利用固相萃取-液质联用技术快速筛选产毒藻种及毒素种类【开题报告】
毕业论文开题报告
生物工程
利用固相萃取-液质联用技术快速筛选产毒藻种及毒素种类一、选题的背景与意义
近年来，一些作为饮用水源的湖泊、水库等水体富营养化及蓝藻水华爆发已严重威胁到人民群众的饮用水安全。蓝藻水华爆发不仅造成水质下降，而且还释放出内源性藻毒素，其中微囊藻毒素(MC)是出现频率最高，危害最严重的藻类毒素，微囊藻毒素-LR(MC-LR)是我国富营养化水体中毒性较大的常见亚型，能强烈抑制蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶 2A(PP2A)的活性，具有肝脏毒性和肿瘤促进作用。除了微囊藻(Microcystis)外，蓝藻门中的鱼腥藻属(Anabaena)、浮丝藻属(Planktothrix)、束丝藻属(Aphanizomenon)中的某些种类也能产生此类毒素。1996年在巴西造成100多名急性肝功能故障，7个月内至少50人死于藻毒素产生的急性效应，引起举世瞩目的关注。淡水水体中的蓝藻毒素已成为全球性的环境问题，世界各地经常发生蓝藻毒素中毒事件。
由于毒素对身体及环境的危害，急需开发一种方便，快捷的方法对其进行检测，本课题采用固相萃取法，液相色谱质谱联用方法对生活中实际藻体和水样中的毒素进行定性定量分析。
二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：
研究的基本内容：
本课题采用固相萃取法对藻毒素进行提取，然后利用液相色谱质谱联用方法对藻体和水样中的毒素进行定性定量分析。
拟解决问题：
1.对实际藻种和水样进行定性定量分析的研究。
2.优化对液相色谱-质谱联用方法的开发。
3.摸索固相萃取法的条件和运用。
三、研究的方法与技术路线：
技术路线：
↓
研究方法：
1、淡水藻的培养
本研究所用的藻种均为中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库( FACHB C ollection) 提供。藻种采用BG11 液体培养基培养，室内温度25℃，光照强度为1000-1500lux，光暗比为12：12，每天摇瓶1-2次，静置培养。
2、藻毒素的提取、纯化
1）抽滤
取1000ml水样，用0.45μm滤膜抽滤，滤液用于测胞外毒素（EMC），滤膜上的藻细胞用于测胞内毒素（IMC）。
2）胞外毒素的前处理（固相萃取）
1.SPE C18小柱（500mg|6ml）预活化：用10ml纯甲醇去活化，再用10ml去离子水平衡。
2.1000ml滤过的水样过柱。
3.杂质淋洗：用20ml20%甲醇进行淋洗抽虑。
4.毒素洗脱：用10ml90%酸化甲醇（含0.1%三氟乙酸）洗脱，洗脱液收集于15ml离心管中。
5.旋转蒸发及定容：洗脱液旋转蒸发至＜1ml（0.5ml左右），用移液枪取出，甲醇定容至1ml，经针式滤器过滤，收集于1.5ml棕色进样品中，-20℃下保存待测。
3）胞内毒素的前处理
1.细胞破碎及藻毒素的提取：剪碎滤膜，加入30ml15%乙酸，65 ℃下水水浴10min，细胞超声破碎10min，再重复水浴、超声2次，0.45μm滤膜抽滤，滤过的水样用于测IMC。
2.其余步骤同上胞外毒素步骤。
色谱和质谱条件：
色谱：Hypersil Gold C18色谱柱（100 mm×2.1mm×1.7μm），进样量10 μL，柱温30℃，流动相为甲醇（A）、0.1%甲酸水溶液（B）和乙腈（C），流速0.2 mL/min，洗脱梯度为：Time (min) Methanol (%) 0.1%formic acid (%) ACN (%)
0 4 90 6
6 12 70 18
14 16 60 24
24 22 45 33
30 32 20 48
31 40 0 60
32 40 0 60
33 4 90 6
40 4 90 6
质谱：采用电喷雾电离源正离子电离模式，雾化气采用氮气，喷雾电压 2.8K V，鞘气流量 30 L/min，
辅助气流量 10 L/min，离子传输毛细管温度 300 ℃，扫描采用选择反应监测（SRM）模式。采集时
间均为0.2 s，碰撞气采用氩气，碰撞气压力1.5 mTorr。Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽 0.7Da。
四、研究的总体安排与进度：
2010.9 指导老师毕业论文题目下达
2010. 9-2010.11 进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和实验方案。
2010.11-2010.12 实验相关原料、药品的采购和相关仪器安装。
2010.12-2011.3 藻毒素的分离和各方面试验的进行。
2011.3-2011.4 完成2篇外文翻译，论文撰写、提交。
2011.4-2011.5 开题答辩。
五、主要参考文献：
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