Cas9 protocol_v1.1_130216
A Brief Protocol for Gene Targeting by Cas9 in Zebrafish
（2013-02-16 v1.1）
一、Cas9靶位点的选择
1.Cas9靶位点（靶点）包含20个碱基，其中5’端应为GG▲；紧邻靶点3’端的3个碱基构
成PAM区，要求序列为NGG（N为任意碱基）（图1）。可在正义链或反义链上选择靶位点。可参考如下的Cas9靶位点预测网站：
https://www.sodocs.net/doc/362414954.html,/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx
▲注意：5’端选择GG并非Cas9靶点本身的要求，而是由于本实验所用的gRNA（guide RNA）体外转录载体采用了T7启动子。T7启动子要求转录起始位点的前两位
为GG，并且第三位最好为G或A；如果采用其他的启动子，可以随之更改。
图1. Cas9的作用原理（引自Mali et al., 2013）
2．如果采用限制性内切酶酶切法检测靶点的突变效率，则需要在靶点序列内、PAM的5’端附近选择一个单一的限制性内切酶位点。
例：斑马鱼th基因的某个Cas9靶点（此例的靶点位于反义链上）：
BxtYI
5’-TCTTGTCACCAAATATGATCCGGATCTGGATCAGGATCACCCAgtaagtgctggattat-3’ 3’-AGAACAGTGGTTTATACTAGGC CTAGACCTAGTCCTAGTG GG Tcattcacgacctaata-5’
PAM Target site
3．对于coding gene，靶位点尽量选择在基因CDS的前2/3区域并且在ATG之后，但是不要在最后一个exon上；最好能破坏重要的domain和/或所有的isoform/variant。同时还要考虑避免在第一个起始密码子的下游还存在额外的具有相同阅读框（in-frame）的起始密码子。靶点也可选择在intron和exon交界处，以破坏基因的剪接。原则上不要选择5’-UTR和3’-UTR。
二、Cas9靶位点的确认
1. 确认靶点在基因组中的唯一性：靶位点序列在Ensembl 网站进行blast ，确认是斑马鱼基
因组中的单一位点。
2．PCR 扩增靶点序列：从准备用于打靶的成鱼中PCR 扩增靶点及附近的序列。在靶位点周
围设计引物，使其距离靶位点两侧都大于100 bp ，并且PCR 扩增产物最好不要超过500 bp ，且为单一条带。
3．检测酶切效率：如果计划采用酶切法检测靶点的突变情况，则需要对上述PCR 产物进行
酶切验证。要求尽量酶切完全，并且电泳后能明显与原条带区分开。
4．测序确认靶点序列：将PCR 产物直接送去测序（不需要TA 克隆）。如果实测序列跟靶
点的预测序列有出入，原则上应根据实测结果设计gRNA 序列；但是，如果实测序列不再符合靶点选择的原则（例如，PAM 区不是NGG ，或5’端不是GG ），则应重新选择靶点；如果测序结果显示靶点序列为杂合子，则最好重新选择实验材料。
5．遴选实验材料：采用上述的PCR 与测序策略筛选出足够量的靶点正确且为纯合的成鱼，
后续针对该靶点的实验最好都用这一批成鱼进行。
三、构建gRNA 体外转录载体
1. p-T7-gRNA 为gRNA 的克隆与体外转录载体，载体骨架来自pMD18-T simple （Amp 抗
性），gRNA 序列的连入方向为RV-M->T7->M13-47。主要区域的序列如下：
T7 promoter +1 BbsI BbsI
5’-...GAATTC TAATACGACTCACTATAG ca GTCTTCTAGAAGAC gttttagagctagaaata gcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttt ttAAAGCTT (3)
2．用BbsI 酶切pT7-gRNA 、切胶回收，得到gRNA 克隆骨架pT7-gRNA_BbsI ，所得粘性末
端如下所示（骨架上5’各留下一个4 bp 的overhang ，中间的小片段丢弃）：
5’-...TAATACGACTCACT ATAG ca GTCTTCTAGAAGAC gt tttagagctag...-3’ 3’-...ATTATGCTGAGTGATATC GTCAGAAGATCTTCTGcaaaat ctcgatc (5)
酶切体系： pT7-gRNA plasmid 1~2 μg
Buffer G 2.0 μL
BbsI (Fermentas) 0.5 μL ddH 2O To 20 μL 37℃，4 h;
切胶回收， 20 μL ddH 2O 溶解。
3．根据靶位点订购两条oligo （均为25 nt ，s 序列与靶序列同向，As 反向）。以th 为例：
th target oligo s ：5’-ataG GGTGATCCTGATCCAGATC gt -3’
th target oligo As ：5’-taaaac GATCTGGATCAGGATCACC -3’
方框内为靶点序列。红色碱基为形成粘性末端所必需的固定序列，不能更改；蓝色碱基则需要根据靶点序列更改（注意target oligo As 中蓝色的碱基为靶点的互补序列，只需要其中的19个碱基，最后一个G 不需要合成）。
4．用ddH 2O 分别将oligo 溶解为10 μM 的溶液，退火，得到粘性末端如下的小片段：
th target_an ：5’-ataG GGTGATCCTGATCCAGATC gt -3’
3’- CCACTAGGACTAGGTCTAG caaaat -5’
退火程序： oligo s (10 μM) 5 μL
oligo As (10 μM) 5 μL 95℃ 5min, -1℃/30sec/cycle,
to 4℃
5．将退火后的片段与回收的上述gRNA 克隆骨架pT7-gRNA_BbsI 连接、转化，挑取克隆，
用RV-M 与target oligo As 作为引物进行菌液PCR 鉴定（58℃退火，延伸30 sec ，30 cycle ）。目的条带约为130 bp 。挑取阳性克隆送测序，选取序列正确的克隆甘油保菌、提质粒。
RV-M 序列：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’
连接体系： pT7-gRNA _BbsI
0.5 μL target_an 2.0 μL
2*solutionI (Takara)
2.5 μL 16℃，2 h 以th 靶位点为例，正确的克隆序列如下（相应的载体称为pT7-th gRNA ）：
5’-...GAATTC TAATACGACTCACT ATAG GGTGATCCTGATCCAGATC gt tttagagctagaa atagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctt tttttAAAGCTT (3)
四、制备Cas9 mRNA 和gRNA
1．制备Cas9 mRNA ：
（1）制备Cas9 mRNA 的体外转录模板：通过XbaI 单酶切线性化pSP6-2sNLS-spCas9载体
（Amp 抗性）（37℃，4 h 以上）；取少量电泳确认线性化完全后，直接回收线性化产物。
（2）体外转录Cas9 mRNA 。
mRNA 体外转录体系（SP6 mMESSAGE mMACHINE ? Kit ，Ambion ）
： 2× NTP/CAP
10 μL 10× Reaction Buffer
2 μL Linearized template DNA 1 μg (<6 μL) 37℃，2h ； 加入1 μL TURBO DNase ，37℃、15 min 以去除DNA 模板；
SP6 Enzyme Mix 2 μL
DEPC H 2O To 20 μL 取0.3 μL ，电泳查看转录效果
（1% agarose ，产物约2 Kbp ）； 回收mRNA 。
（3）添加polyA 序列、回收得到可用于显微注射的Cas9 mRNA （添加polyA 序列可增强
