。

2)将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。

3)用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。

4)在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。

5)显影、定影。

6)根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。

注意：荧光在一段时间后会越来越弱。

记得全程手套操作，一则避免手印污染影响结果，二则保护自己(未交联的丙烯酰胺、甲醛等等虽不立即致命但都会慢慢毒害你的身体)

1. 如果WB前没有可参考的资料——比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件(稀释度)，可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂;

2. 去掉积层胶后，预染的Marker可用以识别胶上下方向和膜的正反面(预染Marker如果照着说明书用量，有可能在电泳时看不到条带，但转膜时有浓缩效应而且背景白就可以看到了。如果要电泳能看到就要参考电泳的那个用量，或者多加1—2倍的量);如果目标蛋白小，指示剂也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示剂已经跑出去了，就要留意分清胶上下方向，切个小角是常用的方法。膜和滤纸一起裁最好(不过滤纸上下叠多了膜不好剪，硝纤膜容易裂，用利刀+ 尺子+垫厚报纸划比较容易)尽量和胶一样大小，胶用纯水冲洗一下后用电泳缓冲液平衡过再量。我自己通常剪的时候会故意长宽各比胶少1mm，保证膜和胶不会碰到对方背后的滤纸就好。

3. 对于特别小的蛋白，tricine SDS-PAGE电泳有助于提高蛋白大小在1KD—20KD间的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的浓度也不用太高(可参考2004年中国生物工程杂志上有一篇文章(有效分离1kD小肽的Tricine-SDS-PAGE方法)

4. 转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍转膜的杂质。还有人在这一步浸泡帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。

5. 膜漂在水面(或者甲醇液面)让液体从下通过膜上的孔渗上来以赶走膜内空气，膜彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜的。最后浸没入缓冲液里平衡。甲醇处理PVDF不要超过15秒。以

后的步骤中不要让膜干涸了。

6. 电转移缓冲液通常用Tris glycine系统，如果是转膜后有部分样品要蛋白测序，最好用CAPS缓冲液，减少甘氨酸对测序的污染。

7. 半干电转移(Semi-Dry)用经过缓冲液饱和的滤纸代替传统转移槽，非常节约试剂，而且效果也好。由于不用“泡”在缓冲液中，半干转不单可用均一缓冲体系，也可以做非均一转移缓冲体系。半干转可以在30分钟内完成转膜(每平方厘米电流2.5—3.5mA，恒流，冷库。如果电流要求小可以延长到60—90分钟，但要防止过热。如果有那种温度贴，可以贴上参考温度)，即使205KD这么大的蛋白转膜效率也高达80%。各种大小的蛋白的转移效率都OK。半干转可以上下层叠2块胶+膜一起转(面积还是按照单个计算)，只要控制好单位面积的电流强度，防止过热就好了。

8. 有人觉得转膜加SDS有助于大分子蛋白转膜，我个人持保留意见，因为SDS等去垢剂影响硝纤膜和蛋白的结合，反而不好。

9. 如果只做Western Blot，膜可以用丽春红S染色并在脱色前照相，对后面的免疫反应影响不大。不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色膜以免影响结果。如果有预染Marker需要用针或者笔扎眼记录条带位置，以免后面会洗掉而无法判断结果。预染Marker也有助于判断转膜的效率和情况，如果比目标分子大的Marker都已经转过去了，那就OK了。

10. 有人说在中性条件下电泳有助于蛋白测序，如果要蛋白测序需要提前一天倒胶，并说预电泳6小时(有还原剂如Glycolate)后再倒积层胶。除了要做HPLC 分析应该用丽春红S而不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色，其他的比如测序或者PTH都可以选灵敏度高些的考马斯亮蓝或者氨基黑。

11. 转印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白条带，有时这种快速的方法可以不用染色识别条带，避免染色膜影响后继实验。

