实验六 酵母菌细胞总数的测定

实验六酵母菌细胞总数的测定

一、目的要求

1.学习并掌握血球计数板计数的原理；

2.掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、实验材料

1.菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）麦芽汁培养液

2.其它：显微镜、血球计数板、手动计数器、擦镜纸、吸水纸等

三、基本原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。该方法是将菌悬液放在血球计数板与盖玻片之间容积一定的计数室中，在显微镜下进行计数，然后根据计数结果计算单位体积内的微生物总数目。

血球计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。血球计数板的构造如下。

图6-1 血球计数板构造

常见血球计数板的计数室有两种规格：一种是16×25型，即计数室共分为16个中方格，每个中方格又分为25个小方格；另一种是25×16型，即计数室先被分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格。但无论是哪一种规格的血球计数板，其计数室的小方格都是400个。我们采用的是25×16型。

计数时，通常数5个中方格的总菌数，再换算成1ml菌液中的总菌数。计算公式如下：

1ml菌液中总菌数＝5×104 A·B

A为5个中方格中的总菌数，B为稀释倍数

四、操作步骤

1.菌悬液的制备：以无菌生理盐水将酿酒酵母培养物制成浓度适当的菌悬液。

2.加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酵母菌悬

液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细作用自动进入计数室（注意取样前要摇

匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生）。

3.找计数室：加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找

到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数（注意调节显微镜光线强弱，使菌体和计数室线条清晰）。

4.显微镜计数：取左上、右上、左下、右下和中央5个中方格进行计数。位于中方格边线

上的菌体一般只计上边和右边线上的（或只计左边和下边线上的）。如遇到酵母出芽，芽体大小达到母细胞一半以上时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从上下两个计数室中得到的平均数值来计算样品的含菌量。

5.清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗

刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察计数室内是否有残留菌体或其它沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

五、实验内容

按上述方法及步骤测定所给酿酒酵母培养液的细胞浓度。

六、实验报告

2.根据你的体会，说说用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误

差，力求准确？

3.能否用血球计数板在油镜下对细菌进行计数？为什么？

PI染色检测细胞周期

1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。 2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。 3、细胞染色 离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。 4、流式分析 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。 分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。 细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。 结果解读 G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76 G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43 S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的）为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一

酵母菌的培养和观察

酵母菌的培养和观察 目的认识酵母菌的形态特征，了解培养酵母菌的方法。 实验前的思考人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。 材料器具甜酒酿汁液，新鲜酵母，豆芽；显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮；蔗糖，乳酸，碘液。 步骤 1．观察酵母菌 （1）用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡（图示）。有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。 （2）在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。 2．培养酵母菌 （1）用蔗糖液培养在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀；再用棉絮塞紧瓶口。然后把烧瓶放在25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。 （2）二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol : PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处 理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有 0.5-2 X 10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS （根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的 PBS J ;然后胰酶消化 （注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心（1000r/300g 5mi n）收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇（乙醇终浓度70%），吹打混匀以免细胞团聚，4C固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g 5min ）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心（第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎）再次获取细胞沉淀后加入1 00卩IRNaseA 于37 C水浴30min，最后加入400卩lPI避光染色30 min （常温或4C 均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS 临时配好总量，其中 PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Trit on X-100 0.2% ） 4 C避光染色30分钟】 5、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结

果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-W和FL2-A显示，去除联体细胞。

七年级生物实验报告单_共10篇.doc

★七年级生物实验报告单_共10篇 范文一：七年级生物上册实验报告单七年级生物实验报告册2015年秋季上学期 学校三台花园初中班级七年级姓名 目录 一、调查校园、公园或农田的生物种类.............................................2二、非生物因素对某种动物影响......................................................3三、练习使用显微镜 (4) 四、观察植物细胞........................................................................5五、观察动物细胞 (6) 六、人体的基本组织........................................................................7七、观察草履虫 (8) 八、裸子植物和被子植物的种子...................................................9九、种子萌发的环境条件 (10) 十、植物茎内水分的运输...................................................11十一、观察叶片的结构 (12) 一、调查校园、公园或农田的生物种类实验报告 年级班实验人：组次：试验时间： 实验名称：调查校园、公园或农田的生物种类 实验目的：1、尝试调查的方法，初步学会调查记录 2、描述身边生物和生活环境

