PCR_DGGE法检测浮游生物16SrDNA在溺死鉴定中的应用

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(收稿日期:2007 06 11;修回日期:2007 08 13)

!基金项目?国家自然科学基金资助项目(30300399)!作者简介?何方刚(1972-)男,湖北随州人,讲师,博士,主要从事法医病理学和临床学研究工作。

!通讯作者?黄代新(1969-),男,湖北松滋人,副教授,博士,主要从事法医遗传学研究工作。

PCR DGGE 法检测浮游生物16S r DNA 在溺死鉴定中的应用

何方刚

1,2

,黄代新1,刘 良1,闫 平2,孟祥志2,张 勇

2

(1.华中科技大学同济医学院法医学系,湖北武汉430030;2.武汉大学医学院法医学教研室,湖北武汉430071)

!摘要?目的建立并评估PCR DGGE 法检测浮游生物对溺死鉴定的应用价值。方法大白兔30只随机分为3组:溺死组(n =12),死后抛尸组(n =12)和对照组(n =6);溺死组和死后抛尸组又分为2个亚组:东湖水域组(n =6)和墨水湖水域组(n =6)。死后提取心血和肺、肝、肾、脑等组织,匀浆后,采用P erco ll 密度梯度离心法分离浮游生物并提取其DNA,PCR 扩增浮游生物特异的16S rDNA 片段后分别用琼脂糖凝胶电泳及DGGE 检测分析。2个溺死案例检材同法检验。结果溺死组各组织器官中浮游生物检测多呈阳性:肺(100%)、肝(83%)、肾(75%)、心血(83%)、脑(42%);死后抛尸组仅2例肺组织(16.7%)检出阳性;对照组全部阴性。溺尸肺组织DGGE 分型图谱与相应溺死点水样分型图谱相似,而与非溺死点水样分型结果差异显著。2实际案例均呈阳性。结论本方法不仅有助于定性诊断溺死,而且通过比较产物的多样性可以推断溺死地点,在法医学溺死鉴定中具有较大实用价值。

!关键词?法医病理学;溺死;浮游生物;16S rDNA;DGG E

!文献标识码?A !文章编号?1001-5728(2008)04-0234-04

A PCR DGGE based m et hod for identifyi n g pl a nkt on 16S r DNA for the diagnosis of drowning (#

HE Fang gang ,HUANG Dai x in ,LI U Liang ,et a.l /#

Faculty of F orensic M ed icine ,Tongji M edical Colle g e ,H uazhong University o f Science and Technolo gy ,Wuhan 430030,China)

!Abstract ?Objective To deve l o p and evaluate a PCR DGGE based m ethod for identify i n g p lankton 16S r DNA for the d i a gnosis of dr own i n g .M et hods Thirty wh ite rabb its w ere div i d ed rando m l y i n to three g r oups :dro w ning group (n =12),post m orte m subm ersion group (n =12)and contro l group (n =6),and the dro w n i n g and post m o rte m sub m ersion g r oups w ere red i v i d ed respectively into t w o subgroups :Donghu Lake (n =6)andM oshu iLake (n =6)subgroups .A fter sacr ificed ,the heart b l o od,lung ,liver ,k i d ney and brain tissues o f rabbits w ere re m oved and ho m ogen ized ,and then the plankton w as separa ted usi n g Percoll

density grad ient cen trif u gati o n technique .A fter DNA ex tracted ,t h e 16S r DNA of plank ton w as a m p lified w ith specific pri m ers follo w ed by agar ose ge l e lectropho resis or denaturi n g gradient gel electrophoresis(DGGE )ana l y sis .In add iti o n,t w o hum an dro w ning cases w ere a lso tested w ith the m ethod described above .R esults P lankton w as de tected fro m m ost ki n ds o f the tissues fro m dr own i n g g r oup :lung (100%),

liver (83%),

kidney (75%),

heart bloods (83%),bra i n (42%).Fo r post m orte m

sub m ersion group ,ho w ever ,plankton w as detected

on l y fro m t w o cases o f l u ng (16.7%),and none fro m contro l g r oup .A fter analyzed w ith DGGE,the spec ial fi n gerpri n t of p lankton fro m the lungs of dro w n i n g rabbits w as very si m ilar to that fr o m the w ater sa mp le o f drown i n g site ,

but no t to the o ther site .

By this

m ethod,the plankton was also detected fro m t w o hu m an drown i n g cases.Conc l u sion The ne w PCR DGGE based m ethod developed by th is study w as helpful no t on l y to diagnosis of dro wn i n g,but also to d iscri m i n ate the site o f dro w ning,and is a potentia lly useful too l for d iagnosing dro w ning.

!K ey w ords?Forensic pathology;Dro w ning;Plank ton;16S r DNA;DGGE

水中尸体的死因分析一直是法医学实践中的难点之一。虽然硅藻检验的溺死诊断价值在学界仍存在争议,但在法医学实践中,仍将其视为一种相对可靠的溺死诊断手段。目前,最常用的硅藻检验方法是强酸消化法,但该法具有操作危险、灵敏度低及污染空气等缺点。因此发展更灵敏、简便的浮游生物检测方法用于溺死的诊断十分必要。

近年来,随着分子生物学的发展,尝试通过检测浮游生物特有的编码DNA序列用于溺死诊断成为研究热点。1996年,K ane等[1]用PCR技术从溺尸组织中成功地扩增出蓝藻16S r DNA。次年,N bel等[2]采用门 特异性引物,从非无菌培养和环境检材中扩增出蓝藻和硅藻16S r D NA片段。这些方法无需消化分离,也不再依赖于浮游生物的形态学和理化特征,在分子水平上,用PCR直接扩增浮游生物特异的DNA 序列,具有很高灵敏度和特异性,解决了蓝藻在形态上和细菌难以区别的问题,并能有效排除腐败菌的干扰,是一种鉴定溺死的实用手段。本文选用N bel 等[2]设计的引物,用PCR DGGE技术研究浮游生物特异性DNA片段检测在溺死诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 动物分组、溺死方法及组织准备

30只大白兔由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供,雌雄不限,体重2.4~3.4kg,随机分成3组:溺死组(n=12)、死后抛尸组(n=12)及对照组(n =6)。选择武汉东湖和墨水湖作为实验动物的溺死地点,由此溺死组和死后抛尸组又各分为2个亚组:东湖组(n=6)和墨水湖组(n=6)。将溺死组大白兔置兔笼中,沉入水下0.5m处,1m i n后提出水面,30s 后重新沉入相同水深处直至溺死,并在水中浸泡6h 后取出;死后抛尸组动物以钝性闭合性脑外伤处死后,置于相同水域相同深度浸泡6h后取出;对照组动物以钝性闭合性脑外伤处死后不做任何处理。

