酶活性及酪氨酸酶..
酶催化活性及其影响因素的研究
学院:化学与分子工程学院
班级:应用化学108班
姓名:王文移05 宁家彬06
指导老师:詹天荣
酶催化活性及影响其活性因素的研究
作者：王文移 宁家彬
[摘要]：酶广泛存在与生物体中，对生命的生化反应至关重要，本实验主要探
究不同浓度下催化活性的不同，以及温度，pH 值，抑制剂对于酶活性的影响。
[关键词]：酪氨酸酶，唾液淀粉酶，活性，pH ，温度，抑制剂
Enzyme is widespread and in living organisms, biochemical reactions vital to life, this experiment mainly explore different catalytic activity of different
concentrations, as well as temperature, pH value, effect of inhibitor for the enzyme activity.
[引言]
认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中在酶存在下的合成或分解与普通的有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性，是当今对酶的研究不可或缺的话题。通过本次实验能够掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析手段研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。
酪氨酸酶是一种氧化还原酶,它广泛存在于动植物和微生物中。土豆的提取液中含有酪氨酸酶。人唾液中的淀粉酶为a-淀粉酶，在唾液腺细胞内合成。酶的活性会受到很多因素的影响，如温度、PH 值、底物浓度以及激活剂抑制剂的影响。本实验目的在于测定各个因素对于酶活性的影响。
1.实验原理
本实验采用唾液淀粉酶及酪氨酸酶来进行反应，主要观察淀粉与试剂的反应颜色，多巴的吸光度。
本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。
由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。
酶的活性计算方法：一般定义在优化的条件下（包括pH 值、离子强度、温度等），25℃时在1min 内转化1mol 底物所需要催化剂的量为活性单位。通过
下式可计算酶的活性：610??=ktV
A
a ，式中，a 为所用溶液的酶的活性，A ?为
最大吸收波长吸光度的变化，t 为时间（min ），k 为多巴红的摩尔吸收系数，V 为加入酶的体积，进而计算出原料（土豆）中酶的活性：m aV o /A 。式中A 为原料中酶的活性（注意此处A 不是吸光度A ），V 0为原料所得的酶溶液的总体积，m 为原料总质量。
淀粉在淀粉酶作用下发生分解，其变化为：淀粉——紫色糊精——红色糊精——麦芽糖，葡萄糖。
淀粉与糊精无还原性，对班氏试剂呈阴性；麦芽糖与葡萄糖则是还原性的糖，与班氏试剂共热生成红棕色氧化亚铜的沉淀。
反应最适温度为37-40o C ，最适pH 为6.8，Cl -离子是激活剂，Cu 2+离子是抑制剂。
下图为多巴在酪氨酸酶的催化作用的下的反应历程
2.实验仪器与试剂
1、仪器：分光光度计、离心机、研钵、水浴、秒表
2、试剂：二羟基苯丙胺酸（多巴）、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸、土豆、淀粉溶液，碘液、班氏试剂、盐酸、乳酸、碳酸钠、氯化钠、硫酸铜
3.实验步骤
3.1 酪氨酸酶的活性研究
3.1.1.溶液配制
0.10mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.2）：50ml 0.20mol/L磷酸二氢钠+8ml
0.1mol/L盐酸，定容至200ml；
0.10mol/L磷酸缓冲溶液（pH=6.0）：50ml 0.20mol/L磷酸二氢钠+22ml
0.1mol/L盐酸，定容至200ml；
0.10mol/L多巴溶液：0.195g多巴，用pH=6.0的磷酸缓冲溶液定容至100ml （现用现配）。
3.1.2酶的提取
取新鲜土豆，清洁后切碎，称取10.0g置于研钵中，加入7.5mL pH=7.2的磷酸缓冲溶液，用力挤压，两层纱布滤出提取液，立即离心分离（3000rpm，
5min），倾出上层清液保存于冰浴中，提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。
3.1.3酶的活性测量
取2.5ml上述提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释到10ml比色管中，摇匀
分别取0.1mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入2.5mL pH=6.0的缓冲溶液，再加入2ml多巴溶液，同时开始计时，用分光光度计在480nm处测定吸光度。开始6min内每分钟读一个数，以后隔2min读一个数，直至吸光度变化不大为止。
取0.2ml，0.3ml。0.4ml已稀释过提取液重复上述实验（总体积为5ml）。
以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。
3.2淀粉酶的活性研究
3.2.1.淀粉酶活性的检测：取一只试管加入5ml淀粉溶液和0.2-2ml唾液，混匀后水浴（37o C）在白瓷板上用碘液观察颜色，至微黄色为止，向上述试管中加入2ml班氏试剂，放入沸水中加热十分钟观察实验现象
3.2.2.pH对酶活性的影响：取四只试管分别加入盐酸，乳酸，蒸馏水，碳酸钠各2ml再加入2ml淀粉溶液和2ml酶溶液，37度水浴，5分钟后加入2ml班氏试剂，沸水浴，观察沉淀生成情况
3.2.3.温度对酶的影响：三只试管分别加入3ml淀粉，另外三只加1ml淀粉酶，分别成组在0，37，70度下水浴，5分钟后混合，5分钟后加碘液，观察颜色
3.2.