实验器材：调查表、笔、望眼镜、放大镜实验设计： 1、选择调查范围。校园、公园或农田 2、分组。8人一组，确定组长 3、设计调查路线。选择生物多、环境变化多得路线。 4、调查记录。 5、归类。 6、进行整理，系在笔记本上。 7、汇报调查结果。 二、非生物因素对某种动物影响实验报告 年级班实验人：组次：试验时间： 实验名称：非生物因素对某种动物影响 实验目的：影响鼠妇分布的环境因素实验器材：10只鼠妇、湿土、铁盘（塑料盘、纸盒）、纸板、玻璃板实验设计： 1.取一个方形的月饼盒，清洗干净，用记号笔在盒内画一条中线。【已做】 2.将10条大小形同，健康状况良好的黄粉虫放入一个纸杯，然后倒扣在月饼盒中线中间静置2分钟。绝对保持安静，不要大声说话和拍打桌子（为什么？），待黄粉虫适应一下环境。 3.2分钟后拿走纸杯，让黄粉虫自由活动，然后迅速用黑卡纸将月饼盒的一半遮起来，另一半有光线照射。明暗反差越大越好。 4.从黄粉虫自由活动算起，每隔一分钟统计一次明处和暗处的黄粉虫数目。共统计10次填入下表。 三、练习使用显微镜实验报告 年级班实验人：组次：试验时间： 实验目的：实验器材：实验设计： 1、_____：右手拿镜臂,左手托住镜座,放置于身体正前方偏左侧； 2、______：从镜头盒取出目镜和物镜,安装在镜头上；（拿物镜时手拿橡胶部位） 3、对光:转动转换器和遮光器,使物镜和遮光器较大孔对准通光孔,调节________使镜筒下降适当距离，转动__________，直到从目镜中看到一片白亮的视野。 4、放装片并固定：将永久玻片标本(有盖玻片一面向上)观察部分正对通光孔，压片夹固定； 5、观察：调节粗准焦螺旋使物镜与玻片靠近（下降过程眼睛注视物镜），通过目镜观察，_________调节粗准焦螺旋，使镜筒上升，直到看清物像，最后调节___________，使物像更加清晰。

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol：PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入1 00μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30 min（常温或4℃均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS临时配好总量，其中PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Triton X-100 0.2%）4℃避光染色30分钟】 5、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

用显微镜观察草履虫

用显微镜观察草履虫 执教：新罗区白沙中心小学陈秋虎 指导： 【教材分析】 显微镜的发明不仅使人们看到了细胞，还看到了身边的许多微生物。微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物在内的一大类生物群体。在前面几课使用显微镜观察生物细胞的基础上，本课重点指导学生观察草履虫。微生物在地球上分布很广，种类和数量极多，和人类的关系也十分密切。本课仅指导学生观察生活在水中的草履虫的样子、运动和颜色等，主要活动为“观察微生物”、“记录微生物”两部分。 【学情分析】 乡下孩子接触显微镜的机会少，对显微镜的使用较为陌生，为了上好这节课，首先要先教会孩子熟练地使用显微镜。可以通过观看微课，学习显微镜的使用，在学生实验的过程中，由听课教师手把手协助教学，做到规范使用。草履虫玻片的制作不属于小学生应掌握的内容，教师可以课前预先制作好草履虫的玻片标本，降低教学难度，腾出更多的时间让学生去探索微观世界，去交流感受。 【设计意图】 通过教学，使学生对草履虫的研究感兴趣，会用画图、文字的形式，记录观察到的内容，学会追踪观察活的草履虫的方法，学会与他人交流自己的发现。六年级的孩子对显微镜以及未知的微观世界有着深深的好奇心，满足他们对微观世界的探索欲望，体验科学探究的乐趣，教会他们探索微观世界的方法是本节课的宗旨，激发培养他们对世界的探索精神是我们的目的。 【教学目标】 科学概念： 1.用显微镜能看到肉眼不能看清楚的草履虫。 2.认识水中生活着很多形态各异的微生物。 过程与方法： 1.进一步熟练使用显微镜。 2.学会在显微镜下观察水中活着的草履虫，用图文方式记录它们的形态和行为特征。

