脾脏单个核细胞的制备

脾脏单个核细胞的制备

脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RPMI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白;

收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混

匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计

数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 10 / 300 μl 的浓度。《流式细胞术检测小鼠

脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》

单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾

脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。加入2 mL RPM I- 1640完

全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织

碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10%

小牛血清的RPM I- 1640 培养液。台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至

5×10 cells /L。《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》

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制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:

手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈

椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出

脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。粗剪成小块, 用

注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加

人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。收集滤过的细胞悬液, 加人0.83 % 的氯化铵到滤

过的细胞中, 静置5 min , 以除去血红细胞。用RPM-ll640 培养液离心( 2500

r/min,10min) 洗涤细胞3 次, 以除去剩余的氯化铵将上述收集到的脾脏细胞置于玻璃培

养瓶中, 在37 ℃ 、5 % C O: 培养箱中静置培养2 h , 以除去贴壁细胞, 收集未贴壁的

细胞悬液即获得脾淋巴细胞。计数接种培养。台盼蓝染色计数, 活细胞数大于95 % 。

《从Ca2+通路研究紫草多糖促进小鼠淋巴细胞增殖的机制》

，

14日龄健康鸡，无菌取脾脏，Hanks'液洗3 次，卡介苗注射器芯研磨，200 目筛网

过滤，制成单细胞悬液，离心( 1000r/min) ，弃上清，Tris-NH4Cl 破解红细胞，冰水浴

放置10min，离心( 1000 r /min) ，弃上清，Hanks'液洗3 次。加入无酚红1640 培养液重悬细胞，计数，调整细胞浓度为1 × 10 cell /mL。于96 孔细胞培养板培养。《马尾

藻多糖对鸡脾脏淋巴细胞增殖及氧化应激影响的实验观察》

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1. 3 鼠脾淋巴细胞的制备小鼠脱颈处死, 于75% 酒精中浸泡5 min, 在超净工作台中无菌打开腹腔, 取出脾脏, 用含有高浓度青链霉素( 青霉素300 IU/ ml+ 链霉素

300μg/ ml) 的PBS液洗涤2-3 次, 剥去脾脏周围结缔组织。将处理好的脾脏移入一无菌青霉素瓶中, 加入适量的RPMI1640 完全培养液( RPMI1640+ 10%胎牛血清+ 青霉素100 IU/ ml+ 链霉素100 μg /ml) , 眼科剪剪碎, 400 目网筛过滤, 收集滤液并叠加于等体积的小鼠淋巴细胞分离液上, 2000 rpm 离心15 min。用无菌吸管取灰白层, 加入适量RPMI1640 完全培养液后, 1 000 rpm 离心5 min、去上清液, 用适量RPMI 1640 完全培养液重悬细胞, 取微量重悬细胞液, 加等体

6积0.4%台盼蓝染色液, 染色2 min, 计数活细胞后, 用RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为2 ×10 /ml( 细

胞活率95%以上) , 备用。《苯对母鼠和子鼠脾淋巴细胞的增殖与凋亡影响》

2. 3. 2 脾淋巴细胞增殖功能检测。处死小鼠后,各取脾脏8 个, 轻轻研磨成匀浆, 200 目筛网过滤, 制备脾细胞悬液, 离心, 1500 rm10m in, 弃上清, 加入适量红细胞裂解液( 1m l悬液中加3m l), 螺旋震荡3m in,

6PBS洗2次, 含10%胎牛血清的RPMI- 1640 培养液重悬, 调整细胞密度为2×10

/ml 加入96 孔U型培养板中,

每孔100μl。分别加入ConA ( 10μg /m l) 100μl 使其终浓度为5μg /ml 每个标本3个复孔, 5% CO2培养箱中培养64h, 培养结束前4h加入MTT( 5mg /ml) 20μl 培养结束后离心1500 rm10m in, 小心吸去上清, 加入DMSO150μl 振荡10m in, 酶标仪

