各 种 转 染 方 法 比 较

转染常用的报告基因

报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。

在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种：

胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)

nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。

新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)

nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。氯霉素乙酰转移酶基因测时可通过放射自显影观察

荧光素酶基因（luciferase Gene）

1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。

β-D-葡萄糖苷酶基因

该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。

除此之外还有庆大霉素转移酶基因等

在动物基因表达调控的研究中，已使用的报告基因主要有以下几种：

绿色荧光蛋白（gfp）基因等。

绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFP Cdnad 开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长紫外波长或蓝

光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。

此外还有β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)等

lipo2000转染操作步骤

L i p o2000瞬时转染细胞步骤 Stealth?RNAiorsiRNATransfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。PlasmidDNATransfection DNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。1中板。 贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。 2转染。 A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection

电穿孔系统技术参数

多功能电穿孔系统 1、工作条件： 电源：100 – 120 VAC or 220 – 240 VAC, 50/60 Hz. 功率：最大240W 室温：0 - 35?C, 相对湿度：0 – 95%, (non-condensing) 2、总则用于原核和真核细胞电转化 3、详细技术指标及规格： 3.1 系统配置：带有方波输出功能的主机、原核细胞组件及哺乳动物细胞组件，0.1/0.2/0.4cm电激转 化杯。该细胞转化仪用于原核细胞、真菌以及哺乳动物细胞的电击转化试验，包括外源DNA导入和细胞融合等。 技术要求和参数： *（1）系统输出波形：指数衰减和方波两种输出，适合不同应用需要。 （2）输出电压：10 – 3,000伏，最小调节量1伏。 *（3）电容容量：10 – 500伏：25 – 3275 μF以25 μF 递增，适合哺乳动物细胞需要。 500 – 3000伏：10, 25, 50 μF三种调节，适应原核细胞要求。 （4）电阻（并联）：50 – 1,000 Ω以50 Ω递增，及无限大设置 *（5）样品电阻：在10 – 2,500 V时，最小20 Ω 在2,500 – 3,000 V时，最小600 Ω （6）方波放电时间：10 – 500 V档位: 持续时间0.05 – 10 ms时，以0.05 ms递增， 持续时间10 – 100 ms时，以1 ms 递增，

可设1 – 10 次脉冲重复，0.1 – 10 sec 间隔 500 – 3,000 V档位: 持续时间0.05 – 5 ms时，以0.05 ms递增， 可设1 – 2 次脉冲重复，5 sec 最小间隔 （7）主机： 输出波形：指数衰减和方波两种输出波形 输出电压; 200 – 3,000伏 放电容量：10, 25, 50 μF，三档调节 样品电阻：最小20 Ω，在10 – 2,500 V档位， 最小600 Ω，在2,500 – 3,000 V档位， 方波放电时间：持续时间0.05 – 5 ms时，以0.05 ms递增， 可设1 – 2 次脉冲重复，5 sec 最小间隔 *实验方法预存：24种程序预设，方便用户优化自己的实验条件 用户自定义方法储存：最多144个程序方便用户储存自己的实验方法。 脉冲波形检测：实时监测并显示脉冲波形。 （8）原核细胞系统 *输出波形：指数衰减或方波 输出电压; 200 – 3,000伏 放电容量：10, 25, 50 μF *样品电阻：在10 – 2,500 V ，20 Ω最小 在2,500 – 3,000 V，600 Ω最小 *方波放电时间：持续时间0.05 – 5 ms以0.05 ms递增， 1 – 2 次脉冲，5 sec 最小间隔

慢病毒转染手册

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因

整理)慢病毒稳转细胞株步骤

稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天 2、加入2ml全培养基DMEM 3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基