情感、态度、价值观： 培养学生对微生物进行研究的兴趣，培养生物具有多样性和复杂性的意识，激发培养他们对世界的探索精神。 【教学重点、难点】 教学重点：用显微镜观察水中活着的草履虫。 教学难点：追踪观察活的微生物，并记录它们的样子、运动和颜色。 【教学准备】 显微镜、擦镜纸、手电筒、含有微生物的水、含有微生物的生物玻片、记录单、课件 【教学过程】 一、引入课题。 1.引起学生的好奇心，激发学生的观察兴趣，观察水瓶中含有草 履虫的水。询问学生想观察草履虫的什么？ 2.引出学习使用显微镜的话题。 二、学习使用显微镜（播放使用显微镜的微课） 1.认识显微镜的构造。 2.显微镜使用要点： （1）先用低倍物镜对光(明亮光圈)。 （2）把标本放在通光孔中心。 （3）眼看物镜,把镜筒降到最低。 （4）眼看目镜，调节粗准焦螺旋， （5）慢慢抬升镜筒，直到看到清晰的图像为止。 三、利用显微镜观察草履虫 1.教师把制作好的玻片标本放在载物台。 2讲解实验记录单的使用方法。

流式检测细胞周期要点

1.收集细胞； ～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀； ％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h； 4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）； 5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h； 目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。 1、Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？ A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%. 2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题： Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？ A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。 Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？ A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。 Q：（3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？ A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。 Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？

细胞周期同步化

细胞周期同步化 在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: Td Ｒ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。 中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。 经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成

酵母菌的培养与观察2

5.酵母菌的培养与观察 实验方向：了解酵母菌的生长特性、种类，观察并对比土壤，水果及酒曲中酵母菌的形态及种类。 一、实验目的 1. 学会选择酵母菌在土壤中采样点并合理取样； 2. 掌握PDA培养基的配制方法； 3. 学习分离纯化酵母菌的基本操作技术，掌握微生物培养方法以及接种技术。 4. 学会使用高压蒸汽灭菌锅、显微成像系统等实验仪器设备； 5. 培养并学习微生物实验的一般思维及方法。 二、实验原理 酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5微米′5~30微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。 酵母菌在自然界分布广泛，目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。 大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5—6，常见于含糖份较高的环境，如果园土，菜地图及果皮等职务表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养集中，酵母菌比霉菌生长的快。 利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做可抑制细菌生长），然后再固体培养基上划线分离。 三、实验器材 1.培养基配方 PDA培养基：马铃薯（去皮）100g，蔗糖与葡萄糖分别10g，水500g，琼脂10g. PDA乳酸液态培养基：马铃薯（去皮）40g，蔗糖与葡萄糖分别4g，水200g，乳酸1ml 2. 仪器及其它用品 小铲，500mL三角锥形瓶，500mL及300mL烧杯，药勺，无菌培养皿，剩9mL无菌水试管8支，无菌玻璃珠，接种环，酒精灯，称量纸，高压蒸汽灭菌器，超净工作台，移液器，分析天平，恒温震荡仪，微波炉显微成像系统。 四、实验步骤与方法 1. 样品收集 （1）土壤样本：在花圃里找开花较多的花丛下离地面5-10厘米的土壤取一小块土壤，（2）水果样本：一小块腐烂水果，一小块新鲜水果 （3）酒曲样本：一小块酒曲 2. 培养基的制备 ⑴PDA培养基的制作 把马铃薯去皮，切成小块状，称量100克，放进500mL的水中用电热炉加热，边用玻璃棒搅拌，以免糊底，煮沸至马铃薯成糊状便停止加热。再用双层纱布放在大烧杯上，左手握住，右手戴上手套把马铃薯慢慢倾倒在纱布上，倒完便把纱布与滤渣拿起来把剩余的汁压挤出来。再用水补充至500mL，加8克葡萄糖及4克琼脂，搅匀后用报纸折成小方块放在瓶口上用手沿瓶口形状往下按并用橡皮胶扎紧，放于高压蒸汽灭菌炉中，用121度灭菌15分钟。待其冷却至45度左右便在无菌条件下倒在灭菌了的培养皿上。待其冷却凝结后便倒置放进

