3种抗氧化活性测定方法

一、抗氧化活性测定

1．DPPH:

a)样品溶液浓度初测定，（0~4℃）储藏。

b)称4mg，加无水甲醇溶解于烧杯，转移至100mL容量瓶定容。

浓度为0.04mg/mL。避光（0~4℃）储藏。

i.5ml离心管（2mlDPPH·溶液+2ml无水甲醇）混合后充分振摇，

反映稳定，40min后测定。以无水甲醇为对照分光检测λ

=517nm。平行测定2次。A1

ii.5ml离心管（2ml待测样+2mL无水甲醇）混合后充分振摇，反映稳定，40min后测定。以无水甲醇为对照分光检测λ

=517nm。A2

iii.5ml离心管（2mlDPPH·溶液+2ml待测样）混合后充分振摇，反映稳定，40min后测定。以无水甲醇为对照分光检测λ

=517nm。A3

清除率（Y）=[1-（A3-A2）/A1]?100%。

平行测定3次，取平均值。分别以试样质量浓度和清除率做显形回归方程并计算清除率为50%时，代测样品的浓度值，即半抑制浓度IC50。自由基清除能力，AE=1/IC50。根据AE大小判断待测样品清除自由基能力的大小，AE越大清除能力越强。

2．·OH

a)PBS制配：磷酸二氢钠31.2g 1000ml蒸馏水定容，磷酸氢二钠71.6g

1000ml蒸馏水定容。移液管移液磷酸二氢钠190ml、磷酸氢二钠

810ml 于1000ml 烧杯，pH 计调7.4。

b) 邻二氮菲：148mg 蒸馏水定容100ml 。

c) 硫酸亚铁：208.5mg 蒸馏水定容100ml 。

d) 100ml30%双蒸馏水定容300ml 。封口。

i. 10ml 离心管（0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 硫酸亚

铁混匀后+0.5ml 22O H +双蒸馏水定容10ml ）37℃水浴1h 后分光λ

=536nm 。A1

ii. 10ml 离心管（0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 硫酸亚

铁混匀后+双蒸馏水定容10ml ）37℃水浴1h 后分光λ=536nm.A2 iii. 10ml 离心管（0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 待测样

+0.5ml 硫酸亚铁混匀后+0.5ml 22O H +双蒸馏水定容10ml ）37℃水

浴1h 后分光λ=536nm.A3

iv. 10ml 离心管（1mlPBS+双蒸馏水定容10ml ）37℃水浴1h 后分光

λ=536nm.A 空。

清除率（Y ）=（A3-A1）/（A2-A1）?100%

平行测定3次，取平均值。分别以试样质量浓度和清除率做显形回归方程并计算清除率为50%时，代测样品的浓度值，即半抑制浓度IC50。自由基清除能力，AE=1/IC50。根据AE 大小判断待测样品清除自由基能力的大小，AE 越大清除能力越强。

3．-

2O ·：

a) 磷酸二氢钠31.2g 1000ml 蒸馏水定容，磷酸氢二钠71.6g 1000ml 蒸馏水定容。用滴管取磷酸二氢钠加入到磷酸氢二钠中，边加边

搅拌，pH计测到8.2。0.2mol/L加蒸馏水稀释到0.05mol/L。

b)邻苯三酚：94.58g蒸馏水溶解定容100ml。

i.（5mlPBS+0.1mL蒸馏水+0.2ml邻苯三酚）4min25℃水浴（+

一滴HCl终止反应。λ=325nm。A0【对照】

ii.（5mlPBS+0.1ml样品液+0.2ml邻苯三酚）4min25℃水浴（+一滴HCl终止反应。λ=325nm。A1

iii.（5mlPBS+0.2mL蒸馏水+0.1ml样品液）4min25℃水浴（+一滴HCl终止反应。λ=325nm。A2

清除率（Y）=1-（A1-A2）/A0?100%

平行测定3次，取平均值。分别以试样质量浓度和清除率做显形回归方程并计算清除率为50%时，代测样品的浓度值，即半抑制浓度IC50。

自由基清除能力，AE=1/IC50。根据AE大小判断待测样品清除自由基能力的大小，AE越大清除能力越强。

总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)

