用16S-rDNA方法鉴定细菌种属

用16S-rDNA方法鉴定细菌种属

用16S rDNA方法鉴定细菌种属

一、实验目的

1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；

2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。

二、实验原理

细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。

16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。

16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将

16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：

细菌基因组的提取：

PCR 的基本原理 ：

PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；

纯化DNA 分离出DNA

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，

按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板

DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种

新链又可成为下次循环的模板。

二、操作步骤

1、细菌基因组DNA提取；

2、PCR扩增；

3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；

4、扩增片段回收；

5、DNA片段测序。

三、结果处理与分析

在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g，，则凝胶为400mg，因此加入的Binding Buffer为1200μl。

我们小组选用B1 16S sequence，以下为制作进化树过程：

1、根据B1 16S 基因序列，到NCBI 上比对，确定其种属

（1）NCBI 主页（https://www.sodocs.net/doc/0e4962746.html,/）依次

点击进入BLAST

（2）选择nucleotide BLAST

处点复选按钮others，最后点BLAST

16S_rDNA鉴定细菌的方法

16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高压灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 1.410×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。 13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等） 14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。 15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避

几种真菌的分离与鉴定教学文案

常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。

16 S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用

16 S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用* 刘文强1，贾玉萍2，赵宏坤3 (1.聊城大学农学院，山东聊城252059；2.山东大学生命科学学院，山东济南252100；3.山东农 业大学动物科技学院，山东泰安271018) 摘要：细菌的16 S 核糖体RNA(ribosome RNA，rRNA)以其在进化上的特征性序列，现已被广泛用于细菌分类和鉴定的分子指标。其具体操作是，以聚合酶链式反应(PCR)分离细菌样本中的16 S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得其序列信息，再与16 S rRNA 数据库中的序列数据进行比较，确定其在进化中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。文章综述了16 S rRNA作为微生物系统分子分类鉴定的理论基础和方法，以及在细菌分类鉴定中的应用。 关键词：16 S rRNA；细菌；鉴定；分类 传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。Cai H Y等[1]认为，rRNA基因序列己成为一个分子指标，可以广泛地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究。目前，大量已知微生物的DNA都被测定并输入国际基因数据库，成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统，从而可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的。随着微生物核糖体数据库的日益完善，该技术已应用于海洋、湖泊和土壤、大气微生物菌群和病原微生物等环境微生物多样性的分析[2]。 116 S rRNA作为细菌分子鉴定的依据

痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国

宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分

细菌鉴定及检测方法

细菌鉴定及检测方法 一、启动条件 1、目的样出现坏包，若批次相同，取表现性状相同的任意一包进行细菌初步鉴 定。若批次不同则分别进行细菌初步鉴定。 2、随机样出现坏包，必须进行细菌初步鉴定。 二、胀包 1、记录批次。 2、及时用72%的酒精对样品的外表进行消毒，尽量不损坏封合待以后检查。在 超净台内以无菌操作剪开包装，再避开横竖封处剪开一个圆形或三角形。3、对样品进行微生物划线培养。 3.1采用普通营养琼脂培养基做细菌的划线培养36±1℃、48小时。 3.2分别吸取10毫升样品到两个无菌的小试管中，，分别在80和100℃的水 浴中加热10分钟，冷却用营养琼脂分别做芽孢（36±1℃、72小时） 和耐热芽孢（55±1℃、72小时）的划线培养。 3.3采用普通营养琼脂培养基或快速检测培养基做嗜冷菌/低温菌的划线培 养（4—6℃ 10天或21±0.5℃ 25小时）。 3.4 必须用高盐察氏或虎红琼脂培养基做霉菌和酵母菌的划线培养 （25—28℃ 5--7天） 4、对样品做感官检测。 5、用PH计检测样品的PH值。 6、将样品倒掉，进行包装密封性检查，并进行记录。 7、记录菌落特征。 8、选区不同形态的单一菌落进行坚定。 8.1 革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴定： 8.1.1涂片、革兰氏染色、镜检。或结晶紫染色、镜检、氢氧化钾拉 丝试验。 8.1.2革兰氏染色、结晶紫染色方法见《微生物检测》 8.1.3氢氧化钾拉丝试验 在微生物载物片上滴一滴3%氢氧化钾，用接种针从培养皿上的