550nm 检测各孔吸光度(OD值)。《复方阿胶浆对移植性肺癌小鼠脾、胸腺重量指数与脾淋巴细胞增殖影响》

1. 2. 2 淋巴细胞悬液制备分离小鼠的派氏结( Peyer S patches, PPs) , 肠系膜淋巴结( mesenteric lymph nodes, MLNs) , 脾脏( Spleen, SP) , 分别置于3 个盛有预冷PBS的无菌培养皿中, 用研磨棒加适度力度轻轻研磨, 于200 目筛网过滤, 收集细胞, 制备单细胞悬液, 以冷PBS 洗涤细胞两次( 1 200 r/ min, 5

7分钟) , 脾细胞以低渗法裂解红细胞, 细胞计数, 将细胞稀释到1×10cells/ ml。《茯苓多糖对免疫抑制小

鼠粘膜淋巴组织及脾脏中CD3+ 和CD19+ 细胞变化的影响》

1.4.3 小鼠脾淋巴细胞增殖的测定小鼠颈椎脱臼处死，无菌取出脾脏，置盛有适量无菌Hank′s 液的小平皿中，用眼科剪轻轻将脾脏剪碎，经200 目筛网碾碎过滤，制成单细胞悬液，用Hank's 液洗3 次，每次离心10 min（1 000 r/min），去上清后加入预冷的0.83%Tris-NH4Cl 裂解红细胞1 min，再用1640 培养液洗涤2-3 次，然后将细胞悬浮于2 mL 完全培养液中，用台盼蓝染色计数活细胞数，调整细胞浓度为1.0×106 个/mL。将细胞悬液分别加入96 孔培养板中，每孔100 μL，每组重复3 孔（见表2），各补加

完全培养基至200 μL。置5%CO2培养箱37 ℃培养72 h，培养结束前4 h，弃去上清液，加入100 μL 不含胎牛血清的RPMI1640 培养液，同时加入MTT（5 mg/mL）10 μL/孔，

继续培养4 h。培养结束后，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，吹打混匀，使结晶完全溶解。然后用酶联免疫检测仪，以570 nm 波长检测、630 nm 波长参考，测定光密度值用

OD 表示。1.5 数据分析采用SPSS13. 0 统计软件进行分析，结果以平均数。。。《不同组分、不同纯度中药复方多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖影响》

小鼠脾细胞培养实验

山东大学实验报告2011年3月30日 姓名张行润系年级 2009级生科4班学号同组者张少华 科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号105 一、实验目的 了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。 二、实验原理 (一)细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (二)细胞死活鉴定 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括： 死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。 三、实验器材