总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法) 产品编号产品名称包装 S0116 总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法) 100次 产品简介： 总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)，即Total Antioxidant Capacity Assay Kit with FRAP method，简称T-AOC Assay Kit，是一种采用Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP)方法，可以对血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力进行检测的试剂盒。 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧，同时一些环境因子例如紫外照射、γ射线照射、吸烟、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激(Oxidative stress)，继而导致各种肿瘤、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、肝损伤、以及中枢神经系统疾病等。 机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导的氧化应激(oxidative stress)的产生。一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。因此测定血浆、血清、尿液、唾液等各种体液，细胞或组织等裂解液中的总抗氧化能力具有非常重要的生物学意义。 植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物溶液的总抗氧化能力的检测可以用于检测各种溶液的抗氧化能力的强弱，可以用于筛选强抗氧化能力的药物。 FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。 Antioxidant Fe3+-TPTZ ——————> Fe2+-TPTZ (蓝色) 提供了抗氧化物Trolox作为对照。Trolox是一种维生素E的类似物，水溶性较好，抗氧化能力和维生素E相近。 本试剂盒方便快捷，加入待测样品后3-5分钟即可进行吸光度测定，通常10-20个样品可以在十多分钟内检测完毕。 本试剂盒可以检测100个样品。 包装清单： 产品编号产品名称包装 S0116-1 TPTZ稀释液 15ml S0116-2 TPTZ溶液 1.5ml S0116-3 检测缓冲液 1.5ml S0116-4 FeSO4·7H2O 200mg S0116-5 Trolox溶液 (10mM) 0.1ml —说明书1份 保存条件： -20℃保存，一年有效。其中S0116-2 TPTZ溶液，S0116-3 检测缓冲液和S0116-5 Trolox溶液 (10mM)需避光保存。 注意事项： 在酸性条件下呈蓝色或接近蓝色的试剂会对本试剂盒的检测产生干扰，需尽量避免。 如果样品中含有外加的较高浓度的铁盐或亚铁盐，会干扰测定。但血浆、血清、细胞或组织裂解液等样品中含有的微量的铁盐或亚铁盐不会干扰测定。 样品中不能添加DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的物质，也不宜添加Tween、Triton和NP-40等去垢剂。 测定时需可以测定A593的酶标仪一台(测585-605nm也可以)或可以测定微量样品的分光光度计一台。 TPTZ对人体有刺激性，请注意适当防护。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用