菌落中挑取微生物，放在氢氧化钾溶液中用力搅拌。7—10秒后，抬 起针头，观察针头和玻片之间是否有丝状物，如果15—20 秒后二者 之间无丝状物，停止搅拌。 判定：无丝状物阳性；有丝状物阴性。 8.2 过氧化氢酶试验（或过氧化氢酶试纸）（产气试验）： 试剂：10%过氧化氢溶液 步骤：在微生物载物片上滴一滴10%过氧化氢，用接种针从培养皿上的菌落中挑取微生物，放在过氧化氢溶液中看是否有气体产生。 判定：产气阳性；不产气阴性。 8.3氧化酶试验 试剂：含1%四甲基双噻二胺和99%的乙醇溶液。 步骤：用上述试剂将一张滤纸浸透（或直接采用氧化酶试纸条），然后进行细菌培养物的涂片试验。 判定：30秒内使显色物质变为深蓝色阳性，不变色阴性。 三、酸包 1、发现酸包后，及时将料液快速转入无菌瓶中。 2、记录批次 3、其它项目检测同胀包。

细菌的分类鉴定及进化地位分析12045109牛天鸣

天津科技大学 《微生物学》结课论文 题目：细菌的分类鉴定及进化地位分析 ） 学院：生物工程学院 专业：制药工程（生物制药） 姓名：牛天鸣 学号： 指导老师：李玉 '

【摘要】 细菌的分类鉴定与细菌的研究和应用有重要的影响。准确地鉴定细菌类别，根据其菌种种类不同，分别针对肠杆菌、阳性球菌、非发酵菌等菌种设计不同药敏板条的抗生素组合，可以指导临床应用用药。目前，细菌分类鉴定方法主要包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类。细菌的进化对于深入认识物种分化、生境适应、毒力进化、耐药性产生芡延等表型进化过程有着重要意义。 关键词：细菌；分类；鉴定；进化。 一、细菌的分类鉴定 目前，细菌分类鉴定的研究已经得到了长足的发展和进步，鉴定依据不再仅局限于形态、生理生化和生态学等表型特征，而是采用不同学科的现代技术和方法从细胞水平、分子水平寻找新的鉴定依据。现在，通常把细菌分类鉴定的方法有4种：传统分类法、2细菌的数值分类和自动化鉴定、化学分类法、分子遗传学分类鉴定法。 1传统分类法 传统分类法又称为经典分类法，是根据微生物的形态特征、培养特征及生理生化特征等表型分类学特征进行分类鉴定的方法[1]。一般传统分类指标常用于初步分类。现今存在于《伯杰氏细菌分类手册》的细菌分类单位名称大都建立在传统分类基础上[2]。由于细菌个体小而简单，仅依据简单的指标不足以区分它们，这就需要增加生理生化特征甚至其他非形态特征来进一步比较和区分。传统分类法中的形态特征常用作分类系统中科以上单元的划分，而形态结构特征结合生理生化特性可以用于科以下单元的分类。随着分子生物学技术的迅猛发展，传统分类方法受到了巨大的冲击，但仍是多相分类学的研究基础。 · 传统的分类鉴定方法主要依赖于表型分析、个体形态学观察，主要观察菌落在其适合的培养基上的生长状况: 细菌在固体培养基上的生长形态、大小、颜色是否均匀一致，菌落个体表面及边缘的生长状况; 在液体培养基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜状况; 半固体上穿刺接种后，观察细菌生长状态。在鉴别培养基上培养，观察结果是否跟预期结果相同。形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要的意义，生化试验是根据细菌培养过程中不同菌种所产生的新陈代谢产物各异，表现出不同的生长特性[3]。通