脾切除手术记录

【脾切除术手术步骤简介】 1.体位：平卧位，左腰部垫高。 2.切口：脾脏肿大不显著时，常采用左上腹正中旁切口或经腹直肌切口，操作方便，并可向上延长，充分显露常有粘连的脾上极。当脾较大或估计粘连较重时，可采用左上腹L形切口或在上述切口的基础上补充作横切口，以更好的显露脾脏。亦有的作左肋下斜切口或上腹横切口。 3.检查：择期手术进入腹腔后，需检查的项目有：①肝：大部分脾切除是用以治疗门静脉高压症的，故应常规检查肝。如肝已萎缩，属晚期病变，就应尽量减少手术操作，减轻病人的负担。必要时切取肝活组织，作病理切片检查。②脾：主要了解脾脏的大小和周围（尤其是与膈肌）粘连的情况，有助于防止分离粘连时出血。此外尚需了解副脾的位置和数目。③腹部其他情况：如腹水的多少，胆道及胰腺有无病变等。④测定门静脉压力。 4.结扎脾动脉：对于脾脏较大者，应结扎脾动脉，使脾缩小，便于操作，减少血液的丢失，使脾内大量的血液流入循环血内，成为最好的自体输血。操作时，先切开胃结肠韧带和胃脾韧带，一一结扎韧带中的血管，进入小网膜腔，显露出胰体、尾部。在胰上缘触到搏动的脾动脉，并在胰体、尾交界处选一脾动脉隆起部分，切开后腹膜，用直角钳仔细分离出脾动脉，并绕以粗丝线结扎。结扎脾动脉时须扎两道（两道相距0.5cm左右），结扎不要过紧，以能闭合管腔为度，以免撕裂动脉壁；但也不能太松，以免起不到阻断血流的作用。此外，还要注意尽量避免损伤其下方平行的脾静脉。 5.分离脾脏：当脾动脉血流阻断后，将脾稍加按摩即可迅速缩小50%以上，一般不必再注射肾上腺素等药物。先将脾向上推开，结扎、剪断附着在脾下极的脾结肠韧带。再将脾拉向内侧，剪开、结扎脾肾韧带。此时脾已大部分离，即可用右手伸入脾上极的后方，抓住脾脏向下内方柔缓牵拉旋转，将其轻轻托出；另一只手可协助托绌上极。脾膈韧带处的膜状粘连可被钝性分离，如粘连带较粗时，应用止血钳钳夹、切断并结扎，即可将脾托出。在处理胃脾韧带上部和脾膈韧带时，最好在直视下进行，否则常易损伤胃大弯部组织或撕破胃短血管，招致出血。 6.切除脾脏：将脾托出切口外面，即刻向脾窝内堵塞大纱布垫，既利止血，又可防止脾又重新滑回腹腔。然后清理脾蒂周围的结缔组织，将脾门动、静脉分别结扎切断（近端血管需结扎加缝扎）。如脾较大，脾蒂较厚，则应在脾门处用3把大止血钳平行钳夹脾蒂，在远端两把钳间切断，在余下两把止血钳近端用粗丝线结扎，然后再在两把钳间缝扎一道，如血管较粗，则可将脾动、静脉分别结扎处理。在处理脾蒂时，应注意避免损伤胰尾。将切除的脾放置在无菌漏斗上，任脾内血液自然流入含有抗凝保养液的贮血瓶中，备自体输血用。 7.止血、检查：脾切除后（特别是门静脉高压症脾切除后），腹膜后和脾膈韧带、脾肾韧带处，常有撕裂的曲张静脉渗血，造成术后膈下积血、继发感染和膈下脓肿，故术中出血点要一一结扎止血。特别是在膈面和左肾上极后腹膜处，要用左手将胃向右侧推开，再用长持针器夹针间断缝合出血点。此外，还需将胰尾部创面缝合，并用后腹膜缝合覆盖。然后将大网膜放在左肾区和脾窝内，以建立侧支循环，还有利于结肠脾曲的复位。有门静脉高压症的病人，在脾切除之后，需再测一次门静脉压力，和术前对比，以估计疗效。 8.引流、缝合：由于病人肝功能较差，凝血功能不佳，即使术中止血彻底，术后仍有可能发生创面渗血，甚至术后发热和膈下感染，应在脾窝处和胰尾处常规放置引流物。

抗体的制备方法与原理

抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～ 1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数

小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数 实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理 小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。 外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各 类免疫细胞。 免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。 红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。 2实验材料： 1）健康小鼠 2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板 3）70汇醇 4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK 5）0.2%台盼蓝 6）细胞计数板、计数器 7）离心机 8）显微镜 3实验方法： 3.1取小鼠脾脏 将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。 用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。 3.2制备单个核细胞悬液

将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用 针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。 弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。3.3 计算细胞浓度 稀释十倍，随机选取一个大方格计数 细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml 3.4 计算细胞活力 在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为： 324- 16/324 X 100%=95.1% 在理论范围之内 4 实验结果 4.1 研磨脾脏得到细胞悬液 本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。 研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。 4.2 白细胞计数