用单蒸水冲洗动物尸体后,转移至超净工作台上,打开胸腹腔,先用一次性注射器从左心血抽取心血并转移至干净试管中,再用超纯水反复冲洗各脏器表面后提取肺、肝、肾等组织,最后打开颅腔提取脑组织。肺、肝、肾和脑组织各取2g加入少量超纯水后用匀浆器匀浆。所有器械均用超纯水浸泡冲洗。

同时收集溺死地点相同水深处的水样5m l。1.2 浮游生物分离

根据Teraza w a等[3]报道的方法进行改良。取8m l Perco ll 溶液(Am ersha m B iosciences,Sw eden)与2m l组织匀浆液或心血混匀后,转移至10m l离心管(NALGENE,Am erican)中,12%17000r pm离心60m i n。吸去上层组织层,下层液体加入2倍体积超纯水混匀,6000rpm离心15m i n。弃上清,向沉渣中加入5m l超纯水,重新悬浮后12000rpm离心10m i n。弃上清,沉渣用于DNA提取。

水样取2m l12000rpm离心5m in并超纯水洗涤2次后,沉淀用于DNA提取。

1.3 浮游生物DNA提取

向沉淀中加入5%Chelex 100180 ,l-80%冷冻30m i n,取出后立即于56%水浴箱中解冻,重复冻融1次,然后按常规Che lex 100法提取DNA[4]。

1.4 PCR扩增及及产物检测

采用N be l等[2]报道的引物扩增浮游生物16S r D NA,引物序列见表1,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 扩增浮游生物16S rDNA的引物序列T ab le1Th e p ri m er sequen ces for a m p lificati on of

the16S rDNA of p lankton

引 物序 列

CYA F5& GGGGAATYTT CCGCAATGGG 3&

CYA R(a)5& GACTACTGGGGTATCTAAT CCCATT 3& CYA R(b)5& GACTACAGGGGTATCTAAT CCCTTT 3&

注:Y=C或T,反向引物CYA R为CYA R(a)和CYA R(b)的等量混合,正向引物5&端加入富含GC的GC夹(5& CGC CCGCCGCGCCCCGCGCCGGTCCCGCCGCCCCCGCCCG 3&)

N o te:Y deno tes a C/T nuc l eotide degene racy.T he reverse pr i m er CYA R was an equ i m o l ar m i x ture of CYA R(a)and C YA R (b),A40 nuc l eo tide GC r i ch sequence(5& CGCCCGCCGCGC CCC G CGCCGGTCCCGCCGCCCCCGCCC G 3&)was attached to the5&end of t he f o r w ard pri m ers

PCR反应总体积为10 ,l内含200 m o l/L dNTPs,50mm ol/L KC,l10mm ol/L T ris H C l(p H8.3), 1.5mm o l/L M gC l2,CYA引物浓度0.5 m o l/L,0.5U Taq DNA聚合酶,模板DNA2 l。PCR热循环参数: 95%2m i n,然后94%45s,60%50s,72%1m i n,共38个循环,再72%延伸10m i n。

扩增产物用2%琼脂糖凝胶分离后溴化乙锭显

色。DGGE检测采用B i o Rad公司的DCode通用突变检测系统。变性梯度凝胶(160mm?160mm?1mm)采用6%的聚丙烯酰胺(丙烯酰胺(亚甲基双丙烯酰胺=37.5(1),变性剂浓度范围为20%~60% (100%的变性剂:7M尿素和40%的甲酰胺)。扩增产物加入等体积的DGGE载样缓冲液(0.5%溴酚蓝,0.5%二甲苯青,70%丙三醇)混匀,当1?TAE电泳缓冲液升温至60%时上样。电泳条件:150V60%电泳6h。电泳后常规银染显带[5]。

2 结 果

2.1 浮游生物16S r DNA定性分析

CYA引物扩增的产物大小为487bp(含GC夹),

各组检测结果见图1、表2

。

图1 溺死组(A)和对照组(B)不同组织浮游生物

16S rDNA扩增产物琼脂糖电泳图

1:pUC19DNA/M sp)mark er;2:水样;3~7:肺、肝、肾、心血和脑组织;8:阴性对照

F ig1The agarose ge l p attern s of a m p lif i cation products of 16S rDNA of p lankton fro m various tissues of the drowning group(A)and con trol group(B)

Lane1:p U C19DNA/M sp)m arke r;L ane2:wa ter sa m ple; Lanes3~7:produc ts from l ung,li ver,k i dney,heart b l ood and bra i n;L ane8:nega tive con tro l

表2 各组16S rDNA产物的阳性数和阳性率

Tab le2T he num ber and percen tage of PCR

products de tection in d ifferen t groups

组别(例数)

阳性例数和阳性率(%)

肺肝肾血脑

溺死组(12)12(100)10(83)9(75)10(83)5(42)死后抛尸组(12)12(100)10(83)9(75)10(83)5(42)对照组(6)0(-)0(-)0(-)0(-)0(-)

2.2 DGGE检测

以武汉地区常见的浮游生物???梅尼氏小环藻(FACHB 986)、铜绿微囊藻(FAC H B 942)、水华鱼腥藻(FAC H B 245)、粘球藻(FAC H B 905)(中科院水生生物研究所提供)经CYA引物扩增的产物混合物作为分子标记。不同地点水样和溺死动物肺组织中浮游生物的检测结果见图2。

图2 不同样本中提取产物的DGGE电泳图

1:不同藻种扩增产物混合物(上带:粘球藻;下带:铜绿微囊藻、水华鱼腥藻和梅尼小环藻);2、4、6:墨水湖、东湖和月湖水样;3、5:墨水湖和东湖溺死动物肺组织浮游生物扩增产物Fig2Th e DGGE pattern s of the a m p lificati on products

fro m d ifferent sa m p l e s

L ane1:products fro m m i xture of G l oeocapsa alpicola(upper band),M i crocystis aerug i nosa,A nabaena fl os aquae and Cyc l o te lla m enegh i niana sp.(l ow er band);l anes2,3:produc ts from w ate r samp l e of M oshu i L ake and from lung ti ssue of a rabbit drowned i n it,respecti ve l y;l anes4,5:products fro m wa ter sa m p le of D onghu Lake and fro m l ung tissue o f a rabb it dro w ned i n it, respec tive l y;lane6:products from w ate r sa m ple of Y uehu Lake

