荧光光谱分析

第十七章荧光光谱分析

当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线被称为荧光。

西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes于1575年第一次记录了荧光现象。17世纪，Boyle和Newton等著名科学家再次观察到荧光现象。17世纪和18世纪，又陆续发现了其它一些发荧光的材料和溶液，但是在荧光现象的解释方面却没有什么进展。1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念。同时，他由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Coppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝-桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1880年，Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则。到19世纪末，人们已经知道了600种以上的荧光化合物。20世纪以来，荧光现象被研究得更多了。例如，1905年Wood发现了共振荧光；1914年Frank和Hertz利用电子冲击发光进行定量研究；1922年Frank和Cario发现了增感应光；1924年Wawillow进行了荧光产率的绝对测定；1926年Gaviola进行了荧光寿命的直接测定等。

荧光分析方法的发展离不开仪器应用的发展。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West研制出第一台光电荧光计。早期的光电荧光计的灵敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。1943年Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置，到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。

荧光光谱分析法除了可以用作组分的定性检测和定量测定的手段之外，还被广泛地作为一种表征技术应用于表征所研究体系的物理、化学性质及其变化情况。例如，在生命科学领域的研究中，人们经常可以利用荧光检测的手段，通过检测某种荧光特定参数（如荧光的波长、强度、偏振和寿命）的变化情况来表征生物大分子在性质和构象上的变化。

很多化合物由于本身具有大的共轭体系和刚性的平面结构，因而具有能发射荧光的内在本质，我们称这些化合物为荧光化合物。在某些所要研究的体系中，由于体系自身含有这种荧光团而具有内源荧光，人们就可以利用其内源荧光，通过检测某种荧光特性参数的变化，对该体系的某些性质加以研究。但是，如果所要研究的体系本身不含有荧光团而不具有内源荧光，或者其内源性质很弱，这时候就必须在体系中外加一种荧光化合物即所谓荧光探针，再通过测量荧光探针的荧光特性的变化来对该体系加以研究。例如，如果我们要检测体系的极性，便可以将对极性敏感的荧光探针加入到体系中，然后通过对荧光探针的荧光特性的检测，求得体系的极性，或通过探针的荧光特性的变化来表征体系的极性的变化情况。

荧光分析法之所以发展如此迅速，应用日益广泛，其原因之一是荧光分析法具

有很高的灵敏度。在微量分析的各种方法中，应用较为广泛的有比色法和分光光度法。但在方法的灵敏度方面，荧光分析法的灵敏度一般要比这两种方法高2～3各数量级。随着现代电子技术的迅速发展，对于微弱光信号检测的灵敏度已大大提高，荧光分析的灵敏度常可达亿分之几，在与毛细管电泳分离技术结合、采用激光诱导荧光检测法时，已能接近或达到单分子检测的水平[1]荧光分析法的另一个优点是选择性高。这主要是对有机化合物的分析而言。吸光物质由于内在本质的差别，不一定都会发荧光，况且，发荧光的物质彼此之间在激发波长和发射波长方面可能有所差异，因而通过选择适当的激发波长和荧光测定波长，便可能达到选择性测定的目的。另外，由于荧光的特性参数较多，除量子产率、激发与发射波长之外，还有荧光寿命、荧光偏振等。因此，还可以通过采用同步扫描、导数光谱、三维光谱、时间分辨和相分辨等一些荧光测定新技术进一步提高测定的选择性。除灵敏度高和选择性好之外，动态线性范围宽，方法简便，重现性好，取样量少，仪器设备不复杂等等，也是荧光分析法的优点。

近年来，在其他学科迅速发展的影响下，激光、微处理机、电子学、光导纤维和纳米材料等方面的一些新技术的引入，很大程度上推动了荧光分析法在理论和应用方面的进展，促进了诸如同步荧光测定、倒数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、近红外荧光分析法、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术、荧光显微与成像技术、空间分辨荧光技术、荧光探针技术、单分子荧光检测技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的某些新方法、新技术的发展，并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观、实时、原位和自动化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩展，遍及工业、农业、生命科学、环境科学、材料科学、食品科学和公安情报等诸多领域。如今，荧光分析法已经发展成为一种十分重要且有效地光谱化学分析手段。

17.1 基本原理

荧光是一种光致发光现象，那么，由于分子对光的选择性吸收，不同波长的入射光便具有不同的激发频率。如果固定荧光的发射波长（即测定波长）而不断改变激发光（即入射光）的波长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱（简称激发光谱）。如果使激发光的波长和强度保持不变，而不断改变荧光的测定波长（即发射波长）并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长的谱图则称为荧光的发射光谱（简称发射光谱）。激发光谱反映了在某一固定的发射波长下所测量的荧光强度对激发波长的依赖关系；发射光谱反映了在某一固定的激发波长下所测量的荧光的波长分布。激发光谱和发射光谱可用以鉴别荧光物质，并可作为进行荧光测定时选择合适的激发波长和测定波长的依据。

荧光测量仪器有各自的特性，如光源的能量分布、单色器的透射率和检测器的敏感度都随波长而改变，因而一般情况下测得的激发光谱和发射光谱，皆为表观的光谱。同一份荧光化合物的溶液在不同的荧光测量仪上所测得的表观光谱彼此间往往有所差异。只有对上述仪器特性的波长因素加以校正之后，所获得的校正光谱（或称真是光谱）才可能是彼此一致的。某种化合物的荧光激发光谱的形状，

理论上应与其吸收光谱的形状相同，但是由于上述仪器特性的波长因素，表光激

发光谱的形状与吸收光谱的形状大都有所差异，只有校正的激发光谱才与吸收光谱非常接近。在化合物的浓度足够小，对不同波长激发光的吸收正比于其吸光系数，且荧光的量子产率与激发波长无关的条件下，校正的激发光谱在形状上与吸收光谱相同。

分子的吸收光谱可能含有几个吸收带，但其发射光谱却通常只含有一个发射带。绝大多数情况下即使分子被激发到S

2

电子态以上的不用振动能级，但是由于内转化和振动松弛的速率是那样的快，以致很快地丧失多余的能量而衰变到

S

1

态的最低振动能级，然后发射荧光，因而其发射光谱通常只含一个发射带，且发射光谱的形状与激发波长无关，只与基态中振动能级的分布情况以及各振动带的跃迁概率有关。但是也有例外，例如有些荧光体具有两个电离态，而每个电离态显示不同的吸收和发射光谱，等等。

物质在吸收入射光的过程中，光子的能量传递给了物质分子。分子被激发后，发生了电子从较低的能级到较高能级的跃迁。该跃迁过程经历的时间约10-15s。跃迁所涉及的两个能级间的能量差，等于所吸收光子的能量。紫外、可见光区的光子能量较高，足以引起分子中的电子发生电子能级间的跃迁。处于该激发态的分子称为电子激发态分子。

