碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探

碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探

一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义:

1.国内外研究现状

碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中，1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。

研究结果发现，海洋酶具有作用pH 范围宽，最适pH 和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。海洋酶所具有的独特性质，引起学术界高度重视，日、美等国就此展开了深入的研究。迄今为止，由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。

相比之下，国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。综合多篇文献分析，目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶，分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。首先是从发酵液取上清制备粗酶液（此酶为一种外分泌蛋白，无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液），通过超速离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。

2.选题依据及意义

此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》，主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进，并对其性质进行初步探究。大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件，并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯，同时得出最佳分离提纯方案。最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株，研发新型高效的碱性蛋白酶，这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。这种积极采用微生物代替化学法的探究，有利于开发现代生物新产品的工业化生产技术研究，有利于加快现代生物领域产业的发展。

二、研究的基本内容，拟解决的主要问题

1.海水中碱性蛋白酶高产菌株的筛选；

2.发酵液中碱性蛋白酶的分离提纯（主要目标）；

3.目标碱性蛋白酶的性质初探（初步预计目标碱性蛋白酶的科研价值）；

4. 结果分析（得出结论，为下一步科研工作打下基础）。

三、研究步骤、方法及措施

1. 实验材料

1.1菌种: 燕山大学生物实验室筛选产碱性蛋白酶海洋菌株。

1.2分离纯化材料

考马斯亮蓝，南京建成生物工程公司；

葡聚糖凝胶层析柱，SDS分析纯，中药集团上海化学试剂公司；等等。

2. 实验方法

2.1生物量测定

用722 型分光光度计测定发酵液的OD值作为生物量指标。

2.2蛋白酶活力测定

先将1 % 酪蛋白放入40 ℃恒温水浴中，预热 5 min；取适当稀释的酶液 1.0 mL，加预热后的酪蛋白1.0 mL 摇匀，并在40 ℃下保温10 分钟：加0.4 mol / L 三氯乙酸2.0 mL 摇匀，取出静止10 min，过滤；取l.0 mL 滤液，于40 ℃下加0.4 mol / L 碳酸钠溶液 5.0 mL，接着加福林试剂使用液 1.0 mL 并保温20 min。在680 nm 波长下比色，测其吸光度[8,9]。

酶活计算方法：X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n

式中：X，样品的酶活力（μ/g或μ/mL）；

A，样品平行实验的平均吸光度；

n，稀释倍数。

K，吸光常数，K=95.3

（说明：测定空白时，加酪蛋白与三氯乙酸的顺序相反）

2.3分离提纯工艺流程

2.3.1粗酶液制备

发酵液经10000r/ min低温离心10min, 取其上清液作为粗酶液

2.3.2 酶的盐析

取9 个容量瓶分别加入发酵上清液20 mL，搅拌下加入硫酸铵，使其饱和度分别为0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，在20 ℃水浴中保温2 小时，滤纸过滤后，分别测定滤液的碱性蛋白酶活力。根据测定结果，以硫酸铵饱和度为横坐标，酶活为纵坐标，绘出该酶的盐析曲线。确

定除杂蛋白和沉淀碱性蛋白酶的A饱和度和B饱和度硫酸铵[10,11]。

2.3.3酶的丙酮沉淀

酶液中加入不同体积的丙酮（20 ℃），放置 2 ~ 3 h，离心收集酶沉淀。同时测定不同丙酮加入量下的上清与沉淀中碱性蛋白酶的活力，得到使沉淀蛋白的酶活力最大的丙酮加入量，并记录数据，同盐析沉淀对比。

2.3.4 酶的分子量测定

取部分沉淀，进行电泳，初步测定分子量，根据数据选择合适孔径。

2.3.5 酶的分离层析

发酵上清液中加入最适体积的丙酮或硫酸盐（20 ℃），放置 2 ~ 3 h，1000 rpm离心5 min 得到沉淀，冷冻干燥。冻干的酶粉溶解于50 mM pH 10.0 的甘氨酸-NaOH 缓冲液中，不能溶解的部分可以离心除去。此溶液在相同缓冲液中透析。

1 mL 透析的酶液上葡聚糖凝胶过滤柱（合适孔径），用50 mM pH 10.0 的甘氨酸-NaOH 缓冲液进行洗脱，流速调节为15 mL / h。收集活性峰，于- 20 ℃下进行储存[12]，进行酶学性质的实验和下一步的纯化。