电转染操作流程

Neon TM 电转染一般流程 1． 电穿孔前一至两天，将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中，保证实验当天细胞量达 到70-90%。 2． 加培养基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500μl ，放于37℃培养箱预热。（注：使用 其他孔数培养板或者100μl 枪头时，加入培养基和质粒及细胞的数量见下表1） 3． 将培养细胞取出，悬浮细胞直接取部分培养的细胞计数，确定细胞密度；贴壁细胞用2ml 的PBS 冲洗细胞，吸出PBS ，加入约750μl 胰酶消化3min ，加入750μl 培养基，终止消化，取部分细胞悬液进行细胞计数，确定细胞密度。 4． 将悬浮细胞转到离心管，室温下100-400g 离心力离心5min ，倒掉上清。 5． 向细胞中加入2mlPBS 冲洗细胞，室温下100-400g 离心力离心5min 。 6． 吸出PBS,用重悬缓冲液R 重新悬浮细胞沉淀，最终使细胞密度为2.0×107个/ml 。轻轻 吹打细胞，使其形成单细胞悬液。（注：细胞悬液在室温时间不能超过15-30min ,否则将导致细胞活性和转染效率降低） 7． 将适量质粒加到1.5ml 离心管中，再加入细胞悬液，轻轻混匀。所用细胞浓度、DNA 和 接种体积见下表1）。 8． 将装有3ml 电解缓冲液E 的Neon TM 管插入移液器架中。 9． 在仪器上设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数。 10．将枪头插入NeonTM 移液器中，用10μl 的枪头吸细胞混合液，枪头中必须无气泡。将带有样品的NeonTM 移液器垂直插入NeonTM 管中。 11．选择电穿孔方案，并按下触摸屏上的Start （开始）键。 12．电脉冲释放后，触摸屏上会显示完成，提示电穿孔完成。 13．将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热培养基的培养板中。将培养板放到培养箱培养。 14．实验结束后，倒掉移液器中E 液，关闭电转仪。 注意：1．加R 液体积=四大格细胞总数/（4×104）×细胞液体积/（2.0×107）。 2．加入质粒体积=加入质粒的量/质粒浓度。 3．加入细胞悬液体积=需加细胞数量/细胞悬液浓度。 4．每个枪头最多只能用2次。 5．Neon TM 管装入的3ml 电解缓冲液E 可用10次电转化。 6．Neon TM 管中加入3ml 电解缓冲液，用10μl 枪头时加E 液,100μl 枪头时用E2液。 表1 NeonTM 枪头 平板培养基的体积 细胞数量（个） 规格 每孔表面积(cm2) DNA(μg) 10μl 100μl 96孔 0.3 0.2-0.3 √ 100μl 1-3×104 48孔 0.7 0.3-0.7 √ 250μl 5-7.5×104 24孔 2 0.5-1.5 √ 500μl 0.5-1.5×105 12孔 4 0.5-3.0 √ 1.0ml 1-3×105 6孔 10 2.0-4.0 √ √ 2.0ml 0.5-1×106 60mm 20 4.0-8.0 √ 5ml 2-4×106 10CM 60 8.0-16 √ 10ml 4-8×106

慢病毒转染PROTOCOL

第一天 病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。 加入 1 ml 适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。在传染当天细胞应该达到约50％平铺（Day 2）。 注意：也可用其它型号培养板转导。这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。 第二天 准备完全培养基和Polybrene? (sc-134220) 混合物，Polybrene 终浓度为：5 μg/ml。 移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12 孔板）。 注意：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10 μg/ml）。过长时间暴露于Polybrene（> 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。 在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。 培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。 轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。 注意：溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。 注意：当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。此外，我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。 注意：用copGFP 对照慢病毒颗粒：sc-108084 观察转导效率。 第三天 移去培养液并添加1 ml 完全培养基（不含Polybrene）。 孵育细胞过夜。 第四天 欲选择稳定表达shRNA 的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。 第五－六天及以后 用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。