电子激发态的多重态用2S+1表示，S是电子自旋角动量量子数的代数和，其数值为0或1。分子中同一轨道里同一轨道里所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自选配对。如果分子中的全部电子都是自旋配对的，即S=0，该分子便处于单重态（或称单线态），用符号S表示。大多数有机物分子的基态是处于单重态的。如果分子吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子处于激发的单重态；倘若电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋不配对的电子，即S=1，分子处于激发的三重态（或称三线态），用符号T表示。符号S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发单重态，T1和T2则分别表示第一和第二电子激发三重态。处于激发态的分子不稳定，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的衰变过程而返回基态。另外，激发态分子也可能由于分子间的作用过程而失活。

辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，即产生荧光活磷光；非辐射跃迁的衰变过程，包括振动松弛（VR）、内转化（ic）、和系间窜越（isc），这些衰变过程导致激发能转化为热能传递给介质。振动松弛是指分子将多余的振动能量传递给介质而衰变到同一电子态的最低振动能级的过程。内转化指相同多重态的两个电

子态间的非辐射跃迁过程（例如S

1～S

，T

2

～T

1

）；系间窜越则指不同多重态的两

个电子态间的非辐射跃迁过程（例如S

1～T

1

，T

1

～S

）。图5.6.1为分子内所发生

的激发过程以及辐射跃迁和非辐射跃迁过程的示意图。

图5.6.1 分子内的激发和衰变过程

A1.A2.吸收；F.荧光；P.磷光；ic.内转化；isc.系间窜越；VR.振动松弛.

如果分子被激发到S2以上的某个电子激发单重态的不同振动能级上，处于这种激发态的分子很快（约10-12～10-14s）发生振动松弛而衰变到该电子态的最低振动能级，然后又经由内转化及振动松弛而衰变到S1态的最低振动能级。接着，

有如下几种衰变到基态的途径：①S

1→S

的辐射跃迁而发射荧光；②S

1

～S

内转

化；③S

1～T

1

系间窜越。而处于T1态的最低振动能级的分子，则可能发生T

1

～

S 0的辐射跃迁而发射磷光，也可能同时发生T

1

～S

系间窜越。

从比较荧光与激发光的波长这一角度出发，荧光又可分为斯托克斯（Stokes）

荧光、反斯托克斯荧光以及共振荧光。斯托克斯荧光的波长比激发光源的长，反斯托克斯荧光的波长则比激发光源的短，而共振荧光具有与激发光相同的波长。在溶液中观察到的通常是斯托克斯荧光。由荧光在电磁辐射中所处的波段范围，又有X射线荧光、紫外荧光、可见荧光和红外荧光之分。

17.2基本构成及其工作原理

荧光光谱仪由光源、单色器（滤光片或光栅）、狭缝、样品室、信号检测放大系统和信号读出、记录系统组成。光源用来激发样品，单色器用来分离出所需要的单色光，信号检测放大系统用来把荧光信号转化为电信号，联结于放大装置上的读出装置用来显示或记录荧光信号。

下面介绍现用仪器（即法国Horiba Jobin Yvon生产的FluorLog-3荧光光谱仪）的各组件。

1、激发光源

理想化的激发光源：由于荧光体的荧光强度与激发光的强度成正比，因此，作

为一种理想的激发光源应具备：①足够的强度；②在所需光谱范围内有连续的光谱；③其强度与波长无关，即光源的输出应是连续平滑等强度的辐射；④光强要稳定。符合这些要求的光源实际上并不存在。可作为激发光源的主要有氙灯、汞灯、氙-汞弧灯、激光器以及闪光灯。高压氙弧灯是荧光光谱仪中应用最广泛的一种光源。本仪器所用的激发光源即为450W氙灯。这种光源是一种短弧气体放电灯，外套为石英，内充氙气，室温时其压力为5atm，工作时压力约为20atm。250～800nm光谱区呈连续光谱，450nm附近有几条锐线。其工作时，在相距约8mm的钨电极间形成一强的电子流（电弧），氙原子与电子流相撞而离解为氙正离子，氙正离子与电子复合而发光。氙原子的离解发射连续光谱，而激发态的氙则发射分布于450nm附近的线状光谱。氙弧灯的光谱输出，短于280nm区的强度迅速下降。有的氙弧灯为无臭氧灯，即工作时氙灯周围不产生臭氧，这种灯所用的石英外套不投射波长短于250nm的光，但这种灯的输出信号强度随波长缩短而迅速下降。工作时，氙灯灯光很强，其射线会损伤肉眼视网膜，紫外线会损伤肉眼角膜，因此，工作者应避免直视光源。

2、单色器和滤光片

⑴光栅单色器

光栅单色器有两个主要性能指标，即色散能力和杂散光水平，色散能力通常以nm/mm表示，其中mm为单色器的狭缝宽度。通常人们总是选用低杂散光的单色器，以减少杂散光的干扰，同时选用高效率的单色器来提高检测弱信号的能力。单色器一般都有进、出光两个狭缝，出射光的强度约与单色器狭缝宽度的平方成正比，增大狭缝宽度有利于提高信号强度，缩小狭缝宽度有利于提高光谱分辨力，但却牺牲了信号强度。对于光敏性的荧光体测量，有必要适当减少入射光的强度。光栅单色器的透射率为波长的函数，机刻光栅的输出最强光的波长被称为闪耀波长。光栅的闪耀波长由光栅的闪耀角而定，而闪耀角则由光栅的线槽角而定。为了弥补激发光源（氙灯）紫外区能量弱的缺点，荧光光谱仪多选用闪耀波长落于紫外区（例如300nm）的单色器为激发单色器。由于荧光体的荧光波长多落于400～600nm，因而发射单色器常采用闪耀波长为500nm左右的光栅。光栅单色器的另一重要特性在于它的透射率与偏振光有关。对于荧光测量来说，单色器的杂散光指标是一个极关键的参数。杂散光被定义为除去所需要波长的光线以外，通过单色器的所有其他光线的强度。首先考虑激发单色器，通常紫外线被用来激发荧光体，而氙灯中的紫外线强度仅约为可见光的1%。荧光体的荧光一般都很弱，通过激发单色器的长波长的杂散光，容易被当做荧光来检测。许多生物样品都有较大的浊度，结果入射的杂散光被样品散射而干扰荧光强度的测量。因此，某些荧光光谱仪采用双光栅单色器，这样，虽然杂散光可降至峰强度的10-8～10-12，可是其灵敏度也将降低。

⑵滤光片

荧光测量的主要误差来自杂散光和散射光。消除这些误差源除用单色器外还可用滤光片。滤光片具有便宜、简单等优点，因此它在荧光光谱仪中有广泛的应用。滤光片可分为玻璃滤光片、胶膜滤光片和干涉滤光片三种。本仪器所用的是玻璃滤光片。玻璃滤光片含有各种不同的金属氧化物，因而呈现不同的颜色。它们透过的光线带宽较宽，且因受金属氧化物种类的限制，品种不多。但它具有稳定、