ABTS_法测定葡萄酒抗氧化活性的研究

第37卷　第11期2009年11月 西北农林科技大学学报(自然科学版) Journal of Northwest A&F University(Nat.Sci.Ed.) Vol.37No.11 Nov.2009 ABTS?+法测定葡萄酒抗氧化活性的研究3 李　华,李　勇,吴　莹,王　华 (西北农林科技大学葡萄酒学院,陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心,陕西杨凌712100) [摘　要]　【目的】确定AB TS?+法测定葡萄酒抗氧化活性的最佳反应时间和葡萄酒的最佳稀释倍数。【方法】应用福林肖卡比色法(FC)测定36种葡萄酒样品的总酚含量(Total phenol index,TPI),从中选出9种总酚含量具代表性的葡萄酒样品,并采用AB TS?+法测定反应不同时间和稀释不同倍数葡萄酒样品的抗氧化活性。【结果】AB TS?+法测定葡萄酒抗氧化活性的最佳反应时间为2～5min;红葡萄酒的最佳稀释倍数为0.2∶10～0.4∶10,桃红葡萄酒的最佳稀释倍数为1∶10～4∶10,白葡萄酒的最佳稀释倍数为3∶10～7∶10。【结论】得到了AB TS?+法测定葡萄酒抗氧化活性的最佳反应时间和葡萄酒的最佳稀释倍数,且无需事先测定总酚含量,简化了试验步骤。 [关键词]　葡萄酒;抗氧化活性;AB TS?+法;反应时间;稀释倍数 [中图分类号]　TS262.6[文献标识码]　A[文章编号]　167129387(2009)1120090208 Research of antioxidant activity of wine s determined by the ABTS?+method L I Hua,L I Y ong,WU Y ing,WAN G Hua (College of Enolog y,Engineering Research Center f or V iti2V i nicult ure,N ort hwest A&F universit y,Yangli ng,S haanx i712100,China) Abstract:【Objective】The p resent st udy aimed to confirm t he best reaction time and wine dilution of t he AB TS?+met hod.【Met hod】The Folin2Ciocalteu colorimetry was used to measure t he total p henol in2 dex of36kinds of wines and t hen9kinds of rep resentative samples were selected f rom t hem,AB TS?+ met hod was used to measure t he antioxidant activities of wines wit h different reaction time and different di2 lutio ns,and was analyzed t he experiment result.【Result】The result s showed t hat t he best reaction time of t he AB TS?+met hod is2to5minutes,t he best dilution range,0.2∶10to0.4∶10for red wines,1∶10to 4∶10for ro se wines,and3∶10to7∶10for white wines.【Conclusion】The st udy has obtained t he best re2 action time and wine dilution to measure antioxident activity of wines by AB TS?+met hod,and t here is no need to measure total p henol content beforehand,so t he test p rocedure is simplified. K ey w ords:wine;antioxidant activity;AB TS?+met hod;reaction time;dilution 经过研究和分析发现,葡萄酒中含有大量的多酚类物质,如白藜芦醇、儿茶酚、表儿茶精、槲皮酮和芸香苷等,这些多酚类物质具有抗氧化活性,除了抑制低密度脂蛋白的氧化、预防心血管疾病以外,还有抗癌、抗炎症和抗血小板凝聚等功能[1],但不同的品种、气候、地理条件和工艺措施,导致葡萄酒中酚类物质在数量和种类上都有明显不同[223]。因此,如何评价葡萄酒中酚类物质的抗氧化活性很有现实意义。 AB TS?+在414,645,734和815nm处均有特征吸收[4]。Miller等[5]在1993年首次介绍了用AB TS?+法来评价一些化合物的抗氧化活性,即根据待测化合物清除AB TS?+引起的吸光度变化来评价其抗氧化活性。此后,AB TS?+法成为一种被广泛采用的抗氧化活性测定方法,用于饮料和食 3[收稿日期]　2009203206 [基金项目]　陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项“陕西省葡萄与葡萄酒产业关键研究”(2007ZD KG209) [作者简介]　李　华(1959―),男,重庆市梁平人,教授,博士生导师,主要从事葡萄与葡萄酒研究。 E2mail:lihuawine@https://www.sodocs.net/doc/ff12568969.html,

抗氧化实验方法

1还原力的测定 样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm 离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min 后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大表明还原力越强。 注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。但具体情况应根据吸光值大小而定。 0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。 铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。 比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）。 2 DPPH自由基清除活性的测定 将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混合，振荡，在 室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。清除率计算公式为： 空白为1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸馏水调零。 式中：Ac——对照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值； Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值； 注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率而定，最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。 DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。而且DPPH试剂很昂贵，用时注意节约。0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml。 3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定 以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL。对照管除不加样液外其他试剂同前。将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温培养1h。取出后，加入20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对照管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分别加入质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却。空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示为: SA(%)=(Ac一AS)/A C×100 式中:Ac一不加样品的吸光度 As一加入样品的吸光度 注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存。 酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度