细菌鉴定和耐药性检测方法的发展

细菌鉴定和耐药性检测对于指导临床精确用药和及时治疗患者具有重要意义。目前临床上进行细菌鉴定和耐药检测仍以表型检测方法为主，主要包括：传统手工鉴定与药敏实验方法、自动化药敏鉴定系统。传统方法虽然能够满足临床的部分需要，但这些方法仍然存在一些缺点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术在临床检验领域的应用，近年来发展了一系列快速细菌鉴定和（或）耐药检测技术，例如基于ＰＣＲ技术和ＤＮＡ探针杂交以及生物芯片技术等，这类方法的特点是快速而准确，一般在几个小时之内就可以得到检测结果。 １传统方法在细菌鉴定和耐药性检测中的应用临床手工细菌鉴定和细菌药敏实验，是临床上尤其在中小医院应用最广泛的方法。细菌鉴定主要是根据细菌对生化物质的代谢特点进行，药敏方法包括纸片扩散法（常规实验室使用较普遍）和抗生素稀释法（ＭＩＣ法）等。这些方法的特点是方便、易操作，成本低，而且灵活性强，测定的细菌和药物可灵活选择。其缺点是操作烦琐、经验依赖性强、报告结果慢，不能完全适应临床治疗的需要。 使用自动化药敏和鉴定系统，是临床微生物学实验包括体外药物敏感实验的发展方向。最有代表性的是ＶＩＴＥＫ－ＡＭＳ微生物自动分析系统，可同时完成细菌鉴定和药敏实验。该套系统的检测卡片分为１４种，每一种鉴定卡片含有２５种以上的生化反应指标，基本与常规检测鉴定相同。此方法的优点是简便、快速、鉴定范围广，受人为的影响小，可靠性高。但它仍需要细菌培养的步骤，准确性也受到一定限制，同时其耗材价格较为昂贵。使用这类仪器的主要是三级甲等以上的大型医院。在细菌快速鉴定方面最有代表性的是ｍｉｎｉ－Ｖｉｄａｓ全自动免疫分析仪，其原理是应用细菌的特异性抗体对细菌进行鉴定，以荧光为标记，进行自动化检测。其最大优点是速度快，可以在４０ｍｉｎ内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。但检测指标过少，主要限于这几种菌，而且也不能进行药敏实验。 目前，微生物鉴定技术中除了少数医院使用半自动、全自动的细菌鉴定仪外，大多数医院主要还是使用常规鉴定技术进行细菌菌种的鉴定。 ２分子生物学技术在细菌种属鉴定中的应用采用与系统发育学相关的基因实现对细菌血清型的分型，越来越成为一种趋势。目前，利用基因检测方法对细菌进行种属鉴定所涉及的基因包括细菌１６ｓｒＲＮＡ基因或５ＳｒＲＮＡ序列、ＨＳＰ基因家族、ｇｙｒＢ基因以及细菌特异基因等。 ２．１利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类依据的原因利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列对细菌进行菌种鉴定在目前应用较多，也越来越被临床所接受。在细菌分类学著作中，如《伯杰氏系统细菌学手册》，越来越倾向于选择１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类的依据。主要原因有下面几点： ２．１．１ｒＲＮＡ存在于所有生物中，在生物进化过程中其功能保持不变。１６ＳｒＲＮＡ基因普遍存在于原核生物中，在真核生物中其同源分子是１８ＳｒＲＮＡ。２．１．２１６ＳｒＲＮＡ最能反映细菌间的亲缘关系。在１６ＳｒＲＮＡ分子中，既含有高度保守的序列，又含 细菌鉴定和耐药性检测方法的发展文章编号：１６７２－３３８４（２００６）－０４－００３９－０６ 【作者】杨华为蒋迪王璨赵传赞高华方 生物芯片北京国家工程研究中心（北京１０２２０６） 【中图分类号】Ｒ９１５【文献标识码】Ｂ

