绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

田　涛,王　琦3

(中国农业大学农学与生物技术学院,北京　100094)

摘　要　荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。近年来,来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。其中绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP,来源于水母)具有独特的应用价值。在活体研究中,GFP相对于其它报告蛋白(如β2半乳糖苷酶)在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾,对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细菌与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论,并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。

关键词　绿色荧光蛋白;标记;微生物;表达

中图分类号　Q93-31 文献标识码　A 文章编号　1005-7021(2005)01-0068-06

The Application of G reen Fluorescent Protein(GFP)as

Molecular Marker in Microbiology

TIAN Tao,WAN G Qi

(Coll.of A gron.&Biotech.Chi na A gric.U niv.Beiji ng100094)

Abstract　The application of fluorescent dyes in microbiology has been paid close extensive attention.Recently,flu2 orescent proteins originated from bioluminescent organisms have enriched research means in microbiology,among them green fluorescent protein(GFP)stemmed from jellyfish possesses unique application values.Study in vivo, GFP has many superiorities over other reported proteins,sayβ2galactosidase,in microbio2physiological and biochemi2 cal studies in situ and real time.In this paper,the applications of GFP as molecular marker in microbiology were re2 viewed,the applications of it on interactions between microbes and hosts,bio2membrane,biodegradation,interac2 tions between bacteria and protozoa,gene transfer,gene expression,protein location,as well as biosensors were also discussed.S ome observation and quantitative analysis methods applied on fluorescence were also briefly introduced. K eyw ords　green fluorescent protein(GFP);marker;microbe;expression

自然界中的许多生物都具有发光的能力,如细菌、真菌、萤火虫、深海鱼类和腔肠动物等。它们的发光能力是由一类称为“荧光蛋白”的蛋白质赋予的。这些蛋白质由不同基因编码,不具有同源性,其发光机制在进化上也不相同。GFP标记系统是首次发现的不需要其他辅助条件的生物发光标记系统。GFP的激发光谱和发射光谱在活体和离体条件下完全相同,而虫荧光酶素的发射光谱在离体和活体条件下并不相同[1]。

天然的GFP是一种多肽,由238个氨基酸组成,分子量27ku。能够将蓝光转化成绿色荧光[2,3]。Inonye和Tsuji证实GFP的活性发色团是一个三肽,其成熟过程需要有氧的参与[4,5]。野生型的GFP无论是在发光生物中,还是在提纯后的溶液中都具有395nm的最大吸收峰和510nm的最大发射峰[6]。Cormack等用定点突变的技术将包围Ser2Tyr2G ly生色团的20个氨基酸进行突变,得到一系列吸收峰红移的突变体。

　收稿日期:2004-03-20

　作者简介:田涛　男,硕士。现从事植病生防与植物微生态学方向研究工作。

3　通讯作者

86微生物学杂志　2005年1月第25卷第1期　JOURNAL OF MICROBIOLO GY Jan.2004Vol.25No.1

这些突变体相对于野生型蛋白具有更高的折叠效率,荧光强度增强30～100倍,使GFP的应用前景更加广阔[5]。

作为报告基因,gf p基因具有很多优良的特性:它表达出来的GFP折叠效率高,可以在多种生物体内表达;无论是直接表达还是以融合蛋白形式表达,GFP对宿主细胞或组织均无毒害作用;GFP的激发不消耗生物能量,不需要任何底物或辅因子;稳定性好,能耐受穿透、毒素、光漂白等不利因素,在甲醛固定、65℃处理0.5h以及p H值6～12范围内均十分稳定;用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计等仪器,可以对标记的目标微生物进行实时、原位的监测,或定量计算其荧光强度[7]。

上述特性使得GFP作为分子标记物在基因工程微生物(G enetically engineered microorgan2 isms,GEMs)中得到广泛的应用。目前GEMs在有害生物综合治理、有毒化学物质及重金属污染修复、污水处理等领域发挥着重要的作用。GEMs处理相对于化学或物理的处理更加经济有效,并且可以降低给环境带来的潜在的危害。虽然如此,基于安全性考虑,GEMs进入自然环境后的命运引起研究人员的关注。过去由于缺乏有效的手段区分GEMs和土著微生物,有关GEMs在自然环境中的存活与扩展并不清楚。近来分子生物学的发展为我们带来全新的技术手段去区分、检测、计量接种到含有大量土著菌的自然环境中的GEMs。例如基因探针、分子杂交、PCR、报告基因等。这些分子生物学的方法有助于我们监测有特定表型或序列的GEMs。其中gf p基因以其特有的性质引起研究人员的更多兴趣。现已建立起来一套成熟的gf p基因标记系统[8]。本文回顾了GFP作为分子标记物应用于微生物学研究的进展。