小鼠免疫组织及免疫细胞的观察

小鼠免疫组织及免疫细胞的观察 【实验原理】 免疫器官、组织及细胞是机体免疫系统的重要组成部分。中枢免疫器官包括胸腺和骨髓，是T淋巴细胞及其他各类免疫细胞发生、发育和分化的场所，外周免疫器官包括脾胀、淋巴结和粘膜相关淋巴组织是免疫应答的场所。各类免疫细胞直接参与免疫系统对抗原类物质的免疫应答，完善的免疫器官组织结构和正常的免疫细胞种类和数量是机体免疫功能发挥正常的基本条件。 【试剂和器材】 小鼠、棉签、解剖台、平皿、大头针、手术剪子、手术镊子、载玻片、瑞士染液、细胞筛 【操作方法】 1.取一只小鼠，采用颈部脱臼法处死，将小鼠放到解剖台上，沿腹中线剪开皮肤且不破坏腹膜和胸膜，剪开腹膜，打开腹腔和胸腔，观察胸腺所在的位置和形状。 2.分离脾细胞：取出脾胀，去除其周围的脂肪组织，用剪子剪碎脾脏，放入细胞筛中，用载玻片清研脾胀，滴加生理盐水，使脾细胞分散成细胞悬液。 3.脾细胞染色观察：取少量细胞悬液置于载玻片上，与室温晾干，加瑞士染色液甲染色1min，甩掉染液，用瑞士染色液乙染色5min，用自来水冲洗，让染液漂走，置于光学显微镜下观察染色脾细胞。 【结果观察】 小鼠脾细胞瑞士染色镜下观察 【注意事项】 1.正确抓取小鼠，防止被鼠咬伤。 2.脾脏分离完整，清研轻柔。 3.染色时间不宜过长或过短。. 【讨论】 脾脏具有多种重要的生理功能, 参与并调节血液、免疫、内分泌系统的运转, 绝非可有可无;脾脏功能在疾病的不同阶段扮演不同的角色,有时甚至完全相反, 即具有双向性、时向性的特点。 1.脾切除术后暴发性感染全脾切除术后 OPSI 的发生率约为 1 %～

2.4 %。虽然 OPSI的发生率不是很高,但脾脏切除后,在由肺炎球菌导致的感染中毒性休克中, 50 %患者的病情迅速进展, 并最终导致死亡。脾脏为全身最大的淋巴器官, 血循环相当丰富, 且脾脏具有延缓微循环的作用, 有利于清除和吞噬多种抗原, 减轻机体感染的发生。同时脾脏拥有大量重要的免疫细胞及免疫因子, 如 T 细胞、B 细胞、K 细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤细胞、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK 细胞)、树突状细胞。免疫因子包括 tufstin 因子、备解素即P因子、纤维结合蛋白免疫核糖核酸环磷酸鸟苷内源性细胞毒因子、调理素和补体等。而脾切除后,脾脏所产生的免疫因子及免疫细胞消失,血浆中免疫球蛋白IgM、IgG下降,巨噬细胞活性下降,补体旁路活性下降及自身抗体活性增强, 使免疫系统失衡,导致机体易感性增加,甚发生OPSI 。 2.关于tufstin是主要由脾脏产生的促吞噬激素, N ajjar 于 1970 年首先发现。是IgG分子Fc段的一种四肽(T hrLy s -P ro -A rg), 通过激活中性粒细胞发挥吞噬功能。需要在白细胞激肽酶及内羧基肽酶的共同作用下释放。脾切除、镰状红细胞贫血、特发性血小板减少性紫癜、A IDS 及一些腹部疾病可使其水平下降, 脾移植后可使 tufstin 的水平升高。虽然已发现其在免疫系统中的重要作用, 但具体机制仍不十分明了。理论上讲上述情况 tufstin 活性减低的原因包括低γ球蛋白血症、脾脏内中性粒细胞释放减少、白细胞激肽酶活性改变及 tufstin 分子异常。 3.脾脏的抗肿瘤功能机体发生肿瘤的主要原因为免疫系统监控失调, 而脾脏作为人体免疫系统的重要组成部分, 无疑与肿瘤的发生密切相关。临床观察发现, 脾脏不仅自身很少发生原发恶性肿瘤且少有转移瘤出现, 这也表明脾脏具有抗肿瘤的作用。目前大家较公认的观点为脾脏在肿瘤免疫中具有双向性、时向性的特点。表现为在肿瘤早期脾脏具有抗肿瘤作用, 而在晚期则表现为免疫抑制, 促进肿瘤生长。其抗肿瘤作用主要表现在:①可增强巨噬细胞的吞噬功能。②可增强巨噬细胞溶解瘤细胞及其过氧化酶作用。③通过增强 NK 细胞活性发挥抗肿瘤作用。④Chu 认为, tufstin 的抗肿瘤机制不仅通过增加巨噬细胞的肿瘤趋向性、吞噬能力和分泌能力, 更重要的是增加巨噬细胞产生氧自由基—超氧阴离子的能力, 对杀伤肿瘤细胞具有重要意义。关于脾脏边缘带淋巴瘤的研究表明, 肿瘤的发生也与脾脏免疫功能的下降有关。