3 讨 论

3.1 浮游生物16S r DNA PCR DGGE检测在溺死鉴定中的应用价值

浮游生物16S r D NA序列相对保守,但其中含有一些可变区[6]。可变区序列差异为生物种群鉴别提供了丰富的信息,已被广泛应用于生物进化、种群鉴别和生态学研究,是理想的检测标记。Kane等[1]利用16S r DNA第五、六可变区在溺死鉴定上进行了成功尝试,本课题组[7]也证实了16S r DNA第三、四可变区在溺死鉴定中的价值。但这些方法因扩增片段小、所含多态性信息较少,仅能用于溺死的定性诊断,不适合用于推断溺死地点。

DGGE是鉴别基因序列中碱基差异高度灵敏的分析检测技术,已被广泛用于微生物种群的鉴定[8]。N be l等[2]结合16S r DNA和DGGE技术进行了浮游生物种群鉴别和群落分析。本文选择N be l设计的引物,其扩增产物所含多态性信息丰度较高,适合于浮游生物种群分析和溺水地点推断。本实验中,在有浮游生物存在的样本中,均能扩增出487bp的16S r D NA基因片段(图1),经DGGE分析后显示出多条电泳条带(图2),即各个样本的产物中存在数个长度相同但碱基序有差异的片段,表明样本中有多种浮游

生物存在。通过对产物DGGE电泳条带的多样性分析表明:+不同水域水样扩增产物存在明显差异(图2中的2、4和6);,溺死动物肺组织与相应溺水地点水样中产物有显著的相似性(图2中的2和3,4和5),与非溺死地点水样中的产物差异显著。本文结果表明,用PCR DGGE技术检测浮游生物16S r DNA不仅有助于定性诊断溺死,而且通过比较可以推断溺死地点,在法医学溺死鉴定中具有较大实用价值。

本实验中死后抛尸组有2例肺组织检测出浮游生物DNA,但肝、肾、脑和心血中没有检测出DNA(表2),分析认为可能是因为水压作用致水中藻类渗入尸体肺组织或操作过程中的污染,这也再次表明不能仅凭单个器官阳性结果诊断溺死,而应根据多个脏器的检测结果作出判断。

3.2 组织中浮游生物的分离

如何从溺尸的组织细胞中有效分离出浮游生物对溺死诊断至关重要。本课题组早期的研究发现,若不进行分离直接从溺尸组织细胞中检测浮游生物,因大量动物DNA的干扰,致使灵敏度很低[7]。为了解决这个问题,本文选用Perco ll 作为分离介质,采用密度梯度离心技术分离组织细胞中的浮游生物。Perco ll是聚乙烯吡咯酮包被的胶体二氧化硅,离心时能自发形成密度梯度,因组织细胞与浮游生物的密度存在差异,故可有效去除动物组织细胞,使检测灵敏度大大提高。采用这种分离技术,本文从2g组织或2m l心血即可获得阳性结果。

3.3 溺死实际案例的应用

案例1 47岁成年女性,发生家庭暴力后离家出走,次日在河中发现其尸体,第3d进行尸体解剖。取肺、肝和肾组织各20g,经强酸消化法检验硅藻阳性,结合尸表和尸体解剖确定其死因为溺死。

案例2 39岁成年女性,失踪2d后,在郊区一水井内发现其尸体,次日进行尸体解剖。根据尸体解剖和案情调查初步考虑其为溺死,但取肺、肝、肾组织各20g和水样15m,l经强酸消化法检验硅藻均为阴性。

为进一步确定两死者的死因,分别取上述2案例的肺、肝、肾组织各2g以及相关水样各2m,l按照本实验方法检测16S r DNA片段,结果均为阳性。

!参 考 文 献?

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(收稿日期:2007 05 23;修回日期:2007 08 09)

新书介绍

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肝糖原的提取、鉴定与定量

生物化学实验报告 姓名： XXX 学号： 专业年级： 2012级临床医学 组别：第3实验室 生物化学实验教学中心

实验名称肝糖原的提取、鉴定、分离 实验日期2013-12-30 实验地点第9实验室 合作者XXX 指导老师XX 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4、熟练运用溶液混匀的各种方法。 5、正确掌握溶液转移的操作。 6、正确操作使用分光光度计。 二、实验原理 ?肝糖原的提取 糖原储存于细胞，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。 ?糖原的鉴定 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。 CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)2 2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O

. . . . 2CuOH = H20 + Cu2O (红色) Cu(OH)2 ==== H2O + CuO (黑色) ?肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。 该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10—100mg围，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。 三、实验材料 ?仪器： 1、普通离心机，室温-100℃恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为 10mg级电子天平 2、剪刀、镊子、研钵 3、试管架，离心管，试管 4、刻度吸量管（2ml ,5ml），1000μl微量可调取液器 5、100ml容量瓶 6、白瓷反应板 ?试剂： 鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）蒽酮显色剂

生物化学实验报告册模板

生物化学实验报告 姓名：李燚 学号： 3180100093 专业年级： 2018级护理学本科 组别：第五实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量操作考试 实验日期2019-12-24 实验地点第XX实验室 合作者张怡君指导老师李某某 评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。 一、实验目的 1.掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项； 2.熟练运用溶液混匀的各种方法； 3.正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器； 4.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定的原理和注意事项，掌握其操作方法。 二、实验原理 三、材料与方法：以流程图示意 （一）实验材料 1.样品：鸡肝 2.试剂： （1）95%乙醇； （2）0.31mol╱L（5%）三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（CCl3COOH）5g，加蒸馏水溶解至100ml；