ORAC法测定虾青素抗氧化能力实验

ORAC法测定虾青素抗氧化能力实验 1.实验目的 1.1 了解多功能酶标仪的应用范围和基本结构及其操作方法 1.2 掌握ORAC法测定虾青素抗氧化能力实验原理 2 实验原理： 2.1 仪器基本原理 酶标仪实际上就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计。光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔极中的待测标本，该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上。光电检测器将透射过待测标本后强弱不同的光信号转换成相应的电信号，电信号经前置放大、对数放大、模数转换等处理后，送入微处理器进行数据处理，转换成相应的浓度，最后由显示器和打印机输出结果。 2.2 ORAC实验原理 ORAC是氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity）的缩写，也被称为抗氧化能力指数，ORAC分析法中的自由基主要来源于偶氮化合物2，2'-偶氮-双-（2-脒基丙烷）氯化二氢[2，2'-azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride，AAPH]热分解产生的过氧化氢自由基，也可以是芬顿( Fenton) 反应过程中产生的羟自由基，以荧光素钠（sodium flourescein，FL）为荧光探针，观察自由基与荧光探针作用后，探针荧光强度的衰退过程，以水溶性维生素E类似物( 6-hydro-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox) 作为抗氧化标准物质，检测体系中各种抗氧化剂延缓探针荧光强度衰退的能力，以此评价抗氧化剂的抗氧化能力。 3 仪器及试剂 3.1 仪器及配件 Enspire 多功能酶标仪，96孔荧光板 3.2 试剂 3.2.1 磷酸盐缓冲液的制备：精密量取适量磷酸，以高纯水稀释得到75 mmol/L 磷酸溶液；称取8.56 g磷酸氢二钾以高纯水500mL溶解，以磷酸溶液调pH 7.4，即得75 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液。 3.2.2 AAPH溶液的制备：精密称取AAPH 207mg，以磷酸盐缓冲液溶解并定容至5 mL量瓶，即得浓度为153 mmol/L的AAPH溶液。 3.2.3 FL溶液的制备：精密称取FL 40 mg，以磷酸盐缓冲液溶解，制成4125 mmol/L的FL 溶液，记为FL母液a。精密吸取FL母液a 50uL置50 mL量瓶中，以上述缓冲液定容至刻度，记为FL母液b；FL母液a，b均于4℃冷藏。实验时精密吸取FL母液b500uL置25 mL 量瓶中，以上述缓冲液定容至刻度，即得8*10-5mmol/L的稀释液。 3.2.4 样品溶液的制备：精密称取虾青素样品适量，以甲醇溶解，配制成1mg/mL的化合物母液，继而以缓冲液稀释制成10，50，100ug/mL的化合物溶液。 4 实验内容 4.1 样品量效曲线的确定：精密吸取FL稀释液100uL于96孔荧光板中，随后加入不同浓度样品溶液50uL振荡5 min，37℃温育10min后迅速加入AAPH液50uL启动反应。以激发波长485 nm，发射波长535 nm进行测定并记录荧光值，反应过程中每隔1.5min测定一次荧光值（记为Fn）。以测定时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制不同浓度虾青素荧光衰变曲线。

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

抗氧化酶 S O D P O D C A T活性测 定方法 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液 （pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na 2HPO 4 ·12H 2 O（分子量 358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH 2PO 4 ·2H 2 O（分子量 156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na 2HPO 4 ) 228.75ml，B母液(NaH 2PO 4 ) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 （3）100μM EDTA-Na 2溶液：取0.03721gEDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定 容至1000ml。 （4）20μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。 （5）750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.06133g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 2、酶活性测定 （1）取10ml试管（要求透明度好）

抗氧化活性测定方法的比较

抗氧化活性测定方法的比较 人体衰老和多种疾病均与自由基有关，寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性，抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。 体外：抗氧化活性可以用在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。常用的方法有羟基自由基（·OH）清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH法）、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS 法）、超氧阴离子自由基法（O2-·）、邻苯三酚自氧化法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定（FRAP法）、总酚测定法、ORAC法等方法。体内：主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。 其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除率，缺点是不同物质具有组成和结构的差异，与DPPH·、ABTS+·的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断，且DPPH自由基会和其他自由基发生反应。邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及ｐＨ值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在

着较大差异。β-胡萝卜素漂白法的缺点是β-胡萝卜素本身有抗氧化活性，对样品活性的测定结果有影响。FRAP法主要用于食品业，优点是简单易操作、可以重复，缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法，缺点是仪器成分较复杂，检测成本较高。 目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法，使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。分光光度法操作较简单、便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外-可见分光光度测量值后计算其活性大小，具有成本低、效率高、样品量少等优点。分光光度法缺点是会受到样本自身颜色和浑浊度的影响和限制，颜色深的样品测得的数据误差大，甚至得到错误的结果；不同物质组成和结构存在差异，与各种自由基的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。外界环境因素对实验结果也存在一定程度的影响，有些抗氧化活性实验在冬天低温时不易成功，测得的数据往往没有规律。 我觉得在测定样品的抗氧化活性时，各种方法都有自己的优缺点，要根据需测物质来决定用什么方法，比如DPPH 法的自由基选择性强，不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应，这类物质需用其他方法测定。若对检测结果

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）L磷酸缓冲液(PBS，： A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g； B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。 （3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。 （4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 2、酶活性测定 （1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀； （2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中 （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min； 同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 （4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。 （5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在