mRNA 的稳定性和翻译效率）。
mRNA 加polyA 的反应体系：
（这里选用的是NEB 的加A 体系；也可以使用Ambion 的加A 试剂盒） ATP (10 mM) 5 μL
10× Reaction Buffer 5 μL 体外转录、回收的mRNA
E. coli Poly(A) 聚合酶 1 μL
DEPC H 2O To 50 μL 37℃，1h ；
取0.3 μL ，电泳查看加A 效果；
（1% agarose ，产物约2 Kbp ，比加A 前略大）； 回收mRNA 。 2． 制备gRNA ：
（1）制备gRNA 的PCR 体外转录模板：用T7-cr fwd 和tracr rev 引物对，以构建好的gRNA
体外转录载体（例如pT7-th gRNA 质粒）为模板，使用高保真酶PCR ，得到gRNA 体外转录模板（58℃退火，延伸30 sec ，40 cycle ，40 μL 体系）。取1 μL PCR 产物电泳，确认为单一条带（125 bp ）后直接回收PCR 产物，用于后续的步骤。
T7-cr fwd 序列：5’-GAAATTAATACGACTCACTATA-3’
tracr rev 序列：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’
（2）体外转录gRNA 。
gRNA 体外转录体系：
（这里选用的是Ambion 的MAXIscript ? T7 Kit ；也可以使用其它的体外转录体系，例如Promega 的产品，但是不要用体外转录mRNA 的体系。） 2.5 mmol/L NTP 4 μL
10× Reaction Buffer 2 μL Template DNA 1 μg (<6 μL) T7 Enzyme Mix 2 μL DEPC H 2O To 20 μL 37℃，1h ；
加入1 μL TURBO DNase ，37℃、15 min 以去除DNA 模板； 取0.3 μL ，电泳查看转录效果
（3% agarose ，产物100 bp 左右）；
回收gRNA 。 （3）回收gRNA ：建议使用Ambion 的mirVana? miRNA Isolation Kit 进行回收。也可采用
LiCl 沉淀法，但效率较低。
用mirVana? miRNA Isolation Kit 回收小片段RNA ：
1）用RNase-free water 将gRNA 转录体系稀释到300 μL ，加入330 μL 无水乙醇；
2）将溶液加到回收柱中，10000 g 离心15 s （转速太高会损伤滤膜）；
3）加入700 μL 的miRNA Wash Solution I ，离心5~10 s ；
4）加入500 μL 的Wash Solution II ，离心5~10 s ；重复一次；
5）弃去收集管中的液体，离心1 min，去除残余的液体；
6）加入适量95℃预热的RNase-free water或Elution Solution，最大转速离心20~30 s，收集得到gRNA溶液。
五、制备F0斑马鱼与靶点突变效率检测
1．将Cas9 mRNA和gRNA混和，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中（每个靶点建议至少注射200枚胚胎）。同时留一些未注射的同批胚胎作为对照。可尝试不同的注射量，推荐剂量为Cas9 mRNA 300~500 pg，gRNA 25~200 pg。
2．取2~4 dpf注射后表型正常的胚胎（30枚，5枚/管），提取基因组DNA，PCR、酶切检测靶位点突变效率。未切开的PCR条带占所有条带的荧光亮度的百分比可大致反映该靶点的突变效率。也可以选用直接克隆测序等其他方法代替酶切检测突变效率。
例：BstYI酶切检测th位点的突变效率（图2）：
图2. th Cas9靶点酶切鉴定结果
箭头所指为酶切位点被破坏的潜在突变条带。此例的靶点突变效率约为20％。
一种提取基因组DNA的简易方法（仅适用于基因组DNA的短片段PCR）：
1）将1~5个胚胎去膜后转移到PCR管中；
2）根据胚胎数加入适量的50 mmol/L NaOH（每个胚胎10 μL左右）；
3）PCR仪加热裂解胚胎，程序：95℃ 10min，4℃ forever；取出后V ortex振荡均匀；
加入1/10体积1 mol/L Tris（pH8.0）中和NaOH，混匀。
3．将未切开的条带回收、TA克隆测序，检测突变类型。
4．选取突变效率较高（最好能>10%，这样更便于筛选）、存活率较高的同批次注射的F0胚胎养大（每个靶点建议至少饲养60条F0成鱼），用于检测/筛选可遗传的突变。
六、检测F0的germline transmission
1.将F0胚胎饲养至性成熟。
2.与野生型（WT）成鱼外交，将3~5个1 dpf的F1胚胎混和为一组提取基因组DNA。每
条F0建议检测20个以上的F1胚胎；建议优先筛选雄性F0。
3.通过PCR和酶切检测靶位点突变情况。
4.回收未切开的条带、TA克隆测序，确定突变类型。可以将同一个F0的所有未切开条带
混和回收、TA克隆测序；每个F0送3~4个阳性克隆测序即可，以确定该F0主要产生的突变类型。
5.选取可产生有效突变的F0鱼外交，大量饲养F1（每个F0建议至少饲养60条F1成鱼），
用于筛选带有突变的F1成鱼（杂合子）。
七、筛选携带靶位点突变的F1成鱼
1.将F1饲养至足够大，直至适合剪尾鳍（1~2个月即可）。
2.F1成鱼剪尾鳍、提基因组，通过PCR和酶切逐条进行基因型检测，筛选出F1杂合子。
建议每一轮检测两个F0的F1成鱼各20条；如果没有筛选到足够量的F1杂合子，可以再做第二轮，甚至第三轮。
3.回收未切开的条带、TA克隆，测序确定突变类型。带有同一突变allele的鱼可以混养；
最好能筛选到分别带有两种不同的移码突变的allele（allele-1，allele-2），并且雌雄均有。
由于每条F0主要产生一种突变类型（一种allele），建议分批测序，每次先测少量的鱼系和克隆（例如两雌两雄）。
附件1：所需载体示意图
图3. Cas9 mRNA体外转录载体
图4. gRNA克隆与体外转录载体
附件2：所需实验材料与试剂
野生型斑马鱼（建议选用实验室常用的近交系品种）。
限制性内切酶：BbsI（Fermentas，ER1011）；XbaI（NEB，R0145L）；鉴定靶点突变效率所需的内切酶（因靶点而异）。
试剂盒：微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为世纪，CW0524）；质粒小提试剂盒（康为世纪，CW0511）；快速DNA产物纯化试剂盒（康为世纪，CW2301）；DNA连接试剂盒（TaKaRa，D6020）；pMD?18-T simple（TaKaRa，D103A，用于突变条带的TA克隆和测序）；SP6 mMESSAGE mMACHINE Kit（Ambion，AM1340，用于体外转录Cas9 mRNA）；Poly(A) Tailing Kit（Ambion，AM1350，用于为Cas9 mRNA加polyA）；MAXIscript? T7 Kit（Ambion，AM1312，用于gRNA的体外转录）；mirVana? miRNA Isolation Kit（Ambion，AM1561，用于gRNA的纯化）。
其他试剂：2×Taq PCR StarMix（含染料）（GenStar，A115-01）；Pyrobest? DNA Polymerase （Takara，DR005A，用于gRNA模板的高保真PCR）；琼脂糖；DNA marker；1×TAE；氨苄青霉素；LB琼脂培养基；LB液体培养基；1 mol/L Tris（pH 8.0）；50 mmol/L NaOH；无水乙醇；超纯水（ddH2O，18M?）；RNase-free water。
仪器设备（养鱼设施除外）：超净工作台（细菌操作用），细菌培养摇床，台式离心机，凝胶电泳仪，凝胶电泳槽，凝胶成像仪，水浴锅，恒温培养箱，漩涡振荡器（V ortex），紫外分光光度计，PCR仪，显微注射装置，体视显微镜，恒温培养箱，配鱼缸（50个左右），台式冷冻离心机