细胞的脂质体转染法和电穿孔法

细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法 （一）脂质体转染 一、实验试剂及器材 Lipofectamine? 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM?减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。 二、实验步骤 1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染； 2. 使用Opti-MEM?减血清培养基稀释Lipofectamine? 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM?培养基为125 μL× 2，Lipofectamine? 3000为 3.75和7.5 μL）； 3. 在每管已稀释的Lipofectamine? 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）； 4. 室温孵育5分钟； 5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中； 6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。 三、注意事项 1. 在无血清培养基（如Opti-MEM?减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine? 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）； 2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；

3. Lipofectamine? 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine? 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染； 4. Lipofectamine? 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。 附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：

lentivirus generation 慢病毒转染手册

Generation o f L entivirus Reagents ?293T: ATCC ?Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001 ?FBS: Invitrogen cat# 16000-044 ?DMEM: Invitrogen cat# 11965-118 ?Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155 ?L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156 ?Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050 ?Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024 ?Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058 293T/fibroblast media (500 mls): DMEM (450 ml) 10% FBS (50 ml) Pen/strep (5ml) L-glutamine (5ml) NEAA (5 ml) Reagent setup Lentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectors A. Production of Virus 1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cells reach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection. 2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorf tube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.

活体电穿孔法介绍 1、什么是活体电穿孔 活体电穿孔法(in vivo ...

活体电穿孔法介绍 1、什么是活体电穿孔 活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多,在基因治疗方面的优势也日趋显著,是一种很好的活体基因导入方法。 活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况。大量的研究表明活体电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景。因此目前国内外对活体电穿孔法介导外源基因转移的研究越来越多。 2、活体电穿孔的法的特点 活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面: 首先,靶器官的选择面广,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官。 在用于基因治疗方面，要考虑到靶器官组织生理特性。如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中,则在某种意义上说已失去了基因导入的价值,这在基因治疗中是关键性的问题。当使用组织特异性表达载体时,研究人员应根据所构建的表达载体来选择基因转移和表达的靶器官组织。例如鱼精蛋白21 启动子可指导外源基因在精母细胞中特异性表达,以小鼠的睾丸作为靶器官将含有鱼精蛋白21启动子的表达载体导入,获得外源基因的表达量远远高于该基因在肝脏和骨骼肌中的表达。 其次,对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几KB 或十几KB 的表达载体, 到100～200KB 的Y AC、BAC 基因组,都有成功导入并获得表达的报道。 此外活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。 但电穿孔法也存在一些的缺点:首先,外源基因表达持续的时间很短,虽然外源基因导入后最快可在215 小时有表达,但大多1～2 月后表达量降至很低。外源基因表达的时间主要由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而存在巨大差异。 由于应用不同的表达载体,Muramatsu 在小鼠肝脏进行电穿孔7天后则检测不到外源基因的表达,而Heller 21 天后还可以检测到外源基因的表达。如果选择代谢和酶活动旺盛的组织器官如肝脏,则表达持续时间会较短,表达时间在 1 个月以内,但以骨骼肌为靶组织,表达可持续15个月。

2020年整理)慢病毒稳转细胞株步骤

作者：空青山 作品编号：89964445889663Gd53022257782215002 时间：2020.12.13 稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天

Ca法转染-制备慢病毒和感染细胞protocol(完整版)

2×HBS (ul)配方：8g NaCl ，0.14g Na2HPO4?2H2O 或0.2g Na2HPO4?7H2O ，6.5g HEPS ，调节pH 值7.0， 最终溶于500ml 双蒸水中,4℃保存。 2MCacl 2配方：87.6g Cacl 2·6H 2O 溶于200ml 双蒸水中，用0.22μm 滤器过滤除 菌，4℃保存，不可冻牢凝固。 ^^^Day 1 1、在转染前24小时，在10cm dish 中（面积约为78.5cm 2）中铺3.6 x106 293T 细胞，于9ml DMEM （hyclone 高糖）+10%FBS+PS ，待次日细胞汇合度达到70%。 ^^^Day 2 2、早上10：00转染，此时转染前无需换液。 浓度过高，混合均匀。 4、将混合好的复合物RT 5min ，加入到细胞培养液中。 5、晚上5：00换液，将培养液换成新鲜的6ml DMEM+10%FBS+PS 。 ^^^Day 3 6、观察24h 荧光。 ^^^Day 4 7、早上10：00观察48h 荧光，此时可以收集病毒，也可以到下午3：00-4：00再收集病毒(高压离心管和EP 管)。 Ooo 感染细胞 ^^^Day 1 1、感染细胞前，消化目的细胞，此时培养液用1640+10FBS+PS\DMEM +10%FBS+PS ，铺种在6孔板中，1 x105 cell/well ，使感染前细胞汇合到20-30%，37℃，5%CO2孵箱过夜。