（4）12mol ╱L HCl ：浓HCl 原液（36%-38%）； （5）12.5mol ╱L （50%）NaOH ：称取NaOH 50g ，用蒸馏水溶解至100ml ； （6）碘试剂：碘100mg 和KI 200mg 溶于50ml 蒸馏水中； （7）班氏试剂：称取柠檬酸钠（C5H5NaO7 ?5H2O ）173g 和无水碳酸钠（Na2CO3）100g 溶于蒸馏水700ml 中，加热促溶。冷却，慢慢倾入17.3%硫酸铜（CuSO4?5H2O ）100ml ，边加边摇。再加蒸馏水至1000ml ，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。 3.仪器和器材： （1）普通离心机，室温至100℃恒温水浴箱（×2），723型可见光分光光度计，精度为10mg 级电子天平（×1）；（2）剪刀（×1），镊子（×1），研钵（×1）；（3）试管架（×1），10ml 离心管（×2），(15㎜×100㎜)试管（×6）；（4）刻度吸量管（2ml ×1，5ml ×2），1000μl 微量可调取液器（×1）； （二）实验方法 1.肝糖原的提取与鉴定的实验的流程图： ＋ 5%CCl3COOH 1 ml ＋5%CCl3COOH 3 ml

免疫比浊法检测免疫球蛋白

免疫比浊法检测免疫球蛋白 一、实验目的 利用免疫比浊法绘制标准曲线，并检测样品中免疫球蛋白的浓度。（本小组检测的为IgG样品） 二、实验原理 1.抗原抗体反应(Antigen-antibody reaction)：抗原与其刺激机体产生的相应抗体在体内或体外发生特异性结合的反应。反应特点有：特异性、比例性、可逆性、敏感性。影响因素有：电解质、温度、酸碱度。 2.免疫比浊法：合适比例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG作用下形成微粒，使样品浊度发生变化。当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱，根据光的强度改变可测得微粒浓度。 分类：①透射比浊法（Transmission tubidimetry）当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈正相关。当抗体浓度固定（过量），样品的浊度与其中所含抗原量成正比。（特点）透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的时间较长。②散射比浊法（Nephelometry）光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光，其强度与复合物的数量和散射夹角成正比，与光的波长成反比。（特点）优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。 本实验采用透射法。 3.聚乙二醇PEG的作用：在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，3~4％的聚乙二醇，可破坏抗原抗体的水化层，促进抗原抗体靠近反应，但如浓度不适合，会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。 三、实验材料 免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)测定试剂(试剂1[PEG]，试剂2[羊抗人IgA, IgG]）（1管/每组）免疫球蛋白A, G(IgA,IgG)校准品，蒸馏水，血清样本（1管） 微量加样枪、ep管（1.5mL离心管） 酶标仪、水浴箱 四、实验步骤 1.在7个EP管中各加250μL IgG试剂1（PEG）。 2.7管分别加入蒸馏水、校准品原液、1：2校准品、1：4校准品、1：8校准品、1：16校准品、样本各2μL。 3.混匀后37℃水浴5min。 4.7管各加入85μL IgG试剂2（羊抗人IgG）。 5.混匀后37℃水浴10min。 6.分别吸取200μL至96孔酶标板中，用酶标仪在700nm处读取OD值。 五、实验结果与数据处理 2.标准曲线

肝糖原的提取、鉴定与定量

生物化学实验报告 姓名：汪煜灵 学号： 3130010071 专业年级： 2013级临床医学 组别：第2实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称肝糖原的提取、鉴定、分离 实验日期2014-12-25 实验地点第2实验室 合作者陈海玲指导老师朱利娜 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4、熟练运用溶液混匀的各种方法。 5、正确掌握溶液转移的操作。 6、正确操作使用分光光度计。 二、实验原理 ●肝糖原的提取 糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。 ●糖原的鉴定 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。 CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)2 2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O

2CuOH = H20 + Cu2O (红色) Cu(OH)2 ==== H2O + CuO (黑色) ●肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。 该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10—100mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。 三、实验材料 ●仪器： 1、普通离心机，室温-100℃恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为 10mg级电子天平 2、剪刀、镊子、研钵 3、试管架，离心管，试管 4、刻度吸量管（2ml ,5ml），1000μl微量可调取液器 5、100ml容量瓶 6、白瓷反应板 ●试剂： 鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）蒽酮显色剂

常用细胞免疫检测方法及其用途

细胞免疫功能检测常用有哪几种方法 一、迟发型过敏反应的体外检测方法 皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应（DTH）的两种常用方法。皮肤试验中诱发对曾经使病人致敏的抗原的再次应答，而接触性过敏是测试受者对从未接触过的物质发生致敏的能力。 1．皮肤试验用皮肤试验诊断DTH，常用的抗原有结核菌纯蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人类试验时在前臂皮内注射少量可溶性抗原，24～48小后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于10mm即被看作为阳性。表明受试者对该病原菌有了一定的细胞免疫能力，若皮试无反应，可用更高浓度的抗原重复试验，若仍无反应即为阴性，需排除皮试技术误差，也可能受试者从未接触过此抗原，也可能由于细胞免疫功能缺损，或由于细胞免疫功能缺损，或由于严重感染（麻疹、慢性播散性结核）造成的无反应性。 2．接触性过敏常应用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）诱发接触性过敏。化合物与皮肤蛋白质结合而导致DTH反应。在动物试验时，初次皮肤上涂抹DNCB后间隔7～10天再激发刺激，则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。 二、细胞免疫的体外检测方法 体外检测淋巴细胞的数量和功能，最易采集的是血标本，首先需分离或纯化淋巴细胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重为1.077的淋巴细胞分层液，当将血液重叠于淋巴细胞分层液之上离心时，由于红细胞（1.092）、多形核白细胞（1.090）、淋巴细胞（1.070）的比重不同而相互分开。淋巴细胞和单核细胞在血浆和分层液交界处形成一薄层。仔细分出这一薄层的细胞，其中淋巴细胞占80%，单核细胞占20%，淋巴细胞中T细胞占80%，B细胞占4%～10%，其作为非DT、非B细胞。 1．T细胞计数

生化实验操作考核要点(新)

【实验操作考核要点】 一、目的要求 1．掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2．了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3．正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4．熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5．正确掌握溶液转移的操作。 6．正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1．吸量管操作（20分）； 2．可调式微量移液器操作（20分）； 3．溶液混匀操作（视具体情况，采用合适的混匀方法）（15分）； 4．溶液转移操作（10分）； 5．分光光度计比色操作（25分）。 6．整体表现（10分）。 三、操作考核标准 （一）吸量管操作（20分，每项操作5分） 1．执管 要求右手拿吸量管，左手拿橡皮球，只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度；吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2．坐姿 要求腰、背保持竖直，看刻度时眼睛保持平视。 3．吸取溶液 吸量管插入液面深度约0.5cm，不能一插到底，也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内；调控吸量管吸取液量的刻度时，吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4．排出液体