耗材：细菌培养皿，移液器，移液器吸头，Eppendorf离心管，PCR管，显微注射针。
引物列表：
RV-M：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’
T7-cr fwd：5’-GAAATTAATACGACTCACTATA-3’
tracr rev：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’
所需养鱼缸估算：
每个靶点的F0建议至少养60条，需要1个大缸或2个中缸，至少占用两个月。筛选出有germline transmission的F0用小缸单独养，每个靶点至少养两条这样的F0，所以要占用2个小缸，至少占用两个月（建议筛选到F1杂合子成鱼后再弃去这两条F0）。
筛选F0时要有足够多的小缸来分缸养鱼，具体数量取决于筛选量。建议至少准备40个小缸（循环使用）。
F1的饲养量取决于germline transmission的效率，每个line（F0）建议至少养60条F1。每个靶点按2个line计算，需占用2个大缸或4个中缸1~2个月，筛选到的F1杂合子要永久占用2个中缸（两种突变类型）（得到足够量的F1后可停止筛选，用中缸饲养至性成熟）。
因此，每个靶点至少需要2个大缸（或4个中缸；饲养F0和F1，占用5个月）、2个中缸（饲养F1杂合子，永久占用）、2个小缸（饲养F0，占用2个月）；还需要40个小缸，供所有靶点共用（筛选F0，永久占用）。此外，要准备足够的野生型斑马鱼用于外交（按筛选雄鱼计算，一雄配两雌，每天30个cross，需要60条雌鱼，一周需要420条；加上损耗，约需500条雌鱼供每周循环使用）。
附件3：主要试剂及费用估算
（不包括养鱼的成本，以及常规PCR、分子克隆的费用）
1、Cas9 mRNA的合成：<10元/靶点。
（1）mRNA合成试剂盒：248.4元/rxn
mMESSAGE mMACHINE? SP6 Kit（Ambion AM1340）：￥6210，25 rxns。
注：每个反应可以合成约20 μg的mRNA，可多次使用（每次注射仅需数百ng的Cas9 mRNA）。
（2）加A反应：109.3元/rxn，或36.5元/rxn
推荐试剂：Poly(A) Tailing Kit（Ambion AM1350）：￥2734，25 rxns。
可选试剂：E.coli Poly(A) polymerase（NEB #M0276S）：￥729，20 rxns（需要两次纯化，有损失）
小结：若用推荐试剂合成mRNA，每次反应约需￥350，得到20 μg mRNA；这些mRNA可至少用于40次注射，约￥9/次，几乎可忽略不计。
2、gRNA的合成：263.2元/靶点，或122.2元/靶点。
（1）oligo订购及其它：100元/靶点
两个oligo共50个碱基，￥50；
模板制备及克隆、测序、提质粒：约￥50。
（2）gRNA合成试剂盒：77.3/rxn，或22.2/rxn
推荐试剂：MAXIscript? T7 Kit（Ambion，AM1312）：￥2320，30 rxns。
可选试剂：T7 RNA polymerase（Promega，P2075）：￥554，25 rxns；
+ NTP mix（花费较少）。
（3）gRNA纯化/回收试剂盒：85.9/rxn，或忽略不计
推荐试剂：mirVana? miRNA Isolation Kit（Ambion，AM1561）：￥3437，40 rxns。
可选试剂：LiCl、乙醇或者异丙醇沉淀，花费很少，但产率较低。
小结：若用推荐试剂合成gRNA，每个gRNA花费￥263.2；
若用Promega体外转录体系+沉淀回收，每个gRNA花费￥122.2。
可见，本实验的主要花费在于gRNA的合成。每个靶点的成本在150~300元。
附件4：工作量及时间成本估算
工作量主要集中在三个阶段：
1、RNA合成和注射及效率检测：限速步骤在显微注射这一步。
（1）每人每天可构建10个gRNA载体：从完成靶位点oligo退火的步骤开始，只需要一轮分子克隆（酶切—连接—转化）的操作即可构建出gRNA体外转录载体。每
人每天可以做一次克隆，每次可以做10个以上的载体（相当于10个以上的靶点）。
（2）Cas9 mRNA体外转录载体的模板线性化和纯化回收约需要5 h，加A再纯化需要约2h；gRNA模板PCR和纯化回收约需要3 h；Cas9 mRNA和gRNA体外转录需
要反应2 h，纯化回收需要1~1.5 h（建议模板在RNA合成前一天准备好；可同时
操作多个gRNA合成，根据个人能力而定，但建议每次在10个以下，以免相互混
淆）。
（3）每人每天可以注射约5个靶点。
（4）每人一天内可完成5个靶点的检测：每个靶点约检测30枚3 dpf左右的胚胎，分为6管进行PCR和酶切鉴定。
2、F0筛选（显微注射2~3个月之后）：限速步骤在于germline transmission的效率。建议
选取效率在10%以上的靶位点进行筛选。
每人每天可以外交30条F0（相当于检测一个靶点）。假设都得到了足够的胚胎，每个F0的后代胚胎取20枚，分4管进行PCR、酶切检测，共需要120个PCR和酶切反应。
对于效率在10%以上的位点，30条F0中至少会有一条有germline transmission。
按照上述步骤，相当于每人每天可检测一个靶位点，得到杂合的F1胚胎。
3、F1成鱼剪尾鳍鉴定（F0外交1~2个月之后）：限速步骤依然为germline transmission的
效率。
每人每天可以完成约40条F1成鱼的剪尾鳍、提取基因组DNA、PCR和酶切鉴定（相当于检测一个F0的后代）。如果靶点的突变效率有保证，至少应该可以筛选到一条杂合的F1成鱼。
一般来说，在一天之内能够完成酶切和切胶回收的步骤，可以鉴定出F1中是否有杂合子。但是，考虑到紧接着要为测序而做TA克隆，这样一天的时间就会比较紧张。因此，建议根据所选内切酶的特性灵活掌握酶切时间（1 h~overnight），在1~2天内完成克隆。
电容器的工作原理及结构
电容器工作原理这得从电容器的结构上说起。最简单的电容器是由两端的极板和中间的绝缘电介质（包括空气）构成的。通电后，极板带电，形成电压（电势差），但是由于中间的绝缘物质，所以整个电容器是不导电的。不过，这样的情况是在没有超过电容器的临界电压（击穿电压）的前提条件下的。我们知道，任何物质都是相对绝缘的，当物质两端的电压加大到一定程度后，物质是都可以导电的，我们称这个电压叫击穿电压。电容也不例外，电容被击穿后，就不是绝缘体了。不过在中学阶段，这样的电压在电路中是见不到的，所以都是在击穿电压以下工作的，可以被当做绝缘体看。但是，在交流电路中，因为电流的方向是随时间成一定的函数关系变化的。而电容器充放电的过程是有时间的，这个时候，在极板间形成变化的电场，而这个电场也是随时间变化的函数。实际上，电流是通过场的形式在电容器间通过的。 电容 diànróng 1. [capacitance；electric capacity]：电容是表征电容器容纳电荷的本领的物理量，非导电体的下述性质:当非导电体的两个相对表面保持某一电位差时（如在电容器中），由于电荷移动的结果，能量便贮存在该非导电体之中 2. [capacitor；condenser]：电容器的俗称 [编辑本段]概述 定义： 电容（或称电容量[4]）是表征电容器容纳电荷的本领的物理量。我们把电容器的两极板间的电势差增加1伏所需的电量，叫做电容器的电容。电容从物理学上讲，它是一种静态电荷存储介质（就像一只水桶一样，你可以把电荷充存进去，在没有放电回路的情况下，刨除介质漏电自放电效应/电解电容比较明显，可能电荷会永久存在，这是它的特征），它的用途较广，它是电子、电力领域中不可缺少的电子元件。主要用于电源滤波、信号滤波、信号耦合、谐振、隔直流等电路中。 电容的符号是C。 在国际单位制里，电容的单位是法拉，简称法，符号是F,常用的电容单位有毫法(mF)、微法(μF)、纳法(nF)和皮法(pF)(皮法又称微微法)等，换算关系是： 1法拉(F)= 1000毫法(mF)＝1000000微法(μF) 1微法(μF)= 1000纳法(nF)= 1000000皮法(pF)。 相关公式： 一个电容器，如果带1库的电量时两级间的电势差是1伏，这个电容器的电容就是1法，即：C=Q/U 但电容的大小不是由Q或U决定的，即：C=εS/4πkd 。其中，ε是一个常数，S为电容极板的正对面积，d为电容极板的距离，k则是静电力常量。常见的平行板电容器,电容为C=εS/d.（ε为极板间介质