转膜后的封闭注意：

12. 转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。脱脂奶是最常用的经济配方，用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素—亲和素的检测方法，脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测(AP)方法。如果采用碱性磷酸酶检测系统，封闭剂最好用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA 磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活(可以加0.05%叠氮化钠，新鲜最好)。经济的脱脂奶配方和AP兼容得不太好，再加上HRP的底物选择范围也更宽，现在HRP是越来越普遍的选择。但是叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用，如果用HRP检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。切记：封闭时间和封闭剂的量都要足够。

13. 如果选用AP作为显色方法，封闭时就要选择Tris缓冲体系，不要用PBS，因为PBS干扰AP。

这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP及TEMED外)，过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡(否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟)，加入10%AP(0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100)及TEMED(分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000)

胶浓度<10%时可用0.1%的SDS封，浓度>10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS)，封胶后切记，勿动。如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。

两胶板之间的电泳液要满. 接好正负极, 开始电泳, 可先小电压,约50V ,大约跑过浓缩胶后再改为100V. 观察MARKER的情况, 适时终止电泳.

建议说目的带要跑到分离胶的2/3处比较好,但本人一直都在上1/3处,结果也还可以.如果浓缩胶跑的好的话, 几个孔的蛋白会跑成一条直线.

注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液

未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内.

10* 电泳缓冲液: Tris7.58克, 甘氨酸36克, SDS 2.5克, ddH2O定容到250ML.

不好溶,可用搅拌器.

可重复使用,每次加一些新的进去.但本人每次都是配新的,也不麻烦.

转膜：

跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟, 脱色液脱

色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何.

另一块可用做转膜. 放入转移缓冲液中摇30分钟左右(有次着急只晃了10分钟，结果也挺好的)。NC膜，0.22um ，效果挺好的，MARKER易染上，丽春红也易着色，还一洗就掉。能比较清楚的了解转膜效果。

不同转膜仪和电源转膜的条件不同，我用的是BIO-RAD 的半干转(电压不过25V的那款)，电源是BIO-RAD的PC200，70KD的我转50分钟，20V，17KD 的转20V，30分钟左右，条件不是很稳定，有时半路打开盖子看看MARKER 转的情况，但膜和胶的位置一定不能窜。也有人说用恒流，说1.2-2MA/CM2我看了一下，我的胶大约都是5*3左右大的，20V一般电流会是60-30MA之间，要是这样算的话,最高就跑胶电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3-4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度;Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑;跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白;

1 本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用BSA 或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较好。

2 本人采用的是过夜封闭方法，虽然时间长，想想封闭效果应该是没有什么问题，但是一定要注意封闭液是否盖过了全部的膜，不要漏掉任何一个小角落哟。

3 洗膜的时候，最好将膜放在平皿中，置于水平的试验桌面上，不时用手晃动一下平皿，这样洗膜会比在脱色摇床上更完全。因为在脱色摇床上晃动，有时洗涤液不足以完全没过膜，在最后显色的时候，会发现液体流过的一道道痕迹，使背景值增加。

4 其实在western blot中，以上操作都是小问题，最主要的是一抗的质量和待检测蛋白的提取质量。在试验之前，最好先用阳性对照与一抗做免疫学沉淀检测(如ELISA)，看看其效价和质量，以便确定在后来的杂交试验中一抗的选择和加量。另外，在做杂交之前最好也先跑一块PAGE胶，染色，检测一下待检蛋白的提取质量。

5 在加一抗温育之前，最好先将等量的一抗与野生型(即阴性对照)的蛋白在37摄氏度作用30分钟，这样可以封闭掉一抗的一些非特异性结合位点。

6 一定不要忘记做阴性对照和阳性对照，特别是阴性对照，不然结果出了什么问题，就无从分析了。

7 全程做下来，最后的显色就像是个一锤定音的时刻，分外激动，但也应该尤为专注，一旦目的条带出现了，就要马上对显色进行终止，要不然杂带就要出

来了。

“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。

另一个感觉是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng(虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg)，最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。

Western Blot为什么必须要用内参?