4.抑制剂与激活剂的作用
3.3影响酶活性的因素的研究
（1）取0.40ml稀释过了的提取液在沸水浴中加热5min，冷却后配成测定溶液，观察现象。
（2）取0.40ml稀释过的提取液，加入少量的固体Na
2S
2
O
3
配成测定溶液，观
察现象。
（3）取0.40ml稀释过的提取液，加少量EDTA振动混合，反应一段时间后配成测定溶液，观察现象。
4.实验数据记录及讨论
(一)酪氨酸酶催化活性研究
加入不同量的酶在不同时间反应的吸光度如下表（表1）所示，由于反应在8分钟以后已经趋于平缓，故在12分钟以后的两组（14、16）实验数据未列出。
表1：不同酶加入量不同时间反应的吸光度测定
换动力学过程，再由直线部分得出转换速率，即为酶的活性。为使作图更为准确，现只取前六分钟内数据作图如下：
图1:0.10mol 提取液关系曲线 图
2:0.20mol 提取液关系曲线
图3:0.30mol 提取液关系曲线 图4:0.40mol 提取液关系曲线
依次得出不同提取液的活性，比较不同体积的提取液加入后相同量的多巴转换速率。由于放置时间较长，第四组实验已经失去可靠性。（酪氨酸酶的吸光系数为lg k=3.7。）
表2：酶的活性计算
(二)淀粉酶实验现象
进行的用沸水浴，EDTA及Na
2S
2
O
3
处理过的酪氨酸酶溶液进行实验发现沸水
浴与Na
2S
2
O
3
的吸光度几乎不变，而EDTA则是变小。可得出如下结论：
（1）在沸水浴中加热5分钟冷却后测得的溶液吸光度基本保持不变，其酶的活性在高温下失活。
（2）加入少量固体Na2S2O3配成的测定溶液，其测得的吸光度也基本保持不变且比（1）条件下的吸光度还小，其原因是硫代硫酸钠是还原剂，使蛋白质变性。
（3）稀释的提取液加入少量EDTA振动混合，其测得的吸光度在缓慢减小。其原因是EDTA与辅助因子络合，使酶活性失活。
5.实验结果讨论
根据酪氨酸酶的活性实验得出结果，可知活性本应当随着酶浓度的增大而增大，但在实际实验中却出现活性随酶浓度的增大而先增大后减小的情况出现，可能是因为在酶提取之后未保存在冰浴中导致没失活，从而导致酶活性的变化出现异常情况。
关于酶的活性影响因素的实验可得出以下结论
（1）pH对活性影响：
1.pH过小（过酸）、过大（过碱）都能使酶蛋白变性而失活.
2.pH的改变能影响酶活性中心上必须基团的解离程度，同时也可以影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化，只有在特定的pH 下，酶、底物和辅酶的解离状态，最适宜它们相互结合，并发生催化作用，从而使酶反应速度达到最大值。这个pH称为酶的最适pH。唾液淀粉酶的最适PH 为中性，故在蒸馏水中沉淀最多，盐酸酸性过强，使酶的活性失活，乳酸是弱酸，颜色基本不变，碳酸钠是弱碱，产生较少的沉淀。
（2）温度对酶活性的影响：
酶的催化作用受温度的影响很大，酶的化学本质是蛋白质，所以温度过高会引起蛋白质变性导致酶的失活，唾液淀粉酶在70°和0°时，酶活性失活，颜色呈蓝色。在37°时，是唾液淀粉酶的最适温度，淀粉遇唾液淀粉酶水解，颜色呈浅黄色。
（3）抑制剂与激活剂对酶活性的影响：
酶的活性受某些物质的影响，能使酶活性增加的称为激活剂，能使酶活性降低的称为抑制剂。很多少量的激活剂和抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性。本实验中氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。所以加入NaCl后，溶液颜色为浅黄色。氯离子促进唾液淀粉酶的水解。铜离子作为抑制剂，故加入硫酸铜后，溶液颜色为深蓝色。水作为对照变量，加入后对溶液稀释，颜色为浅蓝色。
参考文献
[l] KenllnerR,MermetJM,OttoMWindmerHM.Analytical
Chemistry.Chapter6.Weiheim:Wiley VCH，1998；北京大学、吉林大学合译．分析化学．北京:北京大学出版社，2000．第6章
[2] 王希成编．生物化学（第3版）．北京：清华大学出版社2010．第4章
[3] StryerL编，唐有棋等译．生物化学．北京：北京大学出版社，1990
[4] Frieclman M E,DaronHH.JchemEdu，1977，(54)：256
[5] 叶率官．化学试剂，1981，(2)；6
酪氨酸酶
酪氨酸酶 概念：酪氨酸酶(EC 1．14．18．1)是一种含铜的氧化还原酶，它与生物体合成色素直接相关．（长的黑有很大的一部分原因在自己）在人体中，它与色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有关 （酪氨酸酶的分布与动物的生理功能息息相关，不同动物的酪氨酸酶在体内分布的部位不同．多数昆虫在正常生理状态下，酪氨酸酶以酶原的形式存在，不同类型的酪氨酸酶存在于昆虫的特定部位，以完成特定的生理功能．美洲蜚蠊存在于血红细胞内，而麻蝇则仅存在于血浆中，并且在表皮中主要以活化形式的酪氨酸酶存在．昆虫酪氨酸酶除参与黑色素的形成外还是唯一参与角质硬化的酶．昆虫高度硬化的角质能阻断微生物和异物的入侵，并为柔软的元脊椎动物身体提供了保护．在节肢动物中，酪氨酸酶还参与其他两种重要的生理过程——防御反应和伤口愈合． 哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入到表皮和毛发的角质细胞中，使体表着色，从而起保护皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过热等作用．哺乳动物酪氨酸酶常见于黑素细胞中，黑素细胞是存在于皮肤，发囊和眼睛中并产生色素的高度特异性的细胞[1“]．酪氨酸酶功能减退或缺失时，即会影响黑色素代谢，从而发生疾病如白癫疯和白化病．动物与人的常染色体隐性疾病也与酪氨酸酶的缺失或活性下降有关．）作用机制：酪氨酸酶主要参与两个反应过程：催化L．酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌经一系列反应后，形成黑色素，与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关，并与昆虫的蜕皮（蝉蜕可以入药）和（苹果）果蔬的褐化有很大关系 （黑色素生物合成过程可大体分为两个阶段，第一阶段是由酪氨酸酶催化酪氨酸被羟化反应形成L_3，4一二羟基丙氨酸(L_多巴)(单酚酶活性)，并进步将L_多巴氧化生成多巴醌(二酚酶活性)。这两步反应都是由酪氨酸酶催化的，酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能．第二阶段从多巴醌(DOPAqui—non)为原料从两个不同途径分别生成真黑素和褪黑素的过程．真黑素生成，多巴醌经多聚化反应等一系列反应生成无色多巴色素，极不稳定的无色多巴色素被另一分子多巴醌氧化为多巴色素，多巴色素经异构、脱羧生成5，6一二羟基吲哚(DHI)，5，6一二羟基吲哚(DHI)由酪氨酸酶催化氧化为真黑色素的前体吲哚一5，6一醌(IndQu)；褪黑素生成，多巴醌(DOPAquinon)与半胱氨酸(Cys)反应生成产生5-Cys一多巴及5-Cys一多巴醌，然后成环、脱羧变成苯肼噻嗪的衍生物，最后形成褪黑素．在第二阶段，只有少数几步反应由酪氨酸酶、异构酶或金属离子催化，大部分反应都是自发的，因此酪氨酸酶是整个黑色素生成反应的限速酶，第一阶段的两步反应是限速步骤．） 活性中心：酪氨酸酶的活性中心是由两个含铜离子位点构成．在催化过程中，双核铜离子位点以3种形态存在，分别是氧化态、还原态和脱氧态．研究表明与酪氨酸酶结合的双核铜离子活性中心与在血蓝蛋白中发现的活性中心非常相似、
酶活性及酪氨酸酶..