电容器的工作原理及作用
电容器通常简称其为电容，用字母C表示。 定义1：电容器，顾名思义，是‘装电的容器’，是一种容纳电荷的器件。英文名称：capacitor。电容是电子设备中大量使用的电子元件之一，广泛应用于电路中的隔直通交，耦合，旁路，滤波，调谐回路，能量转换，控制等方面。 定义2：电容器，任何两个彼此绝缘且相隔很近的导体（包括导线）间都构成一个电容器。 原理 电容器是由两个电极及其间的介电材料构成的。介电材料是一种电介质，当被置于两块带有等量异性电荷的平行极板间的电场中时，由于极化而在介质表面产生极化电荷，遂使束缚在极板上的电荷相应增加，维持极板间的电位差不变。这就是电容器具有电容特征的原因。电容器中储存的电量Q等于电容量C与电极间的电位差U的乘积。电容量与极板面积和介电材料的介电常数ε成正比，与介电材料厚度（即极板间的距离）成反比。 用途 电力电容器按用途可分为8种： 1.并联电容器。原称移相电容器。主要用于补偿电力系统感性负荷的无功功率，以提高功率因数，改善电压质量，降低线路损耗。 2.串联电容器。串联于工频高压输、配电线路中，用以补偿线路的分布感抗，提高系统的静、动态稳定性，改善线路的电压质量，加长送电距离和增大输送能力。 3.耦合电容器。主要用于高压电力线路的高频通信、测量、控制、保护以及在抽取电能的装置中作部件用。 4.断路器电容器。原称均压电容器。并联在超高压断路器断口上起均压作用，使各断口间的电压在分断过程中和断开时均匀，并可改善断路器的灭弧特性，提高分断能力。 5.电热电容器。用于频率为40～24000赫的电热设备系统中，以提高功率因数，改善回路的电压或频率等特性。
6.脉冲电容器。主要起贮能作用，用作冲击电压发生器、冲击电流发生器、断路器试验用振荡回路等基本贮能元件。 7.直流和滤波电容器。用于高压直流装置和高压整流滤波装置中。⑧标准电容器。用于工频高压测量介质损耗回路中，作为标准电容或用作测量高压的电容分压装置。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
crispr-cas9基因敲除
CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA 的片段整合到CRISPR 中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。 原理 此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。 作为一种RNA 导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9（Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA ，可靶定任何dsDNA 序列，而sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。 应用 基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。 2013 年1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过RNA 注射的方式将CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关G 蛋白偶联受体Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。 CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。 技术优缺点 CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。
电容工作原理
电容工作原理 电容串联可以隔直通交，并联可以滤波。 电容器就是两片不相连的金属板.电容器在电子线路中的作用一般概括为：通交流、阻直流。电容器通常起滤波、旁路、耦合、去耦、转相等电气作用，是电子线路必不可少的组成部分。滤波电路是把脉冲通到地去了，不是通到输出端。 正因为通交流，才能把交流成分通向地，保留直流成分. 一般情况下，电解电容的作用是过滤掉电流中的低频信号，但即使是低频信号，其频率也分为了好几个数量级。因此为了适合在不同频率下使用，电解电容也分为高频电容和低频电容（这里的高频是相对而言）。 低频滤波电容主要用于市电滤波或变压器整流后的滤波，其工作频率与市电一致为50Hz；而高频滤波电容主要工作在开关电源整流后的滤波，其工作频率为几千Hz到几万Hz。当我们将低频滤波电容用于高频电路时，由于低频滤波电容高频特性不好，它在高频充放电时内阻较大，等效电感较高。因此在使用中会因电解液的频繁极化而产生较大的热量。而较高的温度将使电容内部的电解液气化，电容内压力升高，最终导致电容的鼓包和爆裂。 其实主要是充放电的工作原理。其实电容就相当于 一个水库，让过来的有波动的水变的很平稳 电解电容的作用有滤波，一般用在整流桥的后面。 你可以看一下电容是并连还是串连在回路里，并联的话是率除高频，串联的话是率除低频。还有降压电容。还有隔直的作用，一般做保护用！ 电容串联和并联在电路中各有什么作用？ 电容的作用是储存、释放电荷，可起到隔直通交、滤波、振荡作用 电容在电路中：如串联使用一般作为交流信号隔离，如音频功放、视频放大器等 如并联使用一般作为滤波，如电源、信号处理电路中噪声去除等 如与电感或其他芯片并联可组成振荡回路，如无线信号发射、接收、调制、解调等 电容并联可增大电容量，串联减小。比如手头没有大电容，只有小的，就可以并起来用，反之，没有小的就可以用大的串起来用。 在集成电路、超大规模集成电路已经大行其道的今天，电容器作为一种分立式无源元件仍然大量使用于各种功能的电路中，其在电路中所起的重要作用可见一斑。 作贮能元件也是电容器的一个重要应用领域，同电池等储能元件相比，电容器可以瞬时充放电，并且充放电电流基本上不受限制，可以为熔焊机、闪光灯等设备提供大功率的瞬时脉冲电流。 电容器还常常被用以改善电路的品质因子，如节能灯用电容器。 隔直流：作用是阻止直流通过而让交流通过。 旁路（去耦）：为交流电路中某些并联的元件提供低阻抗通路。 耦合：作为两个电路之间的连接，允许交流信号通过并传输到下一级电路 滤波：将整流以后的锯齿波变为平滑的脉动波，接近于直流。 温度补偿：针对其它元件对温度的适应性不够带来的影响，而进行补偿，改善电路的稳定性。计时：电容器与电阻器配合使用，确定电路的时间常数。 调谐：对与频率相关的电路进行系统调谐，比如手机、收音机、电视机。 整流：在预定的时间开或者关半闭导体开关元件。
同源重组的分子机制
同源重组的分子机制 一、断裂重接模型（breakage joining model） C．D．Darlington 1936年提出。 在同源染色体联会时，由于染色体的缠绕而产生张力，两个相对染色单体在同一位置断裂，然后彼此和另一染色单体重新连接起来从而形成重组并消除这种张力。 二、基因转换现象 Olive等广泛研究粪生粪壳菌g座位，g-决定子囊孢子灰色，g+决定子囊孢子的黑色，在g+×g-的杂交中，他们分析了20万子囊，发现0.06%是5∶3分离，0.05%是6∶2分离，0.008％是3∶1∶1∶3（或异常4∶4）分离。图示． (1)一个孢子中的两个孢子有着不同的基因型。(2)分离比例不是4∶4。(3)邻近的基因A/a都呈现正常分离。 断裂重接模型则无法解释异常现象。
