鼻膜去黑头的步骤 去黑头鼻膜怎么用

鼻膜去黑头的步骤去黑头鼻膜怎么用

黑头泛滥和毛孔粗大总是一同困扰着我们的皮肤，而鼻膜则是最快速去除黑头的好方法。那么，鼻膜去黑头的步骤是什么呢?下面跟着小编一起来了解一下吧。

鼻膜去黑头的步骤

洁面。在使用鼻贴之前最需要先洁面，用洗面奶将脸上的油污彻底清理干净。

打开毛孔。也是至关重要的一步，直接影响去黑头的效果，常用的方法是热蒸汽蒸面或热毛巾敷脸，毛孔只要稍微张开就行，控制好程度。

鼻贴去黑头。做完以上的准备工作，就可以开始去黑头了，用黑头鼻贴贴在鼻子上，要注意的是要保持鼻子有一些水分，刚刚打开毛孔的时候应该还有点点湿度，趁这个时候将鼻贴贴在鼻子上。

撕拉。黑头鼻贴贴上后还不能掉以轻心哦，撕拉也是至关重要的，如果方法不正确可能拔不出黑头。需要注意的是撕拉鼻贴必须由下往上拉，一次性迅速揭下来，这样才能最大程度的将黑头连根拔除。

注意：鼻膜也不是适用于任何情况的，如果皮肤上有伤口、发炎、红肿的现象，最好不要使用鼻膜，以免引起发炎，而且鼻膜是有一定刺激性的，所以皮肤敏感的人也不要轻易使用。其实只要正确使用鼻膜，就能达到去黑头缩毛孔的目的了，健康皮肤的人可以试试哦!简单有效去除黑头的方法

1、鸡蛋壳内膜

坚持用几次这个办法去能够去掉黑头。

做法：洗完脸后，敲一个生鸡蛋，取鸡蛋壳内层的那层膜，把它小心撕下来贴在鼻子上，等紧贴后撕下来。

2、番茄加柠檬

这个方法对清除老死细胞，深层清洁肌肤，收敛毛孔，对黑头粉刺和油性肌肤特别有效，柠檬还有美白的效果。

做法：将番茄与柠檬片打成泥，加入一点面粉搅拌均匀。均匀的涂抹在脸上约30分钟左右，用清水洗净。

3、精油去黑头

薰衣草精油迅速进入毛囊，清除毛囊内堆积物，疏通毛孔清除多余油脂，去除黑头的功效无须质疑。

做法：在打湿的化妆棉上滴上几滴薰衣草精油。然后在鼻子上打圈按摩，大约10分钟左右，用清水洗净就可以了。但要提醒大家的是不要用这个方法贴满全脸哦!

4、米饭去黑头

把米饭煮好，米饭不能太硬了!当然如果有糯米饭就更好了，道理大家都懂的，糯米软，粘性强不容易散，且吸附力好。趁热盛一小碗米饭，然后把它紧紧的揉成一团，将其敷在黑头较多的鼻头部分，轻轻地边滚边揉搓。按摩大约20分钟后用清水将脸部清洗干净，有开放性伤口之类的皮肤可能会痛，慎用!

5、食盐去黑头

洗脸后在皮肤还没有干透时，取适量食盐涂在鼻子上打圈圈按摩，你会感觉盐慢慢融化;过十分钟左右用清水洗干净。注意事项：有痘痘或者伤口之类皮肤的肯定会痛，慎用;敏感肤质者不提倡使用该方法。建议产品：洗面盐，用的时候可以取一小勺在手上，用几滴清水调和，就变成浓浓的液体，然后把这个液体在鼻子上按摩一会，再洗掉就OK了。