2.3.6碱性蛋白酶的活力测定

方法同2.2。

2.3.7蛋白质含量的检测

采用Lowry 法进行测定。酶的分离纯化过程中，采用280 nm 紫外检测。

2.3.8 SDS-PAGE 电泳

利用SDS-PAGE 凝胶电泳测定碱性蛋白酶的纯度及分子量。酶液与样品缓冲液在100 ℃下加热 5 min 变性。电泳在40 mA 下进行，蛋白带用考马斯亮兰R-250 进行现色[13]。

2.4 酶学性质的研究

2.4.1 pH对酶的影响

pH的影响分别从对酶的稳定性与活性这两个方面研究。

酪蛋白底物溶解于不同的缓冲液体系中：Tris-HCl pH（7.0 ~ 8.0），50 mM 甘氨酸-NaOH 溶液（pH 9.0 ~ 13.0）。检测酶反应的最适pH 值，以最适反应pH 下测定的最大酶活为100 % 酶活力。

将纯化的储存酶溶解于上述缓冲液中，30 ℃下保存l h，检测残余活性。

2.4.2 温度对酶活性的影响

温度的影响也分别从对酶的稳定性与活性这两个方面研究。

将纯化的储存酶溶解于50 mM pH 10.0 甘氨酸-NaOH 缓冲液，置于封闭的Eppendorf 管中，在不同温度水浴中保温不同时间，测定残余酶活力。于10 ~ 80 ℃范围内检测碱性蛋白酶的活性，确定酶反应的最适温度。

2.4.3 酶动力学曲线及米氏常数的测定

配制不同浓度的酪蛋白底物（最适pH），测定最适温度下不同底物浓度下酶反应的初速度。用双倒数作图法（Lineweaver –Burk），以初速度的倒数对底物的倒数作图，求得最大酶反应速度Vmax 和米氏常数Km 值[14,15]。

2.4.4 金属离子对酶活的影响

将纯化的储存酶溶解于50 mM最适pH的甘氨酸-NaOH 缓冲液中，与不同离子在最适温度下共同保存l h，后测定残余活性。

2.4.5 有机溶剂对酶活的影响

材料为实验室所有有机溶剂如苯、甲苯、二甲苯、甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇、环己烷、正庚烷、无水乙醚、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃等。经过有机溶剂处理过的酶，在37℃下进行酶促反应10min，测定转化后的A280（与酪蛋白浓度成正比）。

2.4.6 碱性蛋白酶的稳定性

将无细胞发酵液与精制酶（适量丙酮对无细胞发酵原液进行沉淀，沉淀的酶蛋白溶于50 mM 最适pH的甘氨酸-NaOH 缓冲液中）分别于室温与 4 ℃下贮藏，每15 天分别测定发酵液与精制酶的活力，考查其稳定性。

四、研究工作进度

1-3周查阅相关文献资料，设计试验方案，写开题报告，任务书和文献综述；

4-8周配制试剂、菌种筛选，进行试验；

9-14周碱性蛋白酶的分离纯化，性质实验测定，数据处理等；

15-16周结果分析；撰写毕业论文；

17周论文评阅、答辩。

五、主要参考文献

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[2] 李丹, 陈丽, 李富超等. 一株产低温碱性蛋白酶海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407的筛选与生长特性. 食品与生物技术学报, 2007, 26(6): 74-80. [3] 孙谧, 王跃军, 张云波等. 一株产低温碱性蛋白酶嗜冷海洋细菌YS-9412-130的分离

和培养条件研究. 海洋水产研究,2000,21(4): 1-5.

[4] 吕明生, 陈静, 王淑军等. 海洋细菌产低温碱性蛋白酶菌株的筛选研究. 江苏食品与发酵, 2004, (1): 7-10.

[5] 韩斌, 张林丰. 现代生物化工中酶工程技术研究与应用. 北京农业, 2008, (33): 37-39.

[6] HAO Jian—Hua, W ANG Yue—Jun, LIU Jun ,et al. Cloning and Characterization of Marine Bacterium QD80 Cold Alkaline Protease. Chinese Journal of Bioehemistry and Molecular Biology, 2005, 21(4): 465-470.

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学报(理学版), 2002, 7(3): 264-267.

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林大学学报(自然科学版), 2007, 36(6): 591-594.

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2010, 39 (13): 7574-7575.