吸量管尖应靠上受纳容器内壁，让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压，而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。 （二）可调式微量移液器操作（20分，每项操作5分） 1．设定容量值 转动加样器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮，可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。 2．吸液 （1）选择合适的吸头安放在取液套筒上，稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙； （2）把按钮压至第一停点，垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮，吸入液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留2-3秒，使管尖外侧的液滴滑落。 3．放液 （1）将吸头口贴到容器内壁底部并保持100°~40°倾斜； （2）平稳地把按钮压到第一停点，等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体； （3）压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过，再松开按钮。按吸头弹射器除去吸头。 4．压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。取液器吸嘴为一次性使用。实验完毕，将取液器读数调至最大量程值，竖立放于支架上。 （三）溶液的混匀（操作流程中下划实线的三处，每项操作5分，共15分）1．肝糖原的提取与鉴定操作中，肝匀浆上清液中加5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2．肝糖原定量测定中，肝组织消化液沸水浴后全部转入100 ml容量瓶，加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。 3．肝糖原定量测定中，加蒽酮溶液后的混匀，可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。因蒽酮溶液（浓硫酸配制）比重大于样品水溶液很多，一加入便沉于管

免疫检测方法

免疫学检测方法 免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。随着学科间的相互渗透，免疫学涉及的范围不断扩大，新的免疫学检测方法层出不穷。免疫学方法的应用范围亦在日益扩大，不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法，也为众多学科的研究提供了方便。本章将从抗原、抗体、免疫细胞和细胞因子检测等方面概括介绍试验的基本类型、原理和主要用途，并对分子生物学技术(分子杂交、转基因、多聚酶链反应)在免疫学领域的应用作一简要介绍。 第一节检测抗原抗体的体外方法 抗原与相应抗体相遇可发生特异性结合，并在外界条件的影响下呈现某种反应现象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗体)检测未知抗体(或抗原)。试验所采用的抗体常存在于血清中，因此又称之为血清学反应(serological reaction)。 一、抗原抗体反应的特点 (一)抗原抗体结合的特异性 抗原借助表面的抗原决定簇与抗体分子超变区在空间构型上的互补，发生特异性结合。同一抗原分子可具有多种不同的抗原决定簇，若两种不同的抗原分子具有一个或多个相同的抗原决定簇，则与抗体反应时可出现交叉反应(cross reaction)。 (二)抗原抗体结合的可逆性 抗原抗体结合除以空间构型互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的非共价方式结合，结合后形成的复合物在一定条件下可发生解离，回复抗原抗体的游离状态。解离后的抗原和抗体仍保持原有的性质。抗原抗体复合物解离度在很大程度上取决于特异性抗体超变区与相应抗原决定簇三维空间构型的互补程度，互补程度越高，分子间距越小，作用力越大，两者结合越牢固，不易解离；反之，则容易发生解离。 (三)抗原抗体结合的比例性与结合物的可见性 抗原与抗体的结合能否出现肉眼可见的反应，取决于两者的比例。若比例合适，则可形成大的抗原抗体结合物，出现肉眼可见反应现象；反之，虽能形成结合物，但体积小，肉眼不可见。由于这种分子比例的差异，分别形成了三种区带现象。等价带表示抗原与抗体比例最合适，形成大而多的结合物，此时在反应体系中测不出或有极少游离的抗原或抗体；抗体过剩带(前带)和抗原过剩带(后带)皆表示抗原与抗体的比例不合适，所形成的结合物少且小，其反应体系中存在着游离的抗原或抗体。抗原抗体分子的比例与结合物大小的关系如图18.1所示。小分子可溶性抗原，因其表面积大，容易导致后带现象；而细胞等颗粒性抗原，在与抗体反应时则易出现前带现象。因此在抗原抗体检测中，为能得到肉眼可见的反应，在了解抗原的物理性状之后，对抗原或抗体进行稀释，以调整二者的比例。

肝糖原提取和测定(严选内容)

肝糖原的提取和鉴定 一、实验目的 1.了解肝糖原的性质并掌握其提取的方法。 2.熟悉肝糖原的鉴定方法。 二、实验原理 肝糖原是糖在体内的重要储存形式之一。其储存量虽然不多，但在代谢过程中，它是动物体内糖的重要的来源之一。肝糖原的合成或分解对血糖浓度的调节起着重要的作用。 糖原属于高分子糖类化合物，微溶于水，无还原性，与碘作用变成红棕色。提取肝糖原是利用三氯醋酸破坏肝组织中的酶，且肝组织中的蛋白质也被三氯醋酸所沉淀，而糖原仍留在溶液中。过滤除去沉淀，滤液中的肝糖原可借加入的乙醇而沉淀。将沉淀的糖原溶于水，即可得到糖原溶液。 糖原与碘作用呈红棕色。糖原被酸水解为葡萄糖，可用班氏试剂检验。利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定组织中糖原的存在。 三、实验材料、仪器和试剂 1. 材料： 小白鼠等动物新鲜肝脏组织 2. 仪器： （1）天平（2）研钵（3）离心机 （4）离心管（5）恒温水浴锅（6）试管

（7）广泛试纸（8）移液管（9）洗耳球 （10）电炉（11）量筒（12）滤纸 3．试剂： （1）10%的三氯醋酸溶液 （2）5%的三氯醋酸溶液 （3）95%乙醇溶液 （4）浓盐酸 （5）20%的NaOH溶液 （6）碘液：(取碘1g、碘化钾2g溶于500mL蒸馏水中) （7）班氏试剂：(将硫酸铜17.3g溶于100mL温蒸馏水中；取柠檬酸钠173g和无水碳酸钠100g溶于700mL温蒸馏水中，待冷却后，将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠和碳酸钠混合液中，最后用蒸馏水稀释至1000mL) 四、操作步骤 (一)肝糖原的提取 （1）肝匀浆的制备：迅速处死小白鼠，立即取出肝脏，用滤纸吸取附着的血液。称取约1g肝脏置研钵中，加入少许石英砂及10%的三氯醋酸溶液1mL，研磨至呈乳状后再加入5%的三氯醋酸2mL，继续研磨，直至肝脏组织已充分磨成均匀糜浆。 （2）提取糖原：将制备好的肝匀浆以3000r/min的转速离心10min。取上清液于另一离心管并量取体积，加入等体积的95%乙醇溶液，混

肝糖原的提取、鉴定与定量-第七实验室(一类特选)