1　GFP在微生物与宿主相互作用研究中的应用

早期的研究者用荧光抗体检测宿主中的微生物,后来发明了用荧光染料直接包被微生物以研究其在活体细胞中的作用方式。由于这些方法严重影响微生物的生理功能,而且在细菌裂殖的过程中荧光信号会不断的减弱,所以很难实现对微生物的长期跟踪[9]。GFP标记系统和荧光显微镜的出现,使研究者能够对微生物和宿主相互作用进行长期的监测。

Raphael等在1995年构建了两套gf p基因表达系统,分别在鼠伤寒杆菌和海分枝杆菌中高效表达GFP,并结合使用落射式荧光显微镜对病菌侵染其哺乳动物宿主吞噬细胞的过程进行实时追踪。实验表明,GFP的表达没有对细菌的存活造成不利影响,也没有降低其侵染能力及在吞噬细胞中的存活能力[10]。G age等借助穿梭载体p TB93F在苜蓿根瘤菌里组成型表达gf p基因,并观察到根瘤菌侵染根系及根瘤形成的全过程[11]。Epel等将gf p基因与烟草花叶病毒运动蛋白基因在烟草花叶病毒中融合表达,观察到病毒运动蛋白与宿主细胞肌动蛋白的结合,通过植物的亚细胞结构-胞间连丝完成细胞间的侵染循环。表明是病毒与植物组分间的相互作用促进了病毒在植物体内的局部传播[12]。1997年,Tombolin等用自杀质粒将吸收峰红移的突变gf p基因整合到荧光假单胞菌的染色体上。由于使用了强启动子(PpsbA)和荧光增强型gf p基因,其表达宿主的荧光更强也更稳定,他们利用激光共聚焦扫描显微镜在忘忧树根的表皮观察到单个的标记细胞[13]。Qazi等(2000)把从枯草芽孢杆菌中克隆到的核糖体识别位点、木聚糖启动子(PxylA)与gf p基因连接,在革兰氏阳性菌中(李斯特单核增生菌、金黄葡萄杆菌、枯草芽孢杆菌等)成功表达出GFP,并对李斯特单核增生菌侵染哺乳细胞的全过程进行跟踪[14]。近年来,我国科研人员也成功地用gf p基因标记对固氮菌、根瘤菌、枯草芽孢杆菌进行研究[15,16]。本实验室成功地用gf p 基因标记蜡质芽孢杆菌A247等,并对其与宿主间的相互作用进行研究。

由于天然的GFP不易被细胞内的蛋白酶系统降解,所以在使用GFP标记系统研究基因的瞬时表达方面受到限制。K eiler等证明:蛋白质C 末端特定的寡肽延伸使一些稳定的蛋白质容易被细胞内原有的蛋白酶系统降解[17]。Qazi等把不同的寡肽连接到GFP的C末端,构建出一系列半衰期的短GFP突变体。其半衰期从60min到300min不等。为研究微生物与宿主间的蛋白质

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1期 田涛等:绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

相互作用提供了有力的工具[14]。

2　GFP在研究开放环境中微生物的应用

近年来,研究人员已经构建出多种GFP表达系统,用于在开放环境中微生物的研究。1996年,Burlge等用Tn5转座子将gf p基因插入恶臭假单胞菌的染色体,以研究细菌的迁移规律。实验证明,可以成功地利用荧光分光光度计精确地检测细菌的迁移率。Eberl等(1997)用gf p基因标记恶臭假单胞菌以研究其在活性污泥中的存活。在接种后,很快就观察到在活性污泥絮状物间自由游动的接种菌。2min后观察到原生动物捕食标记的细菌。但是3d后,虽然在絮凝物中有大量的微生物,但是在絮凝物之外却几乎观察不到标记的细菌。这表明絮凝物起到保护细菌不被原生动物捕食的作用[18]。Olofsson等结合使用落射荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜,研究gf p基因标记的大肠杆菌和粘质沙雷氏菌在活性污泥中的定殖。研究发现,菌体表面的疏水性物质是决定其在絮凝物上粘附能力的关键因子;三维的图像显示,2种菌在絮凝物上的附着模式完全不同;细菌可以通过孔洞穿过絮凝物。他们的研究揭示了细菌在活性污泥中的附着机制,有助于提高污水处理的效率[19]。1999年Unge 等使用gf p2l ux双标记系统对标记菌的代谢活性和荧光强度同时进行原位检测,展示了双标记系统在环境样本原位检测中的应用前景[20]。