六、导师意见

指导教师（签字）

年月日七、审核意见：

审查结果： 1、通过； 2、完善后通过；3、未通过

负责人（签字）：

年月日

药物分离与纯化技术提纲(自制).

第一章绪论 1.药物分离与纯化过程分为机械分离与传质分离，机械分离针对非均相混合物，传质分离（物质传递）针对均相混合物，分为平衡分离过程与速度控制分离。 2.分离剂可以是能量或物质（质量）。 第二章药物分离纯化前的预处理技术 1.预处理的目的：将目的产物转移到易于分离的相态中（液相），同时除去大部分杂质，改变流体特性，利于后续分离。 2.药物成分的形成阶段只能获得含有目的药物成分的混合物，难以进行药物分离。 3.预处理主要完成任务： （1）去除大部分可溶性杂质（阳离子、生物大分子） （2）采用凝聚或絮凝技术，将胶体状态的杂质转化为易于分离的较大颗粒。（3）改善料液的流动性，便于固液分离 （4）固液分离 （5）将胞内产物从细胞内释放出来 4.沉淀技术： （1）高价离子：Ca2+、Mg2+、Fe3+ a影响离子交换 b对药物降解加速催化作用 （2）生物大分子（可溶性黏胶状物）：蛋白、核酸、多糖 a粘度增大，影响固-液分离。 b乳化作用，吸附离子基团。 5.沉淀法去除杂质常用的方法：等电点沉淀法，变性沉淀法，盐析法，有机溶剂沉淀法，反应沉淀法。 6.等电点沉淀法原理：蛋白质是两性电解质，当溶液PH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。

7.变性沉淀法原理：利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。 8.盐析法概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 9.盐析法影响因素： （1）盐析剂的性质和加入量 （2）溶液的pH值 （3）蛋白类化合物的性质 （4）蛋白浓度 （5）温度 10.常用的凝聚剂：AlCl3·6H2O、Al2(SO43·18H2O(明矾）、 K2SO4·Al2(SO43·24H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、ZnSO4和MgCO3等。 11.凝聚作用与絮凝作用的区别：凝聚作用是指某些电解质（凝聚剂）作用下，破坏胶体系统分散状态，而使胶体粒子聚集过程，而絮凝作用是通过架桥作用将许多微粒聚集在一起，形成粗大的松散絮团的过程。 12.助滤剂：具有一定刚性的颗粒或纤维状的固体。 13.常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性碳等。 14.细胞破碎方法 （1）机械法：高压均浆法（可大规模操作），珠磨法（可较大规模操作）、超声破碎法、X－press法 （2）非机械法：酶解法、化学渗透法、渗透压法、冻结融化法、干燥法。 15.高压匀浆法原理：细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。 第三章萃取技术

碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探

碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探 一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义: 1.国内外研究现状 碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中，1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。 研究结果发现，海洋酶具有作用pH 范围宽，最适pH 和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。海洋酶所具有的独特性质，引起学术界高度重视，日、美等国就此展开了深入的研究。迄今为止，由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。 相比之下，国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。综合多篇文献分析，目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶，分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。首先是从发酵液取上清制备粗酶液（此酶为一种外分泌蛋白，无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液），通过超速离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。 2.选题依据及意义 此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》，主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进，并对其性质进行初步探究。大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件，并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯，同时得出最佳分离提纯方案。最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株，研发新型高效的碱性蛋白酶，这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。这种积极采用微生物代替化学法的探究，有利于开发现代生物新产品的工业化生产技术研究，有利于加快现代生物领域产业的发展。 二、研究的基本内容，拟解决的主要问题 1.海水中碱性蛋白酶高产菌株的筛选；

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常 数测定 一、实验原理 (1).碱性磷酸酶的分离纯化 1. 机械破碎法制备肝匀浆 低浓度乙酸钠：低渗破膜 低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP 2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP 加入不同有机溶剂重复离心 正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质 33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP 50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP (2).比活性测定 1.比活性的定义 *单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。 *通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。 *用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。 2.测定样品的比活性必须测定： *每毫升样品中的酶活性单位数。 *每毫升样品中的蛋白质毫克数。

3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理 (3).米氏常数测定 K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度 ＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此, 米氏常数的单位为mol/L。 当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标， 以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。

二. 器材 721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器 托盘天平匀浆器试管 三. 试剂 1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁 5.3625g溶于蒸馏水中, 稀释至50ml. 2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水

中, 稀释至10ml. 3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml 及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml. 4. 丙酮(分析纯). 5. 95%乙醇(分析纯). 6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml. 7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g, 4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可. 8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml. 9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.