酶催化活性及其影响因素的研究 学院:化学与分子工程学院 班级:应用化学108班 姓名:王文移05 宁家彬06 指导老师:詹天荣
酶催化活性及影响其活性因素的研究 作者：王文移 宁家彬 [摘要]：酶广泛存在与生物体中，对生命的生化反应至关重要，本实验主要探 究不同浓度下催化活性的不同，以及温度，pH 值，抑制剂对于酶活性的影响。 [关键词]：酪氨酸酶，唾液淀粉酶，活性，pH ，温度，抑制剂 Enzyme is widespread and in living organisms, biochemical reactions vital to life, this experiment mainly explore different catalytic activity of different concentrations, as well as temperature, pH value, effect of inhibitor for the enzyme activity. [引言] 认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中在酶存在下的合成或分解与普通的有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性，是当今对酶的研究不可或缺的话题。通过本次实验能够掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析手段研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。 酪氨酸酶是一种氧化还原酶,它广泛存在于动植物和微生物中。土豆的提取液中含有酪氨酸酶。人唾液中的淀粉酶为a-淀粉酶，在唾液腺细胞内合成。酶的活性会受到很多因素的影响，如温度、PH 值、底物浓度以及激活剂抑制剂的影响。本实验目的在于测定各个因素对于酶活性的影响。 1.实验原理 本实验采用唾液淀粉酶及酪氨酸酶来进行反应，主要观察淀粉与试剂的反应颜色，多巴的吸光度。 本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。 由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。 酶的活性计算方法：一般定义在优化的条件下（包括pH 值、离子强度、温度等），25℃时在1min 内转化1mol 底物所需要催化剂的量为活性单位。通过 下式可计算酶的活性：610??=ktV A a ，式中，a 为所用溶液的酶的活性，A ?为
蛋白酪氨酸磷酸酶
蛋白酪氨酸磷酸酶 本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！ 1988年Tonks等首次在人的胎盘细胞中分离和纯化了第一个37kDa的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(ProteinTyrosinePhosphatase-1B，PTP-1B)。 PTP1B是一种胞内PTP，位于内质网，在人体的各种组织中都有表达;其与蛋白酪氨酸激酶(ProteinTyrosineKinases，PTK)共同维持着酪氨酸蛋白磷酸化的平衡，参与细胞的信号转导，调节细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等。 PTP1B属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族，专一水解芳香族磷酸，如磷酸化酪氨酸(phosphotyrosyl，pTyr)残基上磷酸根的酶，通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号转导进行负调节，组织细胞中PTP-1B过表达都会降低PTK的活性，使胰岛素受体无法与胰岛素结合，进而引起胰岛素抵抗，最终导致2型糖尿病。 PTP-1BDNA的启动子上有一个转录因子Y盒结合蛋白-1的结合位点，它的过度表达可使PTP-1B的表达水平增加。使用反义寡核苷酸技术减少其表达后，
PTP-1B的表达随之降低，呈正相关趋势。 PTP-1B在体内没有自身的特异性受体，而是在细胞信号传导过程中，与PTP家族中的其他成员以及蛋白酪氨酸激酶协同作用，调控蛋白底物中酪氨酸的磷酸化水平，进而对细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等功能进行调节。 1PTP-1B的生理功能 目前研究发现PTP-1B主要表现出以下几个方面的生理功能： (1)与胰岛素受体(insulinreceptor，IR)、胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate，IRS)等信号蛋白作用，使这些蛋白调节区的酪氨酸残基去磷酸化，进而阻断胰岛素信号级联反应的下传，在胰岛素信号中起着负调控作用。与II型糖尿病的发生具有密切的联系。 (2)在瘦素信号传导过程中，通过降低转录激活子-3(STAT-3)和Janus激酶-2(JAK-2)的磷酸化水平，在瘦素信号中起负调控作用。与肥胖的发生具有密切的联系。 (3)PTP-1B通过与生长因子等底物相互作用，参与细胞生长周期的调节，与肿瘤的发生具有一定的联系。 除此之外，研究还发现PTP-1B在催乳素信号传
酪氨酸酶活性抑制实验方案报告
酪氨酸酶活性抑制实验方案报告 1．1 材料： 酪氨酸酶（或用马铃薯制备）、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 恒温仪、紫外分光光度计、离心机。 1.2 试剂配制 1)磷酸钠缓冲液(1/15 mol／L，pH=6．8) 精确称取1.000 g磷酸二氢钠，1.186 g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500 mL，4℃冰箱保存备用。 2)L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L) 精确称取L_酪氨酸0.272 g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50 mL，微热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7左右，加去离子水定容至200mL。 3)受试液 精确称取受试样品0.1g，分别溶于20 mL去离子水，得到5 mg/mL的待测液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。 4)阳性对照(+CK) 精确称取0.1 g熊果苷粉末，溶于20mL的去离子水中，得到5 mg/mL的阳性对照母液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。