经得起长期光照和便宜等优点。

3、检测器

检测器主要包括光电倍增管（PMT）、光导摄像管（Vidicon）、电子微分器和电荷耦合器件阵列检测器（charge-coupled device,CCD）。

目前，几乎所有普通荧光光谱仪都采用光电倍增管（PMT）作为检测器。PMT是一种很好的电流源，在一定的条件下，其电流量与入射光强度成正比。虽然PMT 对各个光子均起响应，但是平时都是测量众多光子脉冲响应的平均值。光导摄像管被用来作为光学多道分析器（简称OMA）的检测器，它具有检测效率高、动态范围宽、线性响应好、坚固耐用和寿命长等优点。与PMT相比，其检测灵敏度虽不如PMT，但却能同时接受荧光体的整个发射光谱，这有利于光敏性荧光体和复杂样品的分析，且检测系统容易实现自动化[2]。获得导数（亦称微分）光谱的方式有两类，一为光谱信号输出的微分，它包括电子微分、数字微分、机械转速微分；另一类为改变光路结构，例如波长调制等。荧光光谱仪采用电子微分或微处理机微分[3-4]。电荷耦合器件阵列检测器（charge-coupled device,CCD）是一类新型的光学多通道检测器，它具有光谱范围宽、量子效率高、暗电流小、噪声低、灵敏度高、线性范围宽，同时可获取彩色、三维图像等特点。CCD是一种灵敏的固体成像装置，一般来说CCD的有效成像面积为1～8cm2。现在商品型号的CCD 有576*384像素、5126*512像素、1024*1024像素、400万像素、800万像素等系列产品[5-6]。

本中心配备的荧光光谱仪的检测器是R928P PMT（photomultiplier-tube,光电倍增管）。PMT由一个光阴极和多级的二次发射电极所组成。光照射于光阴极时会引起一次电子发射，这些光电子在PMT中被电场加速飞射到第一个二次发射极（打拿极）上时，每个光电子将引起5～20个二次电子发射，这些电子又被加速到下一个电极上去，如此多次重复，最后电子被集中到阳极上去。所产生的电流被放大到可检测的水平。PMT的光电子产生率与施加于光阴极的高压值有关，一般PMT常用-500～-1000V的电压，有些型号的PMT则用-1000～-2000V。电压越高，每个二次电极发射的电子越多，因而PMT本身的放大作用就越大。PMT的灵敏度受暗电流的限制，而暗电流主要由阴极和二次发射极的热电子发射和电极间的漏电流所形成。电极间电压低时，暗电流主要来自漏电流；电极电压高时，则主要来自热电子发射。

4、读出装置

以前，荧光仪器的读出装置有数字电压表、记录仪（x～y型或x～t型）和阴极示波器等几种。数字电压表用于例行定量分析，既准确、方便又便宜。记录仪多用于扫描激发光谱和发射光谱，它可分为x～y记录仪和x～t记录仪两种。x～y记录仪的x轴表示荧光强度，它由光电检测器的输出来驱动其记录笔于相应的荧光强度位置，y轴表示波长，它与单色器扫描速度同步。x～y记录仪可来回反复扫描，其价格约为x～t记录仪的一倍。x～t记录仪的x轴显示荧光强度，t 轴表示与时间有关的波长，它只能进行单向扫描。记录仪记录笔的响应时间一般为0.1～0.5s。阴极示波器显示的速度比记录仪快得多，可是质量好的阴极示波器其价格比记录仪高得多。目前，计算机软硬件技术的发展使得人们可以根据不同的需要选择不同的直观的视频读出方式。

17.3实验技术

17.3.1实验方法的选择

在荧光分析中，可以采用不同的实验方法以进行分析物质浓度的测量。其中最简单的是直接测定的方法。只要分析物质本身法荧光，便可以通过测量其荧光强度以测定其浓度。许多有机芳族化合物和生物物质有内在的荧光性质，通常可以直接进行荧光测定。若有其他干扰物质存在时，则应预先采用掩蔽或分离的办法加以消除。

对于有些物质，它们或者本身不发荧光，或者因荧光量子产率很低而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。间接测定的办法有多种，可按分析物质的具体情况加以适当的选择。第一种方法是荧光衍生化的办法，即通过某种手段使本身不发光的待分析物质转变为另一种发荧光的化合物，再通过测定该化合物的荧光强度，可间接测定待分析物质。例如许多无机金属离子的荧光测定方法，就是通过使它们与某些金属螯合剂反应生成具有荧光的螯合物之后加以测定的[7-8]。某些不发光的有机化合物，可以通过降解反应、氧化还原反应、偶联反应、缩合反应、酶催化反应或光化学反应等办法，使它们转化为荧光物质。例如维生素B1本身不发荧光，但可在碱性溶液中用铁青化钾等一些氧化剂将它氧化为发荧光的硫胺荧[9]。

如果分析物质本身不发荧光，但却具有能使某种荧光化合物荧光猝灭的能力，由于荧光猝灭的程度与分析物质的浓度有着定量的关系，那么，通过测量荧光化合物荧光强度的下降程度，便可间接地测定该分析物质。例如大多数过渡金属离子与具有荧光性质的芳族配位体配合后，往往使配位体的荧光猝灭，从而可间接测定这些金属离子[10-11]。

倘若待分析物质不发荧光，但可以通过选择合适的荧光试剂作为能量受体，在待分析物质受激发后，通过能量转移的办法，经由单重态-单重态（或三重态-单重态）的能量转移过程，将激发能传递给能量受体，使能量受体分子被激发，再通过测定能量受体所发射的发光强度，也可以对分析物进行间接测定。例如在滤纸上用萘作敏化剂以测定低浓度的蒽时，可使蒽的检测限提高达3个数量级。以此类推，低浓度的菲也可由萘敏化而产生较强的荧光[12]。

在荧光分析中，由于每种荧光化合物具有本身的荧光激发光谱和发射光谱，因而在测定时相应的有激发波长和发射波长两种参数可供选择，这在混合物的测定方面比分光光度法具有更有利的条件，有时可简单地通过选择合适的激发波长或发射波长，达到选择性测定混合物中某种组分的目的。

在选择激光波长和发射波长之后仍无法达到混合物中各组分的分别测定时，还可仿照分光光度法中联合测定并解联立方程式的办法；对于混合物的荧光联合测定，也有不采用联立方程式而采用校正图的办法；对于发射光谱相互重叠的双组份或三组分荧光混合物的同时测定，在合适的条件下可应用类似于双波长分光度的原理，采用多波长荧光法进行测定。上述这些办法提出时在当时的仪器条件下是有效的、可以解决问题的，对拓宽荧光分析的应用范围是发挥一定作用的，但毕竟方法比较繁琐、费时。在目前的情况下，由于荧光分析在法学和仪器方面都有了很大的发展，就不必采用上述几种方法，而可以采用更为先进的方法，诸如本书后面将要介绍的同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分

辨荧光测定等方法，以及化学计量学的方法，来达到分别测定或同时测定的目的。 与常规荧光分析法相比，同步荧光分析法具有简化谱图、提高选择性、减少光散射干扰等特点，尤其适合多组分混合物的分析。同步荧光扫描技术由Lloyd [13]首先提出，它与常用的荧光测定方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号与对应的激发波长（或发射波长）构成光谱图，称为同步荧光光谱[14]。