细菌鉴定方法

1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》（1999），中科院微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》（1978）的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种，参照了蔡妙英等译《芽孢杆菌属》（1980）的方法。 （1）革兰氏染色：挑选少许菌苔，涂布于干净玻片的蒸馏水中，风干固定，结晶紫染色（结晶紫2g，草酸铵0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化钾2g，水300 ml）作用1min，水洗，脱色，用番红O 液染3min，水洗，风干，光学显微镜观察。 （2）鞭毛染色：将16~24h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液（丹宁酸5g，FeCl3 1.5g，15%福尔马林2ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100 ml）染6~10min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3溶液）加热复染30min，蒸馏水冲洗，干燥，镜检，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 （3）运动性：半固体琼脂穿刺法，将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中，其中含0.3~0.6%的琼脂。适温培养，运动性可用透射光目测，如生长菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表明鉴定菌无运动性；如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示鉴定菌有运动性。 （4）芽孢染色：孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染20 min，水冲洗后在用0.5%番红O复染20~30s，水洗，吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。 （5）抗酸染色：常规涂片，石碳酸复红（10%碱性复红乙醇饱和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加热染色5 min，倾去染液用酸性乙醇脱色，吕氏美蓝（2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）复染2min，水洗，吸干，镜检。 （6）荚膜染色：在载片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min，加0.5%番红O液数滴滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30s，然后倾去染液，立即吸干，镜检。 1.2.2 培养及生理特性 （1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养1~2d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落和培养基的颜色等。 （2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每处理2管，目测生长情况。

细菌分类鉴定方法的研究进展

细菌分类鉴定方法的研究进展 目录 细菌分类鉴定方法的研究进展 (2) 摘要 (2) ABSTRATC (3) 1、引言 (4) 1.1细菌分类鉴定 (4) 1.1.1 细菌常规鉴定方法 (4) 1.1.2细菌的数值分类和自动化鉴定 (4) 1.1.3化学分类鉴定法 (4) 1.1.4分子遗传学分类鉴定法 (4) 1.2细菌分类鉴定方法的前景 (5) 细菌的鉴定方法的介绍与总结 (5) 1、细菌常规鉴定方法 (5) 1. 1 免疫诊断技术 (5) 1. 1. 1 凝集试验 (5) 1. 1. 2 免疫酶技术 (5) 1.1. 3 免疫荧光技术 (5) 1. 1. 4 放射免疫测定技术 (6) 1. 1. 5 免疫胶体金标记技术 (6) 1. 2 蛋白质图谱分析 (6) 2、细菌的数值分类和自动化鉴定 (6) 3、化学分类鉴定法 (7) 3.1 磷脂脂肪酸分析技术（PLFA）[6] (7) 3．2 高效液相色谱（HPLC）[7] (7) 3.3 气相色谱（GC）[7] (7) 4、分子遗传学分类鉴定法 (7) 4. 1 细菌染色体DNA G+ C mol %含量测定 (7) 4. 2 核酸杂交技术 (7) 4. 3 限制性核酸内切酶分析法 (7) 4. 4 质粒图谱分析法 (7) 4. 5 脉冲场凝胶电泳分析法 (8) 4. 6 PCR技术 (8)

4. 7 16SrRNA 序列和16S～23SrRNA 间区序列分析法 (8) 4. 8 微生物全基因组测序 (8) 6、参考文献 (9) 细菌分类鉴定方法的研究进展 摘要 细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类,分成4个水平:细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。表型鉴定法是对前3个水平的鉴定,包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。分子遗传学鉴定法[1]是核酸水平的鉴定,对细菌染色体或质粒DNA 进行分析,核酸杂交、PCR 技术、16SrRNA 和16 ～23SrRNA 序列分析、全基因组测序等,此类方法使细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基因型鉴定。本文主要来介绍各种分类方法以及每种方法的优缺点。 关键词：细菌分类鉴定表型鉴定分子遗传学鉴定