中文操作手册 phosflow 小鼠脾细胞 胸腺细胞-9

小鼠脾细胞/胸腺细胞BD Phosflow? 操作流程 Protocol I (Detergent Method) 所需试剂： 试剂准备： 按照说明书用双蒸水或者去离子水制备1X Lyse/Fix Buffer （货号：558049）。使用前37°C 预热15-30分钟。 按照说明书用双蒸水稀释制备1 x Perm/Wash Buffer I （货号：557885）。放置至室温后使用。 操作步骤： 1.取小鼠组织样本（如脾脏，胸腺，骨髓等），用PBS或完全培养基制备单细胞悬液 2. 350g 离心6- 8 分钟，弃上清 3. 混匀细胞（此步动作需要轻柔） 4. 以1–10 x 106 cells/mL的浓度将细胞重悬于PBS或完全培养液中。必要时可以用70μm 的滤器过滤去除细胞团块。 5. （选做步骤）因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激，所以有些细胞需要在前处理完成后，可以在完全培养基中静息2-4小时，以保证细胞恢复到未受刺激状态（参见操作说明）。

6. 用适当的刺激剂处理细胞，37°C 孵育适当的时间（1到30分钟，参见操作说明）。实验需设 立未处理样本为阴性对照。 7. 刺激处理完毕后，迅速加入10倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。振荡器低速振 荡混匀5-10次。 8. 37°C 孵育10-12分钟。 9. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。 10. 振荡器低速振荡混匀细胞。 11. 细胞清洗： a．加入与Lyse/Fix Buffer相等量的stain buffer试剂（货号：554656）。 b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。 c．振荡器低速振荡混匀细胞。 12.（选做步骤）：为保证实验结果，若以上步骤红细胞裂解不充分，继续用溶血剂裂解细胞， 但此步骤不得超过2次。 13. 于1–10 x 10^6细胞中加入1ml （最少1ml）Perm/Wash Buffer I进行细胞破膜。轻柔混匀后，室温孵育15-30分钟。 14. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。 15．振荡器低速振荡混匀细胞。 16. 细胞清洗： a．加入与1ml Perm/Wash Buffer I。 b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。 c．振荡器低速振荡混匀细胞 17. 用Perm/Wash Buffer I重悬细胞，使细胞终浓度为5–10 x 106 cells/mL。 18. （选做步骤）每1 x 10^6细胞中加入0.06 μg Fc 封闭抗体（货号：553141 or 553142）。混匀 后冰浴15分钟。 19. 取100 μL 细胞悬液（0.5–1 x 10^6细胞）置于12 x 75-mm BD Falcon?试管中，参考抗体说明书推荐用量加入相应BD Phosflow抗体。