根据激发和发射两种波长在同时扫描过程中彼此间所保持的关系，同步荧光分析法可分为如下四种类型：第一种类型在同时扫描过程中使激发波长（em ex λλ-=常数），这种方法称为恒（固定）波长同步荧光分析法（constant-wavelength synchronous fluorescence spectrometry, CWSFS ）,即习惯上所说的同步荧光法，是最早提出的一种同步扫描技术[13-17]；第二种类型则以能量关系代替波长关系，在两个单色器同时扫描过程中使激发波长与发射波长之间保持固定的能量差，这种方法称为恒能量同步荧光分析法(constant-energy synchronous fluorescence spectrometry,CESFS) [18-20]；第三种类型称为可变角（或可变波长）同步荧光法（variable-angle synchronous fluorescence spectrometry,MISFS ），其扫描路径表现为基体（将干扰物视为基体）的等荧光强度线。

同步荧光扫描测定具有如下优点：1简化光谱；2窄化谱带；3减小光谱的重叠现象；4减小散射光的影响。

三维荧光光谱是近几十年中发展起来的一种新的荧光分析技术。这种技术区别于普通的荧光分析的主要特点在于它能获得激发波长与发射波长同时变化时的荧光强度信息。普通荧光分析所测得的光谱是二维谱图，包括固定激发波长而扫描发射（即荧光测定）波长所获得的发射光谱，和固定发射波长而扫描激发波长所获得的激发光谱。但是，实际上荧光强度应是激发和发射这两个波长变量的函数。描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱，即为三维荧光光谱[21-27]。

另外，荧光分析法还有时间分辨和相分辨荧光分析法、荧光偏振测定、低温荧光分析法、固体表面荧光分析法、动力学荧光分析法空间分辨荧光分析技术、单分子荧光检测、荧光免疫分析法和导数荧光分析法。

固体表面荧光测有两种方法：一种是直接测定固体物质表面的荧光；另一种是将待测组分吸附在固体物质表面，然后进行荧光测定。才用的固体物质品种众多，有硅胶、氧化铝、滤纸、硅酮橡胶、乙酸钠、溴化钾、蔗糖、纤维素等。固体表面荧光测定有两种不同形式，一为反射式，一为透射式。采用反射式时，激发光源和荧光检测器同在样品的一边，一般互成45°角。紫外激发光聚集于固体表面样品斑点上，样品发生的荧光经单色器散射后由检测器检测。采用透射式时，一般将样品吸附在透明的薄层色谱板上，激发光源和检测器分处在样品的两边。紫外激发光经滤光片除去可见光，聚集在样品斑点上而发可见光荧光，荧光透过薄层板再经单色器散射后由检测器检测。在固体表面荧光测定中，待测物质吸附在固体物质的小颗粒上。入射光进入固体物质而在颗粒的边界上发生多重反射，成为漫反射发生的荧光也在颗粒之间发生反射，形成了激发光和荧光两者的散射。在这样复杂的情况下，固体表面发生的荧光强度除与照射面积和荧光物质的数量有关外，还受众多因素的影响，如散射光强度、吸附层厚度、固体颗粒的大小、固体表面对激发光的吸收、测定的方式、观测发光信号的角度等。

17.3.2 实验条件的选择极选择依据

样品的荧光强度和光谱分布可能与样品的吸光度和几何排列有关。样品池的最常见排列法为入射光与样品池成直角，样品中心发光。其他的几何排列法有前表面型和偏离中心型，这些方法通常用于大吸光度和大浊度的样品。前表面型常被排列为入射光与样品成45°角。这种排列法的缺点是：反射入发射单色器的杂散光量大，干扰测量。有人建议采用入射光与样品成30°角的前表面法，理由是：①可减少进入发射单色器的反射光；②样品的光照面积大，可减少样品位置的敏感性。其缺点是因照射面积大可能降低测量的灵敏度。许金钩等认为，当样品的浓度和厚度不太大时，采用后表面发光型会更好些。这种方法几乎可以完全排除发射光进入发射单色器的可能性。如果样品的吸光度较大，则样品的发射光谱和荧光强度都可能失真；高浓度荧光体的前表面发光测量亦有失真现象。但是，前表面型的发光强度与浓度无关，在这种情况下，所有入射光被液池的近表面吸收。前表面发光法亦被用来研究悬浮物和血红蛋白的吸光度，其强度正比于样品中荧光体的吸光度。

17.3.3 实验影响因素及其排除办法

在测量溶液的荧光强度时，通常应注意溶剂的散射光（瑞利散射和拉曼散射）、胶粒的散射光（丁铎尔效应）以及容器表面的散射光的影响问题。上述几种散射光除拉曼散射外均具有与激发光相同的波长。拉曼散射光的波长与激发波长不同，通常要比激发波长稍长一些，且随激发波长的改变而改变，但与激发波长维持一定的频率差。散射光的干扰常是提高荧光灵敏度的主要限制因素，因而实际工作中要注意加以克服。选择适当的激发波长和测定波长，可以大大降低或排除散射光的影响。在测量微弱的荧光强度时，常要加大狭缝宽度以获得足够的荧光强度测量值，但狭缝加大后散射光的影响也将加大，因而实际测定时应选择合适的狭缝宽度。通过空白测定，亦可对散射光的影响进行校正。

下面分别介绍各种环境因素对荧光光谱和荧光强度的影响及其相应的解决办法。

虽然物质产生荧光的能力主要取决于其分子结构，然而环境因素尤其是介质对分子荧光可能产生强烈的影响。了解和利用环境因素的影响，有助于寻求提高荧光分析法的灵敏度和选择性的途径。

⑴溶剂性质的影响[28-31]

同一荧光体在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和强度可能发生显著地变化。由于溶液中溶质与溶剂分子之间存在着静电相互作用，而溶质分子的基态与激发态又具有不同的电子分布，从而具有不同的偶极矩和极化率，导致基态和激发态两者与溶剂分子之间的相互作用程度不同，这对荧光的光谱位置和强度有很大影响。很多荧光体，尤其是那些在芳环上含有极性取代基的荧光体，它们的荧光光谱易受溶剂的影响。溶剂的影响可分为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效应，前者指的是溶剂的折射率和介电常数的影响，后者指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，如形成氢键和配合作用。一般的溶剂效应是普遍存在的，而特殊的溶剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构。特殊的溶剂效应所引起的荧光光谱的

移动值往往大于一般的溶剂效应所引起的。除了一般的和特殊的溶剂效应外，某些荧光体由于自身所具有的化学结构，可能因为溶剂极性的改变而形成分子内电荷转移态和扭转的分子内电荷转移态。因此，在做荧光测试时我们应选择合适的溶剂。

⑵介质酸碱性的影响[29-32]

如果荧光物质是一种有机酸或弱碱，该弱酸和弱碱的分子及其相应的离子，可视为两种不同的型体，各具有不同的荧光特性（如不同的荧光光谱、荧光量子产率或荧光寿命），溶液的酸碱性变化将使荧光物质的两种不同型体的比例发生变化，从而对荧光光谱的形状和强度产生很大的影响。可通过调节溶液的PH值以产生某种所要求的型体，该型体的荧光光谱移动后可与干扰组分的荧光光谱分离开来，达到提高选择性的目的。