细菌鉴定流程

细菌鉴定流程： 取一环标本四区划线接种平板（如为粪便标本接种SS,MAC平板） 培养18-24小时后取一区菌落革兰染色，报告为革兰阳性球菌/革兰阴性球菌/革兰阳性杆菌/革兰阴性杆菌，注意区分细菌和真菌 一般情况下不会给你们做革兰阳性杆菌和革兰阴性球菌 革兰阳性球菌鉴定流程： 先做3%触酶试验：阳性的为葡萄球菌或微球菌，阴性为链球菌或肠球菌 葡萄球菌和微球菌的区别：葡萄糖OF试验，葡萄球菌为F型，微球菌为O型 所以如果做到一个触酶阳性的革兰阳性球菌都要做下葡萄糖OF试验，DNA酶试验，新生霉素试验，血浆凝固酶试验 链球菌和肠球菌的区别：链球菌高盐和胆汁七叶苷试剂均为阴性，而肠球菌都为阳性。 链球菌属内区别：本来可以通过溶血来区分一些的，但是由于实验室的平板αβ溶血比较难区分 所以如果做到一个触酶阴性的革兰阳性球菌都要做下高盐，胆汁七叶苷，杆菌肽，奥普托欣，CAMP 如果做到一个奥普托欣敏感的革兰阳性球菌再加做胆汁溶菌试验和菊糖试验（阳性为变红）可判定为肺炎链球菌 革兰阴性杆菌鉴定流程： 先做氧化酶试验： 氧化酶阴性的革兰阴性杆菌都要做下KIA，MIU，葡磷两支(做MR，VP)，苯丙，枸橼酸盐，硝还，蛋白胨水（做吲哚试验），赖氨酸，鸟氨酸，氨对 如果KIA结果为A/A或者K/A的应为肠杆菌科细菌，如上面向个反应还不能区分细菌到种根据教科书307页加做试验。 一般情况下只会给你们做大肠埃希菌，志贺菌属（四种），沙门菌属（甲副，乙副，伤寒），弗劳地枸橼酸杆菌，肺炎克雷伯，产酸克雷伯，产气肠杆菌，阴沟肠杆菌，普通变形杆菌，奇异变形杆菌，沙雷菌属，摩根菌属，普罗威登斯菌属。 如果KIA结果为K/K应怀疑为不动杆菌属或者嗜麦芽窄食单胞菌：这两个菌区分可通过麦芽糖和赖氨酸试验区分， 如为氧化酶阳性，要做葡萄糖的OF试验（用非发酵），硝还产气，精氨酸双水解酶，一般情况下只有两种菌给你们做一个是铜绿假单胞菌，一个是粪产碱杆菌， 真菌给你们做的一般情况只有白色念珠菌和新生隐球菌，通过墨汁负染，芽管试验，厚膜孢