5) 酪氨酸酶液的制备 以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1： 1( W:V )的比例加入4℃ 预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10 min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2 h内用完。 1.3 检测方法 总反应体系为5mL。具体设计见表l。 在此体系中，受试液，包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为 0.03l25、0.062 5、0.125，0.25、0.5。 实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液，于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应20 min时475 nm波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶的抑制率，并依据浓度一酶抑制率曲线估计半数抑制浓度(IC50)的近似值。 抑制率=[(A-B)/A]×l00％ 其中，“A”为标准对照的吸光值，“B”为受试液(或阳性对照)的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。 表1 5mL试验体系设计
酪氨酸酶的催化作用
酪氨酸酶的催化作用 [原理] 酪氨酸酶是一种以铜为辅基的结合蛋白酶，这种氧化酶可直接作用于底物多巴生成多巴醌，然后经过一系列的反应，最终生成黑色素。在多巴转变为多巴醌的反应中，酪氨酸酶使多巴中的氢原子的两个电子传递给分子氧，使后者转变为氧离子，游离在溶液中的两个质子与氧离子化合生成水。其催化的主要反应及电子传递过程如下： 酪氨酸是甲状腺素、肾上腺素和黑色素的前体。人类皮肤、毛发和眼睛虹膜的黑色素是酪氨酸在酪氨酸羟化酶催化作用下生成了3,4-二羟苯丙氨酸（简称多巴，DOPA ），后者在酪氨酸酶的作用下生成多巴醌，而后经过一系列中间反应，最后聚合成黑色素。白化病（albunism ）是一种表现为皮肤、毛发和虹膜变白，因为缺乏酪氨酸酶而不能合成黑色素的先天性代谢缺陷性疾病。 酪氨酸酶也广泛分布于植物界，例如新鲜蘑菇、马铃薯（外层含量尤多）和谷物等。 [试剂] 1．酪氨酸溶液 0.1g 酪氨酸溶于100ml 0.1%碳酸钠溶液中。 2．马铃薯抽提液 切碎马铃薯约6g 置于研钵中，加少量净砂，研成匀浆，再加蒸馏水l0ml 充分研磨；最后通过棉花过滤，即可获得含有酪氨酸酶的马铃薯抽提液。 3．煮沸过的马铃薯滤液 取2ml 试剂2于试管内，在酒精灯上加热至沸以破坏酶的活性。 4．液体石蜡 [主要器材] 研钵、恒温水浴箱 CHCOOH 2 酪氨酸 2
[操作步骤] 取试管3支按表10进行操作 表10 试剂（滴） 1 2 3 煮沸过的马铃薯液20 —— 马铃薯抽提液—20 20 酪氨酸液20 20 20 充分混匀各管 液体石蜡—— 5 置35℃~40℃水浴约30分钟，观察并记录各管颜色，试解释所得的结果。 [注意事项] 1．煮沸马铃薯液时，小心勿使液体溅出。 2．加液体石蜡时宜斜执试管，沿管壁缓缓加入，不要产生气泡；加入的液体石蜡必需完全覆盖液面，以隔绝空气。
酪氨酸酶抑制率测定方法
1. 4念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制 1. 4. 1念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活力的影响 提取物对酪氨酸酶的抑制参照Masuda和Kubo的方 法[ 6, 7] , 并略作修改。待测样品用DMSO 进行浓度 梯度稀释, 浓度分别为1、05、025、0125 mg / mL; 换算成反应体系中的终浓度分别为333、1665、8325、4 3 g /mL。反应在96孔细胞板上 进行, 每组8孔, 分别是: A. 不含样品, 但含酪氨酸 酶的阴性对照, 3孔重复; B. 不含样品及酪氨酸酶的 空白对照, 1孔; C. 包含样品及酪氨酸酶, 3孔重复, D. 含样品但不含酪氨酸酶的空白对照, 1 孔。A 孔 中加入190 L pH 68、0 1 mo l/L 磷酸缓冲液, 10 L 1380 U /mL酪氨酸酶; B 孔中加入200 L 相 同的磷酸缓冲液; C 孔中加入180 L磷酸缓冲液, 10 L 1380 U /mL酪氨酸酶, 10 L样品; D 孔中加 入190 L磷酸缓冲液, 10 L样品。然后将细胞板 在30条件下放置5 m in, 再在每孔中加入100 L 2 5 mmo l/L L-酪氨酸( 见表1 )。在30反应 10m in后, 立即置于Tecan Sunrise 酶标仪中测量在475 nm下的吸光值。提取物对酪氨酸酶活性的抑 制按公式计算: 抑制率=( A - B ) - ( C- D)*100% A – B
参照文献方法〔3〕在数支干燥的试管中 各加入1.oml0.03%左旋多巴溶液，再加上维 生素E一日环糊精溶液，(加入量按表所列体积) 最后的磷酸钠缓冲液加至5.Oml，25℃恒温10 min后，加入0.4ml酶提取液，立即计时并迅速置于恒温槽内，待反应1min，用BaCRman DV一70型分光原度计在475nm处测定吸收度，以缓冲液为参比，然后根据多巴色素的消光系数“=3700求出Vi，把无维生素E一日环糊精溶液存在时速度定为100%，求出不同浓度维生 素E一日环糊精存在时酶的相对活性以及对酶的抑制率 抑制率二V。空白一V抑制V。空白x100%
蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP_1的中药抑制剂筛选