⑶温度的影响

温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常，随着温度的降低，溶液的荧光量子产率和荧光强度将增大。在进行荧光测定时，由于荧光计光源的温度相当高，容易引起测定溶液的温度上升，加上分析过程中室温可能发生变化，从而导致荧光强度的变化，因而样品室四周的温度在测定过程中应尽可能保持恒定。

⑷重原子效应

有一类溶剂效应，可能影响到溶质的荧光强度和磷光强度，但对跃迁的频率没有可觉察的影响。这一类溶剂效应，既不是由于溶剂的极性，也不是由于溶剂的氢键性质所引起的，而是由于溶剂分子中含有高原子序的原子所造成的。这种效应就是通常所说的“外重原子效应”。芳族化合物分子中的重原子取代基团，同样会引起荧光强度减弱、磷光强度增强的现象，这类重原子效应通常称为“内重原子效应”。

⑸有序介质的影响

表面活性剂或环糊精溶液这样的有序介质，对发光分子的发光特性有着显著的影响，在发光分析中得到了广泛的应用。表面活性剂一般是非光活性物质，毒性小，价格便宜，使用方便，其胶束溶液光学上透明、稳定，对发光物质具有增溶、增敏和增稳得作用，实践证明是提高发光分析法灵敏度和选择性的有效途径之一。环糊精类化合物的特点是分子结构中存在一个亲水的外缘和一个疏水的空腔，其疏水的空腔能与许多有机物结合形成主客体包和物，这一结构特点是它们获得广泛应用的基础。某些荧光物质分子，它们对于环糊精的疏水空腔有更大的亲和力，如果分子的尺寸大小合适，便能够与环糊精分子结合形成包和物而进入环糊精的腔体。这样的包和物是稳定的，而且能够增强荧光强度。

⑹其他溶质的影响

有机分子的荧光，不仅受到溶剂效应的影响，也会因为与其他溶质的相互作用而受到影响。例如芳族配位体与金属离子发生配位作用之后对配位体的荧光光谱和强度的影响，另外，荧光体还可能与其他溶质发生化学反应、能量转移、电荷转移或碰撞作用等过程而导致荧光体的荧光猝灭现象。

17.3.4 对被测样品的一般要求

很多化合物由于本身具有大的共轭体系和刚性的平面结构，因而具有能发射荧光的内在本质，即为荧光化合物。由于其体系自身含有这种荧光团而具有内源荧光，人们就可以利用其内源荧光，通过检测某种荧光特性参数的变化，对该体系的某些性质加以研究。而如果所要研究的体系本身不含有荧光团而不具有内源荧光，或者其内源性质很弱，这时候就必须在体系中外加一种荧光化合物即所谓荧光探针，再通过测量荧光探针的荧光特性的变化来对该体系加以研究。

17.3.5 样品制备方法的一般要求

⑴固体样品：将样品充分干燥并研磨成粉末，用称量纸移至样品槽内，用钥匙压平，使槽内充满粉末即可。

⑵溶液：首先配好对应比例的溶液，然后将溶液小心转移到比色皿内，将比色皿放在支架上，然后一起放入样品槽内，即可准备测试。

17.4 实验结果解析

荧光光谱分析法除了可以用作组分的定性检测和定量测定的手段之外，还被广泛地作为一种表征技术应用于表征所研究体系的物理、化学性质及其变化情况。例如，在生命科学领域的研究中，人们经常可以利用荧光检测的手段，通过检测某种荧光特性参数（如荧光的波长、强度、偏振和寿命）的变化情况来表征生物大分子在性质和构象上的变化。

17.5 应用

直接测定法应用于测定许多有机芳族化合物和生物物质具有内在的荧光性质。间接测定法用于测定本身不发荧光或者因荧光量子产率很低而无法进行直接测定的物质的荧光性质。同步荧光分析法是提高分析选择性，解决多组分荧光物质同时测定的良好手段之一[17,33]。最早发展起来的恒波长同步荧光法在一般的荧光光谱仪上均可方便实现，已在环境、医药、卫生和生物等领域获得广泛的应用，而新近发展的各种新型同步荧光方法正显示出独特的作用，越来越受到人们的重视。由于三维荧光光谱反映了发光强度同时随激发波长和发射波长变化的情况，因而能提供比常规荧光光谱更完整的光谱信息，可作为一种很有价值的光谱指纹技术。这种技术，在环境监测和法庭判证方面，常用于不同油种和来源地鉴别。[34-38]在临床化学方面，已用于某些癌细胞的荧光代谢物的检测，以区分癌细胞和非癌细胞[39]，用人类血浆的三维荧光光谱作为临床化学中一种新的图形识别法以协助临床诊断[40]，以及用于某些细菌的鉴别[41-44]。由于电视荧光计能在极短时间内取得测量体系的三维荧光光谱，方法灵敏快速，且可以同时监测体系中各种物质的反应情况，也可用于提供鉴定未知物的信息，因而对化学反应的多组分动力学研究具有独特的优点，已用于蒽在多氯代链烷烃中的光诱导反应的研究[45]。另外三维荧光光谱法也用于多组分混合物的定性和定量分析。时间分辨荧光分析法

主要应用于金属配合物荧光受命的测定[46-48]、荧光体混合物中两组分的同时测定[46-49]、痕量分析中干扰物与背景荧光的消除、多环芳烃的检测、芳基的检测[50-51]和溶剂松弛的时间分辨测量[52-54]。相分辨荧光分析法主要应用于荧光体两组分混合物中个别组分的荧光光谱的直接记录和荧光寿命的测定[55]、相分辨荧光法分辨9-MA、9，10-DPA和POPOP三组分混合物[56]、基态反应的研究、基态反应可逆性的检测[55]、溶剂松弛的分辨[57]和配位体与大分子的结合反应的分析[58]。荧光体的荧光偏振与荧光各向异性值的测定，能够提供与荧光体在激发态寿命期间的旋转运动动力学相关的信息，为诸如蛋白质-蛋白质作用，蛋白质-DNA健合，抗原-抗体免疫反应，以及细胞膜的流变性等的研究提供理论基础和实验技术。低温荧光分析法主要应用于多环芳烃及衍生物的鉴别和定量分析、炼焦厂分馏水中苯并[a]芘和苯并[a]蒽的测定[59-60]和脱氧核糖核酸（DNA）加和物的分析。

固体表面分析具有简单、快速、取样量小、灵敏度高、费用少等优点，已应用于环境研究、法庭检测、食品分析、农药分析、生物化学、医学、临床化学等方面的工作。近年来电子计算机、激光光源、电视式多道检测器的采用使固体表面荧光分析有更为广阔的用途。