1930年，德国遗传学家H．温克勒把这种不规则分离现象解释为减数分裂过程中同源染色体联会时一个基因使相对位置上基因发生相应的变化所致，因而称就基因转变。好象是由于一个基因转换为另一等位基因，所以称为基因转换（gene conversion）。 以后由于发现一个基因发生基因转变时，它两旁的基因常同时发生重组：在5∶3和6∶2分离的子囊中，大约有30%也在g座位的这边或那边发生重组；有基因转换的子囊中，基因转换和遗传重组都发生在同样两个单体的子囊比例竟高达90%。 所以认为基因转变是某种形式的染色体交换的结果。因此，基因转变的研究，实质上也是染色体交换机制的研究。 三、同源重组的Holliday模型
1964年，R. Holliday提出了重组的杂合DNA模型(hybrid DNA mode)，并作修正。图示．过程：
电容补偿柜的作用与工作原理
电容补尝柜的作用和工作原理 一. 电容补偿柜之作用: 用于补偿发电机无功电流、减轻发电机工作负荷，增加发电机可使用容量，可减少工厂一定的用电量、节省工业电力，提高发供电设备的供电质量和供电能力。 二. 电容柜工作原理 用电设备除电阻性负载外，大部分用电设备均属感性用电负载（如日光灯、变压器、马达等用电设备）这些感应负载，使供电电源电压相位发生改变（即电流滞后于电压），因此电压波动大，无功功率增大，浪费大量电能。当功率因数过低时，以致供电电源输出电流过大而出现超负载现象。电容补偿柜内的电脑电容控制系统可解决以上弊端，它可根据用电负荷的变化，而自动设置。电容组数的投入，进行电流补偿，从而减低大量无功电流，使线路电能损耗降到最低程度，提供一个高素质的电力源。 三. 电容补偿技术: 在工业生产中广泛使用的交流异步电动机，电焊机、电磁铁工频加热器导用点设备都是感性负载。这些感性负载在进行能量转换过程中，使加在其上的电压超前电流一个角度。这个角度的余弦，叫做功率因数，这个电流（既有电阻又有电感的线圈中流过的电流）可分解为与电压相同相位的有功分量和落后于电压90 度的无功分量。这个无功分量叫做电感无功电流。与电感无功电流相应的功率叫做电感无功功率。当功率因数很低时，也就是无功功率很大时会有以下危害：
?增长线路电流使线路损耗增大，浪费电能。 ?因线路电流增大，可使电压降低影响设备使用。 ?对变压器而言，无功功率越大，则供电局所收的每度电电费越贵，当功率因数低于0.7 时，供电局可拒绝供电。 ?对发电机而言，以310KW 发电机为例。 310KW 发电机的额定功率为280KW ，额定电流为530A ，当负载功率因数0.6 时 功率= 380 x 530 x 1.732 x 0.6 = 210KW 从上可看出，在负载为530A 时，机组的柴油机部分很轻松，而电球以不堪重负，如负荷再增加则需再开一台发电机。加接入电容补偿柜，让功率因数达到0.96 ，同样210KW 的负荷。 电流=210000/ （380x1.732x0.96 ）=332A 补偿后电流降低了近200A ，柴油机和电球部分都相当轻松，再增加部分负荷也能承受，不需再加开一台发电机，可节约大量柴油。也让其他机组充分休息。从以上可看出，电容补偿的经济效益可观，是低压配电系统中不可缺少的重要成员。 原理：把具有容性负荷的装置与感性负荷并联接在同一电路,当容性负荷释放能量时,感性负荷吸收能量;而感性负荷释放能量时,容 性负荷却在吸收能量,能量在两种负荷之间互相交换.这样,感性负荷 所吸收的无功功率可由容性负荷输出的无功功率中得到补偿,这就是他的补偿原理
B-Cas9敲进小鼠
B-Cas9敲进小鼠——一个神奇的基因敲除小鼠制备工具CRISPR/Cas9技术自问世以来就受到了科学家们的青睐。随着基因敲除技术不断更新完善，最近诞生了一种可以快速、高效制备基因敲除小鼠的工具模型--B-Cas9敲进小鼠。B-Cas9敲进小鼠自身携带Cas9蛋白，只需注射sgRNA就可以对基因进行编辑。那么，我们为什么需要B-Cas9敲进小鼠？它有哪些优势、应用领域如何呢？B-Cas9敲进小鼠又是如何制备的呢？ 1）B-Cas9敲除小鼠的优势 不仅可以缩短敲除小鼠的制备周期，还可以提高敲除效率。在携带有Cas9蛋白的小鼠体内注射sgRNA病毒，便可即时获得敲除小鼠；若在小鼠体内注射多个sgRNA病毒，就可以实现多基因同时敲除。 2）B-Cas9敲除小鼠的应用 不仅可以快速制备组织特异性基因敲除小鼠模型；其多基因变异更接近于肿瘤的异质性，还可以制备多基因敲除的癌症模型；除此之外, B-Cas9敲进小鼠还可以结合sgRNA文库进行高通量筛选。 3）B-Cas9敲除小鼠的制备原理 将表达Cas9蛋白的序列插入到Rosa26位点当中，并在Cas9前面添加TetO元件，以达到控制Cas9表达，实现可诱导型、组织特异性表达的效果。B-Cas9敲进小鼠只有在注射了Dox后，Dox与Teto复合体结合才能诱导Cas9蛋白的表达。（打靶策略如下图）
4）B-Cas9敲进小鼠与国外引进的Cas9敲进小鼠作比较，我们不难发现，B-Cas9敲进小鼠更加有优势。时间上省去了运输和隔离的3-4个月，费用也减少一半多。从遗传背景和技术改造来看，B-Cas9敲进小鼠的遗传背景是纯净的C57BL/6背景，而国外引进的Cas9敲进小鼠是129背景上回交的。B-Cas9敲进小鼠最大的优势在于其可诱导、可逆性表达Cas9,让实验更加方便,易于操控。
同源重组的分子机制.doc
同源重组的分子机制 、断裂重接模型(breakage joi ning model ) C. D. Darlington 1936 年提岀。 在同源染色体联会时，由于染色体的缠绕而产生张力，两个相对染色单体在同一位置断裂, 然后彼此和另一染色单体重新连接起来从而形成重组并消除这种张力。 、基因转换现象 Olive等广泛研究粪生粪壳菌g座位，g-决定子囊抱子灰色，g+决定子囊抱子的黑色，在+ - g X g的杂交中，他们分析了20万子囊，发现0.06%是5 : 3分离，0.05%是6 : 2分离，0.008 % 是3 ： 1 ：1 ：3 (或异常4 : 4)分离。图示.(1) 一个抱子中的两个抱子有着不同的基因型。(2)分离比例不是4 : 4。(3)邻近的基因A/a都呈现正常分离。
断裂重接模型则无法解释异常现象。
1930年，德国遗传学家H.温克勒把这种不规则分离现象解释为减数分裂过程中同源染色 体联会时一个基因使相对位置上基因发生相应的变化所致，因而称就基因转变。好象是由于一个 基因转换为另一等位基因，所以称为基因转换(gene con version ) 30%也在g座位的这边或那边发生重组；有基因转换的子囊中，基因转换 和遗传重组都发生在同样两个单体的子囊比例竟高达90%。 所以认为基因转变是某种形式的染色体交换的结果。因此，基因转变的研究，实质上也是染色体交换机制的研究。 粗糙脉俺菌中+ pdxpX pcfc ■!■杂交 抱子对 子囊型 1234 第一对+ pdxp pdj：++ +pdx ■+ 第二对+ +pds +++ 第三对+ pixp+ +”酝 ++ 4 第四对pdx ++ pcfep pd^ +pdx +、同源重组的Holliday模型 M pdx—pdxp-Dtt 哆醇pH?感 + + pdx
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠(Cas9-KO)的制作方法-2018-2-28
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠（Cas9-KO）的制作方法 一、CRISPR/Cas9靶向基因敲除小鼠制作的基本技术原理： 通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA。这一tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA。在与crRNA引导序列互补的位点，Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链而Cas9 RuvC-like 结构域剪切非互补链，实现敲除目的基因的功能，制备基因敲除小鼠模型。 二、具体步骤如下： 一）模型制作策略制作：利用生物信息学手段(NCBI&IMPC&MGI)，分别仔细分析目的基因敲除后小鼠的生存能力及繁育能力，并结合邻近基因的影响，最终选择合适的敲除区域进行敲除方案的设计，出具相应的制作策略。 二）载体的设计和构建：使用麻省理工学院的CRISPR Design工具 （https://www.sodocs.net/doc/362414954.html,/），依据中靶Score的高低及脱靶Score的高低设计一对长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA，并在该靶区域设计引物用于后续阳性小鼠的基因鉴定。 1、制备sgRNA的实验方法步骤： 1）线性化pUC57-GDNA-T7载体 中提pUC57-GDNA-T7载体，用BsaI线性化过夜。胶回收保存备用。 2）引物退火及加磷酸 将上下游引物（干粉）稀释，再进行引物退火及加磷酸。 3）连接&阳性菌落筛选