【CN110016462A】从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910125091.4 (22)申请日 2019.02.20 (71)申请人 优睿赛思（武汉）生物科技有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖开发区高 新大道666号生物创新园C6栋C6221室 (72)发明人 娄阳　吴海　 (74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所 (普通合伙) 42212 代理人 胡清堂 (51)Int.Cl. C12N 5/0781(2010.01) (54)发明名称 从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋 巴细胞的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从脾脏细胞中高效分离 单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，本发明利用 采用多重淋巴细胞表面标记物抗体的负筛选，以 及快捷的荧光标记抗原物质方法的建立和利用 荧光标记抗原物质来进行高特异性的筛选，从而 实现对单个抗原特异性B淋巴细胞的高通量快速 筛选，并且使最终获得抗体特异性B淋巴细胞的 阳性率从传统杂交瘤方法的不足5％，提高至 30％。所以，该方案不但能够极大程度缩短单克 隆抗体开发的时间，而且能够大大提高所获得单 克隆抗体的数量和多样性。权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 110016462 A 2019.07.16 C N 110016462 A

权　利　要　求　书1/1页CN 110016462 A 1.一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，所述脾脏细胞为经过普通抗原免疫的脾脏细胞，其步骤如下： 1)利用以生物标记的非B细胞淋巴细胞表面标志物抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除非B细胞，以提高脾脏细胞中B淋巴细胞相对丰度； 2)利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原，对步骤1得到的脾脏细胞进行进一步负筛选，以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞，保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞； 3)利用7-AAD进行分选，去除死细胞； 4)用流式细胞仪，进行单细胞的筛选，得到目标淋巴细胞。 其中，所述预标记筛选抗原为与小分子荧光染料偶联的普通抗原。 2.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原为与包含亲和素的小分子荧光染料偶联且经生物素标记的普通抗原。 3.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原的制备方法包括以下步骤：采用滴加方式进行偶联反应，分多次将包含亲和素的小分子荧光染料滴加到经生物素标记普通抗原中进行偶联，每次滴加后孵育使其偶联充分；其中包含亲和素的小分子荧光染料的用量为经生物素标记普通抗原的5倍以上。 4.根据权利要求2或3所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原的制备方法还包括以下步骤：在包含亲和素的小分子荧光染料和经生物素标记普通抗原偶联完成后，根据偶联产物的大小，选择合适的分子筛离心管，除去未偶联的底物。 5.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述步骤1)为：以生物素标记的CD4单克隆抗体、CD8单克隆抗体和CD14单克隆抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除T淋巴细胞和单核细胞得到CD4、CD8和CD14阴性的脾脏细胞，提高B淋巴细胞的相对丰度。 6.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述步骤2)中荧光标记的IgM多克隆抗体为FITC标记的IgM多克隆抗体。 2

小鼠脾细胞的体外培养及形态观察

小鼠脾细胞的体外培养及形态观察 黄殿玲,李核,何文琴,李霞,杨佩,王纯 摘要：用组织块法和冷消化法对小鼠脾细胞在含血清培养液中进行原代培养,并对正常细胞形态进行观察。结果表明组织块法和消化法培养可获得比较均一、稳定的细胞群,细胞呈典型的成纤维形态。 关键字：脾细胞原代培养形态 多细胞生物的细胞可以分离出来，在适宜的培养液以及培养箱中存活，并在一定的时间内，保持其形态、生理、生化特性，经过一定时间还可以观察到一定量的细胞。直接从身故体内分离的细胞，如小鼠的脾细胞，在体外培养的过程中尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。 在生物体内或体外，正常的细胞只能分裂一定的次数，然后停止分裂，最终死亡。这一过程称为衰老，此为正常的现象。只有细胞被转化后，细胞可以无限增殖，就称为细胞系/株。细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括pH、渗透压、营养和生长因子等，已保证细胞的增殖。细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。这就要为细胞的培养创造适宜的环境，使细胞更容易存活或生长。细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。 超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。在细胞原代培养的操作过程中，这个设备是必要的，细胞本来就比较易感染，不易存活，在空气中，以及人体表面存在许多易感染细菌，所以为了提高细胞的存活率，一定要保持操作过程干净，无污染。细胞培养是细胞生物学研究的中心技术。通过细胞培养可以观察研究细胞的某些生理特性，同时在体外进行细胞培养，也打破了以往的细胞只能在生物体内增殖、分裂。其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。 1 材料与方法 1.1 实验材料 取出生一周的小鼠，采用颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。取一只小鼠置于解剖盘中，抓住小鼠的尾巴，确保小鼠的前爪在解剖盘中，慢慢的安抚使小鼠安静下来；用剪刀或手术钳紧紧的按住小鼠的颈的后部，用力向后拉小鼠的尾巴；切记不要