有关动力学荧光分析的应用，已出版的书籍和综述性文章[61-64]都陆续有所介绍。

荧光显微技术已成为生物学、医学诊断[65]、半导体、微电子器件、高分子材料的生产检测[66]和超高灵敏分析[67-68]等的重要工具。

利用共焦荧光法已经观察到空气—水界面上荧光分子随时间波动的荧光光谱图。

共焦显微荧光在生物学研究中的应用主要有三方面：1用共焦方式观察生物样品。2对生物样品进行光学连续“切片”，并实现显微结构的三维重建。3对生物样品进行定量分析。

共焦荧光显微镜能帮助医生确定组织的层状结构和诊断反常皮肤生长，分辨样品的分层结构、各层厚度和各层荧光相关浓度等，这些都是常规方法难以做到的。共焦荧光显微技术和时间分辨荧光法结合，可用于测绘空间分辨荧光光衰变曲线和开展荧光动力学研究；与相关谱技术结合，可测量磷脂系统的扩散速度和表面密度[69]，探测表面结合荧光物种的微秒级动力学[70]等。此外，共焦荧光显微镜已应用于从单分子水平上观察和分析DNA—蛋白质复合物[71]。

全内反射荧光法已成为荧光光谱学在生物化学应用中的重要工具[72-74]。

单分子检测在化学分析、DNA测序、纳米材料分析、医学诊断、医学分析、单DNA操纵、活细胞分析、分子动力学机理等方面都具有独特的应用价值，对许多科学领域的发展产生了和正在产生着深远的影响。单分子水平上的生物分子研究，揭示了生物大分子的结构和功能，单分子荧光检测尤其在生命科学中具有广阔的应用前景，为生命科学提供了新的研究手段。

在生化、临床医学以及环境分析中，对分析的灵敏度和准确性要求越来越高，甚至要求单分子检测。荧光免疫分析法作为一种广泛采用的生物医学分析技术，同样在不断追求超高灵敏度和操作的自动化，其发展趋势主要表现在以下几方面：（1）高特异性、高亲和性抗原和抗体的制备，这是一切免疫分析特异性和灵敏性的基础。

（2）荧光标记物进一步更新和相应的荧光检测技术提高，如能避开背景荧光的长寿荧光（磷光）标记物，避免生物本底荧光的近红外荧光标记物、上转换荧光标记物等。另外，具有信号放大能力的纳米标记物也是一个重要发展方向。

（3）与高效分离技术相结合，实现荧光免疫分析的快速、自动化和多组分同时测定。

（4）实际应用中的在线和现场荧光免疫分析。

（5）免疫芯片的实用化以现实微量多组分的免疫分析。

导数荧光技术用于蛋白质分析和叶绿素a、b和脱镁叶绿素a、b的定量测定

17.6 实验

聚苯胺的荧光光谱测试

一、实验目的

1、了解FluoroLog-3荧光光谱分析方法的物理和化学的原理，

2、了解仪器的结构、操作方法、测试原理和定性定量分析方法，

3、通过对聚苯胺的荧光光谱测试实验，了解聚合物的荧光光谱的红移现象。

二、实验仪器、设备名称及其主要性能参数

本中心配置的荧光光谱仪是法国Horiba Jobin Yvon生产的FluoroLog-3荧光光谱仪。

该仪器具有以下特点：

●计算机控制，界面显示、仪器能自动记录荧光光谱；

●高分辨率、低杂散光单色系统；

●高灵敏度、低噪声单光子计数器做接收系统；

●采用氙灯作为光源；

●配有稳定性好、精度高的外光路系统；

●配有多种附件，适用于液体、固体样品的分析。

主要参数及性能指标：

●波长范围 200nm-850nm

●波长精度≤±0.4nm

●波长重复性≤0.2nm

●狭缝宽度0-2mm连续可调，示值精度0.01mm、最大高度20mm

●接收单元为单光子计数器技术指标

●灵敏度:稳态测量信噪比S/N≥5000:1（条件：R928P PMT，5nm带宽，1s

响应时间，350nm激发，397nm水拉曼峰，450nm强度，S/N=（I

397-I

450

）/

（I

450

）1/2）,这是JY的计算方法，在分母中考虑了全部的噪声。

三、实验辅助设备、仪器、装置

四、实验原理（实验原理、设备结构及其功能）

光源：450W氙灯

激发单色仪

样品室：T-box

发射单色仪

检测仪：R928P PMT （photomultiplier-tube,光电倍增管）

五、实验操作方法（演示性实验）

㈠开机步骤：

1、开启电源（Power）开关，风扇开动；

2、开启Xe灯电源（Main Lam）开关；

3、开启控制器开关，软盘启动，等待至听到一声鸣响（约30秒）；

4、开启操作电脑开关，运行FluorEssence操作软件，点击M系统初始化，进入

操作界面。

㈡系统转换和操作

1、由稳态转换到TCSPC状态：

●关闭SPECTRACQ电源。

●将PMT信号输出连接到TB-02前置放大器的输入端。

●拆下稳态样品箱，换上TCSPC样品箱。

●装NanoLED。

●开IBH Hub 和TB-02前置放大器的电源。

●开SPECTRACQ电源，等待软盘启动完成。

●运行DataStation软件，系统初始化，选择TCSPC Lifetime。

●做未知样品的时间衰减曲线。

●做荧光散射体（Ludox）的时间衰减曲线。

●保存数据文件。

●运行DAS6软件，做曲线拟合，得到荧光寿命。

2、由TCSPC状态转换到稳态：

●关闭SPECTRACQ电源。关闭IBH Hub 电源和TB-02前置放大器的电源。

●将PMT信号输出连接到DM302的输入端。

●取下NanoLED。

●拆下TCSPC样品箱，换上稳态样品箱。

●开Xe灯风扇，电源。

●开SPECTRACQ电源。

●运行FluorEssence软件。

六、实验数据处理或谱图解析方法

以苯胺和聚苯胺为例，演示两种样品的操作过程，最后得到两个样品的激发光谱和发射光谱，并比较最大发射波长的移动情况。

七、注意事项

1、FL3-TCSPC为精密光谱仪，不得随意打开机盖，触摸反光镜和光栅表面。

2、开Xe灯前，必须确定计算机、显示器、打印机、控制器等设备的电源在关闭位置。关Xe灯前，必须先关闭所有设备的电源。否则，开、关Xe灯时产生的尖峰电脉冲会损坏上述设备。