实验报告

＆1 走进生物实验室 【实验目的】：识别本校生物实验室器具，结合各种器具辨认并说明其用途。【课前准备】放大镜、解剖针、载玻片、盖玻片、显微镜、烧杯、试管夹、培养皿、刀片、滴管、三脚架和石棉网等。 【实验步骤】*认识材料和用具引导学生观察 (一)图1中是生物实验室常用的实验器具，你能把它们按各自的用途进行归类吗? (1)属于观察器具的是____；(2)属于解剖器具的是____； (3)属于加热器具的是____；(4)属于通用器具的是____。 图1 实验室常用的实验器具 （二）1．认识显微镜的主要结构， 写出显微镜主要部分的名称。 ⑴______⑵______⑶______⑷ ______⑸_____（6）_ ⑺______⑻_______⑼_______⑽ _______⑾______⑿_______⒀ _______⒁_______ 【教学反思】这是学生第一次走进实 验室，第一次接触生物实验，所以必 要的实验规则是要强调的，实验秩序 虽然有些乱，但学生在实验中体验到 了生物学科的奥妙，对生物学稀罕生 了浓厚的兴趣。

＆2 练习使用显微镜 【实验目的】：正确说明显微镜的结构与功能,能独立、规范地使用显微镜，能 观察到清晰的物像；在认识、使用显微镜的过程中发现问题，并尝试解决问题； 【课前准备】准备显微镜，并逐个检查（准备两个不同倍数的目镜）；三种标本（写有“上”字的玻片；写有数字的透明纸；写有数字的不透明纸；），擦镜纸，纱布，显课前每班培训几名学生，以便课上帮助教师辅导其他学生。 【实验步骤】 *认识材料和用具引导学生观察实验桌上显微镜、玻片标本、擦镜纸、纱布等。 *取镜和安放右手握，左手托；略偏左，安目镜。指导学生看书37页：取镜和安放。强调安放目镜时，手指不要触摸镜头，对学生进行爱护显微镜的教育。 *显微镜的构造学生两人一组，看书对照实物认识显微镜各部分名称，之后回答教师指示部分的名称。（教师利用课件，点击即显示各部分名称） *显微镜的使用教师对学生的回答进行鼓励，引出显微镜的使用。介绍三种观察标本： （1）写有“上”字的玻片；（2）印有数字的透明纸；（3）写有数字的不透明纸。 对光要求学生先看书，然后指导学生动手观察。按照先看到一个白亮的视野→放入标本→-看到清晰像的顺序（建议先观察2号标本）。 （1）低倍物镜对准通光孔。（2）左眼看，右眼睁。（3）转动反光镜，看到明亮视野。 观察学生边看书自学边操作显微镜进行观察。（1）标本放在载物台上，压住，正对通光孔。（2）镜筒先下降，直到接近标本。（3）左眼注视目镜，使镜筒缓缓上升，直到看清物像。 强调：⑴用低倍物镜（10×或8×，即短的物镜）对准通光孔。⑵转动转换器的手法要正确，对学生进行爱护显微镜的教育。⑶镜茼先下降后上升，镜筒下降时，眼睛一定要看着物镜，以免压碎标本。 ⑷左眼看目镜，右眼睁开是为了画图。引导学生继续观察。 【教学反思】上好本节课的关键是组织好学生进行探究和操作，教师最好课前培训几位学生作助手，这样看似麻烦，实际在上课时解决了不少问题，以后的学习中还会用到显微镜，所以在开始就要强调规范操作，帮助学生养成良好习惯。 ＆3 练习测量

细胞增殖细胞周期的测定方法

苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 1 “细胞增殖”相关知识的建构（2 课时）一、减数分裂与基因的分离、自由 组合定律请画出能体现基因自由组合现象的细胞分裂图像 例1、（08 江苏）某种昆虫长翅（A）对残翅（a）为显性，直翅（B）对弯翅（b）为显性，有刺刚毛（D）对无刺刚毛（d）为显性，控制这3 对性状的基因均位于常染色体上。现有这种昆虫一个体基因型如下图所示，请回答下列问题。（1）长翅与残翅、直翅与弯翅两对相对性状的遗传是否遵 循基因自由组合定律，并说明理由。。（2）该昆虫一个初级精母细胞产生的精细胞的基因型为____________。（3）该昆虫细胞有丝分裂后期，移向细胞同一极的基因有。（4）该昆虫细胞分裂中复制形成的两个D 基因发生分离的时期 有______ 。（5）为验证基因自由组合定律，可用来与该昆虫进行交配的异性个体的基因型分别是 _______________________________________________ ____________________________ 。二、细胞分裂与可遗传变异请画出可遗传变异种类的概念图苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 2 1、基因重组（非同源染色体的自由组合、交叉互换）例2、（07 广东）在减数分裂中每对同源染色体配对形成四分体，四分体中的非姐妹染色单体 之间经常发生交换。实验表明，交换也可以发生在某些生物体的有丝分裂中，这种现