T淋巴细胞提取

淋巴细胞提取 一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象：B／C 小鼠 三实验器材： 1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基 2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台 四实验步骤： 1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果） 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示

6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。 五、注意事项： ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。

小鼠脾细胞培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 崔文强201300140012 2015.4.7 【实验目的】 1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养； 2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 【实验原理】 1.细胞培养 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞培养的意义 具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。 细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。 2.细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。 ②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色

脾脏单个核细胞的制备

脾脏单个核细胞的制备 脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RPMI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白; 收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混 匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计 数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 10 / 300 μl 的浓度。《流式细胞术检测小鼠 脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》 单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾 脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。加入2 mL RPM I- 1640完 全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织 碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10% 小牛血清的RPM I- 1640 培养液。台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至 5×10 cells /L。《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》 610 制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取: 手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈 椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出 脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。粗剪成小块, 用 注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加 人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。收集滤过的细胞悬液, 加人0.83 % 的氯化铵到滤 过的细胞中, 静置5 min , 以除去血红细胞。用RPM-ll640 培养液离心( 2500 r/min,10min) 洗涤细胞3 次, 以除去剩余的氯化铵将上述收集到的脾脏细胞置于玻璃培 养瓶中, 在37 ℃ 、5 % C O: 培养箱中静置培养2 h , 以除去贴壁细胞, 收集未贴壁的 细胞悬液即获得脾淋巴细胞。计数接种培养。台盼蓝染色计数, 活细胞数大于95 % 。 《从Ca2+通路研究紫草多糖促进小鼠淋巴细胞增殖的机制》 ， 14日龄健康鸡，无菌取脾脏，Hanks'液洗3 次，卡介苗注射器芯研磨，200 目筛网 过滤，制成单细胞悬液，离心( 1000r/min) ，弃上清，Tris-NH4Cl 破解红细胞，冰水浴 放置10min，离心( 1000 r /min) ，弃上清，Hanks'液洗3 次。加入无酚红1640 培养液重悬细胞，计数，调整细胞浓度为1 × 10 cell /mL。于96 孔细胞培养板培养。《马尾 藻多糖对鸡脾脏淋巴细胞增殖及氧化应激影响的实验观察》 6

小鼠脾脏细胞原代培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 陈素君 200900140007 实验目的：了解原代培养的基本方法及操作过程。学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制 及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。 实验原理：细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响，二是细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。 要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。 细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。 实验用品： 一、器材 解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好 倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板 二、试剂 PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝 三、小白鼠 实验方法： 1. 细胞的原代培养 1.1断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。 1.2在超净工作台无菌操作，将小鼠背朝下放在解剖板上，用镊子提起腹部皮肤，剪开。沿 开口向两侧斜着剪开，翻起皮肤露出腹腔，即可看到白色的胃。提起胃，找到后面条状的脾，用弯头镊子取出脾，将周围的脂肪组织去除。PBS缓冲液清洗1-2次待用。 1.3在无菌培养皿内加入PBS缓冲液30滴，用L型针头吸取PBS0.2mL注入小鼠脾脏，用针 头在脾脏上戳几个小孔，顺脾脏轻轻刮，从小孔挤出分散的细胞。 1.4将培养皿倾斜，使大块组织充分沉淀，吸取分散的细胞悬液2mL，1000r/min离心5min。