3、关Xe灯电源（Main Lamp）后，不能立即关闭Xe灯的冷却风扇，15分钟后关Xe灯主电源（Power）。

4、Xe灯上的4个冷却出入风口必须保持干净，通风良好。每季度的第一个工作日用除尘器将4个通风口上的杂物清理干净。

5、仪器的工作状态可以通过测试Xe灯得激发光谱和纯净水的拉曼光谱检查。

6、稳态测试时，信号强度不能大于10E+06，如果信号过强：①可以将激发和发射单色仪的狭缝关小；②降低PMT探测器的高压。

7、系统状态转换，由稳态转换到TCSPC状态或由TCSPC状态转换到稳态时，必须关闭系统电源。

八、思考及讨论

紫外电子吸收光谱、拉曼光谱和荧光光谱的关系。

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荧光分析法检测原理及应用举例

1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。

1 原子荧光光谱法的基本原理

1 原子荧光光谱法的基本原理 1.1 原子荧光光谱法原理 原子荧光光谱法（AFS)是原子光谱法中的一个重要分支，是介于原子发射(AES）和原子吸收（AAＳ)之间的光谱分析技术，它的基本原理就是：固态、液态样品在消化液中经过高温加热，发生氧化还原、分解等反应后样品转化为清亮液态,将含分析元素的酸性溶液在预还原剂的作用下，转化成特定价态，还原剂 KBH 4 反应产生氢化物和氢气，在载气（氩气)的推动下氢化物和氢气被引入原子化器(石英炉）中并原子化。特定的基态原子(一般为蒸气状态)吸收合适的特定频率的辐射,其中部分受激发态原子在去激发过程中以光辐射的形式发射出特征波长的荧光,检测器测定原子发出的荧光而实现对元素测定的痕量分析方法。1.2 原子荧光的类型 原子荧光是一种辐射的去活化(ｄｅcactｉｖatioｎ)过程。当有原子吸收由一合适的激发光源发射出的特征波长辐射后被激发，接着辐射区活化而发射出荧光。基本上，荧光线的波长和激发线的波长相同,也有可能比激发线的波长长，但比激发线波长短的情况也有，但不多。原子荧光有5中基本类型:①共振荧光。即激发波长与产生的荧光波长相同时，这种荧光称为共振荧光,是原子荧光分析中最常用的一种荧光;②直跃线荧光。即激发波长大于产生的荧光波长相同时，这种荧光称为直跃线荧光；③阶跃线荧光。即激发波长小于产生的荧光波长相同 时,这种荧光称为阶跃线荧光;④热助阶跃线荧光.既原子吸收能量由基态E 激发 至E 2能级时,由于受到热能的进一步激发,电子可能跃迁至于E 2 相近的较高能级 E 3，当其由E 3 跃迁到较低能级E 1 时所发射的荧光，称为热助阶跃线荧光;⑤热助 反Stokes荧光。即电子从基态E 0邻近的Ｅ ２ 能级激发至E ３ 能级时，其荧光辐射 过程可能是由Ｅ ３回到Ｅ 所发出的荧光成为热助反Sｔokes荧光。 1．3 汞的检测方法 汞及其化合物属于剧毒物质,是国际国内进出口商品中一项重要理化指标。汞在体内达到一定量时，将对人的神经系统、肾、肝脏产生严重的损害。汞测定方法有冷原子吸收光谱法、二硫腙比色法、原子荧光光谱分析法、电热原子吸收

三维荧光光谱分析法

三维荧光光谱分析法 荧光强度与激发波长Kex、发射波长Kem、衰变时间( t)、荧光寿命(S)、吸光系数(E)、偏振度(P ) 及待测组分浓度(c) 等因素有关。若主要研究荧光强度与Kex 和Kem 的关系, 就构成了Kex2K em2F 三维荧光光谱(EEM ) , EEM 光谱技术简化了复杂组分繁琐的分离过程, 提高了荧光分析的灵敏度、选择性和实用性, 还可进行指纹分析和技术鉴定。许金钩小组应用EEM 技术和方法,获得了生物大分子、有机小分子荧光探针、以及荧光探针分子与生物大分子相互作用的大量信息, 并运用Mon te2Carlo 数学模型对EEM 进行总体积分,建立了EEM 总体积分方法, 用于样品中有机物质和药物分子的定量分析, 获得满意的结果。除了使用EEM 技术和方法外, 还可以根据实际需要, 选择荧光衰变时间( t)、偏振度(P )、荧光寿命(S) 等参数,构成Kex2K em2x (待定参数) 三维荧光光谱, 从不同的角度出发来提高荧光分析的灵敏度、选择性。这种分析技术不仅被用来进行物质的定性和定量分析,而且被用于测定生物大分子的形状、大小、构象, 以及固态物质、生物大分子与有机分子和金属离子相互作用等的研究, 在临床医学、环境检测、法医鉴定、生命科学以及有序介质中生物大分子荧光探针光谱特性的研究等方面, 发挥着极为重要的作用。但由于多维荧光光谱技术中需要处理大量的实验数据,因此在研制仪器的同时, 还要开发许多有实用价值的数学处理方法和多维光谱软件120 世纪70 年代发展起来的同步导数荧光技术在混合物的连续测定中发挥着重要作用, 这一方法的特点是同时扫描激发波长和发射波长, 并对得出的图谱进行微分处理, 使容易重叠的波峰彼此完全分开, 便于得出可靠的测量结果。有人对人血尿中temopo rt in2po lyethylene glyno l 共轭物分别用HPLC、C I 和荧光光谱分析法进行测定, 发现荧光光谱分析法是其中最简便、迅速、灵敏的分析方法, 新一代荧光指示剂如酪氨

荧光光谱分析

第十七章荧光光谱分析 当紫外线照射到某些物质的时候,这些物质会发射出各种颜色与不同强度的可见光,而当紫外线停止照射时,所发射的光线也随之很快地消失,这种光线被称为荧光。 西班牙的内科医生与植物学家N、Monardes于1575年第一次记录了荧光现象。17世纪,Boyle与Newton等著名科学家再次观察到荧光现象。17世纪与18世纪,又陆续发现了其它一些发荧光的材料与溶液,但就是在荧光现象的解释方面却没有什么进展。1852年,Stokes在考察奎宁与叶绿素的荧光时,用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长,才判明这种现象就是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光,而不就是由光的漫射所引起的,从而导入了荧光就是光发射的概念。同时,她由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年,Coppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作,应用铝-桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1880年,Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则。到19世纪末,人们已经知道了600种以上的荧光化合物。20世纪以来,荧光现象被研究得更多了。例如,1905年Wood发现了共振荧光;1914年Frank与Hertz利用电子冲击发光进行定量研究;1922年Frank与Cario发现了增感应光;1924年Wawillow进行了荧光产率的绝对测定;1926年Gaviola进行了荧光寿命的直接测定等。 荧光分析方法的发展离不开仪器应用的发展。19世纪以前,荧光的观察就是靠肉眼进行的,直到1928年,才由Jette与West研制出第一台光电荧光计。早期的光电荧光计的灵敏度就是有限的,1939年Zworykin与Rajchman发明光电倍增管以后,在增加灵敏度与容许使用分辨率更高的单色器等方面,就是一个非常重要的阶段。1943年Dutton与Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤,1948年由Studer 推出了第一台自动光谱校正装置,到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。 荧光光谱分析法除了可以用作组分的定性检测与定量测定的手段之外,还被广泛地作为一种表征技术应用于表征所研究体系的物理、化学性质及其变化情况。例如,在生命科学领域的研究中,人们经常可以利用荧光检测的手段,通过检测某种荧光特定参数(如荧光的波长、强度、偏振与寿命)的变化情况来表征生物大分子在性质与构象上的变化。 很多化合物由于本身具有大的共轭体系与刚性的平面结构,因而具有能发射荧光的内在本质,我们称这些化合物为荧光化合物。在某些所要研究的体系中,由于体系自身含有这种荧光团而具有内源荧光,人们就可以利用其内源荧光,通过检测某种荧光特性参数的变化,对该体系的某些性质加以研究。但就是,如果所要研究的体系本身不含有荧光团而不具有内源荧光,或者其内源性质很弱,这时候就必须在体系中外加一种荧光化合物即所谓荧光探针,再通过测量荧光探针的荧光特性的变化来对该体系加以研究。例如,如果我们要检测体系的极性,便可以将对极性敏感的荧光探针加入到体系中,然后通过对荧光探针的荧光特性的检测,求得体系的极性,或通过探针的荧光特性的变化来表征体系的极性的变化情况。 荧光分析法之所以发展如此迅速,应用日益广泛,其原因之一就是荧光分析法具有很高的灵敏度。在微量分析的各种方法中,应用较为广泛的有比色法与分光光度法。但在方法的灵敏度方面,荧光分析法的灵敏度一般要比这两种方法高2～3各数量级。随着现代电子技术的迅速发展,对于微弱光信号检测的灵敏度已大大提高,荧光分析的灵敏度常可达亿分之几,在与毛细管电泳分离技术结合、采用激