6、珍珠粉去黑头

取适量珍珠粉放入小碟中，加入适量清水，将珍珠粉调成膏状;将调好的珍珠粉膏状物，

取适量均匀地涂敷在脸上;用面部按摩的手法在脸上按摩，直到脸上的珍珠粉变干，再用清水将脸洗净即可。每周使用2~3次，能很好地去除老化的角质和黑头。

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黑头导出膜怎么撕

5个黑头去除的简单方法

野火烧不尽，春风吹又生。用这句诗来形容黑头真是再合适不过了。似乎黑头总是祛完又长永远消灭不干净，可见祛黑头是一场令人头疼的持久战。关于这场战斗的正确方法，你又了解多少呢？现在就由小编给大家支支招吧！ 绝招1：溶解+净吸去黑头 清除原理：用黑头乳化将黑头溶出再清理掉。 方法：先用热毛巾敷脸或蒸气熏脸让毛孔张开，再将导出液倒在化妆棉上，以t字区为主3～5分钟后揭下，就会发现化妆棉上沾上了很多黑黑的脏污。随即涂抹上黑头净吸膜覆盖整个鼻头，强力净吸毛孔深处黑头、油脂，十五分钟后将面膜揭下，洁面后敷上净肌清脂收敛水，将毛孔缩小即可。 优点：去黑头效果比较明显，对皮肤基本无损伤。 缺点：需要花比较长的时间，使用后应立即拍上收敛水防止毛孔粗大。 绝招2：深层清洁面膜去黑头 清除原理：去除老废角质层，疏通毛孔，让黑头浮出表面后清除掉。 方法：使用具有去黑头功能的深层清洁面膜，使用面膜后让黑头浮出表面，再用海绵清洗或者用粉刺棒将它们轻轻刮掉，最后用洗面乳彻底清理。 优点：深层清洁面膜不会刺激毛孔，对皮肤无损伤。 缺点：一次去黑效果不够明显，见效慢，对于严重的大粒黑头基本没什么用。 绝招3：拔除黑头 清除原理：一种纯粹的物理解决方案，借助粘力将黑头从毛孔中强制拔出来。 方法：用毛巾热敷清洁过的脸，让角质软化，并让毛孔张开。在皮肤还没有干燥的时候就把粘湿的鼻贴贴上去，但鼻贴不可以太湿。等到完全干透，鼻贴开始发硬，再从下而上将鼻贴揭起。用完以后一定记得要用有收敛效果的爽肤水收缩毛孔，或用冰水冷敷收缩。 优点：去黑头的效果很明显，颗粒较大的黑头也能去除干净。 缺点：对皮肤有拉扯，会导致毛孔口松弛变大，如果不及时收敛，黑头会更快出现，毛孔会变大。 绝招4：气浴磨砂清除黑头 清除原理：利用热蒸气让毛孔打开，再经过磨砂膏的摩擦将老废角质和黑头一并清除。 方法：使用热毛巾敷脸或泡蒸气澡10分钟后，使用专用于去黑头的磨砂膏进行清洁，按摩5分钟后洗净磨砂膏。之后不要忘记要用含有滋润功能的乳液涂抹按摩磨砂过的地方。 优点：去黑头的同时，也清除了老废角质。 缺点：磨砂膏对皮肤角质层的伤害很多，也可能会让毛孔变粗大，不宜经常使用。 绝招5：天然去黑头方法 1、蛋清去黑头 将蛋白与蛋黄分开只留蛋白部分待用。 ①准备好清洁的化妆棉，将原本厚厚的化妆棉撕开成为较薄的薄片，越薄越好； ②打开一个蛋，将蛋白与蛋黄分开，留蛋白部分待用； ③将撕薄后的化妆棉浸入蛋白，稍微沥干后贴在鼻头上； ④静待十至十五分钟，待化妆棉干透后小心撕下。 2、蒸完米饭捏一小团在脸上轻揉据说会把脏东西都带下来 每次蒸完米饭捏一小团在脸上轻柔，说会把脏东西都带下来。据说有位老太太从不做美容，但是皮肤非常好，就用的是这个法子！使用饭团在脸上轻轻滚，然后再将脸洗干净。