知识十六 主要蛋白质的理化性质、功能、临床意义.

知识十六主要蛋白质的理化性质、功能、临床意义 教学目的： 1、熟悉血浆蛋白质的理化性质、功能与临床意义； 2、掌握个别血浆蛋白质特别是血浆中的白蛋白、前白蛋白的临床意义； 3、了解疾病时血浆蛋白质的变化等。 重点：个别血浆蛋白质特别是血浆中的白蛋白、前白蛋白的临床意义。 难点：血浆蛋白质测定的临床意义；疾病时血浆蛋白质的变化。 教学方法和手段：课堂讲授为主，多媒体教学为辅，课堂提问突出重点。 授课时数：1学时 教学内容及组织： 一、血浆蛋白质的组成及功能 血浆蛋白质是血浆固体成份中含量最多、组成复杂、功能广泛的一类化合物。占血浆固体成份90%左右，目前已经研究的血浆蛋白质有300多种，分离出的纯品约100来种，除免疫球蛋白外，主要由肝细胞合成，主要功能。 1. 维持血浆胶体渗透压；清蛋白。 2. 作为某些物质的载体，起运输作用；如清蛋白能与多种物质结合（FA、胆红素），某些球蛋白具特异地运输某些物质的功能，运铁蛋白、运皮质醇蛋白。 3. 维持体液pH恒定；血浆蛋白pI一般都小于7.4是弱酸，一部分以弱酸盐形式存在，构成缓冲对。 4. 免疫功能；血浆中许多具有免疫功能的球蛋白，主要由浆细胞合成，电泳时位于γ区带，如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，此外，还有具有免疫作用的非特异球蛋白，如补体。 5. 凝血与纤溶作用；凝血与纤溶是一对矛盾的统一、凝血因子与纤溶因子绝大部分是血浆蛋白质，它们促进血液凝固，防止血液流失和溶解血栓，防止重要脏器的动脉栓塞。 6. 营养作用；血浆蛋白质可分解成AA，用于合成组织蛋白或氧化供能。 7. 催化作用；血浆中有许多酶类，其中部分在血浆中发挥作用，称血浆功能性酶，如凝血酶原、纤溶酶原、铜蓝蛋白、LPL、LCAT、肾素等。 二、个别血浆蛋白质 （一）前白蛋白（prealbumin，PA）分子量5.4万，由肝细胞合成，电泳时移动速度较白蛋白快，位于其前方面得名，半寿期短12h，PA是一类运载蛋白，一种能与甲状腺素结合，称为甲状腺结合蛋白，一种能与VitA结合，称为VitA 结合蛋白，常用测定方法是免疫学方法，正常参与范围0.2～0.4g /L,急性炎症，

酶的分离纯化方法介绍

酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。

详细介绍碱性磷酸酶分离纯化的过程及采取的技术

1、详细介绍碱性磷酸酶（SOD、木瓜凝乳蛋白酶、精氨酸激酶）的提取、分离纯 化方案及采用每种技术（如：如果采用阴离子交换层析，那为什么不采用阳离子交换层析呢，要解释清楚）的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度？ 一、精氨酸激酶的介绍 无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+和ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸、Mg2+和ADP，是无脊椎动物体内能量代谢的关键调控酶[1]。它不仅在对墨鱼的能量代谢过程中具有重要作用，而且在墨鱼体内的表达量也很高。因此，对精氨酸激酶深入研究十分必要。本实验主要对墨鱼肌肉组织的精氨酸激酶进行分离、纯化及部分酶学性质的鉴定。对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降；pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用。 二、工艺路线