在蛋白质测序中也有一定作用。具有可高温高压灭菌特性。用双蒸水配制，－20℃储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果) 3、将细胞放入37℃，5%CO2孵箱，4-5h后换液2Ml 1640\DMEM +10%FBS+PS。过夜。 ^^^Day 3 4、早上换2ml新鲜的1640\DMEM +10%FBS+PS。 ^^^Day 4 5、晚上观察48h荧光率。（由于慢病毒表达过程比较慢，到48h才能观察到荧光）开始药筛。 6、药筛：用嘌呤霉素（puro） Puro:储存浓度：10mg\ml(－20度保存)，使用浓度：2ug\ml。 7、药筛48h后观察48h荧光率，之后可以用2ug\ml维持培养一周后改用1ug\ml puro的培养基培养。

电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化

电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化 (作者：___________ 单位： __________ 邮编：___________ ) 作者：单铁英苏安英唐军民 【摘要】目的：通过电穿孔法将带有增强型绿色荧光蛋白基因 (enhan ced gree n fluoresce nt protein EGFP )的真核表达载体plRES2-EGFP( IRES2 in ternal ribosome en trysite 2 内部核糖体 进入位点2)质粒导入未成熟树突状细胞( Immature Den dritic Cell,imDC)，探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响。方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，采用细胞因子体 外培养诱导其成为imDC在大肠杆菌中扩增plRES2-EGFP质粒，选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量等。应用电穿孔仪将PIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，荧光显微镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数。0.4%锥虫蓝(trypan blue) 染色，计数电转染后细胞存活率。结果：当imDC浓度为5X 106/mL 与6卩g DNA质粒混合，设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 卩s时,其电转染率到最高，细胞存活率最高，转染后24 h明显表达，48

h后表达最强。结论：在适当的电压、脉冲时间下，选择适当的细胞浓度、DNA剂量，在转染后的一定时间范围内，电穿孔法转染imDC 可使目的基因获得较高的转染率，且细胞死亡最少。电转染提供了外 源基因转染imDC的可行技术。 【关键词】电穿孔转染绿色荧光蛋白树突状细胞 Abstract Objective:plRES2-EGFP was successfully tran sfacted into immature dendritic cells by means of electroporation in order to investigate the effect of electransfection efficiency and survival rate of immature dendritic cells in different con diti on s.Methods:M ono cytes obta ined form huma n peripheral blood by density guadient centrifugation are induced into imDCs in the presenee of cytokines in vitro.plRES2-EGFP was amplified in E.coli.imDCs were tran sferred with pIRES2-EGFP by means of electroporati on with differe nt electric voltages,times of impulse,cell concen trati onsand the doses of DNA.Numbers of green fluorescence positive cells and the total cell number were coun ted respectively un der fluoresce nt microscope and visible light microscope.the cells were stained with 0.4% trypan blue,electransfection efficiency and the cell survival rate were counted.Results:Electransfection efficiency was in creased to the highest value whe n imDCs with the