细菌鉴定学习

现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】

菌种保藏中的细菌鉴定方法

万方数据

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菌种保藏中的细菌鉴定方法 作者：杜昕波， 赵耘， 李伟杰， DU Xin-bo， ZHAO Yun， LI Wei-jie 作者单位：中国兽医药品监察所,北京,100081 刊名： 中国兽药杂志 英文刊名：CHINESE JOURNAL OF VETERINARY DRUG 年，卷(期)：2009，43(3) 引用次数：0次 参考文献(6条) 1.兽医微生物学 2005 2.医学微生物学实验技术 2006 3.程池.杨梅.李金霞.姚粟.胡海蓉Biolog微生物自动分析系统--细菌鉴定操作规程的研究[期刊论文]-食品与发酵工业 2006(5) 4.杜昕波.赵耘.李伟杰.康凯.陈敏.张媛利用BIOLOG系统对不同种类细菌鉴定的研究[期刊论文]-中国兽药杂志2008(9) 5.原核生物系统学 2007 6.常见细菌系统鉴定手册 2001 相似文献(8条) 1.学位论文杜蓉分枝杆菌分枝菌酸的反相高效液相色谱分型鉴定技术方法研究与应用2008 结核病具有高流行性和高传染性，至今仍是一个严重的公共卫生问题。WHO已将结核病作为重点控制的传染病之一，据估计全球约有1/3的人感染结核菌，每秒有1个新增病例（WHO，2006年）。分枝杆菌在微生物分类中属于放线菌目、分枝杆菌科，临床主要致病的是结核分枝杆菌（MTB），此外还有非结核分枝杆菌（NTM），NTM所引起的结核样病变与结核临床表现相似，但治疗方案和抗药性根据不同种属有所不同。因此对分枝杆菌做出及时准确的分型鉴定、检测对控制结核病疫情具有十分重要的现实意义。 分枝菌酸（MA）是一类高分子量的含有α-支链、β-羟基脂肪酸的化合物，是所有分枝杆菌细胞壁脂质的主要组分，其脂肪酸上碳链的长度、不饱和状态、官能团及其含量与生物种型有关，且各生物种型之间MA呈现指纹特征。 本论文的目的是通过采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析比较样品中MA之间的差异，建立快速灵敏准确的分枝杆菌种间分型鉴定的HPLC标准方法，并构建分枝杆菌标准菌株的MA指纹谱库，为分枝杆菌的分型鉴定提供了重要的技术方法和谱库数据补充。全文分为四章： 第一章前言，简要介绍了分枝杆菌分型鉴别及检测方法的研究现状和存在问题，尤其介绍了HPLC方法的应用。并在此基础上提出了本论文的研究目的和研究内容。 第二章建立了以甲醇和二氯甲烷为流动相的梯度洗脱RP-HPLC法。分枝杆菌经过接种、培养、皂化、酸化及衍生化后，采用RP-HPLC进行分析，建立了快速灵敏准确的分枝杆菌种间分型鉴定的RP-HPLC标准方法。 第三章采用第二章所建立的方法，构建了49种《伯杰细菌鉴定手册》中所载入的分枝杆菌标准菌株（来源于ATCC（美国标准菌种收藏中心））的MA指纹谱库。通过对各个谱图进行详细分析，依据峰的分布特点可将其分为单簇（14种）、双簇（23种）、三簇及多簇（12种）三类，而后根据相对保留时间和相对峰高比的比例进行种间水平鉴别。此法成功鉴别了41种分枝杆菌（其余8种难以采用此法准确鉴别），对于难以鉴别的部分菌种尝试采用GC法对其进行进一步分型鉴别。 第四章在完成第二、三章工作的基础上，使用所建立的方法亦测定了大量来源于DSMZ（德国菌种保藏中心）的分枝杆菌（包含未收录入《伯杰细菌鉴定手册》的菌种）的MA 指纹图谱，为分枝杆菌的分型鉴定提供了重要的技术方法和谱库数据补充。 2.期刊论文程池.杨梅.李金霞.姚粟.胡海蓉.Cheng Chi.Yang Mei.Li Jinxia.Yao Su.Hu Hairong Biolog微生物自动分析系统--细菌鉴定操作规程的研究-食品与发酵工业2006,32(5) Biolog微生物自动分析系统是美国Biolog公司研制开发的新型自动化快速微生物鉴定系统,以细菌对微平板上95种碳源的利用情况为基础从而进行微生物鉴定.目前我国已经累计引进100余台,但使用率较低.文中在总结实践经验的基础上,参阅最新Biolog系统操作手册4.2版和国家微生物资源平台技术规程的统一格式,研究制定了细菌鉴定的操作规程,以规范系统使用,获得准确鉴定结果,尽快提高我国Biolog系统的应用水平. 3.学位论文刘晗黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性2006 寡糖及糖缀合物广泛的存在于生命体内，是重要的信息物质，参与多种生命活动。寡糖由于结合位置和结合类型的不同，种类繁多，有着多种重要的生物活性。黄原胶是人类研究最为透彻、商业化应用程度最高的由微生物分泌的胞外多糖，而关于其降解产物——黄原胶寡糖是否拥有某种生物学活性，至今少见报道。 首先，本文对一株从野外筛选到的分泌黄原胶酶的菌株进行了鉴定，根据该菌株形态特征、生理生化特征，对照《伯杰细菌鉴定手册》，初步确定它属于鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)。16SrRNA序列测定结果也支持这一结论。该菌已保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCCNO.1421)。 其次，通过对Sphingomonassp.XT-11发酵条件的研究，筛选出有利于产酶的各实验因子的适宜水平。结果表明，酶形成的适宜温度为30℃，培养基适宜起始pH值为7.0，培养基适宜底物浓度为1﹪，摇瓶发酵用250mL三角瓶装液30mL酶活力较高。适宜种龄为16～24h，接种量对发酵影响不大。 再次，对黄原胶寡糖在抗氧化、抑制皮肤浅部真菌、植物诱抗、抑制ACE方面的生物学活性进行了探索，发现粗酶液降解得到的粗黄原胶寡糖拥有较强的抗氧化能力，而对ACE则没有抑制作用；黄原胶寡糖还拥有了较强的抗皮肤浅部真菌活性以及一定的植物诱抗活性。 最后，对鞘氨醇单胞菌XT-11红细胞凝集活性进行了研究。发现该菌悬液能凝集2种血红细胞。菌悬液对兔红细胞的凝集可以被肝素所抑制。其凝集活性不依赖于Ca2+；在pH为6.0～10.0范围内较稳定；它的凝集活性在60℃时完全丧失。 4.期刊论文张海燕.贺江舟.龚明福.刘占文.张利莉.Zhang Haiyan.He Jiangzhou.Gong Mingfu.Liu Zhanwen. Zhang Lili利用菌落PCR-DGGE快速鉴定盐渍土壤菌种多样性-塔里木大学学报2007,19(4) 利用菌落PCR方法,结合DGGE的检测方法,对所保存的87份盐生菌的培养物进行了多样性检测,初步研究显示至少有31株不同的菌种,表明新疆盐生环境存在较为丰富的菌种资源,同时表明菌落PCR结合DGGE技术为细菌鉴定和菌种保藏过程中重复菌株的去除提供了一种快速可靠的手段. 5.学位论文陈接锋产聚β-羟基丁酸球衣菌分离筛选及发酵和提取的研究2003 球衣菌是活性污泥中的主要丝状菌,对污水中的有机物和有毒物质有很强的降解能力,而且胞内也能积累相当量的PHB,已逐渐受到重视,因此,该文详