南方医科大学生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别：

生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称Folin-酚试剂法测定蛋白质含量 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。 一、实验目的 1、学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法； 2、学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法； 3、学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式； 4、正确掌握使用离心机的方法步骤； 5、熟练运用溶液混匀的各种方法； 6、正确掌握溶液转移的操作； 7、正确掌握使用分光光度计的方法步骤 二、实验原理 实验1肝糖原的提取与鉴定 糖原是生物的主要储能物质之一，主要储存与肝细胞中，采用研磨匀浆等方法可以使肝细胞破碎。肝细胞破碎，细胞内容物流出。低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝

组织中的酶并且使蛋白质沉淀，糖原则能够稳定地保存在上清液中，从而达到分离糖原与蛋白质等其他成分的目的。糖原不溶于乙醇但可溶于热水，故可以先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。此外，糖原还可以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可以判定肝组织中糖原的存在。糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min后会出现砖红色沉淀。 CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)2↓ 2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH +氧化型葡萄糖+ H2O 2CuOH = H20 + Cu2O↓ (红色) Cu(OH)2 ==== H2O + CuO↓ (黑色) 实验2肝糖原定量测定 糖原在浓碱溶液中非常稳定，故可将肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，保留肝糖原。糖原可以被浓酸水解成葡萄糖，而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成5-羟甲基呋喃甲醛，该化合物与蒽酮脱水缩合可以生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10-100μg，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。利用该反应原理处理标准葡萄糖溶液，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。 三、材料与方法：以流程图示意 1、实验材料 （1）肝糖原的提取与鉴定 样品：1.50g的鸡肝 试剂：5%三氯醋酸溶液、95%乙醇、蒸馏水、浓HCl溶液、50%NaOH溶液、碘试剂和

湖北省孝感市第一中学2020-2021学年高一上学期期中考试生物试卷含答案

高一生物试卷 考试时间：2020年11月17日下午2:30—3:30本试卷满分100分，考试时间60分钟 ★祝考试顺利★ 注意事项： 1．答题前，先将自己的姓名、准考证号填写在试卷和答题卡上，并将准考证条形码粘贴在答题卡上的指定位置。 2．选择题的作答：每小题选出答案后，用2B铅笔把答题卡对应题目的答案标号涂黑。写在试卷、草稿纸和答题卡上的非答题区域均无效。 3．非选择题的作答：用黑色签字笔直接答在答题卡上对应的答题区域内。写在试卷、草稿纸和答题卡上的非答题区域均无效。 4．考试结束后，请将本试卷和答题卡一并上交。 一、选择题（共15小题，每小题2分，共30分。每小题只有一个选项符合题目要求）1．细胞学说和生物进化论作为生物学大厦的基石，被恩格斯列入19世纪自然科学三大发现中，下面关于细胞学说的叙述，正确的是（） A．施莱登和施旺发现了细胞并创立了细胞学说 B．细胞学说认为一切生物都由细胞发育而来，并由细胞和细胞产物所构成 C．“细胞通过分裂产生新细胞”是对细胞学说的重要补充 D．细胞学说从细胞水平阐明了生物界的统一性和差异性 2．“黄鹤西楼月，长江万里情”，长江作为世界上第三大河流，拥有丰富的生物资源。下列说法不正确的是（） A．长江中所有的长江江豚构成一个种群B．长江构成一个生态系统 C．长江中的芦苇没有系统这一层次D．长江中所有的鱼构成一个群落3．2019年底，新冠病毒（遗传物质为RNA）肆虐全球，给人们的生活带来了巨大的影响。 新冠病毒和肺炎双球菌均可引发肺炎，但二者结构不同。下列叙述中正确的是（）A．新冠病毒和肺炎双球菌都可以在人工配制的培养基上生存 B．新冠病毒和肺炎双球菌都有唯一的细胞器——核糖体 C．新冠病毒和肺炎双球菌都具有RNA D．新冠病毒和肺炎双球菌都属于生命系统的结构层次 4．制作花生子叶临时切片检测脂肪时，需要使用显微镜观察子叶细胞的着色情况。下列叙述正确的是（） A．若显微镜目镜和物镜的放大倍数分别为“10×”和“40×”，观察的对象直径放大400倍B．若在低倍镜下观察到脂肪颗粒不在视野中央，而在左上角，应先将切片向右下角移动，再转动转换器换高倍镜 C．换用高倍镜后，发现物像较暗且不清晰，可通过反光镜、光圈和粗准焦螺旋进行调节D．脂肪颗粒被苏丹Ⅲ染液染色呈红色 5．玉米是我国重要的粮食作物，下列关于玉米的说法中错误的是（）

肝糖原的提取鉴定与定量肝糖原的提取与鉴定

肝糖原的提取鉴定与定量肝糖原的提取与鉴定生物化学实验报告 姓名： 学号： 3130010071 专业年级： xx级临床医学 组别：第2实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称肝糖原的提取、鉴定、分离实验日期 xx-12-25 合作者评分 陈海玲 签名 实验地点

第2实验室 指导老师朱利娜 批改日期 一、实验目的 1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4、熟练运用溶液混匀的各种方法。 5、正确掌握溶液转移的操作。 6、正确操作使用分光光度计。 二、实验原理 ●肝糖原的提取

糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。●糖原的鉴定 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。 CuSO 4 + 2NaOH = Na2SO 4 + Cu(OH)2Cu(OH)2 + C6H 12O 6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O 2CuOH = H20 + Cu2红色) Cu(OH)2 ==== H2黑色) ●肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在10—100mg 范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。