三、研究内容与方案 1.对虾精氨酸激酶的提取、分离 取10g于-20℃贮存的新鲜对虾肌肉,高速组织捣碎机2000r·min-1匀浆5min,加入40mL预冷的缓冲液A(0.1mmol·L-1Tris-HCl,10mmo l·L-1巯基乙醇,5mmol·L-1叠氮化钠,20mmo l·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF),pH8.0),搅拌均匀,把悬液放置于预冷的离心管中,4℃,5000×g离心20min后保存上清。＊选择使用巯基乙醇和PMSF的原因： 巯基乙醇可以防止蛋白酶在分离提取过程中的氧化、 PMSF是蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白酶水解 ＊注意事项 该步骤完成后，要对粗酶液进行酶活力的测定 2.对虾精氨酸激酶的纯化 1）DEAE-纤维素柱层析 装柱直接取商品DEAE cellulose DE-52装柱(2.5x40cm)装柱前，先在柱中加入一定量的层析柱平衡液（约10cm高），然后倒入凝胶，打开柱底部的出口，使其自然沉降，当柱中形成明显分界面时，放入两层大小合适的滤纸片与凝胶顶部，接上恒流泵，流速选用2.5ml/min，当柱不再进一步压缩时，保持柱顶部缓冲液1-2cm高[4]。平衡使用DEAE cellulose DE-52阴离子交换层析柱平衡液洗脱2-3个柱体积，平衡12h。加样打开柱顶，用吸管吸出多余的缓冲液至柱床上薄薄一层，然后加入酶液，加样量一般不超过约2-3ml。洗脱采用NaCl浓度梯度洗脱法，将DEAE cellulose DE-52层析柱洗脱液A液和B液分别加到梯度混合仪两容器内，将B液150ml加入左杯，A液150ml加入右杯，打开梯度混合仪两容器内，流速1.5ml/min，通过波长280nm的核酸蛋白检测仪后，由自动收集器收集。 ＊选择阴、阳离子交换层析的原则： 蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH有较大关系。以用阴离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH条件下，等电点pIpH的

木瓜蛋白酶的提取

木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13生物技术第二大组第二小组 组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景： 在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。 二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一 种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观

为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶 的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。 关键词：胃蛋白酶分离纯化应用 ．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线 （自溶、过滤）（脱脂、去杂质） 猪胃黏膜→自溶液→上清液 （浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品 工艺过程 （1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术 有机溶剂法

可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 底物亲和法 底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】 透析法 胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换2—3次。如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却，避免样品变性。透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。【1】 3胃蛋白酶的纯化技术 凝胶过滤法

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析 实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室 合作者指导老师 总分教师签名批改日期 碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。 AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。 一实验原理 1、碱性磷酸酶的分离纯化 AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。 2、碱性磷酸酶的比活性测定 根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg?pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm 处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。 3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表 示： 式中：Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。 ①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析 实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室 合作者指导老师 总分教师签名批改日期 碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重

组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。 一实验原理 1、碱性磷酸酶的分离纯化 AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。 2、碱性磷酸酶的比活性测定 根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg ?pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚

蛋白质的性质和分类

蛋白质凭借游离的氨基和羧基而具有两性特征，在等电点易生成沉淀。不同的蛋白质等电点不同，该特性常用作蛋白质的分离提纯。生成的沉淀按其有机结构和化学性质，通过pH的细微变化可复溶。蛋白质的两性特征使其成为很好的缓冲剂，并且由于其分子量大和离解度低，在维持蛋白质溶液形成的渗透压中也起着重要作用。这种缓冲和渗透作用对于维持内环境的稳定和平衡具有非常重要的意义。 在紫外线照射、加热煮沸以及用强酸、强碱、重金属盐或有机溶剂处理蛋白质时，可使其若干理化和生物学性质发生改变，这种现象称为蛋白质的变性。酶的灭活，食物蛋白经烹调加工有助于消化等，就是利用了这一特性。 (二)蛋白质的分类 简单的化学方法难于区分数量庞杂、特性各异的这类大分子化合物。通常按照其结构、形态和物理特性进行分类。不同分类间往往也有交错重迭的情况。一般可分为纤维蛋白、球状蛋白和结合蛋白三大类。 1.纤维蛋白包括胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白。 (1) 胶原蛋白胶原蛋白是软骨和结缔组织的主要蛋白质，一般占哺乳动物体蛋白总量的30%左右。胶原蛋白不溶于水，对动物消化酶有抗性，但在水或稀酸、稀碱中煮沸，易变成可溶的、易消化的白明胶。胶原蛋白含有大量的羟脯氨酸和少量羟赖氨酸，缺乏半胱氨酸、胱氨酸和色氨酸。 (2) 弹性蛋白弹性蛋白是弹性组织，如腱和动脉的蛋白质。弹性蛋白不能转变成白明胶。 (3) 角蛋白角蛋白是羽毛、毛发、爪、喙、蹄、角以及脑灰质、脊髓和视网膜神经的蛋白质。它们不易溶解和消化，含较多的胱氨酸(14-15%)。粉碎的羽毛和猪毛，在15-20磅蒸气压力下加热处理一小时，其消化率可提高到70-80%，胱氨酸含量则减少5-6%。 2.球状蛋白 (1) 清蛋白主要有卵清蛋白、血清清蛋白、豆清蛋白、乳清蛋白等，溶于水，加热凝固。 (2) 球蛋白球蛋白可用5-10%的NaCl溶液从动、植物组织中提取；其不溶或微溶于水，可溶于中性盐的稀溶液中，加热凝固。血清球蛋白、血浆纤维蛋白原、肌浆蛋白、豌豆的豆球蛋白等都属于此类蛋白。 (3) 谷蛋白麦谷蛋白、玉米谷蛋白、大米的米精蛋白属此类蛋白。不溶于水或中性溶液，而溶于稀酸或稀碱。 (4) 醇溶蛋白玉米醇溶蛋白、小麦和黑麦的麦醇溶蛋白、大麦的大麦醇溶蛋白属此类蛋白。不溶于水、无水乙醇或中性溶液，而溶于70-80%的乙醇。 (5) 组蛋白属碱性蛋白，溶于水。组蛋白含碱性氨基酸特别多。大多数组蛋白在活细胞中与核酸结合，如血红蛋白的珠蛋白和鲭鱼精子中的鲭组蛋白。 (6) 鱼精蛋白鱼精蛋白是低分子蛋白，含碱性氨基酸多，溶于水。例如鲑鱼精子中的鲑精蛋白、鲟鱼的鲟精蛋白、鲱鱼的鲱精蛋白等。鱼精蛋白在鱼的精子细胞中与核酸结合。 球蛋白比纤维蛋白易于消化，从营养学的角度看，氨基酸含量和比例也较纤维蛋白更理想。 3. 结合蛋白 结合蛋白是蛋白部分再结合一个非氨基酸的基团(辅基)。如核蛋白(脱氧核糖核蛋白、核糖体)，磷蛋白(酪蛋白、胃蛋白酶)，金属蛋白(细胞色素氧化酶、铜蓝蛋白、黄嘌呤氧化酶)，脂蛋白(卵黄球蛋白、血中β1-脂蛋白)，色蛋白(血红蛋白、细胞色素C、黄素蛋白、视网膜中与视紫质结合的水溶性蛋白)及糖蛋白(γ球蛋白、半乳糖蛋白、甘露糖蛋白、氨基糖蛋白)。

药物分离纯化

1.什么是化学萃取？影响化学萃取的因素？溶质与萃取剂之间的化学作用？ 2.什么事截留分子量？各种分离膜（如微滤、超滤、纳滤）的截留组分范围怎样？ 3.什么是乳化现象？消除乳化的方法有哪些？ 4.什么是反萃取、萃取相、萃余相？ 5.什么是有效成分和有效部位？ 6.什么是双水相萃取技术？有哪些特点？ 7.什么是半仿生提取法？其优点有哪些？ 8.什么是分子印迹技术，其特点如何？ 9.什么是分子蒸馏，其操作过程如何，有哪些特点？ 10.依据分离记理，色谱法分为哪几类？ 11.根据料液和溶剂的接触和流动情况，萃取操作过程如何划分？ 12.什么是凝胶色谱，其分离机理如何，有哪些用途？其操作过程如何？ 13.什么是住色谱，如何操作？ 14.活性氧化铝有哪些类型？特点是什么？其含水量关系如何？ 15.何为浸漉法，去操作过程如何？ 16.离子交换树脂有哪些类型,影响其选择性的因素？其操作过程如何？ 17.容积提前中药有效成分时，选择溶剂的原则，常见容积大机型大小如何？ 1分离纯化过程：通过物理、化学或生物等手段，或将这些方法结合，将某混合物系分离纯化成两个或多个组成彼此不同的产物的过程。 分离纯化技术：在工业中通过适当的技术手段与装备，耗费一定的能量来实现混合物的分离过程，研究实现这一分离纯化过程的科学技术。 1、药物分离的特点：（1）药物的品种繁多，结构复杂，不同来源的药物性质差别很大，采用的分离技术原理和方法也多种多样。（2）以天然形式存在的药物，或生物来源的药物通常含量较低，杂质的量远远大于有效成分的量。分离过程需要多种方法联合应用，使有效成分的含量不断提高。（3）药物中很多品种特别是天然成分和生物活性物质具有稳定性差、易分解、易变性等特点，在选择分离方法时需要考虑被分离物质的性质，采用适当的分离方法和条件，以保证产品的稳定性（4）从药物研究到药品生产，分离在量上的差别很大，小到 以鉴定、含量测定的6- 10g级，大到生产的吨级的纯化。（5）药品的质量要求高，必须达到国家标准，生产环境需要达到一定的洁净度，防止环境对产品的污染。 2、分离纯化方法按原理分为机械分离和传质分离。 3、萃取：将样品中的目标化合物选择性地转移到另一相中或选择性地保留在原来的相中（转移非目标化合物），从而使目标化合物与原来的复杂机体相互分离的方法。反萃取：调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作。萃取相：当溶剂与混合液混合后成为两相，其中一个以萃取剂为主（溶有溶质）的称为萃取相。萃余相：另一个以原溶液为主的（即溶剂含量较低）称为萃余相。萃取液：利用蒸馏、蒸发和结晶等方法除去萃取相中的溶剂后得到的液体称为萃取液。萃余液：利用蒸馏、蒸发和结晶等方法除去萃余相中的溶剂后的液体称为萃余液。化学萃取：也称反应萃取，是利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。影响化学萃取的因素：（1）被萃取药物的结构（2）pH的影响（3）温度的影响（4）无机盐的存在（5）溶质的结构（6）萃取剂（7）稀释剂。 4、化学萃取中，溶质与萃取剂之间的化学作用主要有：（1）配位反应（2）阳离子交换反应（3）离子缔合反应萃取（4）协同反应萃取。 5、根据料液和溶剂的接触和流动情况，可以把萃取操作过程分成单级萃取操作和多级萃取