抗氧化性方法

取0.2mL 甲醇，加入0.3 mL样品溶液（浓度50-800ug/mL ,甲醇配制），混匀，加入2.5mL 75uM DPPH（甲醇溶解）溶液，室温放置30min ,于517nm处测吸光值。 清除率=[A0-（A-A b）/A0]×100% A0：不加入样品，DPPH吸光值（对照） A：样品和DPPH吸光值 A b：样品，不加DPPH吸光值 2 O2-· PMS吩嗪硫酸甲酯 NADH 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NBT氯化硝基四氮唑蓝 0.1mL 样品溶液，加入1mL 16 mM Tris-HCl (pH 8.0)---78uM NADH, 1mL 16 mM Tris-HCl (pH 8.0)- --10uM PMS ，1mL 16 mM Tris-HCl (pH 8.0)- --50uM NBT, 25min保温5 min后于560 nm 处吸 光值。清除率=（1-A 样品/A 对照 ）×100%。 3 邻苯三酚自氧化 0.1mL 样品溶液，加入2.8mL 0.05M Tris-HCl (pH 8.0)---1mM EDTA,加入0.2mL 6mM 邻苯三酚。室温迅速振摇，于325nm处每30s 测吸光值至4min。 清除率=（1-样品斜率/对照斜率）×100% 4 FRAP reagent： 10体积300 mmol/L pH3.6醋酸缓冲液,1体积10 mmol/L TPTZ---40 mmol/L HCl 溶液，1体积20mmol/L FeCl3. 1.5mL 新配制FRAP reagent加热至37℃,于593 nm处测空白吸光值。然后加入50uL 样品溶液和150uL去离子水。8min后测吸光值。 FRAP值=A样品-A空白 2.1 清除羟基自由基（HPLC法） 2.1.1色谱条件 色谱柱：Angilent HC-C18柱（(4.6×250mm，5um); 流动相：甲醇：0.1% H3PO4=30:70;流速： 1ml/min;柱温：35℃；紫外检测波长：254nm;进样量：20ul。

抗氧化剂抗氧化活性的测定方法

1.抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物氧化的物质。被氧化的底物包括蛋白质、脂质、糖和DNA。 2.初始型抗氧化剂(AH)可通过与脂质自由基L.、过氧自由基LOO.或烷氧自由基LO.反应抑制脂质氧化链反应。 L.+ AH--- LH + A. LOO.+ AH--- LOOH + A. LO.+ AH--- LOH + A. 抗氧化剂自由基A.也能与过氧自由基、烷氧自由基反应从而终止脂质氧化反应。 LOO.+ A.---LOOA LO.+ A.---LOA 次级型抗氧化剂可通过各种机理延缓脂质氧化,如螯合过渡金属、给初始型抗氧化剂补充氢、清除氧以及使活性物质失活等。 抗氧化剂的活性分为在生物体外(如食品中)的活性和在生物体内的活性。本文综述了体外测定抗氧化剂抗氧化活性的方法,不包括在生物体中测定生物活性的方法。 3.评价或表征抗氧化活性的方法为了说明在特定条件下被测物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力 实际测定时至少要说明在测试条件下被测物是抗氧化剂还是促氧化剂;在指定浓度下比较不同测试材料(如被测物与标准抗氧化剂或添加有被测物的测试体系与空白体系)对底物的作用。 评价或表征抗氧化活性的方法有: (1)在指定的时间测量氧化产物或官能团的浓度或吸光度值;( 2)测量反应的速率;

( 3)测量诱导期(延滞期)或氧化达到一定程度所需的时间;( 4)测量速度的积分(即动力学曲线下的面积) ; ( 5)测量被测物产生与标准抗氧化剂相当作用的浓度。4.参数 4.1诱导期( induction period) 诱导期tIND(也叫延滞期, lag period)常定义为化学反应的速度。诱导期是一个相当不确定的值,受检测方法、使用仪器的灵敏性以及一些其他因素的影响。对于脂质氧化,诱导期通常是指链增长阶段动力学曲线的切线和时间轴的交点。 4.2抑制率( percentag e of inhibition)和IC50 抑制率和IC50 (抗氧化剂提供50%抑制作用时的浓度,也可用EC50表示的)常用来表征抗氧化能力。它们不仅与被测抗氧化剂的反应性能和氧化的底物有关,而且受其他因素的影响,如脂质氧化链反应的长度和抑制速率等。此外,用IC50表征抗氧化剂 的活性与比较活性的时间点有关。只有在其他参数相同的情况下,在某一研究中测得的抑制率和IC50才可以与另一研究中测得的值进行直接比较。TEC50是指抗氧化剂提供50%抑制作用所需的时间,也常用来表征抗氧化活性 5.对测定方法的要求 测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要 求: ( 1)能说明测试体系中发生的反应,并能用明确的动力学图解描述;( 2)测试要有再现性; ( 3)测试效率要足够高; ( 4)方法要相对简单; ( 5)能连续检测; ( 6)应使用与体内或食品有关的活性自由基;