这些研究表明,用分子生物学的方法可以清晰地区分接种菌和环境中的土著菌,与传统的抗生素抗性标记相比,其灵敏度和精确度要高得多。GFP分子标记法已成为研究微生物在环境中存活、繁殖、扩展以及空间定位的重要手段。但是其样品制备和技术操作也比较复杂,这可能成为妨碍快速分析微生物与环境相互作用的限制因子[7]。

3　生物膜

生物膜是一个较新的概念,研究人员发现,当细菌形成生物膜粘附在固体表面时,整个菌群的物理性质有重大改变,比如细菌的附着能力明显增强,这正是我们很难清除牙齿表面牙细菌的原因。但其机理目前还不十分清楚。gf p基因标记系统对于研究生物膜上的多细菌群落间的相互作用是一种理想的工具。M ller等(1998)使用GFP 标记嗜精杆菌时发现,当嗜精杆菌C6预先附着在生物膜的底层时,恶臭杆菌R1趋向与定殖在有多种混合种群细菌的生物膜的最外层[21]。Skillman等(1998)用gf p基因标记成团泛菌, 16h后用碘化丙锭染色(不影响GFP),观察2种菌群在生物膜上的空间定位。发现2种细菌是以微菌落的形式紧密相连。他们认为表面相互联系的大分子物质是这种相互作用的基础,是gf p 基因标记使得他们能够观察到这种细菌间的独特的作用方式,而正是这种作用方式决定了生物膜的特性[22]。

4　生物降解

用微生物降解环境中的有害化合物或减轻重金属对环境的危害,是一种较为经济有效的方法。在很多实验室内的生物降解研究中,把具有代谢上降解或矿化污染物能力的菌添加到受污染的环境样本中,从而分析其在特定环境中对目标污染物的降解、矿化能力。了解生物降解、矿化过程中细菌的数量、存活、代谢活性、空间分布以及降解能力,有助于增进我们对生物降解过程的了解,也是我们更好地利用生物降解过程以减轻有害物质对环境危害的基础。用GFP作为分子标记物可以使研究者很方便地检测接种的细菌,精确地进行细胞计数以及空间定位等。Tresse等(1998)用Tn52gf p自杀质粒将gf p基因整合到莫拉克氏菌染色体上,以研究该菌对土壤中对硝基酚(PNP)的降解。在研究过程中发现,菌体接种到土壤2周后仍可以检测到接种体,而用平板计数法只有0.1%的样品可以检测到。放射性标记的PNP有58%被矿化。实验表明:并不是每一个菌体都是可培养的;可能有具有PNP降解能力的土著微生物存在[23]。Errampulli等(1998)经过为期12个月的GFP标记菌株存活实验证明,带有gf p基因的菌株具有同亲本一样的化合物降解、重金属矿化及存活能力;用GFP作为分子标记物是进行长期细菌存活实验的有力工具[24]。

5　细菌和原生动物的相互作用

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原生动物对细菌的捕食是影响细菌在环境中存活的重要因素。Eberl等(1997)以及Olofsson 等(1998)在研究用GFP标记的恶臭假单胞菌和莫拉克氏菌在活性污泥中的存活实验中,观察到有纤毛的原生动物对标记菌的捕食作用,并进一步揭示了活性污泥中的絮状物对细菌的保护作用[18,19]。Jacqueline等利用荧光分光光度计结合表面荧光显微镜,分析原生动物吞食GFP标记的大肠杆菌的速率。他们在对比用荧光分光光度计读数和荧光显微镜以及常规染色法得出的数据后认为,用荧光分光光度计能够有效减少人为的错误,能够更准确地反映出原生动物于被捕食细菌间的相互消长的关系[25]。

6　在基因转导方面的应用

GFP标记系统对研究环境中微生物间基因转移也是有用的工具。Normander等(1998)用恶臭假单胞菌作为基因供体,用落射式荧光显微镜在大豆叶面原位观察到接合子,首次观察到在特定的生境中(大豆叶面)供体和受体间的高频率的基因转移。叶面上细菌间的基因转移频率,比在聚碳酸脂滤膜大约高30倍。表明叶面微生境可能对聚集于其上的微生物间的质粒转移有刺激作用[26]。

7　基因表达与蛋白质定位

研究细菌在酸性环境中的基因表达一直是个难题,因为在低p H值时菌的生长受到抑制。Valdivia等把gf p基因随机连接到鼠伤寒沙门氏菌(S al monella typhi m uri um)DNA文库中基因片断的后面。再把包含融合基因的载体转入S. typhi m uri um。把GFP标记的S.typhi m uri um 放入酸性环境,从而捕捉到S.typhi m uri um对酸性环境反应的基因,并证实这些酸诱导基因的启动子和细菌抗药性基因具有高度的同源性[27]。