病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备

一、实验目的 熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。 二、实验材料 患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原） 三、实验药品、用具 2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔 四、实验操作程序 （一）病原菌的分离与鉴定 1 ．培养基的制备 （ 1 ）普通肉汤培养基： 按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6 初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。 （ 2 ）普通营养琼脂培养基 普通肉汤 1000ml

琼脂 20g 琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。 将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。 加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。 盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。 培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。 2 ．病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。 体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧

菌种保藏中的细菌鉴定方法

菌种保藏中的细菌鉴定方法 作为科研生产中最重要的基础性资源—菌毒种,其收集、保藏及相关的研究工作在我国正处于整理、整合以及全方面逐步正规化阶段.2003年7月23日,科技部在北京召开了“国家科技基础条件平台建设”部际联席会和专家顾问组成立大会,正式启动了国家科技基础条件平台建设工作.国家自然科技资源共享平台建设作为其中的一个重要组成部分同步启动.作为该项8的一个重要组成部分,微生物菌种资源整理、整合工作同期启动,在此项工作中,中国兽医药品监察所承担了兽医微生物资源整理、整合工作.本所在行业内发展了数家加盟单位,在整理、整合菌种资源的过程中遇到了一些实验室细菌鉴定结果出现偏差的问题.经分析调查,多是由于实验室人员结构以及实验室的硬件水平差别较大等原因,造成实验室间鉴定能力的参差不齐,致使鉴定项目完成情况不尽相同,细菌鉴定结果出现偏差. 细菌鉴定是指将分离培养获得的病原菌,通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度,继而进行系统鉴定.而菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时,应在开启后经过两代的适应性培养方可进行复核性的系统鉴定.系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型(群).目前菌种保藏机构通常使用的细菌鉴定方法大致有以下几种: 1、传统方法 常规宏观菌落形态学观察,主要观察菌落在其适合的培养基上的生长状况:细菌在固体培养基上的生长形态、大小、颜色是否均匀一致,菌落个体表面及边缘的生长状况;在液体培养基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜状况;半固体上穿刺接种后,观察细菌是否沿着接种线生长以及其生长状态是呈毛刷样生长还是均匀生长,上下生长是否一致.在鉴别培养基上培养,观察结果是否跟预期结果相同. 细菌的个体形态学观察,即通过显微镜观察.观察前细菌需要着色,要根据预先确定的观