抗氧化功能评价方法

附件1： 抗氧化功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 试验项目 1.1 动物实验 1.1.1 体重 1.1.2 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane） 1.1.3 蛋白质氧化产物：蛋白质羰基 1.1.4 抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶 1.1.5 抗氧化物质：还原性谷胱甘肽 1.2 人体试食试验 1.2.1 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane） 1.2.2 超氧化物歧化酶 1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶 2 试验原则 2.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。 2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。 2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。 2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 3 结果判定 3.1 动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。 3.2 人体试食试验：脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该受试样品具有抗氧化功能的作用。

抗氧化功能检验方法 Method for the Assessment of Antioxidative Function 1 动物实验 1.1 实验动物 选用10月龄以上老龄大鼠或8月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。单一性别，小鼠每组10－15只，大鼠8－12只。 1.2 剂量分组及受试样品给予时间 实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。 1.3 实验方法 1.3.1 老龄动物 选用10月龄以上大鼠或8月龄以上小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。 1.3.2 D－半乳糖氧化损伤模型 1.3. 2.1原理 D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。 1.3. 2.2造模方法 选25-30g健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖40mg－1.2g/kg BW 颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。 1.3.3 乙醇氧化损伤模型 1.3.3.1原理

抗氧化活性测定方法

抗氧化方法 一、Determination of Superoxide Anion Scavenging Ability（超氧阴离子清除能 力） 1、determined by a CL method in the pyrogallol-luminol system on a BPCL Ultra-weak luminescence analyzer。（焦性没食子酸-发光胺，荧光检 测） 2、步骤：10μL sample (不同浓度) + 50 μL焦棓酸(6.25*10-4 mol/L) + 0.94 mL of a mixture containing luminol (0.05 mol/L) and carbonate buffer (pH 10.2) （发光胺用pH 10.2碳酸盐缓冲液配成0.05 mol/L） 3、Hi-V, 800; Kv, -1; the spectral range of CL（波长范围）180-800 nm; 温 度：30 ° C.总时间：300S，每2S读数一次。 4、对照：不加样品（样品用水代替）。空白不加焦棓酸（用来调零）。 二、Determination of Scavenging Ability on Hydroxide Radicals（羟基自由基清除能力） 1、CuSO4-Phen-Vc-H2O2 CL system（1 mL体系） 2、50 μL of sample solution （样品液）+ 50 μL of a 1.0 mmol/L CuSO4 solution （CuSO4 溶液）+ 50 μL of a 1 mmol/L 1,10-phenanthroline solution（邻二氮菲溶液）+ 700 μL of a 0.05mol/L borate buffer (pH 9.0) （硼酸缓冲液）+ 100 μL of a 1 mmol/L ascorbate solution + 50 μL of a 0.15% H2O2 solution 3、总时间400S，间隔3S。Hi-V, 800; Kv, -1; the spectral range of CL（波长范围）180-800 nm; 温度：30 ° C. 4、阳性对照：不加样品（样品用水代替）。空白不加H2O2（用来调零）。 三、Determination of Scavenging Effect on Hydrogen Peroxide（过氧化氢清除 能力） 1、luminol-H2O2 system