象称为有丝分裂交换。图39—1 是某高等动物一个表皮细胞发生有丝分裂交换的示意图，其中D 和d，E 和e，F 和 f 表示某对同源染色体上的三对等位基因。图39—1 交换 过程示意图（左：交换前的染色体；右：交换后的染色体）（1）请问该细胞在发生有丝分裂交换后，产生几种基因型 的子代表皮细胞？并分别写出基因型 _______________________________________________ __________________。（2）如果不考虑该生物产生配子时发生的交换，那么该生物产生的配子有几种基因型？并 写出基因型 _______________________________________________ _____________。（3）如果图39—1 是该生物的精原细胞在产生精细胞时发生减数分裂交换后的结果，请问由它产 生的配子类型有几种？并写出基因型 ______________________________。（4）如果细胞在减数分裂和有丝分裂中都发生交换，你认为哪一种分裂方式对于遗传多样性的贡献更大？为什么？ _______________________________________________。 2、染色体变异（染色体结构变异、染色体数目变异）例 3、（10 苏州高二期末）右下图表示某生物体的细胞进行减数 分裂过程中，其中联会的两对染色体之间出现异常的

“观察酵母菌和霉菌”实验报告单

“观察酵母菌和霉菌”实验报告单 名称 姓名实验“观察酵母菌和霉菌” 组员 实验内容 材料用具 目的要求酵母菌培养液、橘子皮上的青霉、吸管、镊子、显微镜、解剖针、载玻片、盖玻片、放大镜、稀释的碘液、吸水纸 认识酵母菌、霉菌的形态结构年级八上生物实验类型提交时间分组实验指导老师 方法步骤 酵母菌电镜照片xx霉菌电镜照片 (1)观察酵母菌 1.取一滴酵母菌培养液，滴在载玻片上、盖上盖玻片、用显微镜观察，就能看到一个个椭圆形的细胞，细胞中有明显的液泡，这就是酵母菌。 2.在盖玻片的一侧滴一滴碘液、用吸水纸从另一侧吸引，对酵母菌进行染色、在显微镜下能看到酵母菌细胞中染上颜色的细胞核和淀粉粒。有的细胞上长出大小不一的突起，这是酵母菌在进行出芽生殖。 （2）观察青霉 1.从培养皿中取一块长有青霉的橘子皮，垫上白纸，用放大镜观察，可以看到一条条直立生长的白色绒毛，这就是青霉的直立菌丝，菌丝的顶端长有成串的青绿色的孢子。

2.用解剖针挑取少许长有袍子的菌丝，制成临时装片，置于显微镜下观察。注意观察菌丝有没有颜色，直立菌丝的顶端有没有扫帚状的结构，以及孢子的着生状态和颜色。 讨论 1.酵母菌的细胞结构有什么特点？ 2.青霉孢子的颜色和着生状态有什么特点？ 1.制备酵母菌培养液时，应将装置放在25-30℃的环境中培养，以使酵母菌快速繁殖。 2.酵母菌培养液应含有一定浓度的糖，但是糖的浓度不宜过高。 3.培养青霉时，可以在培养皿里垫一层吸水纸，加适量的水，并盖上盖，放在阴暗温暖的环境中。 每天往里面加适量的温水，以保持一定的温度。 4.青霉分生孢子梗上成串的孢子容易碰落，盖盖玻片时要特别小心，动作须轻缓，盖好后不能移动位置。 注意事项 AA