Western操作步骤

Western-Blot 操作流程 （一）组织中总蛋白的提取 用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中，加入200uLRIPA裂解液(含PMSF，比例为97：1：1：1)，用杵子研磨3-4min, 段事先在酒精里浸泡至少30min，用之前用滤纸吸干酒精，） 20-30s,每隔5min 后在 4℃下12000rpm 离心 5min，取上清分装于 1.5mlEP管中并置于-80℃冰箱保存。 （二）BCA法蛋白含量的测定 (1) 从-20℃取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 (3)以上步骤完成后，在所有加样的孔里各加上200uLBCA蛋白浓度测定试剂（按试剂A：试剂B=50：1的比例配置），然后置于37℃水浴锅30min后取出。 (4)酶标仪测定OD值。 (5)EXCEL表格制作标准曲线，按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。 （三）稀释蛋白及蛋白变性 如果计算出的样本的蛋白浓度偏高，需要用RIPA裂解液将蛋白稀释（一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL）;稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中，加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液，置于99-100℃的干式恒温器中加热5-10min,使蛋白变性。（注意：将EP管的盖子盖紧，插入加热器的大圆孔中）煮过的蛋白置于-20℃冰箱保存。 （四）制作SDS电泳胶 ⑴清洗玻璃板，双蒸水冲洗晾干后，根据厂家说明安装玻璃板。 ⑵配置10%的分离胶 配方：H2O2 4.0ml 30%丙烯酰胺液 3.3ml 1.5mol/l Tris （ PH8.8） 2.5ml 10%SDS 100ul 10%过硫酸胺 100ul TEMED 4ul ⑶分离胶溶液中加入 TEMED 以及 10%过硫酸胺后需立即混匀（防止未灌胶就发生凝固），将混合液立即加入玻璃板内，距梳子下缘约 lcm 处即可，蒸馏水封顶，待凝胶完全聚合（约30min）后，倒去双蒸水。 ⑷制备5%的浓缩胶 配方；H2O2 3.4ml 30%丙烯酰胺液 0.83ml 1.5mol/l Tris （ PH6.8） 0.63ml 10%SDS 50ul

Western超详细实验步骤

Western实验步骤 1. 电泳(Electrophoresis) （1）SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。 一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。 配胶步骤： 1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。 2.按比例配分离胶（8ml-10ml） 3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面 4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。（如果今日不上样可以放入4°C冰箱） 注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理 1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀 2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。 3.12000r离心5分钟。 （3）上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右 2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。 3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳） 注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。 3.转膜(Transfer) 1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。 2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。 3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序 4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。 5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）

Western操作步骤

Western-Blot 操作流程及注意事项 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6. 于4℃下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强） （2）组织中总蛋白的提取： 1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： 1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min。 2. 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后PBS 重复洗涤一次。 3. 用枪吸干上清后，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （二）蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2. 取18 个1.5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。

western转膜条件

western 转膜条件 蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KD WB用膜类型、孔径：0.45 NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA 转膜时间：60~90 min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KD WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V 转膜时间：60~70 min 设备名字是“ Bio-Rad mini ”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“ Bio-Rad mini ” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。 蛋白来源：293T 细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V ，控制电流不要超过300 mA。转膜时间：70 min 蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。 蛋白来源：成纤维细胞 蛋白名称（可保密）：smad3 蛋白分子量：54 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流 转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 蛋白来源：胰腺癌细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：16 KDa and 42 KDa

Western_blot_试剂配制及操作流程

Western-Blot操作流程 试剂配制 1.RIPA裂解液： 10mM Tris（MW121.14，PH7.5） 1%NP40 0.5%TritonX-100 0.2%脱氧胆酸钠 2 mM EDTA 1 mM PMSF 20%甘油 调pH值至7.5。 混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。 制胶用（1-6）： 1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。 2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 18.671g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。 3.10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4.10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g

（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周） 5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。 6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。 10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150μl 10%AP 150μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加异丙醇（1ml）消泡 5%上层胶（两块胶，6ml）： 依次加入去离子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60μl 10%AP 60μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。 7．5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 8．10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g

Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜

Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜 PAGE倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防止漏胶，PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失——胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分，AP算最活跃分子——如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那绝对是你自己找骂，不值得同情。水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。Cambrex(原来的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液，很贵，也很好——配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带清晰漂亮，可惜一直没有搞清楚配方的奥秘；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，不过，对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。更加豪华的选择是已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是"razor sharp"啊！平时都能用这么豪华的东西心情当然超爽啊，实验紧凑又轻松，效率也更高啊！如果实验都能这么“好马配好鞍”，想必更容易出结果，也就更容易拿经费吧！什么时候我们的实验才能实现这种良性循环啊！Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）PAGEr都是首选预制胶。可是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的优惠活动，买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道就没有一点非份之想的冲动？ 上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer （别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。 电泳结果检查：如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng 蛋白。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot

Western Blot 原理和操作方法(详细)资料

Western Blot 原理和操作方法（详细） 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用. SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数

western转膜

western blot转移电泳一般操作流程 总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。

电转缓冲液和电转条件的选择 对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。现在实验室常用的Bio-rad 小型Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表： 槽式转印半干转印 Mini Trans-Blot槽Trans-Blot半干转印系统转印槽印迹区域（宽 x 长）10 x 7.5 厘米24 x 16 厘米 转移参数 凝胶夹数 2 -