取步骤二中的加磷酸产物与线性化载体pUC57-GDNA-T7进行连接，该连接反应在干式恒温器中进行。对连接产物进行转化，涂板，37°C培养箱过夜培养。再用PCR&测序的方法筛选阳性克隆，再将测序正确的克隆进行甘油菌保种，-80°C保存备用 4）制备转录模板 以构建好的sgRNA载体为模板进行PCR扩增，将PCR产物切胶回收，回收产物离心后倒掉上清留DNA沉淀，再溶解DNA。再吸1 μl测DNA浓度，浓度应介于300-500ng/μl，OD260/280介于1.8-2.0范围内。 5）最后进行sgRNA转录，将得到的sgRNA测浓度，跑电泳，分装保存。 三）Cas9/sgRNA的显微注射：将转录好的Cas9 mRNA，sgRNA混合使用显微操作仪将混合物显微注射到小鼠受精卵的胞浆中，再将受精卵移植到假孕的母鼠子宫中，等待F0代小鼠出生。 四）F0 小鼠的鉴定：在F0代小鼠出生后5-7天时，采用剪脚趾法标记小鼠，并将剪取鼠尾组织用在靶区域设计的引物进行鉴定，选取PCR阳性的样品进行测序。 五）F0代小鼠的可遗传性检测：将PCR以及测序正确的F0代小鼠与野生型C57BL/6小鼠进行交配，产生F1代小鼠，依据F0代小鼠的鉴定方法对F1代小鼠进行鉴定，获得的阳性F1代杂合子小鼠即可稳定遗传。
原核生物的同源重组
原核生物的同源重组 在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（Homologous Recombination）。同源重组的频率与DNA或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。 3.1.1 原核细菌的基因转移程序 原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方法主要有以下几种： 1．Ca2+诱导转化法 1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收 噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。 2．原生质体转化法 在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子的吸收。此时，再加入含有待转化的DNA样品和聚乙二醇的等渗溶液，均匀混合。通过
电容降压式电源原理及电路
电容降压式电源原理及电路 电容降压式电源 将交流市电转换为低压直流的常规方法是采用变压器降压后再整流滤波，当受体积和成本等因素的限制时，最简单实用的方法就是采用电容降压式电源。 一、电路原理 电容降压式简易电源的基本电路如图1，C1为降压电容器，D2为半波整流二极
管，D1在市电的负半周时给C1提供放电回路，D3是稳压二极管，R1为关断电源后C1的电荷泄放电阻。在实际应用时常常采用的是图2的所示的电路。当需要向负载提供较大的电流时，可采用图3所示的桥式整流电路。 整流后未经稳压的直流电压一般会高于30伏，并且会随负载电流的变化发生很大的波动，这是因为此类电源内阻很大的缘故所致，故不适合大电流供电的应用场合。 二、器件选择 1.电路设计时，应先测定负载电流的准确值，然后参考示例来选择降压电容器的容量。因为通过降压电容C1向负载提供的电流Io，实际上是流过C1的充放电电流Ic。C1容量越大，容抗Xc越小，则流经C1的充、放电电流越大。当负载电流Io小于C1的充放电电流时，多余的电流就会流过稳压管，若稳压管的最大允许电流Idmax小于Ic-Io时易造成稳压管烧毁。 2.为保证C1可靠工作，其耐压选择应大于两倍的电源电压。 3.泄放电阻R1的选择必须保证在要求的时间内泄放掉C1上的电荷。 三、设计举例 图2中，已知C1为0.33μF，交流输入为220V/50Hz，求电路能供给负载的最大电流。 C1在电路中的容抗Xc为： Xc=1 /（2 πf C）= 1/（2*3.14*50*0.33*10-6）= 9.65K 流过电容器C1的充电电流（Ic）为： Ic = U / Xc = 220 / 9.65 = 22mA。 通常降压电容C1的容量C与负载电流Io的关系可近似认为：C=14.5 I，其中C的容量单位是μF，Io的单位是A。 电容降压式电源是一种非隔离电源，在应用上要特别注意隔离，防止触电。 请看： 电容降压式电源电路的计算与元件选择 电容降压式电源电路又称恒流电源电路，由于省去了笨重的交流电源变压器，体
使用CRISPR-CAS系统构建可遗传的基因敲除小鼠和大鼠
使用CRISPR-CAS系统构建可遗传的基因敲除小鼠和大鼠致编辑：CRISPR-CAS系统已经成为一种细胞和模式生物中有效的基因编辑技术。我们使用CRISPR-CAS系统，通过同时注入两种单导向RNA靶向Uhrf2,同时带入Cas9 mRNA来诱导小鼠的DNA片段缺失。此外，我们通过一种单一的显微注射方法得到了敲除Mc3R和Mc4R两种基因的大鼠。在小鼠和大鼠中均观察到较高的种系转移效率（突变可遗传）。 成簇有序间隔短回文重复关联蛋白系统（CRISPR-CAS系统）是一种在细菌和古细菌中演变的针对病毒和质粒入侵的基于RNA的后天免疫系统。【Bamboo注：该系统由一段Cas基因（双链DNA核酸酶）加一段特异序列组成，Cas作用为结合导向RNA,切割目的基因，导向RNA为CRISPR序列转录而成，有二级结构】根据作用机制不同，CRISPR-CAS系统目前有三种类型。在第二类型（下文称该系统）中，CRISPR序列转录RNA（crRNA）和反式激活RNA(TraceRNA)结合后有能力引导Cas9核酸内切酶到特定的序列，从而导致目标DNA双链缺失。【Bamboo注：机理：摄取了病毒DNA后，CRISPR 序列在转录产物tracrRNA,表达产物CAS蛋白，RNA酶共同作用下产生导向RNA,导向RNA含有病毒DNA序列，可遗传给下一代，再遇到病毒DNA时将其剪切】之前的研究表明在哺乳动物中有多种基因工程使用RNA介导的Cas9核酸酶系统。最近，使用该系统进行高效基因编辑已经在斑马鱼、小鼠和细菌中实现。几个小组也证明通过该系统介导的在细胞和斑马鱼中基因靶向效率与ZFNs（锌指核酸酶）和TALENs（转录活化因子效应核酸酶）【Bamboo注：另外两种常见DNA编辑方式】相似或较高。虽然已经有报道在单个小鼠胚胎中可使用该系统打乱多个基因，但是在动物体中尚未见该系统介导的突变种系转移。此外，长的特异的基因组DNA片段能否被该系统敲除也是未知的。CRISPR-CAS系统基因打靶在其他哺乳动物模型，例如实验室大鼠的效用，还需要确定。在这里，俺们报告俺们使用该系统在小鼠和大鼠中实现了高效的，可遗传的基因敲除。 图1使用该系统产生基因突变鼠。(a)该系统构建：Spacer-核酸引导序列；DR-分隔核酸引导序列的小重复片段；NLS-核酸定位信号序列。(b) F0代大鼠注射导向RNA后突变体的检测：Mc4r靶向前后（-，+）分别使用T7E1酶切Mc4r F0代大鼠尾基因组PCR产物。箭头为突变带，M是Marker.(c) Mc3r和Mc4r基因的序列。红框为核苷酸替换。右侧显示碱基对序列改变。通过DNA测序分析六组克隆扩增的PCR产物序列。各基因型在六组克隆的发生率列在右侧。 为了测试该系统在小鼠中的活动，初始试验选用了细胞中基因组Th位点已经被有效靶向的小鼠。首先，我们向FVB小鼠品系雄性原核（受精卵核物质融合前）中注入不同浓度的线性DNA(针对特定CrDNA和tracrRNA的人工编码Cas9核酸内切酶基因)（图1a），在子鼠中检测Th位点基因突变情况。同ZFNs（锌指核酸酶）和TALENs （转录活化因子效应核酸酶）相似，该系统诱导的双链DNA缺失主要被NHEJ(非同源