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)，空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照)，已知量标准产物的正对照;另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。

内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

Western超详细实验步骤

Western实验步骤 1. 电泳(Electrophoresis) （1）SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。 一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。 配胶步骤： 1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。 2.按比例配分离胶（8ml-10ml） 3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面 4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。（如果今日不上样可以放入4°C冰箱） 注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理 1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀 2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。 3.12000r离心5分钟。 （3）上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右 2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。 3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳） 注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。 3.转膜(Transfer) 1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。 2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。 3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序 4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。 5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续

平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被

Western操作步骤

Western-Blot 操作流程 （一）组织中总蛋白的提取 用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中，加入200uLRIPA裂解液(含PMSF，比例为97：1：1：1)，用杵子研磨3-4min, 段事先在酒精里浸泡至少30min，用之前用滤纸吸干酒精，） 20-30s,每隔5min 后在 4℃下12000rpm 离心 5min，取上清分装于 1.5mlEP管中并置于-80℃冰箱保存。 （二）BCA法蛋白含量的测定 (1) 从-20℃取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 (3)以上步骤完成后，在所有加样的孔里各加上200uLBCA蛋白浓度测定试剂（按试剂A：试剂B=50：1的比例配置），然后置于37℃水浴锅30min后取出。 (4)酶标仪测定OD值。 (5)EXCEL表格制作标准曲线，按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。 （三）稀释蛋白及蛋白变性 如果计算出的样本的蛋白浓度偏高，需要用RIPA裂解液将蛋白稀释（一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL）;稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中，加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液，置于99-100℃的干式恒温器中加热5-10min,使蛋白变性。（注意：将EP管的盖子盖紧，插入加热器的大圆孔中）煮过的蛋白置于-20℃冰箱保存。 （四）制作SDS电泳胶 ⑴清洗玻璃板，双蒸水冲洗晾干后，根据厂家说明安装玻璃板。 ⑵配置10%的分离胶 配方：H2O2 4.0ml 30%丙烯酰胺液 3.3ml 1.5mol/l Tris （ PH8.8） 2.5ml 10%SDS 100ul 10%过硫酸胺 100ul TEMED 4ul ⑶分离胶溶液中加入 TEMED 以及 10%过硫酸胺后需立即混匀（防止未灌胶就发生凝固），将混合液立即加入玻璃板内，距梳子下缘约 lcm 处即可，蒸馏水封顶，待凝胶完全聚合（约30min）后，倒去双蒸水。 ⑷制备5%的浓缩胶 配方；H2O2 3.4ml 30%丙烯酰胺液 0.83ml 1.5mol/l Tris （ PH6.8） 0.63ml 10%SDS 50ul

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分

2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h

（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二

western blot实验步骤

Western bolt 一、实验目的 通过实验了解western blot技术的原理和操作。 二、实验原理 SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。 化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。 三、实验器材 1.电泳槽，胶板架子 2.转膜仪 3.NC膜 4.电泳电源 5.滤纸 6.摇床 7.X射线摄影暗匣 8.X射线胶片 9.塑料薄膜 四、实验试剂 1.runningbuffer 5xrunningbuffer(1L) Tris 15.1g

蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项

蛋白印迹——Western blot 实验流程及注意事项 各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 实验步骤 1.配制分离胶5ml（配方见图1）； 2.将液体用1ml移液器加入玻璃板（从玻璃板的边缘加入，速度适中，尽量不 要产生气泡）； 3.用去离子水压胶（利用重力作用把胶压平，否则如果有气泡，胶就不平了， 影响电泳效果。注意上面盖一保鲜膜，防止液体挥发）； 4.大约1第二天一早配制堆积胶）， 5.倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干，加入堆积胶，并插入梳子； 6.约1小时后堆积胶凝固，把玻璃板转移到电泳装置并加紧（防止漏液）； 7.将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液； 8.拔掉梳子，用微量注射器冲洗上样孔，加入和上样缓冲buffer混合变性的蛋 白；①蛋白上样量：20-50μg；②上样缓冲液：加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×；③上样最大体积：根据梳子孔径和玻璃板的距离而定，一般我们用的上样最大体积在30ul左右；④蛋白变性：上样前要将样品于沸水中煮5-10min 使蛋白变性。可以使用PCR仪进行变性，99℃5分钟，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：a. EP 管容易炸开，样品丢失；b. 容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量； 9.在电泳槽中加入电泳缓冲液； 10.恒压80V 30分钟，100V 2小时左右，溴酚蓝跑到底即可（电泳时间可以根 据自己目的蛋白的具体条件设置，一般4～5 h，电压为40V 较好，也可用60V。）；