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取的分离纯 化 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。 关键词：胃蛋白酶分离纯化应用 ．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线 （自溶、过滤）（脱脂、去杂质） 猪胃黏膜→自溶液→上清液 （浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品 工艺过程 （1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、

干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术 有机溶剂法 可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 底物亲和法 底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】

我国制药分离纯化技术现状和发展方向

我国制药分离纯化技术现状和发展方向 引言：制药工业关系国计民生。一种好的药品，不仅能治疗疾病，而且能够提高国民的身体素质。大千世界，形形色色的动植物，不计其数的化合物，想要从里面找到能够制成药物的有效成分是一件困难的工作。由于药物的纯度和杂质含量与其药效、毒副作用、价格等息息相关，使得分离过程在制药行业中的地位和作用非常重要。因此，制药分离纯化技术在制药工业中具有举足轻重的地位。 一、现状 制药分离过程主要利用待分离的物质中的有效活性成分与共存杂志之间在物理、化学及生物学性质上的差异进行分离，是一个复杂的过程。 近年来，我国的医药产业虽然得了比较大的发展，但是在制药过程上并没有取得重大突破，与发达国家仍有很大的差距。其原因是多方面的，但最主要的原因来自于生产过程中的工艺技术和装备问题，药品提取分离纯化过程作为医药生产过程中最关键的环节，自然而然的成为了首要原因。 目前，在我国制药领域，很多先进的提取分离纯化技术已经得到了发展和应用，但是仍然没有成为制药过程中的主导工艺，依然是以传统落后的提取技术为主导，在制药过程中存在着提取分离技术装备简单，工艺流程单一等缺陷。我国目前的分离提取技术还存在很多不足。设计和开发出一个新的生产系统和设备，显得尤为迫切。 制药提取分离技术及其装备关系到三个问题：(1)能否最大限度