缓冲液要求450ml ≤200 ml 电极距离4cm 按夹层结构厚度确定 转移时间（高强度）60分钟15–60 分钟 冷却蓝胶冷却装置/冷却旋管- 凝胶容量 18.3 x 19.3 厘米- 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）16 x 20 厘米- 1 块凝胶（2块凝胶堆叠）16 x 16 厘米- 13.3 x 8.7 厘米- 3 个凝胶并列 8.3 x 7.3 厘米每个凝胶夹1块凝胶共2个 凝胶夹（两种尺寸）4个凝胶并列 8.6 x 6.8 厘米 通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD 以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。 而对于半干转，我们一般选择恒流（膜面积的3倍：3 mA/cm2）之间一般60分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。 需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用

western 操作步骤

Western 操作步骤 （三）SDS——PAGE电泳 （1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后放在烤箱里烤干。 （2）灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左右和下部封边） 2、配10%下层胶（10ml两块胶，每块胶5毫升左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后胶上加一层甲醇（约1ml）液封，液封后胶凝的更快。 3、当甲醇和胶之间有一条折线时，说明胶已凝了。弃甲醇，并用吸水纸将甲醇吸干。 4、等待胶凝期间，准备好蛋白、细胞裂解液、上样缓冲液，上样总体积一般不超过30ul,上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白质变性，上样前在冰上放置3~5分钟。 5、配5%的上层胶（4ml两块胶，每块胶2ml），加入TEMED后立刻摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。 6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两竖直向上轻轻拔出。电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的伤员（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。 7、上样（注意：最外的两个泳道易跑歪，尽量不用）Marker 3ul （Marker加在最外边上的加样孔中）样本20~30ul （3）电泳：恒流25mA每块胶，两块胶50mA。电泳至溴酚兰刚跑出来即可终止电泳，进行转膜 （四）转膜 （1）转一张膜需准备四张滤纸和一张硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套（以防手上的蛋白污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1×转膜缓冲液浸湿。 （2）夹子黑的一面：海绵—2张滤纸—NC膜—胶—两张滤纸—海绵（刘老师的顺序），将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回赶几遍以赶走里面的气泡。在垫子上垫两层滤纸（光滑面临膜），放膜于滤纸上，将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于膜上，用手调整对齐，再放两张滤纸（光滑面临膜）用玻璃棒赶去其中的气泡。最后盖下另一块海绵垫，擀几下就可以合起来了。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，否则会发生短路。如果同时做两块胶，转膜时要记住样本的位置。 （3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的红面，夹的白面对槽的黑面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用35V过夜（刘老师）。 转膜时点击方向注意是膜正胶负转膜结束前配制封闭液（3%脱脂牛奶）及1×TBST缓冲液。 （五）免疫反应 （1）封闭：将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭30分钟。 （2）一抗 A.从封闭液中取出膜，1×TBST 5min ×4次 B.将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1小时后，4度过夜，次日用1×TBST

怎么彻底去黑头 简单实用怎么彻底去黑头方法大全

怎么彻底去黑头简单实用怎么彻底去黑头方法大全怎么彻底去黑头？说到怎么彻底去黑头这个问题，应该是90%的女性都非常关注的吧。那么到底怎么彻底去黑头呢？关于这个问题，我们一定要学会去了解一些超级有效的怎么彻底去黑头的方法。下面，就一起来看看吧！ 怎么彻底去黑头1、做好深层清洁 如果敷衍的清洁皮肤，则黑头也会在你敷衍的行为下继续滋长。想要彻底的清除黑头，一定要做深层洁面打基础。油性皮肤一定要养成定期去角质的习惯，每周都要进行一次深层洁面护理，这样才可以帮助去除油腻皮肤的污垢和油脂，减少黑头。如果是干性皮肤或是混合性皮肤，建议一个月清洁一次即可。【怎么彻底去黑头】深层清洁离不开洁面产品，小编一直使用DreamtimesM2梦幻洁面乳。 清洁力高于婵真银杏洁面，滋润度又丝毫不输丝塔芙，清洁与滋润的平衡能把握的如此协调，这也许应该就是M2梦幻洁面被誉为“控油洁面之王”的最大原因吧，蕴含的D-SPINO自然光解成分，使其获得出色的美白保湿，紧肤功效的同时，更让其在快速祛痘后，不留任何痘痕，痘印。一款仅60来块钱的洗面奶竟然在清洁、控油、滋润保湿方面做到如此的效果，实在是让我们不得不再次膜拜年轻护肤大牌Dreamtimes的天赐恩泽。 怎么彻底去黑头2、粘土面膜粉+小苏打 将小苏打粉加上护肤水与粘土面膜粉混合均匀。这款面膜粉对于去除毛孔中的污垢有非常显著的效果，吸附能力相当强。【怎么彻底去黑头】怎么彻底去黑头3、绿豆粉去黑头 先将脸洗净，然后在绿豆粉里加入适量的水，搅拌成浆状，把它敷在需要去黑头的地方，然后把吸油纸放在上面。等绿豆粉差不多干时，把吸油纸撕下即可，需要注意的是最多每周敷一次，如果天天做的话会损伤到皮肤。【怎么彻底去黑头】 怎么彻底去黑头4、珍珠粉去黑头 在药店选购质量比较好的内服珍珠粉。取适量珍珠粉放入小碟中，加入适量清水，将珍珠粉调成膏状。好的珍珠粉均匀地涂在脸上。以按摩的手法在脸上按摩，直到脸上的珍珠粉变干，再用清水将脸洗净即可。每周可用两次，能很好地