在特定的环境条件下,枯草芽孢杆菌(B acil2

l us subtilis)进行不对称的细胞分裂,形成一个前芽孢和一个母细胞。这个分裂过程是由级联的σ因子控制2种细胞的转录造成的。Webb等利用GFP标记技术观察到在前芽孢和母细胞中特定的基因表达。gf p基因和ssp E22G基因以及csf B 融合使前芽孢具有荧光现象,而gf p基因和cot E 基因融合转录使母细胞具有荧光现象。从而证明了两种细胞分化时基因表达的差异[28]。

细胞分裂时,在染色体着丝点处形成复杂的蛋白网。Ma等把GFP和FtsA及FtsZ融合。观察到在快速分裂的细胞中分裂环的形成,并且FtsA2GFP和FtsZ2GFP两种融合蛋白都定位在细胞的分裂点上,从而有力地支持了在分裂细胞的中央赤道板形成多蛋白分隔复合物的观点[29]。

8　在生物传感器中的应用

将报告基因融合在特定分解代谢启动子的后面,就可以构建出针对特定污染物的生物传感器。Burlag等(1990)及Selifonova等(1993)分别构建出以荧光素酶为指示的检测环境中萘和汞的生物传感器[30,31]。Hansen(2000)及Roberto等分别构建出以GFP为报道基因的生物传感器,对环境中的水银、砷等进行监测[32,33]。Errampalli认为,由于GFP相对于其它生物发光蛋白的优势,以GFP为基础的生物传感器将有很好的开发前景[7]。

9　GFP的检测方法

当前,常用的检测GFP标记的微生物方法有以下几种:①用蓝光或长波紫外灯照射菌落或菌液,可用肉眼直接观察GFP标记菌发出的绿色荧光,并且可以进行快速的平板计数。②落射荧光显微镜与适合的滤光片配合,可以观察到单个的标记菌体并对其计数,还可配合数码相机保留图片。Omega公司开发的Openlab图像处理软件可以方便地进行图像处理[14]。③共聚焦激光扫描显微镜(CL SM)以氩原子发出的488nm激光为激发光,具有高分辨率及三维成像功能。CL SM 在分析gf p基因标记菌在环境样本及生物膜中的空间定位应用方面有极高的应用价值。④使用流式细胞仪可以快速计量GFP标记菌的数量和荧光强度[13,18]。⑤双光子激光扫描显微镜不但具有共聚焦激光扫描显微镜的优点,并且克服了普通荧光显微镜和CL SM的光漂泊现象,使更长时间对目标进行跟踪成为可能[34]。另外,根据gf p基因的特定序列还可以使用基因探针、分子杂交、PCR等分子生物学方法进行检测。

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1期 田涛等:绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

10　结　语

1994年Chalfie 等首次在果蝇、大肠杆菌等

生物体内成功表达gf p 基因,作为分子标记物,GFP 标记系统只有不到10a 的历史,但是如今越来越多的研究人员将其作为又一快速高效的研究工具。在实时、原位研究微生物的空间定位、基因

表达、微生物与环境相互作用等方面开创了一条全新的道路,展示了良好的应用前景。但是,基于细菌间高频的基因转移而带来的安全性的问题,研究者应该谨慎地在开放的环境中使用以质粒为

载体的转基因工程菌(GEMs ),从而减少由此可能带来的对人类及环境潜在的风险

。

图1　用GFP 标记细菌的基本技术路线

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1期 田涛等:绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

荧光蛋白(整理)

荧光 一、定义 荧光（fluorescence ）又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 二、原理 光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。 荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时，既是共 荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。 三、荧光蛋白 1、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP ）