超级电容器工作原理
超级电容器工作原理 超级电容器既拥有与传统电容器一样较高的放电功率，又拥有与电池一样较大的储存电荷的能力。但因其放电特性仍与传统电容器更为相似，所以仍可称之为“电容”。到现在为止，对于超级电容器的名称还没有统一的说法，有的称之为“超电容器”，有的称之为“电化学电容器”“双电层电容器”，有的还称之为“超级电容器”，总之名称还不统一。但是有人提出根据其储能机理，分为双电层电容器（靠电极 -电解质界面形成双电层）和赝电容器（靠快速可逆的化学吸-脱附或氧化-还原反应产生赝电容）两类。 （一）双电层电容器的基本原理 双电层电容器是利用电极材料与电解质之间形成的界面双电层 来存储能量的一种新型储能元件。当电极材料与电解液接触时，由于界面间存在着分子间力、库仑力或者原子间力的相互作用，会在固液界面处出现界面双电层，是一种符号相反的、稳定的双层电荷。对于一个电极-溶液体系来说，体系会因电极的电子导电和电解质溶液的离子导电而在固液界面上形成双电层。当外加电场施加在两个电极上后，溶液中的阴、阳离子会在电场的作用下分别向正、负电极迁移，而在电极表面形成所谓的双电层；当外加电场撤销后，电极上具有的正、负电荷与溶液中具有相反电荷的离子会互相吸引而使双电层变得更加稳定，这样就会在正、负极间产生稳定的电位差。 在体系中对于某一电极来说，会在电极表面一定距离内产生与电极上的电荷等量的异性离子电荷，来使其保持电中性；当将两极和外
电源连接时，由于电极上的电荷迁移作用而在外电路中产生相应的电流，而溶液中离子迁移到溶液中会呈现出电中性，这就是双电层电容器的充放电原理。 从理论上说，双电层中存在的离子浓度要大于溶液本体中离子浓度，这些浓度较高的离子受到固相体系中异性电荷吸引的同时，还会有一个扩散回溶液本体浓度较低区域的趋势。电容器的这种储能过程是可逆的，因为它是通过将电解质溶液进行电化学极化实现的，整个过程并没有产生电化学反应。双电层电容器的工作原理如下图所示： （二）法拉第准电容器的基本原理 法拉第准电容器是在双电层电容器后发展起来的，有人将其简称为准电容。这种电容的产生是因为电极活性物质在其表面或者体相中
电容器的工作原理及作用
电容器的工作原理及作用 定义1：电容器，顾名思义，是‘装电的容器’，是一种容纳电荷的器件。英文名称：capacitor。电容是电子设备中大量使用的电子元件之一，广泛应用于电路中的隔直通交，耦合，旁路，滤波，调谐回路，能量转换，控制等方面。 定义2：电容器，任何两个彼此绝缘且相隔很近的导体（包括导线）间都构成一个电容器。 原理电容器是由两个电极及其间的介电材料构成的。介电材料是一种电介质，当被置于两块带有等量异性电荷的平行极板间的电场中时，由于极化而在介质表面产生极化电荷，遂使束缚在极板上的电荷相应增加，维持极板间的电位差不变。这就是电容器具有电容特征的原因。电容器中储存的电量Q等于电容量C与电极间的电位差U 的乘积。电容量与极板面积和介电材料的介电常数ε成正比，与介电材料厚度（即极板间的距离）成反比。 用途电力电容器按用途可分为8种：1、并联电容器。原称移相电容器。主要用于补偿电力系统感性负荷的无功功率，以提高功率因数，改善电压质量，降低线路损耗。2、串联电容器。串联于工频高压输、配电线路中，用以补偿线路的分布感抗，提高系统的静、动态稳定性，改善线路的电压质量，加长送电距离和增大输送能力。3、耦合电容器。主要用于高压电力线路的高频通信、测量、控制、保护以及在抽取电能的装置中作部件用。4、断
路器电容器。原称均压电容器。并联在超高压断路器断口上起均压作用，使各断口间的电压在分断过程中和断开时均匀，并可改善断路器的灭弧特性，提高分断能力。5、电热电容器。用于频率为40～24000赫的电热设备系统中，以提高功率因数，改善回路的电压或频率等特性。6、脉冲电容器。主要起贮能作用，用作冲击电压发生器、冲击电流发生器、断路器试验用振荡回路等基本贮能元件。7、直流和滤波电容器。用于高压直流装置和高压整流滤波装置中。⑧标准电容器。用于工频高压测量介质损耗回路中，作为标准电容或用作测量高压的电容分压装置。
电容在不同的电路中的工作原理1
电容在不同的电路中的工作原理 1：无功补偿：工频电流和谐波电流是有本质区别的，一般常规设备不能测量谐波电流，且谐波的产生有随机性，就象心脏病一样，你测的时候不一定有，但你不测的时候却可能发生，只有连续化测量的数据才可用来谐波治理。 整流必然有谐波，但整流的方式不同，引起的谐波次数和大小也不同，如6脉动整流会产生5次和7次谐波，12脉动整流会产生11次和13次谐波。我想你拆掉一个变压器还能出直流，就是用二个接线组别不同的变压器，组成了12脉动整流，以消除低次谐波的影响；但你少了一个变压器，变成6脉动整流了，产生的谐波变了，但你的无功补偿柜还是原来补偿11次和13次谐波的，在5次和7次谐波下，当然不能用了。 你用的无功功率补偿装置，应该是一个具有滤谐波功能的电容器+电抗器组组成，内部由多个这样的单通滤波器组合而成，某个单通滤波器（一个电容器+电抗器）只能完成特定谐波的滤除，对其它次波反而有放大作用，如内部有11次滤波器，对5次谐波就有放大作用，你说的大谐波电流可能是放大后的谐波电流。 生产这个装置的厂家，估计技术力量也不强，很可能对上面的单通滤波器（一个电容器+电抗器）设计或生产组装产生问题，参数计算错误或元件参数分散性太大，如本设计的是滤11次谐波的，却变成了滤12次谐波的了，使11次谐波电流被放大，这也许就是变压器烧毁
的真正原因。（正规的滤波器设计应取电网参数，估计厂家根本作不到） 你改正电容器或电抗器参数是很复杂，没有意义的，只有恢复12脉动整流才是正确道路。即重新安装和烧毁变压器同接线组别，和未烧变压器不同接线组别的变压器，有可能降低系统运行电压，可能会解决这些问题。 2：电容器补偿器的作用：把具有容性负荷的装置与感性功率负荷并联接在同一电路,当容姓负荷释放能量时,感性负荷吸收能量;而感性 负荷释放能量时,容性负荷却在吸收能量,能量在两种负荷之间互相交换,这样,感性负荷所吸收的无功功率可由容性负荷输出的无功功率中得到补偿,这就是电容补偿器基本原理。 3：电容供储电的原理：电容（Capacitor）是第二种最常用的元件。电容的主要物理特征是储存电荷。由于电荷的储存意味着能的储存，因此也可说电容器是一个储能元件，确切的说是储存电能。两个平行的金属板即构成一个电容器。电容也有多种多样，它包括固定电容，可变电容，电解电容，瓷片电容，云母电容，涤纶电容，钽电容等，其中钽电容特别稳定。电容有固定电容和可变电容之分。固定电容在电路中常常用来做为耦合，滤波，积分，微分，与电阻一起构成RC 充放电电路，与电感一起构成LC振荡电路等。可变电容由于其容量在一定范围内可以任意改变，所以当它和电感一起构成LC回路时，回路的谐振频率就会随着可变电容器容量的变化而变化。一般接受机电路就是利用这样一个原理来改变接收机的接收频率的。
电容的作用和工作原理
电容的作用和工作原理 在电子线路中，电容用来通过交流而阻隔直流，也用来存储和释放电荷以充当滤波器，平滑输出脉动信号。小容量的电容，通常在高频电路中使用，如收音机、发射机和振荡器中。大容量的电容往往是作滤波和存储电荷用。而且还有一个特点，一般1μF以上的电容均为电解电容，而1μF以下的电容多为瓷片电容，当然也有其他的，比如独石电容、涤纶电容、小容量的云母电容等。电解电容有个铝壳，里面充满了电解质，并引出两个电极，作为正（+）、负（-）极，与其它电容器不同，它们在电路中的极性不能接错，而其他电容则没有极性。 把电容器的两个电极分别接在电源的正、负极上，过一会儿即使把电源断开，两个引脚间仍然会有残留电压（学了以后的教程，可以用万用表观察），我们说电容器储存了电荷。电容器极板间建立起电压，积蓄起电能，这个过程称为电容器的充电。充好电的电容器两端有一定的电压。电容器储存的电荷向电路释放的过程，称为电容器的放电。 举一个现实生活中的例子，我们看到市售的整流电源在拔下插头后，上面的发光二极管还会继续亮一会儿，然后逐渐熄灭，就是因为里面的电容事先存储了电能，然后释放。当然这个电容原本是用作滤波的。至于电容滤波，不知你有没有用整流电源听随身听的经历，一般低质的电源由于厂家出于节约成本考虑使用了较小容量的滤波电容，造成耳机中有嗡嗡声。这时可以在电源