western的操作步骤Word版

Western Blot操作全过程 一，收蛋白 a（如果要收集死细胞） 1.取冰，将4°C离心机提前降温。 2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量 的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。 3.弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。 4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。（1×Cell Lysis Buffer： PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。PMSF 常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。） 5.冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm， 15min。 6.小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。如：100μL。 7.将收集好的蛋白保存与—20°C。（可长期保存） b （如果不收集死细胞） 1．弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。（同上） 2．冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。） 3．将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。

4．小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。 5．将收集好的蛋白保存与—20°C。（可长期保存） 二，测蛋白浓度 BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作） 1.需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋 白。 2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80μl（A： B=50：1）。例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。共有11个孔。则A液取11×80=880μl，B液取880÷50=17.6两液混匀，加入96孔板，每孔80μl。然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。（标准蛋白先配好浓度125，250，500，1000，2000） 3.将孔板放入37°C温箱孵育30min。 4.用酶标仪测蛋白浓度。 5.记下蛋白浓度，根据要上样的μg量算出μl量。例：蛋白浓度为 1000，需上样15μg。则需上样15÷1000=？上样量不超过20μl。 三，配胶 1.将薄板和厚板用洁净的布擦干净，对齐，夹好。（板必须擦干净， 下端对齐，否则容易漏胶。）

[原创]-Western-blot转膜整个过程

转膜（T r a r s m e m b r a n）1转膜的定义 将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。 2转移膜的选择 杂交膜的选择是决定Westernblot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Westernblot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。 最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose,NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 硝酸纤维素（nitrocellulose,NC）膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 膜的选择主要根据： p膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； p不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； p如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。 几种膜的性质对比 PVDF膜NC膜尼龙膜背景低低较高 蛋白结合能力100-200μg/cm280-100μg/cm2>400ug/cm2机械强度强干的膜很脆软而结实 溶剂抗性强差差

怎样去黑头 简单几步让你和黑头说拜拜

怎样去黑头简单几步让你和黑头说拜拜 --> 对于很多爱美的人来说，不能够容忍的事情就是自己身上某处的不清洁，你是否因为脸上经常有黑头而困扰不堪呢?你是否也在苦苦寻求如何去除这些缠人的黑头呢?下面，不妨跟随小编一起看看怎样有效去黑头，去黑头有哪些小窍门以及怎样彻底去除黑头! 目录 1、怎样有效去黑头 2、怎样天然快速去黑头 3、简单去黑头的方法 4、去黑头小窍门 5、怎样去鼻子上的黑头 6、怎样去除脸上的黑头 7、怎样彻底去除黑头8、怎样用偏方去黑头 怎样有效去黑头 脸蛋是一个人的活招牌，如果这块招牌上脏兮兮的，难免会给别人留下不好的印象。那么，在日常生活中，你该如何美容，让自己脸上变得一干二净呢?下面为大家介绍了一些方法，赶快学起来吧! 牛奶食盐去黑头 需要材料：牛奶适量、食盐适量 做法：清洗干净面部肌肤后，往掌心里加入适量的食盐，然后兑入少许的牛奶，稍微搅拌在食盐还未溶解的状态下，将食盐牛奶涂于面部肌肤黑头处，轻轻按摩搓揉1分钟的时间后，最后再用清水