地从药材中提取有效成分，但是保证无用的物质不能被同时转移。(2)能否尽量使所提取物质的量相对平均；(3)能否在尽量满足最大产能的情况下，把成本降到最低。简单来说是产率、工艺条件稳定和效率三个问题。这些问题如果能得到有效的解决，就能为后续生产环节制提供良好的生产环境，实现提高生产质量的最终目的，目前，我国大部分所使用的传统提取工艺和装备都难以解决以上的几个问题，生产中仍然以传统落后的工艺技术和装备为主导，提取生产过程中的装备陈旧、工艺流程单一，集成优化和高效节能的成套装备虽然已经开发出来，但是并没有得到广泛应用，因此，充分利用各种先进的提取分离纯化技术，先进的装备的优势以及自动化控制与在线检测系统的优势，开发出先进、适用的中药提取分离技术流程，并使其得到推广和广泛的应用。 传统的分离纯化方法主要有水提醇沉法(水醇法)、醇提水沉法(醇水法)、酸碱法、盐析法、离子交换法和结晶法等。新的分离纯化方法主要有絮凝沉淀法、大孔树脂吸附法、超滤法、高速离心法等。这些新技术的推广应用，降低了生产成本、提高了产品质量，推动了医药的现代化进程，为我国的医药行业走向国际市场奠定了基础。 二、发展方向 我国的医药生产水平与世界先进的药物提取水平差距甚大，影响了我国医药产品在世界药品市场的地位。中国已经加入WTO，国内医药生产企业要想在竞争中赢得主动，必须采用先进的提取分离技术，才可能使我国医药产品生产和销售在国际市场占有更多的份额，

药物分离与纯化

硕士学位课程考试试卷 考试科目：天然药物的分离与纯化 考生姓名：邱诗春 考生学号：20111902042 学院：生物工程学院 专业：生物学 考生成绩： 任课老师(签名) 考试日期：20 11 年11 月 5 日午时至时

姜黄中天然药物的分离与纯化 摘要：姜黄素是姜黄属植物中的主要活性成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、清除自由基、抗微生物以及对心血管系统、消化系统等多方面药理作用，有较好的临床应用价值和研发潜力。随着提取分离纯化技术的发展，目前有多种方法从植物中提取并分离姜黄素。本文对近年来研究姜黄素的酶法、渗漉法、水杨酸钠法、超临界CO2 萃取法、超声提取法及微波提取法等提取方法；大孔树脂吸附法、聚酰胺吸附法、活性炭色谱法、硅胶柱色谱法、乙酸沉淀法等分离纯化方法进行综述，为进一步开发利用姜黄素提供依据。 关键字：姜黄素；提取；分离 Abstract: Curcumin is one of the major active ingredients in plants of Curcuma L. and has many pharmacological effects, such as: anti-cancer, anti-oxidant, anti-inflammatory, free radical scavenging, and anti-microbial effect in the cardiovascular system and digestive system, and so on. It has better clinical application and developping potential of new drug. With the development of extraction and isolation technology, there are many ways to extract and isolate curcumin from plants. The recent studies of curcumin extraction methods, i.e. enzyme method, percolation method, sodium salicylate method, supercritical CO2, ultrasonic extraction and microwave extraction. Separation methods, i.e. polyamide adsorption, macroporous resin adsorption, polyamide adsorption, activated carbon chromatography, silica gel column chromatography and acid-precipitation method are reviewed to provide the basis evidence for further utilization of curcumin. Key words：curcumin; extraction; separation 姜黄（Curcuma longa）为多年生草本植物，其性味辛、苦、温，入心、肝、脾经，可行气破瘀，通经止痛，并且还有助消化特性，可以作为调味品、天然色素、天然染料，近年来因其具抗肿瘤、抗炎、抗氧化[1,2]等活性而倍受关注．姜

菠萝蛋白酶的提取、分离纯化及活性测定

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定 15食安（1）班张凯 摘要：本研究运用硫酸铵沉淀法和透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量，得到同一品种及成熟度的菠萝皮经两种不同的纯化方法处理，菠萝皮中的蛋白酶都能被有效纯化，但是蛋白酶活性会损失一部分。 关键词：菠萝蛋白酶；透析法；分离纯化；酶活性； 前言 菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称,主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同,分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。Marcano于1891年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶。随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药和化工领域有很好的利用价值。1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。目前,菠萝蛋白酶的一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域。随着提取纯化技术的不断进步,高活性的菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工和食品领域。[1]利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶，不仅可充分利用资源，拓展菠萝蛋白酶的获取途径和应用空间，还可降低菠萝加工废料对环境的污染；随着市场对菠萝加工产品需求量的增大，对于菠萝皮的研究与利用就显得尤为重要，尤其对最主要的功能成分蛋白酶的分离、纯化与性质的研究更有意义。[2] 本文通过对菠萝皮蛋白酶的提取，初步分离纯化及活性测定进行了初步研究，探讨影响菠萝蛋白酶活性的影响因素，并解决实验存在的一些问题。 1实验材料与仪器 1．1实验材料与试剂 新鲜菠萝，透析袋（截留相对分子质量8 000~14 000），0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），1％酪蛋白，激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二