草履虫伸缩泡观察实验报告

草履虫伸缩泡观察实验报告摘要： 伸缩泡是草履虫体内水分调节细胞器，是一种规律性伸缩的液泡。在草履虫的内质与外质之间有2个伸缩泡，一前一后。每个伸缩泡向周围细胞质伸出放射排列的收集管。在电镜下，这些收集管端部与内质网的小管相通联。在伸缩泡及收集管上有由一束微管组成的收缩丝。由于收缩丝的收缩使内质网收集的水分（其中也有代谢废物）排入收集管，注入伸缩泡，经由表膜小孔（排泄孔）排出体外。前后两个伸缩泡交替收缩，不断排出体内过多的水分，以调节体内渗透压平衡。 本周动物生物学实验课上我们小组进行了草履虫伸缩泡的观察实验，我们采用分组的方式进行研究，设置了浓度梯度（生理盐水% 、 % 、 % 、 % 、% 、蒸馏水）记录不同浓度下一分钟内草履虫伸缩泡的收缩次数，研究外界环境浓度对草履虫伸缩泡收缩运动的影响。我们收集到的数据是蒸馏水状态下伸缩泡平均每分钟收缩5次，原液中伸缩泡平均每分钟收缩2次，在%的生理盐水中伸缩泡平均每分钟收缩3次，在%的生理盐水中伸缩泡平均每分钟收缩1次，在%的生理盐水中伸缩泡平均每分钟收缩2次，在%的生理盐水中伸缩泡平均每分钟收缩1次，在%的生理盐水中伸缩泡平均每分钟收缩0次。大致可以看出草履虫所处外界环境浓度越高时收缩次数越少，在浓度过高时伸缩泡不再收缩。 通过这次实验，我们了解了草履虫的基本特征，探究了其伸缩泡的活动机理，进一步掌握观察了微小活动目标的技巧。 关键词：草履虫，伸缩泡，收缩次数，不同浓度 正文 一、实验材料准备 采集的原生动物培养液、秒表、显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、吸水纸、镜头纸、棉纤维、牙签、不同浓度生理盐水（%、%、%、%、%）、蒸馏水、纱布。 二、实验方法 1.分组安排 本实验组组共六人，分别负责观察并记录在蒸馏水，浓度为%，%，%，%，%的生理盐水中草履虫伸缩泡的收缩次数，最后大家观察原液状态下草履虫伸缩泡伸缩情况，每人选取5个观察对象（样本），每个样本计数 3 个计时单位，以一分钟为一个计时单位。最后求平均值，计算出每个时间单位（一分钟）内草履虫伸缩泡的收缩次数。 2.实验操作 （1）临时玻片制作 ①在载玻片上滴一滴生理盐水（或蒸馏水）。 ②用牙签挑取培养缸边或稻草杆上的膜状粘腻物，蘸入生理盐水（或蒸馏水）水滴中。 ③将小片棉纤维撕得很薄，轻轻覆盖在生理盐水（或蒸馏水）水滴上。* ④盖上盖玻片（用镊子夹取，45o角盖盖玻片）。 ⑤轻压盖玻片，同时用吸水纸在盖玻片四周边缘处轻轻吸去多余水分。当虫体被压，运动困难，略有变形时伸缩泡运动较易观察。 （2）观察临时玻片 ①把玻片放在载物台上，转动光圈调亮视野，将物镜转换到4×，转动粗准焦螺旋直至视野清晰，将草履虫聚集的部分移至视野正中央。 ②转换到10×的物镜，转动粗准焦螺旋使视野清晰，可观察到草履虫大致形态，寻找运动不剧烈的草履虫（以困在棉纤维中的草履虫为宜）作为样本，将其移至视野中央。 ③转换至40×的物镜，转动光圈将视野稍稍调暗（便于观察草履虫伸缩泡的收缩），转动细准焦螺