在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP 衍生的Emerald（祖母绿），它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L 和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。 下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白： （1）来源绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质 Aequorin 的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb 。 （2）性质 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67 位残基（Ser65-Tyr66-Gly67 ）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象（Photobleaching ），用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。 （3）野生型 野生型GFP（wild type GFP, wtGFP ）从一开始就引起了人们极大的兴趣，而且被用作新型的简单报告基因及体内标记，但GFP在异源生物体中的表达并非那么简单。例如，研究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP，并且wtGFP在37℃的热稳定性差。这些都阻碍了它在转基因中的应用。这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP的变体。现在，人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。 这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白，它们可防止高温导致的错误折叠。近年来出现的新型wtGFP基因突变体的激发和发射谱发生了改变，热稳定性和荧光强度得到了提高，GFP报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。 （4）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）现在，应用最为广泛的是红移变体增强型GFP （EGFP）。诸如EGFP这些红移变体的最大激发峰发生红向移动，大约为490nm，这一波长也恰好是多数分光设备、流式细胞仪及共聚焦显微镜的常用波长。EGFP有两个氨基酸突变，当被蓝光激发时，它发出的荧光要比wtGFP亮30-40 倍。wtGFP和包括EGFP在内的多数变体半衰期长，所以不适合精确追踪表达的减少或损耗。 （5）不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP） 为克服这一问题，人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）。原理就是将EGFP的cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase, ODC）基因的C-末端。ODC含有一个PEST序列，这个序列可促进该蛋白在细胞内的降解。虽然，目前这些不稳定变体还没有在小鼠中应用，但这些变体有利于实时追踪基因表达动力学的研究。 （6）增强型黄色荧光蛋白（EYFP）另一种红移变体是增强型黄色荧光蛋白（EYFP），该变体有四个氨基酸突变。在527nm时，EYFP的发射光从绿色变为黄绿色。EYFP荧光的亮度水平与EGFP相当。EYFP 抗酸性差、对卤化物敏感，使它的应用受到限制。在EYFP 基础上改进的突变体mCitrine[21] 和mVenus[22]是目前应用

荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用

荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用 Feb 20, 2010No Comments 随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。 我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapid photoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。 ?0?2 荧光标志物 小分子有机染料 小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不断增加之中。不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用（图1A~C）。?0?2 荧光蛋白 第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻

绿色荧光蛋白的应用及发展前景汇总

学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景 姓名周紫嫣学 号014010110349 专业生物工程 指导教师周小萍职 称教师 中国·武汉二○一二年四月

目录 摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II 1 GPF的发现 (1) 2 GFP的结构及发光原理 (1) 2.1 GFP的结构 (1) 2.2 GFP的发光原理 (2) 3 GFP在生物技术中的应用 (2) 3.1 GFP作为报告基因 (2) 3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3) 3.3 GFP用于药物筛选 (3) 3.4 GFP作为生物传感器 (3) 3.5 GFP用于融合抗体 (4) 3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4) 3.7 GFP用于基因表达调控 (4) 4 GFP存在问题及发展前景 (4) 参考文献 (5) 致谢 (5)

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白GFP的研究与应用 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一种极具潜力的标记物，有着广泛的应用前景。通过阅读吴沛桥的《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》这篇文献，对GFP有了进一步了解。 关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；性质；原理；应用 1 引言 发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962 年,Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequoria victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白, 并观察到一个在紫外光下发出“非常明亮, 浅绿色荧光”的副产物。1974 年,Shimomura等纯化得到了这种自发荧光的蛋白（即GFP）。 2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·查尔非(Mratin Chalfie)以及美国华裔科学家钱永健(Rorge Y.Tsien)，他们三人因为在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面做出了突出成就。 2 GFP的理化性质 从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。 GFP性质极其稳定，耐高温，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它们在pH7.0~pH12.2的范围内的吸收、发射光谱也是相同的。 3 GFP的荧光原理

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白(GFP)原核表达情况分析 姓名：韩吉梅学号：2013107001 专业：作物栽培学与耕作学 摘要：将含有绿色荧光基因的重组载体导入大肠杆菌中,经IPTG诱导产生大量融合蛋白,用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量。考马斯亮蓝染色4小时再过夜脱色，观察目的蛋白的分子量大约为31.9kD,与预期值相符。 关键字：绿色荧光蛋白SDS-PAGE 原核表达 1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。由于GFP检测具有高灵敏度,操作简单,无需使用同位素等优点,近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域[1-2]。采用GFP作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有

效的手段[3-4]。同时也正因为其荧光反应不是酶反应,所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质,或者GFP表达频率不高的情况下,GFP的检测可能会产生一些假相,不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP,制备出GFP抗体,利用抗原与抗体之间的特异性,在体外对GFP进行检测,可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题,可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度[5]。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。 2 材料与方法 2.1 材料 30%分离胶贮液分离胶缓冲液（Tris-HC l缓冲液pH8.9）浓缩胶贮液浓缩胶缓冲液10%SDS 20%过硫酸铵（AP）染色液脱色液1×SDS上样缓冲液1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液四甲基乙二