第46卷 第6期吉林大学学报(理学版) Vol .46 No .6 2008年11月JOURNAL OF J I L I N UN I V ERSI TY (SC I E NCE E D I TI O N ) Nov 2008 蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21的中药抑制剂筛选 李婉南1 ,李 莹1 ,庄 妍1 ,李 贺1 ,陈颖丽2 ,赵志壮 1,3 ,付学奇 1 (1.吉林大学生命科学学院,长春130012;2.吉林省中医药科学院,长春130021; 3.美国俄克拉荷马大学健康科学中心,俄克拉荷马城73104,美国) 摘要:用含有蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21催化结构域(ΔSHP 21)的质粒转化大肠杆菌,得到 ΔSHP 21的高效表达,经分离纯化后,以ΔSHP 21为靶标,通过体外酶反应动力学实验,对157种中药水提液的抑制效果进行研究,筛选出两种对ΔSHP 21具有显著抑制作用的中药:山茱萸和蒲公英,并对其I C 50及抑制类型做了进一步研究.为建立蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂的筛选方法和中药在治疗免疫疾病和糖尿病上的开发和应用提供了理论依据.关键词:包含SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶1(SHP 21);中药;抑制剂;筛选中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:167125489(2008)0621211206 Screen i n g Traditi onal Chi n ese M edi ci n es for I nhi bitors of Prote i n Tyrosi n e Phosphat ase SHP 21 L IW an 2nan 1 ,L I Ying 1 ,ZHUANG Yan 1 ,L I He 1 ,CHEN Ying 2li 2 ,ZHAO Zhi 2zhuang 1,3 ,F U Xue 2qi 1 (1.College of L ife Sciences,J ilin U niversity,Changchun 130012,China; 2.A cade m y of Traditional Chinese M edicine and Herbs of J ilin P rovince,Changchun 130021,China; 3.Health Sciences Center ,O klaho m a U niversity,O klaho m a C ity 73104,USA ) Ab s trac t:W ith pT7as a vect or,ΔSHP 21,a recombinant p r otein containing the catalytic domain of p r otein tyr osine phos phatase SHP 21,was highly exp ressed in E .coli cells .The enzy me was further purified t o near homogeneity .W ith the purified recombinant enzy me as a target,aqueous extracts of 157traditi onal Chinese herb medicines were analyzed f or their abilities t o inhibit SHP 21.T wo most potent inhibit ors,na mely,cornel and dandeli on,were identified,and their I C 50values and inhibit ory types were further analyzed .This study thus established a good syste m t o screen inhibit ors of SHP 21and de monstrated the potential of traditi onal Chinese medicines in treat m ent of i m munol ogical diseases and diabetes . Key wo rd s:SH22containing tyr osine phos phatase 1(SHP 21);traditi onal Chinese herb;inhibit or;screening 收稿日期:2008201215. 作者简介:李婉南(1975～),女,汉族,博士,讲师,从事蛋白质酪氨酸结构与功能的研究,E 2mail:wyshshk@https://www.sodocs.net/doc/268921622.html,.联系人:付学奇(1960～),男,汉族,博士,教授,博士生导师,从事细胞信号传导与药物筛选的研究,E 2mail:fxq@jlu .edu .cn . 基金项目:吉林省科技发展计划项目基金(批准号:20060563;200705394;20080434). 蛋白质酪氨酸磷酸酶(Pr otein Tyr osine Phos phatase,PTPs )与蛋白质酪氨酸激酶(Pr otein Tyr osine Kinases,PTKs )协同作用,控制着蛋白质酪氨酸的磷酸化过程,调节细胞生长发育,并在细胞信号传导过程中发挥重要作用 [1] ,许多生理和病理现象都与此相关 [2] .研究表明,一些疾病如某些癌症、糖尿 病、白血病、免疫缺陷病、努南氏综合症等正是由于PTPs 的基因突变或异常表达导致的[3,4] ,因此 PTPs 已经成为继PTKs 之后又一个热门的研究领域.SHP 21(SH22Containing Tyr osine Phos phatase 1),又称为HCP,SHPTP1或PTP1C,是含有SH2结构域的具有高度保守序列的蛋白质酪氨酸磷酸酶的亚家
酪氨酸酶活性抑制实验方法
酪氨酸酶活性抑制实验方法 一、试剂：酪氨酸酶、酪氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、阳性对照（熊果苷粉末）、样品、去离子水 二、试剂配制： 1、磷酸盐缓冲溶液（PH=6.8）：先分别配制0.2M的磷酸二氢钠和0.2M的磷酸氢二钠。 0.2M磷酸二氢钠：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 去离子水； 0.2M磷酸氢二钠：称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 去离子水； 取51ML磷酸二氢钠+49ML磷酸氢二钠即得0.2M、PH=6.8的磷酸缓冲液。 2、L-酪氨酸溶液：称取L-酪氨酸25.6 g，用磷酸缓冲液定容于50mL容量瓶 中，即得L-酪氨酸溶液。 3、酪氨酸酶溶液：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1：1（W:V ）的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2h内用完。 4、受试液的配制：将原先所配5mg/ml的溶液用甲醇稀释到1mg/ml.。 5、阳性对照：取熊果苷粉末0.01g，溶于10ml的甲醇溶液，即得1mg/ml的 对照品溶液。 三、实验方法： 依下表所示向试管中依次加入磷酸盐缓冲溶液、样品溶液、酪氨酸溶液，于35℃水浴10分钟。然后加入酪氨酸酶液，混匀，再在35 ℃下孵育30min，迅速转移至比色皿中，在475nm处测定吸光值。