菌种保藏中的细菌鉴定方法

菌种保藏中的细菌鉴定方法 杜昕波,赵耘,李伟杰 (中国兽医药品监察所,北京　100081) [收稿日期]2008211211　[文献标识码]A [文章编号]100221280(2009)0320050203　[中图分类号]S852.61 [摘　要]　综述了在菌种保藏工作中目前行业内使用的各种细菌鉴定方法,包括传统方法、仪 器的自动化鉴定以及分子生物学方法,并简述了各种方法的原理和优缺点,以期能为行业同仁更 好开展菌种保藏、鉴定工作提供帮助。[关键词]　菌种保藏;细菌鉴定;传统方法;仪器自动化鉴定;分子生物学方法 基金项目:自然科技资源平台项目(2005OK A212053) 作者简介:杜昕波(1980年-),研究实习员,大学本科,从事细菌鉴定及方法研究和制备工作。E -mail:duxinbo@ivdc .g ov .cn 通讯作者:赵耘,主要从事病毒、细菌鉴定及检测方法研究及其防治工作。E -mail:zhaoyun@ivdc .gov .cn M ethods of Bacter i a l I den ti f i ca ti on i n the Program of Culture Collecti on DU Xin -bo,ZHAO Yun,L IW ei -jie (China Institute of Veterinary D rug Control,B eijing 100081;China ) Abstract:This paper revie wed vari ous methods of bacterial identificati on in the p r ogra m of culture collecti on t oday,including traditi onal methods,aut omatic m icr obi ol ogy analysis syste m and method of molecular bi ol ogy .It als o su mmarized the funda mental p rinci p le,relative merits of the above -menti oned methods s o as t o p r ovide aid for executing above -menti oned work . key words:culture collecti on;bacterial identificati on;traditi onal method;aut omatic m icr obi ol ogy analysis syste m;method of molecular bi ol ogy 作为科研生产中最重要的基础性资源———菌毒种,其收集、保藏及相关的研究工作在我国正处于整理、整合以及全方面逐步正规化阶段。2003年7月23日,科技部在北京召开了“国家科技基础条 件平台建设”部际联席会和专家顾问组成立大会,正式启动了国家科技基础条件平台建设工作。国家自然科技资源共享平台建设作为其中的一个重要组成部分同步启动。作为该项目的一个重要组成部分,微生物菌种资源整理、整合工作同期启动,在此项工作中,中国兽医药品监察所承担了兽医微生物资源整理、整合工作。本所在行业内发展了数家加盟单位,在整理、整合菌种资源的过程中遇到 了一些实验室细菌鉴定结果出现偏差的问题。经 分析调查,多是由于实验室人员结构以及实验室的硬件水平差别较大等原因,造成实验室间鉴定能力的参差不齐,致使鉴定项目完成情况不尽相同,细菌鉴定结果出现偏差。 细菌鉴定是指将分离培养获得的病原菌,通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度,继而进行系统鉴定。而菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时,应在开启后经过两代的适应性培养方可进行复核性的系统鉴定。系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准 ?05?　中国兽药杂志 2009,43(3):50～52/杜昕波,等