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

western-blot-全过程-详细步骤复习课程

w e s t e r n-b l o t-全过程-详细步骤

一：提蛋白： 1.PBS洗2遍，加RIPA 80-100ul（含10xcooktail）。 2.在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。 3.4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA 200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加 PBS(2个对照组20ul，实验组18ul)）。 4.取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。 5.96孔板中每孔加2ul蛋白液。 6.每孔加200ulA/B混合液。 7.37度半小时。 8.测浓度以及标化用一起在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及loding buffer，还 有标化后的浓度。562波长0.046斜率（实验组值-对照组值）/斜率=浓度浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug） 9.加好对应的RIPA以及loding buffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。 二：跑胶 1. 1.0玻板，洗干净 2.配制10%或者12%分离胶一块胶需要5ml 3.灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇 4.配制5%浓缩胶 2块胶需要4ml 5.待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子 6.待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*running buffer（上腔灌满，下腔过电线 丝） 7.预电泳，100v，10-15min 8.加样（蛋白样品及marker）10ul，marker 5ul 9.60v 10-20min，之后100-110v 三：转膜

1.配transfer buffer ，用10*transfer buffer 稀释10倍，并加20%甲醇 2.transfer buffer浸泡海绵、滤纸 3.pvdf膜，甲醇泡1分钟，清水洗2次，泡在transfer buffer里20min 4.胶取出，在transfer buffer里泡10min 5.黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸） 6.转膜100v，1—1.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑） 四：封闭、一抗、二抗 1．5%脱脂奶粉（pbst溶）1h 37度 2.一抗4度12h 3.pbst洗膜，3次，每次10min 4.二抗（1:5000）1h 37度 5. pbst洗膜，3次，每次10min 6.显影剂A和B各300ul PBST：1000ml’PBS+1mltween 5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉 10*running buffer：tris 30.3g 甘氨酸 144.1g sds 10g 加水至1000ml 10*transfer buffer：tris 30.3g 甘氨酸 144.1g 加水至1000ml 1* transfer buffer：100ml10*transfer buffer 200ml甲醇加水至1000ml

Western blot实验操作步骤

Western blot实验步骤 一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取） 1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。 2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。 3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中. 4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存） 常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。 二、蛋白浓度测定(BCA法) BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。 标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存),完全溶解蛋白标准品，取10ul 稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。蛋白样品在什么溶液中，

标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。 1.配置BCA工作液 A液： B液= 50 :1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本 2.先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。（96孔板）, 总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。 3.37度，温箱中孵育30min。562nm波长，测OD值。待测蛋白样品浓度在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。 4.根据所测样品的OD值，绘制标准曲线。根据标准曲线即可计算样本相应的蛋白含量，除以样本稀释液总体积（10ul）,再乘以样本稀释倍数，即为样本的实际浓度（ug/ul） 5.蛋白定量后，以最小蛋白浓度为标准，将各组蛋白样本调至相同浓度（ddH2O补齐） 绘制标准曲线：X轴为蛋白质量，Y为OD值 插入—XY散点图,选中图上一点，右键，添加趋势线—选项（显