受试组用空白对照组1调零，阴性对照组用空白对照组2调零，阳性对照组用空白对照组3调零。 受试组吸光值为A1，阴性对照组吸光值为A2，阳性对照组吸光值为A3。 抑制率=1－[（A1－A2）/(A3－A2)]×100%=（A3－A1）/(A3－A2)×100% 注：受试液组共四种样品
蛋白酪氨酸磷酸酶
蛋白酪氨酸磷酸酶 蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）是细胞增殖和信号传导的调节过程中，调节蛋白酪氨酸残基磷酸化水平的酶家族。PTP 和蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）及其各自相应的底物协同作用，形成一个复杂的信号传导网络，通过调控蛋白氨基酸残基的磷酸化水平，调节生物体内细胞的生长、分化、代谢过程，参与细胞周期调控、细胞迁移、基因转录和免疫应答等过程。目前的研究发现人类共有112 种PTPs，依据它们的结构分为酪氨酸特异性、双特异性和低分子量磷酸酶，其中蛋白酪氨酸磷酸酶-1B （Protein Tyrosine Phos－phatase-1B，PTP-1B）于1988 年由Tonks 等首次在人的胎盘细胞中分离和纯化得到，属于酪氨酸特异性磷酸酶，依据受体结构可分为受体样PTP-1B 和胞内PTP-1B。PTP-1B 专一水解芳香族磷酸，由435 个氨基酸残基组成，分子量约50ku。其结构中有一个氨基末端催化区和两个富含脯氨酸的模序。PTP-1B 在肌肉、心、肝、睾丸、肾、脾、脑和脂肪等组织中广泛表达，主要集中在细胞浆的内质网的表面。PTP-1B 的N 端为包含半胱氨酸和精氨酸残基的催化中心，朝向胞浆方向；C 端通过35 个特异性氨基酸与内质网相结合，羧基末端水解断裂后从内质网释放出有活性的PTP1B；N 端和C 端之间为两段富含脯氨酸的区域，在PTP1B 与其他蛋白之间的相互作用上发挥重要作用。 PTP-1B DNA 的启动子上有一个转录因子Y 盒结合蛋白-1 的结合位点，它的过度表达可使PTP-1B 的表达水平增加。使用反义寡核苷酸技术减少其表达后，PTP-1B 的表达随之降低，呈正相关趋势。 PTP-1B 在体内没有自身的特异性受体，而是在细胞信号传导过程中，与PTP 家族中的其他成员以及蛋白酪氨酸激酶协同作用，调控蛋白底物中酪氨酸的磷酸化水平，进而对细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等功能进行调节。 1 PTP-1B 的生理功能 目前研究发现PTP-1B主要表现出以下几个方面的生理功能： （1）与胰岛素受体（insulin receptor ，IR）、胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）等信号蛋白作用，使这些蛋白调节区的酪氨酸残基去磷酸化，进而阻断胰岛素信号级联反应的下传，在胰岛素信号中起着负调控作用。与II 型糖尿病的发生具有密切的联系。 （2）在瘦素信号传导过程中，通过降低转录激活子-3（STAT-3）和Janus 激酶-2（JAK-2）的磷酸化水平，在瘦素信号中起负调控作用。与肥胖的发生具有密切的联系。 （3）PTP-1B 通过与生长因子等底物相互作用，参与细胞生长周期的调节，与肿瘤的发生具有一定的联系。 除此之外，研究还发现PTP-1B 在催乳素信号传导、血小板凝集等方面具有一定的影响。 2 PTP-1B 与糖尿病之间的关系 糖尿病是一类慢性代谢性疾病，随着生活水平的提高，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势，成为继心脑血管疾病及癌症之后，威胁人类健康的第三大类疾病。目前已有约 3 亿糖尿病患者，到2030 年，预计患者人数将突破5 亿。根据糖尿病的发病机制，糖尿病可分为I 型糖尿病和II 型糖尿病，其中II 型糖尿病患者超过糖尿病患者总数的80%，主要表现为胰岛素抵抗或胰岛素受体不敏感，分泌胰岛素的胰腺B 细胞数量减少，功能障碍，从而导致糖代谢障碍，血糖水平升高。对PTP-1B 生理功能的研究已经证实，其与胰岛素及瘦素信号传导呈负调节关系，因此PTP-1B 与II 型糖尿病的发病原因关系密切，是开发II 型糖尿病治疗药物的重要靶点之一。 2.1 PTP-1B 胰岛素抵抗：代谢过程中，胰岛素可与脂肪、骨骼肌、肝细胞等细胞的细胞膜上的胰岛素受体胞外亚基结合，进而使受体胞内亚基酪氨酸激酶活化，导致自身及其底物
酪氨酸酶
酪氨酸酶(EC 1.14.18.1,Tyrosinase)是一种含 铜的金属酶,广泛分布于微生物、动植物及人体中[1]. 在植物中,酪氨酸酶一般称为多酚氧化酶;在昆虫中, 则称为酚氧化酶;在微生物和人体中,才称为酪氨酸 酶.酪氨酸酶主要参与两个反应过程:催化L-酪氨酸 羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌,多巴 醌经一系列反应后,形成黑色素.酪氨酸酶在生物体中 具有重要的生理功能.同时,它也与人体雀斑、褐斑等 黑色素过度沉积等疾病的发生有关,并与昆虫的蜕皮 和果蔬的褐化有很大关系[2]. 自从发现了人黑色素细胞可以以L-3,4-二羟基 丙氨酸(L-多巴)为底物合成黑色素,这个反应成为酪 氨酸酶活性和定位检测的基础.在之后的研究中,酪氨 酸酶成为第一个用亲和色谱纯化的酶,酪氨酸酶也是 最早发现能将酶分子内部氧原子参入到有机物中的酶;并为酶自杀性失活提供了早期实例.现今,人们已 经从微生物、植物及多种动物中提取并纯化了酪氨酸酶. 目前,对酪氨酸酶的研究主要集中在酶的分离纯 化、催化机制、活性调控以及酪氨酸酶基因及其在生物体内的生理作用等方面,在结构方面,其三维结构仍未 得到.鉴于此,对编码酪氨酸酶基因的结构、表达及其 调控,酪氨酸酶的合成和运输的研究也在不断发展. 酪氨酸酶的理化性质 高等脊椎动物、低等脊椎动物和原核生物的酪氨 酸酶的理化性质不同.由表1可以看到,从Strepto- myces antibioticus的272个氨基酸到Homo sapiens 的529个氨基酸,不同生物中的酪氨酸酶氨基酸数目 差异很大.虽然它们在生物体内具有相似的生理功能, 但它们的理化性质却有不同程度的差异性.酪氨酸酶 在同工酶的研究也占有非常重要的地位,是生物体内 具有同工酶的一大类酶.据研究,哺乳动物、原核动物、真菌的酪氨酸酶一般为单聚体或二聚体;而昆虫、两栖类的酪氨酸酶一般为二聚体、四聚体或五聚体等多聚体.