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白（GFP）的转化表达及免疫印迹检测 王媛0811142 南开大学生命科学学院生物技术08级 一、摘要： 本实验利用酶切方法检测载体中所含GFP片段后，通过转化的方法把绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌进行表达，通过免疫印记杂交方法（western blotting）分析GFP在大肠杆菌中的表达，在分离检测的全过程中（转化平板，细胞裂解，电泳，电转移），均可通过紫外灯清晰地检测到颜色亮丽的绿色荧光蛋白。 关键词：绿色荧光蛋白免疫印记杂交 二、引言： 绿色荧光蛋白是一种源于水母(Aequorea Victoria)等海洋无脊椎动物的蛋白，分子量为26.9KD。GFP的开放阅读框架长度约为740bp，编码238个氨基酸残基。GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发色基团，无需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下就能发荧光，荧光性质稳定，可保持10分钟。GFP能在不同的细胞内稳定表达，无种属、组织和位置特异性，对细胞无毒性且检测方法简单，将其作为报告基因已广泛应用于细胞生物学和分子生物学领域。 免疫印记又称蛋白质印记，是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫检测技术。其原理是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极，从而将电泳分离的蛋白从凝胶转移至固相载体上。 三、实验材料、仪器及方法： 3.1 实验材料 3.1.1 菌种 E.coli DH5α(pETH)菌株 E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 E.coli BL21菌株 E.coli BL21 (pETH)菌株E.coli BL21 (pETH-GFP）)菌株 3.1.2 试剂与材料 LB培养基（自己配置灭菌）Amp（100mg/ml）IPTG(10mg/ml) CaCl2(1M) 50*TAE Acry/Bis 贮存液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液泳动缓冲液（5*）上扬缓冲液（5*）转移缓冲液PBS 1.5% A.P.S 质粒小量提取试剂盒Eco RI限制性内切酶DNA Maker Protein Maker pH试纸 3.1.3 仪器 紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直板式电泳系统、半干式蛋白质印迹电转移系统等。3.2 实验方法 1、配置LB培养基，包括液体、固体培养基后灭菌；分别接种pETH-GFP/DH 5α（LA 4ml）一支，pETH/DH 5α(LA 4ml)一支，BL21（LB 4ml）四支 2、按照protocal,利用tiangen质粒提取试剂盒分别提取pETH-GFP/DH 5α、pETH/DH 5α质粒后，按照酶切体系混匀后，至于37℃温箱酶切2h。 3、制备0.8%琼脂糖凝胶，20ml每块，加入适量EB，按照点样顺序点样后，60V恒压电泳，约0.5~1h.后，凝胶自显影拍照（胶图见后面实验结果） 4、取40μlBL21菌液接种于4mlLB，37℃，200rpm，约2.5h,此时OD600=0.3~0.5，利用氯化钙法制备感受态细胞，制备完成至于冰上备用。 5、铺制平板，1块LB，4块LA，冷却凝固后于37℃倒置烘干备用。其中两块LA平板上面涂布IPTG（100μl+100μl水），正置备用。 6、按照阴性对照、空白对照、GFP基因转化表达、GFP基因的转化四组分别进行转化，涂板，37℃倒置过夜培养，紫外灯下观察，呈绿色荧光的单菌落即为转化子。记录各板菌落数

绿色萤光蛋白

绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca+2)可产生交互作用。 由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。 在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。 我们这边细胞组的基本上都在用这个东东。标记细胞 GFP的分子结构和发光机制 绿色荧光蛋白为一个由238个氨基酸残基组成的单链，GFP有两个吸收峰，主峰在395nm，次峰在470nm，其荧光发射峰在509nm。GFP 的化学性质相当稳定，其变性需要在90℃或pH<4或pH>12的条件下用6mollL盐酸胍处理，这一性质与GFP的结构特性相关。 Yang等的研究表明，GFP是由两个相当规则的内含一个α-螺旋和外面包围l1个β-折叠的β-桶状结构组成的二聚体，β-桶状结构直径约3nm，高约4nm。β折叠彼此紧密结合，象桶板一样形成桶状结构的外围，并且形成了一个规则的氢键带。桶状结构和位于其末端的短α螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域，没有可供扩散的配体进入缝隙。这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点。 GFP的生色基团附着于α-螺旋上，几乎完美的包被于桶状结构中心。位于圆桶中央的α-螺旋含有一个由六肽组成的发光中心，而发光团是由其中的三肽Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成了对羟基苯咪唑啉酮。GFP的生色基团是蛋白质自身催化环化的结果，环化是一个有氧过程，在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光，因为GFP的生色团形成需要O2使Tyr66脱氢氧化。生色基团通过Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射，此模型为Yang等的晶体学证据所支持。 GFP在生物技术中的应用研究 1．分子标记 作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。 除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点。 2．药物筛选 许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。 在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域，而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。因而，这些受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。利用这一原理，已经成功构建了一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体(hGR)的迁移过程。在一96孔板中培养细胞，并以一编码hGR GFP蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段