脾切除术手术记录

脾切除术的过程： 1．初步麻醉：氯氨酮5ml/只，静脉给药初步麻醉。 2．固定：绳子绕过犬齿使其狗嘴部不能张开，采取仰卧位四肢展开固定于手术上。 3．备皮：用弯剪刀在狗狗左腹股沟区备皮10c m×10c m面积，在狗狗上至剑突上5cm下至下至脐下5cm备皮。 4.术中麻醉：配置浓度为20%乌拉坦注射液500ml备用；左后肢腹股沟区备皮常规消毒，寻找出左后肢股静脉大概位置，沿股静脉走行依次切开皮肤皮下组织及深筋膜，切口长度3cm，游离出股静脉2cm，取30cm长4号线对折后由止血钳穿带过血管下，剪断丝线，一条丝线远心端结扎血管，另一条丝线备用，用眼科剪刀在股静脉表明进行“T”字造口，再插入麻醉药管，并用另一条丝线固定已插入药管，乌拉坦注射液中速滴入。采用连续缝合方法先缝合深筋膜，再采用单纯缝合方式缝合皮下组织与皮肤。 5.消毒与铺单：在将手术的区域进行常规消毒，先铺小单再中单最后铺大单，围成暴露手术区域20cm×3cm。 6.手术过程：在前正中线偏右1cm做长15cm纵行切口，上至剑突下,下至脐上5cm ,逐层切开皮肤，皮下组织，腹直肌鞘前层，钝性分离腹直肌，打开腹膜，进入腹腔。探查腹腔决定行脾切除术。 7．确定肝脾位置后，用手探入腹腔轻轻托起脾脏，下端用温水纱布填塞。充分显露脾蒂。结扎并切断胃短血管后小心分离脾蒂，剪开结扎脾的韧带，显露脾动静脉。用7号线在脾的动静脉处分别进行双重结扎，再切断脾动脉和脾静脉。 8．切断脾蒂后，全齿血管钳钳夹切断脾膈韧带，完全游离脾脏，移走脾脏。腹腔内反复冲洗，手术野彻底止血，再次检查腹腔内其他脏器未见损伤后逐层关闭腹腔。采用连续缝合的方式先缝腹直肌层，再缝合皮肤及皮下组织。 9．手术经过顺利，术中出血约100ml，术中狗狗血压平稳，麻醉效果满意，术后标本送病检。

小鼠脾脏中分离淋巴细胞

小鼠脾脏中分离淋巴细 胞 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】

从小鼠脾脏中分离淋巴细胞 １小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。 ２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。个人用1500转/分钟，20分钟。 ３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。 ４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培

养或做它用。但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。

小鼠脾脏细胞原代培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 实验背景： 一、细胞培养的基本条件： 1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清 3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器 4.细胞保存条件：液氮罐 1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

3.CO2培养箱： CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ℃，14 h)。 ③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液 蒸发。 三、细胞培养用液的配制： 1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 3.消化液： ①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 ②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 ③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是 0.25％。用滤器过滤除菌。 ④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 ⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 4.培养基： 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 ①天然培养基： 天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污

小鼠淋巴细胞分离方法

小鼠淋巴细胞分离方法 一、实验用品的准备： 1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20μl枪头、200μl 枪头、1000μl枪头。摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒； 2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个； 200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个； 5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10 把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）； 注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。 二、相关实验： （一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞 实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。 实验动物：BABALB/c小鼠；雌性 实验材料： 1．小鼠淋巴细胞分离液, 2．60mm玻璃培养皿 3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌 4．气管切开包 5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机 6．1640培养基 实验方法 1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。 4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。 5. 3000转离心15分钟。（病毒室离心机） 6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。 7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。 8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。