蛋白酪氨酸磷酸酶-1B与糖尿病之间的关系研究
蛋白酪氨酸磷酸酶-1B与糖尿病之间的关 系研究 本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！ 1988年Tonks等首次在人的胎盘细胞中分离和纯化了第一个37kDa的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(ProteinTyrosinePhosphatase-1B，PTP-1B)。 PTP1B是一种胞内PTP，位于内质网，在人体的各种组织中都有表达;其与蛋白酪氨酸激酶(ProteinTyrosineKinases，PTK)共同维持着酪氨酸蛋白磷酸化的平衡，参与细胞的信号转导，调节细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等。 PTP1B属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族，专一水解芳香族磷酸，如磷酸化酪氨酸(phosphotyrosyl，pTyr)残基上磷酸根的酶，通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号转导进行负调节，组织细胞中PTP-1B过表达都会降低PTK的活性，使胰岛素受体无法与胰岛素结合，进而引起胰岛素抵抗，最终导致2型糖尿病。
PTP-1BDNA的启动子上有一个转录因子Y盒结合蛋白-1的结合位点，它的过度表达可使PTP-1B的表达水平增加。使用反义寡核苷酸技术减少其表达后，PTP-1B的表达随之降低，呈正相关趋势。 PTP-1B在体内没有自身的特异性受体，而是在细胞信号传导过程中，与PTP家族中的其他成员以及蛋白酪氨酸激酶协同作用，调控蛋白底物中酪氨酸的磷酸化水平，进而对细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等功能进行调节。 1PTP-1B的生理功能 目前研究发现PTP-1B主要表现出以下几个方面的生理功能： (1)与胰岛素受体(insulinreceptor，IR)、胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate，IRS)等信号蛋白作用，使这些蛋白调节区的酪氨酸残基去磷酸化，进而阻断胰岛素信号级联反应的下传，在胰岛素信号中起着负调控作用。与II型糖尿病的发生具有密切的联系。
酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究
酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究 作者 摘要 关键词 一．实验目的 1.认识生物体中酶的存在和催化作用，便于我们了解生物体系中酶存在下的合成或分 解与普通的有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性。 2.掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析的手段研究催化反应特别 是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。 二．实验原理 许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压等苛刻条件下才能进行，而在生物体内，即使在十分温和的条件下，如常温、常压和近中性溶液中，许多复杂的化学反应却能顺利进行，其根本原因就是由于生物酶的存在。 生物酶是一种生物催化剂，按照它的组成，可分为两类，一类是简单蛋白质，其活性取决于它的结构，如脲酶、淀粉酶等；第二类的结合蛋白质酶，它需要加入某些非蛋白质组分（称为辅助因子）后，才能表现出酶的活性。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。 通常反被酶作用的物质称为该酶的底物，一种酶催化特定的一个或一类底物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，因而引起广大分析工作者的重视和兴趣。酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是有生化、医学方面有很高的应用价值。例如生命物质和流体中的特殊有机成分，用其他方法测定有困难，用酶法分析却有其独到之处。 本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。 由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。 其反应过程如下图所示
酪氨酸酶催化活性
综合实验辅导教材 酪氨酸酸酶的提取及催化活性的研究 一、实验目的 认识生物体中酶的存在和催化作用，了解从土豆中提取酶的方法和研究酶活性的一般方法，学会用现代分析手段研究催化反应，特别是生物化学体系中催化过程的基本思路和方法。 二、实验原理 许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压等苛刻条件下才能进行，而在生物体内，即使在十分温和的条件下，如常温、常压和近中性溶液中，许多复杂的化学反应却能顺利进行，其根本原因就是由于生物酶的存在。生物酶是一种生物催化剂，按照它的组成，可分为两类，一类是简单蛋白质，其活性取决于它的结构，如脲酶、淀粉酶等；第二类的结合蛋白质酶，它需要加入某些非蛋白质组分（称为辅助因子）后，才能表现出酶的活性。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。 通常反被酶作用的物质称为该酶的底物，一种酶催化特定的一个或一类底物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，因而引起广大分析工作者的重视和兴趣。酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是有生化、医学方面有很高的应用价值。例如生命物质和流体中的特殊有机成分，用其他方法测定有困难，用酶法分析却有其独到之处。 本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。 由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。 酶的活性计算方法：一般定义在优化的条件下（包括pH 值、离子强度、温度等），25℃时在1min 内转化1μmol 底物所需要催化剂的量为活性单位。通过下式可计算酶的活性：6 10??= ktV A a ，式中， a 为所用溶液的酶的活性，A ?为最大吸收波长吸光度的变化，t 为时间（min ），k 为多巴
酪氨酸酶活性抑制实验方案
酪氨酸酶活性抑制实验方案 1．1 材料： 酪氨酸酶（或用马铃薯制备）、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 恒温仪、紫外分光光度计、离心机。 1.2 试剂配制 1)磷酸钠缓冲液(1/15 mol／L，pH=6．8) 精确称取1.000 g磷酸二氢钠，1.186 g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500 mL，4℃冰箱保存备用。 2)L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L) 精确称取L_酪氨酸0.272 g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50 mL，微热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7左右，加去离子水定容至200mL。 3)受试液 精确称取受试样品0.1g，分别溶于20 mL去离子水，得到5 mg/mL的待测液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。 