绿色荧光蛋白的研究现状与应用

绿色荧光蛋白的研究现状与应用 【摘要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。 【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因 2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。 1 绿色荧光蛋白的理论研究 1.1绿色荧光蛋白的发现 绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。 1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理 1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。溶液中，395nm激发的荧光发射峰在508nm，375nm激发的荧光发射峰在503nm。 1.3绿色荧光蛋白的优点 绿色荧光蛋白的独特之处即它的优点很多，主要有：荧光反应不需要底物和任何其他辅助因子，只需要在蓝光和紫外光下照射，利用荧光显微镜甚至是直接用肉眼就可以观察，易于检测且灵敏度高；荧光性质稳定，对光漂白有较强的耐受性；无毒害，转化后细胞仍可连续传代；通用性好，无种属特异性；分子量小，易于构建载体；不受假阳性干扰，结果真实可靠；可进行活细胞定时定位观察；易于得到突变体。 2 绿色荧光蛋白的应用 1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP 应用研究的先河。也正是由于绿色荧光蛋白的许多优点，使得其应用十分广泛。 2.1作为报告基因 GFP通常用作报告基因，可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。GFP最显著的优势是荧光反应不需要底物和其他辅助因子。有利必有弊，

荧光技术

https://www.sodocs.net/doc/084440191.html,/?p=21977 首页专题译述会议展览技术方法教学视频热点话题生命百态研究前沿科研综述电子杂志RSS 订阅当前位置: 生命奥秘> 技术方法> 文章正文荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用 cyq 发表于2010-02-20 14:48 | 来源：| 阅读 随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。 我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapid photoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。 荧光标志物 小分子有机染料 小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不

试验设计——绿色荧光蛋白的表达

分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 ——闵霞（2013141241165）李彩云（2013141241095） 一、引言 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。 基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA 分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 本次实验中，分子克隆质粒载体所携带的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将EGFP基因插入表达载体pET-28a中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过Bam HI和NotⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段EGFP和表达载体pET-28a质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断EGFP基因工程菌的构建效果 二、主要路线： 1、质粒DNA的提取 2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 3、酶切连接重组质粒 4、重组质粒的扩增 5、菌落PCR法鉴定阳性克隆 6、目的荧光蛋白基因的表达 1、质粒DNA的提取 实验原理： 1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞

对绿色荧光蛋白(GFP)的了解及应用

对绿色荧光蛋白的了解及应用 学院：生命科学学院 姓名：马宗英 年级：2011 学号：2011012923

前言 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白质”。这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨基酸，二级结构也是普通的α螺旋和β片层。但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质——发出绿色荧光。 【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用 一、绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现的。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。 野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来[1]，它至少存在4种同源GFP，但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。 生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内,65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成了GFP生色团的核心[2],见图1。图2为生色团的形成机制。 图1 多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列 图2生色团的形成机制 目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚，大家只是认为，GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机

制也有很大差异。 二、GFP在生命科学中的应用 1、作为蛋白质标签（protein tagging） 利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。由于GFP只有238个氨基酸，相对较小，所以将其与其它蛋白质融合后并不影响自身的发光功能。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更为详尽的观察的新方法。如细胞分裂、染色体复制和分裂、发育和信号转导等过程的研究均是借助绿色荧光蛋白进行标记。 GFP作为蛋白质标签除用于特定蛋白质的标记定位外，还大量用于各种细胞成分的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。曾经有人将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境监测以及探测信号转导过程等等，以上都可以为传统生物学研究提供新思路和新方法。 2、药物筛选 利用细胞表面标记,通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪,可以分离与纯化特殊类型的细胞;同时还可利用不同颜色GFP衍生物标记相关蛋白质,来观察在单细胞内相互作用的靶细胞,再借助于荧光激活细胞分离器、等聚焦显微镜分离出目的细胞,从而可方便地用于大规模筛选新的药物。 另一方面，利用GFP来进行药物筛选由于必须与迁移的信号分子相偶联的限制，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。 3、用于免疫学 可采用基因工程的方法生产GFP标记抗体，以取代传统的免疫学标记方法，建立一种简便、快速的免疫诊断新技术。相比于一般的标记物，GFP对光稳定、对抗体的标记率可达100%，而且因为GFP是直接与抗体结合，所以无需添加任何底物，可以避免非抗原抗体结合的背景干扰等。 线粒体中表达的GFP是研究比较成功的一种小分子抗体，因为它可以在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构架抗体融合蛋白。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。 在制备抗体时，为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His 序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题，由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体，若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。 除了以上应用之外，绿色荧光蛋白还普遍应用于跟踪观察微生物、发育机理研究、细胞筛选以及生物传感器等许多生命科学研究中。 三、GFP的突变及其应用 GFP作为一种新型标记物，正受到科学界的广泛关注，而且野生型的GFP也不断地在被改造，著名的生物学家钱永健所完成的单点突变(S65T) 显著提高了GFP的光谱性质,其荧

绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析

石河子大学 分子生物学实验结课论文 绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析 学生姓名 学号 专业 年级、班级 指导教师 所在学院 中国·新疆·石河子 2016年1月 绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析

摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。 关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达 1 前言 1.1实验目的 掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。 1.2实验背景 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。同时也正因为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种

绿色荧光蛋白及其应用

DOI：CNKI:50-1068/S.20120208.1744.051 网络出版时间：2012-02-08 17:44 网络出版地址：https://www.sodocs.net/doc/084440191.html,/kcms/detail/50.1068.S.20120208.1744.051.html 绿色荧光蛋白及其应用 四川攀枝花学院生物与化学工程学院韩洪波 摘要：作为一种报告基因，由于其自身独特的发光机制，GFP在分子生物学的研 究中得到越来越广泛深入的应用，如用于特定蛋白的标记定位，活体内的肿瘤检 测、药物筛选等等。GFP的运用，为传统生物学研究提供了新思路和新方法。 关键词：绿色荧光蛋白；性质；应用 1962年，Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequorea victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白（aequorin），并观察到一个在紫外光下发出非常 明亮，浅绿色荧光的副产物。[1]1974年，Shimomura等纯化得到了这种自发荧光 的蛋白。1985年Prasher 等构建维多利亚多管水母的cDNA文库，用于克隆水 母蛋白的编码基因，并得到含有GFP片段的蛋白。[2]1992年Prasher 等克隆到 编码全长GFP 的cDNA但直到此时人们对GFP的应用前景还不甚了解。1994 年，Chalfie 等首次在原核的大肠杆菌和真核的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中表达了具有荧光性GFP，证明GFP 的荧光产生不需要水母中特异组 分的参与，钱永健及其同事提出GFP中Ser65-Tyr66-Gly67 氨基酸残基形成4- 对羟基苯甲基-5-咪唑啉酮生色团发光的机制，并表明生色团的形成不需要任何 酶或辅助因子的参与，而只需分子氧的存在此后对GFP的研究进入了高潮，并 在1996 年解析了其晶体结构基于已有知识和晶体结构，人们通过突变的方法得 到许多不同荧光性质的GFP同时，受GFP启发，人们开始在其它生物中寻找类 似的荧光蛋白，并相继在珊瑚、海葵、水螅甲壳类动物甚至低等脊索动物中发现 了GFP样蛋白荧光谱覆盖蓝色到远红光，使得荧光蛋白的使用范围不断扩大， 极大地促进了生命科学和医药科学的发展。2008年，诺贝尔化学奖授予Osamu Shimomura，MartinChalfie 和Roger Tsien以表彰他们因发现和发展了绿色荧光 蛋白所做的巨大贡献。[3] 一、GFP的分子结构和发光机制

蛋白标记技术详解

蛋白标记技术详解 蛋白质标记的主要目的是监测生物过程、辅助检测（例如化合物的可靠定量、蛋白质修饰的特异性检测）或者纯化蛋白及其结合对象。蛋白质的标记能够提高检测灵敏度以及简化检测工作流程。 目前有多种蛋白质标记技术来帮助我们研究感兴趣的蛋白质的丰度、位置、相互作用、翻译后修饰、功能，乃至监测活细胞中的蛋白质运输等问题。目前有多种类型的标记物和标记方式可供选择，但是针对特定的应用应当选择适合的标记策略。 1.代谢标记策略 代谢标记策略是一种体内标记方法，在这种方法中，细胞被“喂养”了化学标记的营养物，然后这些标记物被掺入新合成的蛋白质、核酸或代谢物中。然后，我们可以收集细胞并分离这些分子以获得细胞生物过程的全局视图。 蛋白同位素标记 原理 蛋白同位素标记是一种经典的蛋白示踪和蛋白组学定量技术，用天然同位素（轻型）或稳定同位素（重型）标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，这样细胞新合成的蛋白质可以在细胞生长期间通过掺入含有不同同位素的氨基酸进行标记。 应用举例 蛋白质组学研究方向流行的代谢标记方法是SILAC（Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture），即细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记。结合质谱技术，SILAC 通过使用重型氨基酸（例如，15N-或13C-赖氨酸）标记其中一组培养物或细胞系，而向另一组添加正常的轻型氨基酸，从而量化两种培养物或细胞系之间蛋白质丰度的差异。然后将在这两种条件下生长的细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的