两端并接上一个较大容量的电解电容（1000μF，注意正极接正极），一般可以改善效果。发烧友制作HiFi音响，都要用至少1万微法以上的电容器来滤波，滤波电容越大，输出的电压波形越接近直流，而且大电容的储能作用，使得突发的大信号到来时，电路有足够的能量转换为强劲有力的音频输出。这时，大电容的作用有点像水库，使得原来汹涌的水流平滑地输出，并可以保证下游大量用水时的供应。 电子电路中，只有在电容器充电过程中，才有电流流过，充电过程结束后，电容器是不能通过直流电的，在电路中起着“隔直流”的作用。电路中，电容器常被用作耦合、旁路、滤波等，都是利用它“通交流，隔直流”的特性。那么交流电为什么能够通过电容器呢？我们先来看看交流电的特点。交流电不仅方向往复交变，它的大小也在按规律变化。电容器接在交流电源上，电容器连续地充电、放电，电路中就会流过与交流电变化规律一致的充电电流和放电电流。 电容器的选用涉及到很多问题。首先是耐压的问题。加在一个电容器的两端的电压超过了它的额定电压，电容器就会被击穿损坏。一般电解电容的耐压分档为 6.3V，10V，16V，25V，50V 等。
用CRISPR Cas9方案构建双基因敲除鼠, 获得双基因敲除纯合子小鼠的交配方案
双基因敲除小鼠繁殖工作： CRISPR/Cas9方案构建双基因敲除鼠，得到F0杂合子之后，如何建系才能获 得双基因敲除纯合子小鼠？这是经常被问到的问题，下面就简单回答一下。 假设我们的目的基因为A和B，通常用CRISPR/Cas9方法得到的基因敲除鼠 为杂合子，双杂合子小鼠基因型为AaBb，大写字母代表野生型（dominant），小写字母代表突变型（recessive）。得到F0杂合子（AaBb）之后，可以用 以下方案之一来获得双基因敲除纯合子小鼠： 方案一： 1.将双杂合子小鼠（AaBb）与野生鼠（AABB）交配，理论上将得到25%的 野生型（AABB），25%基因A单杂合子（AaBB）,25%基因B单杂合子 （AABb）及25%双杂合子小鼠（AaBb）。 2.将所得到的双杂合子小鼠（AaBb）互交（inter-cross），理论上6.25% 的后代将会是双基因敲除纯合子小鼠（aabb），见下图。
3.由于双基因敲除实验中一般都需要单基因敲除动物作为对照，所以在 进行上面小鼠breeding的同时可以将基因A单杂合子（AaBB）互交， 在后代中鉴定出基因A纯合子（aaBB）,同样将基因B单杂合子（AABb）互交，在后代中鉴定出基因B纯合子（AAbb）。 方案二： 将双杂合子小鼠（AaBb）与单基因纯合子（如aaBB）交配，所生小鼠 中约25%为基因A纯合子而基因B杂合子（aaBb,见下图左）。然后将 aaBb小鼠互交，理论上后代小鼠中25%为双基因敲除纯合子小鼠 （aabb），见下图右。 需要特别注意的几个问题： 1)上面所讲的方法适用于位于不同的染色体两个基因的基因敲除，如 果两个基因位于同一条染色体上，要通过上述方法得到双基因敲除 纯合子小鼠很难； 2)上述方法有赖于基因特异性的Genotyping PCR assays。在开始set up breeding之前必须将两个目的基因特异性的Genotyping PCR assays 准备好； 3)要事先研究一下目的基因敲除后有无胚胎致死性，是否影响其生长 发育等。当然单基因敲除无胚胎致死性并不表示双基因敲除无胚胎 致死性。
DNA双链断裂与同源重组修复机理研究进展
DNA双链断裂与同源重组修复机理研究进展 卞广兴 郭葆玉 第二军医大学药学院生化药学教研室(上海,200433) 摘要 双链断裂(doub le strand b reak s,D SB s)是细胞染色体复制过程中经常出现的DNA损伤,它的修复过程在真核生物中以同源重组(homo logy recom b inati on,HR)修复为主。正常机体中有着一系列的基因和蛋白及时修复这些损伤,这些蛋白归属于RAD52上位性集团(RAD52ep istasis group)。它们对细胞发挥功能和维持生存意义重大,近来国外研究十分活跃。 关键词 同源重组;双链断裂 1 与HR有关的基因和蛋白 在多种多样的生物体中,基因组保持完整具有极为重要的意义。它是细胞发挥功能和维持生存的必要条件。生物体基因组暴露于离子射线或者受内切酶作用,特别是在染色体自我复制过程中都会出现双链断裂。如果这些断裂未能及时修复就会引起细胞的染色体丢失或导致细胞的死亡。修复不正确也会引起基因的突变和染色体的重组。真核生物对这些断裂的修复有两种机理:非同源末端连接(non2 hom o logy end j o in ing,N H EJ)和同源重组(hom o l2 ogy recom b inati on,HR)。 同源重组是发生在DNA的同源序列之间的重组方式。真核生物非姊妹染色子体的交换,姊妹染色子体的交换,细菌及某些低等真核生物的转化,细菌的转导,接合,噬菌体的重组等都属于这一类型。有人认为,在原核生物中D SB s的修复以HR方式为主;而对于真核生物,其它的修复方式才是主要的。但近几年对酵母和哺乳动物细胞的研究发现,真核生物中的HR不仅在机理上与原核相似,而且具有同等的重要性[1]。 在HR中起重要作用的蛋白归属于R ec A家族,其中R ec A是其中的第一个成员,它是一个由R ec A基因编码的蛋白,在E.coli的HR和DNA复制中起重要作用。近几年来,研究发现了R ec A的很多同源蛋白,如T4噬菌体中的U vsX和哺乳动物细胞中的R ad51等。它们被统称为RAD52上位性集团。包括:RAD50、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RAD59、M R E11和XR S2、XRCC2等。它们的突变缺失细胞都表现出对离子射线的敏感和有丝分裂 无丝分裂缺陷,表明它们是D SB s修复的某条途径的组成部分[2]。其中的不少成员就是在研究射线照射对生物体的作用(radiati on sen si2 tive m u tati on)中发现的,其命名也沿袭了原来的名称(RAD)。从酵母到脊椎动物基因序列的高度保守性表明它们在HR中有着类似的功能。研究中,符合这两者的因子大都可归于RAD52上位性集团。这其中最重要的是RAD51、RAD52和RAD54。 RAD51在所有的细胞中都表达,可能执行链交换的功能。它的作用同R ec A相似,但又不完全相同。Sonoda等[3]把人的RAD51转入鸡B细胞系的D T40细胞发现,RAD51缺失的细胞静息在细胞周期的G2 M期,累积对细胞有毒害作用的染色体断裂并最终死亡。同时发现大多数可探测到的染色体缺失是异染色质型的缺口或断裂,同一染色体的姊妹染色单体在同样的基因座断裂。这表明很多不可修复的裂隙是复制过程中产生的双链断裂的可能原因。尽管RAD51的分布远比其它因子广泛,研究表明它并不是D SB s诱导的所有重组修复形式中应用最广的因子[4]。RAD51在D SB s诱导的同源染色体交换中是必须的,但它对于其他形式的重组,如自发重组(spon taneou s recom b inati on),却并不是必须的。不过,RAD52在已知的这些重组形式中却都是必须的。 RAD52是重组中最重要的蛋白,它在真核细胞中进化保守,原核中基因序列差别较大。R ad52在体内形成多聚体的环,既可以连接DNA链末端又可促进互补链的退火。人的R ad52具有类似的特性。细胞在缺失RAD52的情况下几乎所有形式的HR 都被阻断了[4]。但是研究发现,剔除了RAD52的脊椎动物细胞可以存活而不会象剔除了RAD51等那样严重(死亡),有人认为这可能是细胞中还有其它起类似作用的因子未被发现[5]。 RAD55和RAD57同RAD51具有某些同源