免疫检测

免疫检测技术的研究进展 摘要：本文综述了近几年来出现的免疫检测技术的新方法，简要介绍了它们的原理、特点及其应用，并做出相应的比较。并论述了免疫检测技术在食品检验中应用的主要领域。免疫检测技术是基于抗体抗原反应的原理对待测物进行定量定性分析的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、简便等优点，是现代生命科学的重要研究手段，在生物分析检测领域有着广泛的应用前景。 关键词：免疫检测技术；分子印迹技术；流动注射免疫；免疫传感器；脂质体；MIA；应用 美国物理学家Yallow和Berson于1959年利用放射免疫检测法(Radioimmunoassay，RIA)检测血清中的胰岛素，从而将免疫检测方法引入化学分析界。从此，免疫检测技术被广泛应用于生物分析检测。 免疫检测技术是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定量或定性分析的检测方法。其基本原理是抗体和抗原之间的相互作用，其中抗原和抗体之间反应的特异性和灵敏性是免疫检测技术的关键。目前应用最广的免疫检测技术主要有：酶联免疫吸附试验(enzyme—linkedim—munosorbentassay，ELISA)，免疫荧光技术(im—munofIuorescenceassay，IFA)，免疫凝集试验(im—muneagglutination，IA)和免疫沉淀(immunopre—cipitate，IP)等，它们在生物领域发挥了极其重要的作用。 随着样品检测项目的不断增加，以及对快速、简单的原位检测的需求，促进了免疫检测技术的发展，出现了分子印迹技术(molecularimprintingtechnique)、流动注射免疫检测(flow injectionim— munoassay)、脂质体免疫检测(1iposomeimmunoas—say)、免疫传感器(immunosensor)，以及多组分免疫检测(multicomponentimmunoassay)等新免疫检测技术。 1 新型免疫检测技术简介 1．1分子印迹技术 分子印迹技术是最近10多年来发展起来的一种交叉技术，是模拟抗体抗原相互作用的具有特异选择性识别位点性质的技术。它利用化学手段合成一种高分子聚合物——分子印迹聚合物(mo—lecularlyimprintingpolymer，MIP)。MIP能够特异性吸附作为印迹分子的待测物，在免疫分析中可以取代生物抗体。与生物抗体比较，MIP具有稳定性好、制备周期短、费用低、易于保存和可以在复杂 环境中应用等优势。该技术是传统意义的蛋白质类抗原抗体免疫检测技术的延伸。 分子印迹技术研究在国外得到较高重视，特别是在生物药物检测。利用分子印迹技术第一次合成恩氟沙星的MIP，显示出与结构相似物环丙沙星的高度交叉反应性，能选择性识别混合抗生素中的喹诺酮类，并应用于清除复杂样品中的喹诺酮类的吸附剂；应用合成的吲哚美辛MIP作为识别物质，以及可溶性锰(1V)一甲醛一吲哚美辛的检测体系，建立了新的吲哚美辛检测的分子印迹化学发光方法，检测极限为4×10一g／mL。分子印迹技术尚存在一些缺点，例如水溶液或极性溶剂中进行分子印迹和识别仍是一大难题。该技术目前处于研究阶段，主要是以有机小分子化合物为检测对象。小分子化合物属于半抗原，制备相应的免疫检测用抗体，需要与大分子蛋白质连接，分子印迹技术的应用则免除了这方面的考虑。 1．2流动注射免疫检测 流动注射免疫分析技术(FIIA)是将流动注射分析与免疫分析结合的一种新的免疫检测技术。目前已在药物分析、环境监测及农药残留检测等生物检测方面得到了广泛应用。流动注射免疫分析一般采用异相免疫反应模式，使用固相载体固定抗原或者抗体，从而使游离部分从免疫反应结合物中分离。关于流动注射免疫分析的研究较多。钱昌顺L1检

肝糖原的提取、鉴定与定量实验实验报告

生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别：

实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量实验 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1．掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2．了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3．正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4．熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5．正确掌握溶液转移的操作。 6．正确操作使用分光光度计。 二、实验原理 1、肝糖原的提取与鉴定 糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。 糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中, 依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。 2、肝糖原定量测定

糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在(10~100)g范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先臵于浓碱中加热,以破坏其它成分,而保留肝糖原。 三、材料与方法：以流程图示意 1、材料 (1)样品:鸡肝(2)试剂:95%乙醇、5%(W/V)三氯乙酸、浓盐酸、12.5mol/L(50%)NaOH溶液、碘试剂、班氏试剂、5.35mol/L(30%)KOH溶液、标准葡萄糖液(50mg/L)、蒽酮显色剂(3)仪器和器材:普通离心机、室温-100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管(2ml、5ml)、1000μl微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板 2、操作方法 （1）肝糖原提取与鉴定 鸡肝约1.5 g，剪碎 COOH 1 ml ＋5%CCl 3 研磨至乳状 COOH 3 ml ＋5%CCl 3 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3分钟（4000 r / min） 沉淀（弃去）上清（取约3 ml）

进食状态对糖尿病大鼠血糖及肝糖原的影响

进食状态对糖尿病大鼠血糖及肝糖原的影响 实验目的： 1.熟悉常用的糖尿病大鼠造模方法 2.掌握血糖仪的使用方法 3.掌握组织样品的制备方法 4.了解血清胰岛素水平检测方法 5.熟悉肝糖原提取、鉴定的方法与原理 6.通过本实验探讨临床糖尿病患者不同进食状态对血糖的影响 实验用品： 一、器材： 普通离心机，酶标仪，恒温水浴箱，分光光度计，0.01g电子天平、0.1g电子天平，血糖仪，棉签，干棉球，剪刀2把，镊子2把，研钵2个，白磁盘，试管架，拆条酶标板，吸水纸，5ml离心管，试管，烧杯，漏斗，玻璃棒，刻度吸量管，EP管，滤纸，1000μl微量可调取液器，50ml容量瓶3个，注射器，白瓷反应板，塑料手套，布手套，抹布，记号笔 二、试剂： 5%三氯乙酸溶液，蒸馏水，生理盐水，碘试剂，95％乙醇，标准葡萄糖溶液（50mg/L），98%浓硫酸，30%KOH溶液，0.2%蒽酮显色剂，柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（PH4.4），1%链脲佐菌素（STZ）溶液，10%水合氯醛溶液，大鼠胰岛素（INF）ELISA检测试剂盒 实验步骤： 一、标记： 二、造模：