慢病毒生产及使用操作手册

慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。

慢病毒(过表达)包装步骤

. 慢病毒（过表达）包装步骤 秦超 1.转染 复苏293T细胞，传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。 转染步骤：（以10cm培养皿为例） ⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%-90%，保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。 ⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti-mem，混匀 ⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti-mem，混匀，室温静置5min ⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min ⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。 2.收毒(36-48h) 收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可。 ⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min，以沉淀细胞碎片。 ⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm离心至所需体积。 ⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，-80℃冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。 3.接毒 接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml 细胞密度60%-70%时可以再接毒一次。 4.检测及培养细胞系(48h) 如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系，可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！ 精品

细胞电转染

细胞电转染 电转的简介 (1) 电穿孔转染的基本原理及过程 (1) 电穿孔转染条件的选择 (1) 1 电参数 (1) 2脉冲时程 (2) 3 脉冲次数 (2) 4 细胞因素 (3) 5 质粒因素 (3) 6 温度 (4) 7．缓冲液以及培养液的成 (4) 仪器常用键区介绍 (5) Neon TM电转染一般流程 (7) 电转的简介 电穿孔转染，作为物理方法的一种，出现于20世纪80年代中。这种方法不仅能够将DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，臻染率高，适用谱广等。尤其对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。 电穿孔转染的基本原理及过程 电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入胞核的技术。其过程简述如下：首先在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。再次电击后，质粒脱离复合物并扩散至胞质内，开始瞬转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳转。一旦DNA扩散进入细胞，细胞膜上的小孔可 自动重新闭合。 电穿孔转染条件的选择 1 电参数 电场强度E与电压V有以下关系：V=E×d，在电穿孔实验中，d为两电极之间的距离，是一个定值，故本文所指的电场强度的选择即电压的选择。对于动物细胞

来说，电场强度通常选择1～1000V／cm，并遵循低电场长时程的原则。电场强度的大小对DNA摄入量的影响主要有：在阈电场强度Ec (Ec=Uc／1．5R)以下无R)以下无DNA摄入；适中的场强下DNA的摄入呈电场依赖型，随场强的升高而增大；高场强下，DNA的摄入进入平台期，与电场的大小无关。电场强度的大小对细胞存活率的影响主要有：在阈电场强度以下存活率无变化；在适中的场强下，存活率呈电场依赖型，随场强的升高而下降；存活率在高场强下降为0。因此，要保证较高的转染效率，必须综合考虑DNA摄入量以及存活率两个方面。不同的细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方式除了实验直接测定比较不同场强下(对悬浮细胞来说，取1～3倍的阈电场强度，对贴壁细胞来说可升至5倍)转染率的高低之外，还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50％左右的电场参数为较理想的参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。 2脉冲时程 时间常数为电容与电阻的乘积，是设定的电压呈指数衰减到37％的时间。电脉冲的时间长短对电转染效率有较大的影响，太长、太短都会使转染效率下降。最佳时间的确定主要取决于细胞的大小，细胞越大，穿透胞膜所需的脉冲时程越长。电转染真核细胞的脉冲时程一般控制在ms级(不小于1 ms)。电脉冲之前，DNA和细胞随机分布于电极之间；电脉冲早期，DNA和细胞向阳极运动；电脉冲后期DNA分子撞向细胞阴极面或末端，并且插入细胞外膜或者进一步进入细胞膜间隙，随后在孵育期间，DNA通过内膜渗透进入胞质。因此电压脉冲有双重效应，即驱使DNA快速向阳极运动以及向受体细胞表面渗透。电脉冲的时间太短，则不能使DNA分子有效进入细胞；而电脉冲时间过长，细胞局部过热可导致不可恢复的损伤，同时电泳所引起的细胞内外的物质进出(如Na+／K+浓度差的破坏)都可引起细胞存活率下降，转染效率的提高被抵消。真核细胞基因转染一般遵循低电场长时程的原则。长时程(一般20～60 ms)可使细胞上的穿孔更大，开放时间更长。此外，适当地延长时程也能降低电穿孔的阈电场值，加大电场依赖性吸收的斜率，提高平台期电场值的放大作用。 3 脉冲次数 脉冲次数的选择一般为1～10次，实验证明对于大多数细胞系较理想的脉冲次数为3～4次。第1次脉冲后，外加的电场开始在细胞膜上穿孔，第2 次脉冲后，