清洗干净面部肌肤就可以了。 蛋清去黑头 需要材料：蛋清一只，薄化妆棉一张 做法：将蛋清放入容器中，充分打匀，浸入化妆棉，让化妆棉充分吸收蛋清溶液，清洗干净面部肌肤后，将沾满蛋清的化妆棉贴于面部黑头处，静待20分钟，这个时候蛋清差不多干了，然后揭下面膜纸，黑头会一起被吸出来。 柠檬汁去黑头 需要材料：柠檬一颗 做法：将柠檬洗净，去皮切成小块放入榨汁机中榨取汁液，然后倒入一盆清水中，用力洗脸，每天可坚持一次，不但能去除黑头，同时还能控油洁肤，细致毛孔，效果十分出色;柠檬洗脸是很简单的方法，因为柠檬酸性较大，所以不建议直接用来涂脸。 生黄瓜蛋清 需要材料：蛋清一颗，黄瓜一小段 做法：将黄瓜洗净，切成片状，然后将黄瓜片沾取蛋清，稍微晾干一些，就可以将黄瓜片贴于脸上有黑头的地方，保持15分钟后，再用清水洗净拍上爽肤水即可，但是记住敷蛋清黄瓜片前，记得要先彻底清洗干净面部肌肤。 红糖蜂蜜 需要材料：红糖一匙，蜂蜜适量 做法：将黑头与蜂蜜一起混合均匀，洁脸部后，涂抹在黑头

Western 转膜步骤 操作方法

Western 转膜步骤操作方法 Western转膜步骤(建议用伯乐电泳系统来操作完成) 下面的步骤适用于通过Xcell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最佳效果，用户的优化是必要的。 I. 所需材料：?Xcell SureLock?或Xcell Ⅱ?Mini-Cell以及Blot Module（Cat. Nos. EI10001, EI9001及EI9051） ?电泳后的迷你胶（mini-gel）（最大的尺寸9cm*9cm） ?预先切割好的印记膜： 硝酸纤维素（Cat. no. LC2000或LC2001）， PVDF（Cat. No. LC2002）或Nylon+（Cat. No. LC2003） ?转印垫（Cat. No. EI9052） ?甲醇 ?去离子水 ?转移缓冲液（配方见下文） ?用于平衡膜，滤纸和转移垫的浅盘 II. 规格： 转印槽尺寸：14.5cm x 14cm x 11cm Blot Module容积：约200ml 下缓冲液槽容积：600ml Blot尺寸：约9cm*9cm 注意：在以下步骤中，应该始终使用手套以避免凝胶和膜的污染，并防止接触电泳和电转过程中常用的刺激物。 Ⅲ材料制备 a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的Towbin缓冲液，其中含有20％的甲醇。使用Xcell Ⅱ转印系统进行成功的转膜，0.5Xtowbin缓冲液就可以提供足够的离子强度，而不产生过多的热量。这种缓冲液可能不适合其它的转印系统，反过来也是这样。一升的转膜缓冲液制备方法如下（含20％甲醇的0.5X Towbin） 使用我们的Tris-Glycine转膜缓冲液：去离子水760 ml 转膜缓冲液（Cat. No. LC3675）40 ml (25×未稀释液) 甲醇200 ml 总体积1000 ml 自己制备Tris-Glycine转膜缓冲液： Tris 碱(12mM) 1.45 g 甘氨酸(96mM) 7.2 g 甲醇（20％终浓度）200 ml

Western blot基本操作步骤

Western blot基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ 水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳 将电泳装置与电源连接。调节电压为100-200V，电泳50min，直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线。

western转膜条件

w e s t e r n转膜条件 蛋白来源：RAW264.7总蛋白 蛋白名称（可保密）：一些转录因子 蛋白分子量：40~70KD WB用膜类型、孔径：0.45NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400mA 转膜时间：60~90min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，?曾经因为失误，转了15min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞总蛋白 蛋白名称（可保密）：occludin&AKT 蛋白分子量：65KD&56KD WB用膜类型、孔径：0.45PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100V 转膜时间：60~70min 设备名字是“Bio-Radmini”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：65KD&55KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理） 转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12V 转膜时间：30-40min 设备：“Bio-Radmini” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。? 蛋白来源：293T细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：95KD&35KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90V-110V，控制电流不要超过300mA。转膜时间：70min? 蛋白来源：肿瘤手术标本 蛋白名称（可保密）：转录因子 蛋白分子量：33KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350mA恒流 转膜时间：150min

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