A、抓取大鼠并称重。（结果见表一） B、大鼠先禁食12小时后（此部分为老师帮忙完成），进行血糖检测。然后抓取大鼠单次腹腔注射按1%STZ溶液（65mg/Kg），注射后一小时，给予自由饮食、饮水。 具体抓取大鼠方法：用右手将鼠尾抓住提起，放在较粗糙的台面或鼠笼上，抓住鼠尾向后轻拉，左手紧抓两耳和头颈部皮肤，余下三指紧捏鼠背部皮肤，如果大鼠后肢挣扎厉害，可将鼠尾放在小指和无名指之间夹住。 C、以后每天安排人员进去喂养动物，记录饮食量和更换垫料。 D、待72小时后大鼠尾静脉采血再次检测血糖，以餐后血糖≥16.7mmol/L为大鼠糖尿病模型造模成功的判定标准。 血糖检测具体步骤：将血糖检测专用试纸插入血糖分析仪中，待血糖仪显示屏上显示滴血标记时，方可使用。用剪刀剪断大鼠尾尖约＜0.5cm，挤出的第一滴血用棉球擦掉不要，第二滴血滴在试纸上。待血糖仪显示屏上显示稳定的数值后记录。（血糖检测结果见表二） 三、麻醉： 大鼠称量后，通过计算每只大鼠所需麻醉量（0.3ml/100g），抓取大鼠，腹腔注射。 四、血清胰岛素水平检测： 麻醉后摘除大鼠眼球，取血约1ml于EP管中，静置一小时以上，由于实验顺序要求先进行接下来的肝糖原检测并鉴定实验，所以静置后将EP管放入冰箱内冷藏一天，第二天进行实验时，将EP管对称放入离心机中，进行2000r/min离心15分钟，分离血清100μl。采用大鼠胰岛素ELISA检测试剂盒，严格按照试剂盒步骤进行血清胰岛素水平检测。 板37°C温育30分钟。 3．洗涤5次，每孔加入酶标试剂50μl，37°C温育30分钟。 4．洗涤5次，每孔加入显色液A,B各50μl，37°C避光显色10分钟。

肝糖原的提取、鉴定与定量实验报告记录

肝糖原的提取、鉴定与定量实验报告记录

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生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。 一、实验目的 1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4、熟练运用溶液混匀的各种方法。 5、正确掌握溶液转移的操作。 6、正确操作使用分光光度计。 二、实验原理 1、肝糖原的提取与鉴定 糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，

依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。 CuSO4十2NaOH = Na2SO4+Cu(OH)2↓ 2Cu(OH)2十C6H12O6 = 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O 2CuOH = Cu2O↓(红色)+H2O Cu(OH)2= CuO↓(黑色)+H2O 2、肝糖原定量测定 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在(10~100)g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先臵于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。 三、材料与方法：以流程图示意 1、材料： （1）样品：鸡肝 （2）试剂：95%乙醇、5%（W/V）三氯乙酸、浓盐酸、12.5mol/L（50%）NaOH溶液、碘试剂、班氏试剂、5.35mol/L（30%）KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）、蒽酮显色剂 （3）仪器和器材：普通离心机、室温-100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管（2ml、5ml）、1000μl微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板 2、方法：

肝糖原的提取与鉴定实验报告

肝糖原的提取与鉴定实验报告 实验六肝糖原的提取 实验六肝糖原的提取、鉴定与定量 （生物化学实验操作考核卷） 姓名，学号，专业，级班组，月日 目的要求: 1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4. 熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5. 正确掌握溶液转移的操作。 6. 正确操作使用分光光度计。 实验原理: 糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶 且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95, 乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。

CuSO 什 2NaOH ? Na2 SO4+Cu(OH)2? 2Cu(OH)2十 C6H12O6 ? 2CuO 十氧化型葡萄糖 +H2O 2CuOH ? Cu2O?红色)+H2O Cu(OH) CuO?(黑色)+H2O 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生 物—— 5- 羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质 在620nm 处有最大吸收。糖含量在（10?100）?g 范围内，溶液颜色的深浅与 可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比 色，通过标准 对照法 （直接比较法 ）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液 中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留 肝糖原。 实验材料 : （ 一 ） 仪器 1. 普通离心机，室温？100?恒温水浴箱（X 2） , 722型分光光度计，精度为 10mg 级电 子天平（X 1） 试管架（X 1），10mL 离心管（X 2），（100 X 15）mm 试管（X 6） 刻度吸量管（2mL X 1，5 mL X 2），1000^L 微量可调取液器（X 1） 5. 100mL 容量瓶(X 1) 6. 白瓷反应板 （X 1） （ 二） 实验样品和试剂 1. 鸡肝。 2. 95, 乙醇。 3. 0.31mol/L(5,) 三氯醋酸溶液 :称 2. 剪刀（X 1），镊子（X 1），研钵（X 1） 3. 4.

肝糖原的提取、鉴定与定量-第七实验室

生物化学实验报告 姓名: 学 号: 专业 年级: 组另I」:

生物化学与分子生物学实验教学中心 指导老师 格式要求： 正文请统一用： 小四号，宋体， 1.5 倍行距；数字、英文用 Times New Roman ；标题用： 四号，黑体，加粗 。 需强调的地方请用 蓝颜色标出。 不得 出 现多行、多页空白现象。 一、实验目的 1、学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法； 2、学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法； 3、学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式； 4、正确掌握使用离心机的方法步骤； 5、熟练运用溶液混匀的各种方法； 6、正确掌握溶液转移的操作； 7、正确掌握使用分光光度计的方法步骤 二、实验原理 实验 1 肝糖原的提取与鉴定 糖原是生物的主要储能物质之一，主要储存与肝细胞中，采用研磨匀浆等方法可以使 肝细胞破碎。肝细胞破碎，细胞内容物流出。低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破 坏肝组织中的酶并且使蛋白质沉淀，糖原则能够稳定地保存在上清液中，从而达到分 离糖原与蛋白质等其他成分的目的。糖原不溶于乙醇但可溶于热水，故可以先用 乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这 是糖原中葡萄 实验名称 Folin- 酚试剂法测定蛋白质含 量 实验日期 实验地点 合作者 评分 教师签名 批改日期 95%

糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。此外，糖原还可以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可以判定肝组织中糖原的存在。糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min 后会出现砖红色沉淀。 CuS04 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(0H)2 2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH +氧化型葡萄糖+ H2O 2CuOH = H20 + Cu20；(红色) Cu(0H)2 ==== H20 + CuOj (黑色) 实验2 肝糖原定量测定 糖原在浓碱溶液中非常稳定，故可将肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，保留肝糖原。糖原可以被浓酸水解成葡萄糖，而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成5-羟甲基呋喃甲醛，该化合物与蒽酮脱水缩合可以生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在10-100ug溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。利用该反应原理处理标准葡萄糖溶液，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。 三、材料与方法：以流程图示意 1、实验材料 (1)肝糖原的提取与鉴定 样品：1.50g的鸡肝 试剂：5%三氯醋酸溶液、95%乙醇、蒸馏水、浓HCl 溶液、50%NaOH 溶液、碘试剂和班氏试剂 仪器和器材：离心机、天平、试管、试管架、研钵、玻璃棒、室温-100 C恒温水浴箱、