电穿孔系统

电穿孔系统 BJ5183电转感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。BJ5183为重组腺病毒质粒构建专用菌株，能够表达供pAdEasy骨架质粒和pAdEasy穿梭质粒进行同源重组的所有组分。pUC19质粒检测感受态细胞的转化。 1.电极间距为0.1cm的电转杯（Gene Pulser?/MicroPulser? electroporation cuvettes）插入碎冰中，压实冰面，冰中静置5分钟，使电转杯充分降温。（电转杯重复使用方法：每次用完后，用大量的自来水冲洗干净去掉菌液和DNA，用蒸馏水洗3遍，将其泡在75%乙醇中30分钟，取出杯子，沥干液体，放在超净台中，使乙醇充分挥发，盖上盖子放干燥地方备用）； 2.取-70℃保存的感受态细胞插入冰中，待细胞刚化冻后，加入质粒DNA或连 接产物（洗脱或溶解质粒的溶液中离子不能太高，或用双蒸水稀释，对照pUC19可以用无菌水稀释到10pg/μl），用手指拨打管底轻轻混匀，立即插入冰中，在超净台中用无菌吸头将细胞/DNA混合物快速转移到电击杯中，避免产生气泡，确保细胞沉到杯底，盖上杯盖，空管保留待用。 3.启动电转仪，设置电击参数：2.0kV，200Ω，25μF（BTX ECM 630或Bio-Rad GenePulser）。用纸巾擦掉电转杯外部的水分，将电转杯放入电转槽中进行电击。完成后，将电转杯插入冰中，加入950μl无抗生素的SOC或LB培养基，并将液体转移到原来保留的感受态空管中，37℃，150-250rpm振荡培养1小时。 4.取100-200μl左右的菌液或稀释后的菌液，涂布于含相应抗生素的LB平板上， 倒置放于37℃培养箱培养12-18小时。 注意事项： 1.电转杯必须预冷。感受态细胞应该在冰水浴中化冻，加入DNA后应轻柔 混匀，加入DNA的体积小于细胞体积的1/10。 2.一旦DNA加入到细胞中，电击操作应该立即进行。 3.DNA 应该溶解在水或TE中，连接酶的存在会降低转化效率，必要时需 纯化连接产物。 4.电击时，电转杯中的气泡和含高浓度盐离子的DNA或转化产物会导致电 弧现象的发生。

电转染标准步骤

电转染标准步骤 1.清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时，然后在紫外灯下照射后即可使用。 2.电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前出于对数生长期。对于原代培养细胞，一般培养2-3天后，细胞单层融合度可以达到70-80%，即可开始试验。 3.PBS洗细胞2次后，胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化。 4.轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。 5.完全弃去上清，根据细胞数量，加入适量的电转缓冲液重悬细胞（一般为0.5-0.6ml左右），并上下吹打均匀。 6.加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度（质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM），上下吹打均匀。若以0.5ml计算，所需质粒为0.5×20=10ug。 7.将含有相应浓度核酸的细胞悬液转移入相应规格的电转杯中，按照预定条件设置参数，进行电击操作。（不同细胞电转前，需要进行预试验摸索电转的最佳条件，既要保证较高的转染效率，又要保证较高的细胞存活率。经过实践摸索后得出，相应的最佳参数为：质粒：250V，10ms，1（最多2），0，4mm cuvette；SiRNA: 250V，5ms，1（最多2），0，4mm cuvette。 8.电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8-12min，以使核酸充分进入细胞。 9.将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。 10.正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞。 11.培养24h后，即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞的实验处理。

关于慢病毒感染的相关知识总结讲解

慢病毒使用操作手册 一、慢病毒的储存与稀释: 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） ①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 ②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。 二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验： 感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。 慢病毒感染目的细胞预实验 1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项： ①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 ②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 ③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含