最详细的WesternBlot过程步骤详解

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

Western基本步骤

Westen blot 一、配胶 （一）安装胶架 （二）配胶 1、分离胶：10%（10ML） O 4 ml DdH 2 30%Acr 3.3ml Tris-Hcl(8.8) 2.5ml 10%SDS 0.1ml 10%过硫酸铵AP 0.1ml TEMED O.OO4ML 2、积层胶: 4ml O 2.7 ml DdH 2 30%Acr 0.67ml Tris-Hcl(6.8) 0.5ml 10%SDS 0.04ml 10%过硫酸铵AP 0.04ml TEMED O.OO4ML 注意事项：1、TEMED催化AP产生自由基，加速Acr凝胶聚合，一般于4度存放。 不宜多加，否则胶易变硬脆裂。 2、TEMED易燃、腐蚀性、神经毒性，要注意防护。易挥发，使用后立 即盖紧瓶盖，佩戴PE手套。 3、每加完一样晃匀，TEMED最后加。 （三）灌胶 1、分离胶1ml枪吹打均匀，避免气泡，尽快灌入固定好的玻璃板中。 O，压平分离胶界面。待胶凝后可见分割折线。 2、分离胶上灌满ddH 2 O，分隔线先清楚后不清楚，待胶凝后又可见。 可用乙醇代替ddH 2 O，用滤纸吸干。 3、分离胶凝后，倒去顶部ddH 2 4、积层胶1ml枪吹打均匀，灌入玻璃板中至顶部。 5、插入梳子，注意梳子底部应无气泡。略倾斜插入梳子可避免出现气泡 6、20-30分钟后胶凝。 二、电泳 （一）准备 1、装上电泳装置，倒入1*电泳液。先倒内槽（新）没过短玻璃板，如内槽不漏液再加外槽，没过钢丝电极即可，内外槽不能相通。 2、拔出梳子（用力均匀缓慢拔出），用10vl枪点样。 （二）上样和电泳 1、10vl枪点样。（1.0胶最大上样量30vl，0.75胶最大上样量25vl） 2、样尽量点在中间孔位，空孔位用残样或5*buffer填补，避免边缘效应，使电流在胶板中均匀分布。

western步骤

1、组织蛋白的提取 取上述用于Mn含量测定中另外4只大鼠剩余的纹状体组织置于2ml EP管中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加400μl单去污剂裂解液（含PMSF）于超声器中进行裂解，然后置于冰上。几分钟后再超声数秒再置于冰上，要重复几次使组织尽量碾碎。裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，去上清分装于新的离心管中并置于-20℃保存。 2、蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。取96孔板，按下表加入各种试剂。混匀后，室温放置2min。在酶标仪上比色分析，测量OD值。 表2，标准曲线的制备 0μg 2.5μg 5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg 1mg/mlBSA - 2.5μl 5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl 0.15mol/L NaCl 100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μl G250考马斯亮蓝溶液1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml （2）检测样品蛋白含量 ①取96孔板，实验用各孔加入4℃存储的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min，后即可用于测蛋白。 ②其中一孔加0.15molNaCl溶液100μl做空白对照，其余个孔加95μl 0.15molNaCl溶液和5μl 0.15molNaCl待测蛋白样品，混匀后静置2min，在酶标仪上比色分析，在595nm处测量OD值。 ③绘制标准曲线，测得的结果是5μl样品含的蛋白量。 3、SDS-PAGE电泳 （1）干净玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直置于架上准备灌胶。 （2）制备分离胶并灌胶：配置8ml 10%分离胶，3.2ml ddH2O，2.0ml 1.5mol/L Tris·HCl分离胶缓冲液（pH8.8），2.72ml 30%丙烯酰胺溶液，80μl 10%SDS，80μl 10%APS（过硫酸铵），16μl TEMED。

WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

Western操作步骤

Western-Blot 操作流程及注意事项 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6. 于4℃下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强） （2）组织中总蛋白的提取： 1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： 1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min。 2. 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后PBS 重复洗涤一次。 3. 用枪吸干上清后，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （二）蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2. 取18 个1.5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。

WB实验步骤

蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶

4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。