抗氧化物活性测定方法总结

抗氧化物活性测定方法（倾向于考虑DPPH法和ORAC法） 1.FRAP法:铁离子还原抗氧化能力测定法[1] FRAP(ferric ion reducing antioxidant power)方法，在低pH值的溶液中， Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。 该法快速简便、易于操作、重复性好，但FRAP反应属于电子转移(SET)反应，因此FRAP方法不能够测定氢转移反应(HAT)起作用的物质。而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力，因此没有抗氧化能力的生物学相关性。 2.TEAC法(trolox equivalent antioxidant capacity) ABTS(2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐)与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力，测得的结果以TEAC表示，即被测抗氧化剂清除ABTS·+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox(VE的水溶性类似物)清除ABTS·+的能力的比值。 TEAC法十分简单，适用于大量样品的分析检测。但是，ABTS·+并非生理自由基，缺乏生理相关性，而且与FRAP方法相似，ABTS·+与不同抗氧化剂问的氧化反应时间不同，因此，只能定性不能定量评价样品的抗氧化能力。 3.DPPH法[2，3](2，2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity) DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)法是较常用的方法之一。DPPH·是一种稳定的以氮为中心的自由基，其醇溶液呈深紫色,在517nm 处有一吸收峰。当反应系统中存在自由基清除剂时，它可以和DPPH·的单电子配对而使517nm 处的吸收峰渐渐消退。而且，这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学计量关系。因此，根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。通过计算DPPH自由基剩余一半时所需抗氧化剂的浓度(EC50)以及时间(TEC50)反应抗氧化物的活性。 DPPH法快速、简单，仅需要一台紫外分光光度计就可以测定，但DPPH方法存在的不足是，当被测物与DPPH紫外吸收有重叠时，将会影响测定结果，比如类胡萝卜素。此外，由于空间位阻决定反应的倾向，小分子化合物由于更易接近自由基而拥有相对较高的抗氧化能力。此外该方法线性范围也相对较窄，而且所有还原剂都能够对DPPH起作用，因此结果并不能完全代表抗氧化能力。

植物总抗氧化能力(TAC)比色法(ABTS)定量检测试剂盒

植物总抗氧化能力（TAC）比色法（ABTS）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
植物总抗氧化能力 （TAC） 比色法 （ABTS） 定量检测试剂盒是一种旨在通过过硫酸钾的参与， 使染料 ABTS 氧化，在抗氧化剂的存在下，通过分光光度仪，观察其峰值下降的变化，来定量检测对应于标准水溶性生 育酚 Trolox 的总抗氧化能力，即抑制氧化等值浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功 实验证明的。适用于各种体液包括血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液等各种体液的总抗氧化能力检 测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。b5E2RGbCb5E2RGbC
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-） 、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2） 、羟自由基或氢氧基 （hydroxyl radical；OH-） 、过氧化基（peroxyl radical；ROO-） 、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO） 、烷 氧自由基（alcoxyl radical） 、氮氧基（nitric Oxide；NO-） 、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-） 次氯酸（hypochlorous acid；HOCl） 、半醌自由基（semiquinone radical） 、单线态氧气（singlet oxygen）等 细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如 冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物 歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER） 、 铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素 （bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过过硫酸钾 （potassium persulfate）氧化2,2’-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸） （2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline6-sulfonic acid)，diammonium salt；ABTS）产生的ABTS自由基，衡量体系中抗氧化剂捕获自由基或者消耗 抗氧化剂的能力，在分光光度仪（730nm波长）的帮助下，观察其峰值下降的变化，并与标准化抗氧化剂 水溶性生育酚Trolox对照。p1EanqFDp1EanqFD
产品内容
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抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase ,APX)活性测定试剂盒 使用说明

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase ，APX）活性测定试剂盒使用说明 微量法100T/96S 产品简介： APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化H 2O 2氧化AsA，是植物AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到AsA 的含量，在胁迫和解胁迫条件下，APX 与AsA 具有一定的负相关性。 APX 催化H 2O 2氧化AsA，通过测定AsA 的氧化速率，可计算得APX 活性。 试验中所需的仪器和试剂： 低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 试剂一：液体×2瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加3mL 蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1支，4℃保存。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称取约0.1g 样品，加1mL 试剂一，冰上充分研磨，13000g 4℃离心20min，取上清液。 二、测定操作表： 1.分光光度计预热30min 以上，调节波长到265nm，用蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃中预热30min 以上。 3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL 蒸馏水、140μL 预热的试

剂一、20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 4.测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL预热的试剂 一、20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 APX活力计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/g鲜重)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Wε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间（min），2min。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.1848×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。