4)阳性对照(+CK) 精确称取0.1 g熊果苷粉末，溶于20mL的去离子水中，得到5 mg/mL的阳性对照母液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。 5) 酪氨酸酶液的制备 以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1：1( W:V )的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10 min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2 h内用完。 1.3 检测方法 总反应体系为5mL。具体设计见表l。 在此体系中，受试液，包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为0.03l25、0.062 5、0.125，0.25、0.5。 实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液，于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应20 min时475 nm 波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液(包括阳性对
酪氨酸酶的提取及其催化活性研究
酪氨酸特性及其影响因素 摘要：酶是由生物细胞合成的、对特定底物起高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂。生 物体内所有的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。只要有生命活动的地方就有酶的作用，生命不能离开酶的存在。在酶的催化下，机体内物质的新陈代谢有条不紊地进行着；同时又在许多因素的影响下，酶对代谢发挥着巧妙的调节作用。生物体的许多疾病与酶的异常密切相关；许多药物也可通过对酶的作用来达到治疗的目的。随着酶学研究的深入，必将对人类社会产生深远影响和做出巨大贡献。 Summary: The enzyme is high efficiency catalyst on a specific substrate protein synthesis by biological cells is the biological catalyst. Chemical reactions in all organisms is almost in the under the catalysis of enzyme. As long as there is life there is the function of enzyme the enzyme in the presence of life can not leave. In the enzyme catalytic machine body material the new supersedes the old. With everything in good order and well arranged; and at the same time, the influence of many factors under the regulation of enzyme plays cleverly on metabolism. Many diseases and enzyme of organisms are closely related; many drugs can also be based on the role of the enzyme to achieve the purpose of treatment. With the in-depth study of bound enzyme have a far-reaching impact on human society and make great contributions to. 关键词：酶催化活性影响因素 正文 引言：酶是具有催化作用的蛋白质。其活性仅决定于它的蛋白质结构。酶与一般非生物催化剂相比，具有以下几个特点： 1、酶的主要成分是蛋白质。它具有表现活性和专一性所必需的空间结构，以提供反应中心。由于蛋白质遇高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线等容易变性而失活，所以酶促反应都是在比较温和的条件下进行的。 2、酶促反应所需的活化能较低。如使1mol 蔗糖水解所需活化能高达1.34MJ，用H+离子作催化剂时活化能降至87.9 KJ，若用蔗糖酶催化时只需39.4 KJ。 3、酶的催化效率非常高。酶的催化效率通常比非催化反应高108 ~1020倍，比一般非生物催化剂高107~1013倍。 4、酶具有高度的专一性。酶对所作用的底物有严格的选择性，每一种酶只能对某一类物质甚至只对某一种物质起催化作用，这是一般非生物陈化剂所无法比拟的。 影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH值、温度和抑制剂等。在酶浓度恒定的情况下，增加底物的浓度，可以提高酶促反应的初速度。当底物浓度增至某一限度后，反应初速度就不再随底物的浓度而变化，而是逐渐趋近某一极限值，这个极限值称为最大速度(V max)。 酪氨酸的提取及其催化活性研究
组织酪氨酸酶(tyrosinase)活性比色法定量检测试剂盒产品
组织酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 组织酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过酪氨酸酶反应系统中底物酪氨酸氧化后，产生多巴色素，呈现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定组织裂解悬液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种人体和动物组织，尤其是皮肤、眼睛和黑色素瘤组织裂解悬液样品中酪氨酸酶的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 酪氨酸酶（tyrosinase；EC1.14.18.1）是一种单酚单加氧酶（monophenol monooxygenase），又称为单酚酶（monophenolase）或单酚二羟基苯丙氨酸：O2氧化还原酶（monophenol dihydroxyphenylalanin：O2 oxidoreductase），具有双功能的含铜糖蛋白，广泛存在于植物、酵母和动物组织中，其蛋白结构、大小、糖基化方式、激活特征等都不同。人体酪氨酸酶是一个跨膜蛋白，而催化结构域在黑色素细胞（melanocyte）或色素细胞的黑色素器（melanosome）里。酪氨酸酶通过催化L-酪氨酸（L-tyrosine）等的o-羟基化 （o-hydroxylation）反应变成L-多巴（L-dopamine），进而氧化产生黑色素底物多巴醌（dopaquinone），从而由多巴色素（dopachrome）转化为黑色素（melanin）中的真黑素（eumelanin），以及其它色素，包括毛发和眼睛色素。紫外线可以激活酪氨酸酶活性，严重时，会引起色素沉着（hyperpigmentation）。酪氨酸酶基因突变将导致I型眼皮肤白化病（oculocutaneous albinism）。酪氨酸酶抑制剂成为增白化妆品的重要元素。基于底物酪氨酸，在酪氨酸酶的催化下，产生多巴色素，通过其吸光值的变化（475nm波长），来定量测定酪氨酸酶的活性。其反应系统为： 产品内容 清理液（Reagent A）毫升 裂解液（Reagent B）毫升 缓冲液（Reagent C）毫升 底物液（Reagent D）毫升 阴性液（Reagent E）微升 产品说明书1份 保存方式 保存裂解液（Reagent B）和底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保证6月 用户自备