流式检测细胞周期和凋亡实验步骤

流式细胞技术检测细胞周期分布 1) 已转染miRNA mimics的细胞培养达到85％融合时，用胰酶消化细胞。1000 rpm，离心5min，收集细胞沉淀； 2) 已消毒的PBS重悬细胞，1000 rpm/min，离心5 min，收集细胞。重复此步骤2次，以除去胰酶； 3) 加入预冷的70%乙醇固定细胞过夜； 4) 第二天1000rpm，离心5 min，收集细胞沉淀，PBS重悬两次，以除去乙醇； 5) 离心后加入500ul PBS重悬细胞，加入碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI，1g/L Triton X-100，100g/L RNase)混匀，4℃避光孵育30min。 6）流式细胞仪FACStar (美国BD公司) 检测。接收的信号经Cellquest软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。实验重复3次。 2.11流式细胞技术检测细胞凋亡水平 1) 已转染BART6-3p mimics的细胞培养达到85％融合时，将上清培养液收集至离心管内；常常 2）PBS清洗贴壁细胞3次，用胰酶消化细胞（注意：消化时不可过度），收集于第一步的离心管内； 3) 1000 rpm离心5min，弃上清收集细胞，PBS轻轻重悬后，加入195 ulAnnexin V-FITC结合液，吹打混匀，重悬细胞，加入5ul Annexin V，轻轻混匀。避光室温孵育15min； 4) 加入10 ul PI染色液，轻轻混匀，避光孵育； 空白：Annexin V—FITC结合液200ul 双染：185ul结合液+5 ulAnnexin V—FITC+10ul PI 单染：195ul结合液+5ul Annexin V—FITC 190ul结合液+10PI 5) 进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检 测方法 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA 链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。 采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。

四种克鲁弗酵母菌培养及形态特征的观察

四种克鲁弗酵母菌培养及形态特征的观察 阿克依旦,山格依里四巴依尔,古丽娜孜四托合塔日巴依,热娜古丽四木沙* （新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐830052） 摘要：以克鲁弗酵母菌（S.kluyveri ）作为实验材料，研究培养基及甜菜糖蜜添加量对4种S.kluyveri 菌落增殖的影响，同时对菌落形态和细胞形态进行观察三结果表明：与麦芽汁固体培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基相比，4种S.kluyveri 均适合生长在甜菜糖蜜培养基中，其甜菜糖蜜最适添加比例为4％三4种S.kluyveri 在同一培养条件下生长，其形态结构并无明显差异，其菌落均为湿润有光泽二不透明的圆形菌落，细胞形态均为圆形的两端芽殖细胞三其中编号为1685和编号为10955的菌株菌落和细胞大小较其他两种菌株较大三 关键词：S.kluyveri ；培养基；甜菜糖蜜；形态结构 中图分类号：TQ926.2文献标识码：A 文章编号：1674-506X （2017）01-0006-0003 Observation of Four Saccharomyces kluyveri Culture and Morphological Characteristics Aheyidan,Shangeyili 四Bayier,Gulinazi 四Tuohetamubayi,Renaguli 四Musha * （College of Food Science and Pharmaceutical Science ,Xinjiang Agricultural University ,Urumqi Xinjiang 830052,China ）Abstract ：Saccharomyces kluyveri （S.kluyveri ）as experimental materials,discuss medium and beet molasses addi-tion on effect of four hinds of S.kluyveri colony proliferation,colony and cell morphology were observed simultane-ously.Results show that compared with malt extract agar medium and potato dextrose agar,four species of S.kluyveri are suitable for growing in beet molasses medium,beet molasses is the optimum ratio of 4％.Four S.hluyveri under the same conditions,no significant differences in morphological structure,their colonies are circular colony with wet shiny,opaque,cells are round both ends of the budding cells.Strain number 1685and numbered 10955colonies and cell size are larger than the other two strains. Key words ：S.kluyveri ；medium；beet molasses；morphological structure doi ：10.3969／j.issn.1674-506X.2017.01-002收稿日期：2016-12-04 基金项目：国家自然科学基金资助项目（31460440） 作者简介：阿克依旦（1991-）,女,研究生三研究方向：食品加工与安全*通讯作者 Saccharomyces kluyveri （克鲁弗酵母菌）简称S.kluyveri ,是芽殖酵母,具有降解嘧啶的作用[1-2］三其特点为菌体营养丰富,是唯一持有神经酰胺的菌株, 具有较强的发酵功能,可以分解甜菜糖蜜中的棉籽 糖[3］三神经酰胺存在于植物[4］二哺乳动物[5］二酵母[6］等真核生物中三Tamura 等[3］报道S.kluyveri 酵母菌在甜菜糖蜜培养物中的脑苷脂富集功能三糖蜜作为制糖产业的副产品之一,可添加在酵母生产培养基中[7-10］,而S.kluyveri 酵母菌的培养基基质中需要添加一定比例的可溶性糖类,目前,国内涉及到关于酵母菌的第53卷（第1期）Vol.53, No.1 万方数据