X荧光光谱分析仪工作原理

X荧光光谱分析仪工作原理 用X射线照射试样时，试样可以被激发出各种波长的荧光X射线，需要把混合的X射线按波长（或能量）分开，分别测量不同波长（或能量）的X射线的强度，以进行定性和定量分析，为此使用的仪器叫X射线荧光光谱仪。由于X光具有一定波长，同时又有一定能量，因此，X射线荧光光谱仪有两种基本类型：波长色散型和能量色散型。下图是这两类仪器的原理图。 用X射线照射试样时，试样可以被激发出各种波长的荧光X射线，需要把混合的X射线按波长（或能量）分开，分别测量不同波长（或能量）的X射线的强度，以进行定性和定量分析，为此使用的仪器叫X射线荧光光谱仪。由于X光具有一定波长，同时又有一定能量，因此，X射线荧光光谱仪有两种基本类型：波长色散型和能量色散型。下图是这两类仪器的原理图。 现将两种类型X射线光谱仪的主要部件及工作原理叙述如下： 1.X射线管

两种类型的X射线荧光光谱仪都需要用X射线管作为激发光源。上图是X射线管的结构示意图。灯丝和靶极密封在抽成真空的金属罩内，灯丝和靶极之间加高压（一般为40KV）,灯丝发射的电子经高压电场加速撞击在靶极上，产生X射线。X射线管产生的一次X射线，作为激发X射线荧光的辐射源。只有当一次X射线的波长稍短于受激元素吸收限lmin时，才能有效的激发出X射线荧光。笥?SPAN lang=EN-US>lmin的一次X射线其能量不足以使受激元素激发。 X射线管的靶材和管工作电压决定了能有效激发受激元素的那部分一次X射线的强度。管工作电压升高，短波长一次X射线比例增加，故产生的荧光X射线的强度也增强。但并不是说管工作电压越高越好，因为入射X射线的荧光激发效率与其波长有关，越靠近被测元素吸收限波长，激发效率越高。 X射线管产生的X射线透过铍窗入射到样品上，激发出样品元素的特征X射线，正常工作时，X射线管所消耗功率的0.2%左右转变为X射线辐射，其余均变为热能使X射线管升温，因此必须不断的通冷却水冷却靶电极。 2.分光系统

X射线荧光光谱分析基本原理

X射线荧光光谱分析 X射线是一种电磁辐射，其波长介于紫外线和γ射线之间。它的波长没有一个严格的界限，一般来说是指波长为0.001-50nm的电磁辐射。对分析化学家来说，最感兴趣的波段是0.01-24nm，0.01nm左右是超铀元素的K系谱线，24nm则是最轻元素Li的K系谱线。1923年赫维西(Hevesy, G. Von)提出了应用X射线荧光光谱进行定量分析，但由于受到当时探测技术水平的限制，该法并未得到实际应用，直到20世纪40年代后期，随着X射线管、分光技术和半导体探测器技术的改进，X荧光分析才开始进入蓬勃发展的时期，成为一种极为重要的分析手段。 1.1 X射线荧光光谱分析的基本原理 当能量高于原子内层电子结合能的高能X射线与原子发生碰撞时，驱逐一个内层电子而出现一个空穴，使整个原子体系处于不稳定的激发态，激发态原子寿命约为10-12-10-14s，然后自发地由能量高的状态跃迁到能量低的状态。这个过程称为驰豫过程。驰豫过程既可以是非辐射跃迁，也可以是辐射跃迁。当较外层的电子跃迁到空穴时，所释放的能量随即在原子内部被吸收而逐出较外层的另一个次级光电子，此称为俄歇效应，亦称次级光电效应或无辐射效应，所逐出的次级光电子称为俄歇电子。它的能量是特征的，与入射辐射的能量无关。当较外层的电子跃入内层空穴所释放的能量不在原子内被吸收，而是以辐射形式放出，便产生X射线荧光，其能量等于两能级之间的能量差。因此，X射线荧光的能量或波长是特征性的，与元素有一一对应的关系。图1-1给出了X射线荧光和俄歇电子产生过程示意图。

K层电子被逐出后,其空穴可以被外层中任一电子所填充，从而可产生一系列的谱线，称为K系谱线：由L层跃迁到K层辐射的X射线叫Kα射线,由M层跃迁到K层辐射的X射线叫Kβ射线……。同样,L层电子被逐出可以产生L系辐射(见图1-2)。

荧光分析技术新进展

第27卷第5期 唐山师范学院学报 2005年9月 Vol. 27 No.5 Journal of Tangshan Teachers College Sep. 2005 ────────── 收稿日期：2005-04-02 作者简介：孙继红（1969-），男，河北丰南人，唐山第九中学中教一级教师。 - 19 - 荧光分析技术新进展 孙继红1，钱丹青2 （1.唐山第九中学，河北 唐山 063000；2.唐山学院 机电系，河北 唐山 063000） 摘 要：荧光分析法因具有灵敏度高,线性范围宽等优点。综述了近年来荧光分析技术的发展情况，并对各种荧光分析新技术的特点和应用进行了归纳。 关键词：荧光分析；HPLC ；离子色谱 中图分类号：O657.3 文献标识码：B 文章编号：1009-9115（2005）05-0019-02 近年来荧光分析研究发展迅速，年文献量不断增加。主要应用领域有中西药、临床、生物大分子、食品营养和添加剂等试样。激光诱导荧光法诊断恶性肿瘤，显微荧光法研究药物与细胞的相互，DNA 编序及含量的荧光法测定均是目前受到关注的热点问题。 1 荧光分析新技术 近些年更多的研究者转向充分利用或开发仪器软件技术，以期提高发光分析的选择性和灵敏度，这方面年均论文数量增长了约两倍。刘绍璞先生等率先研究了分子二级散射光谱、共振荧光光谱、共振瑞利散射光谱的分析应用并取得了丰硕成果。郑飞跃等利用解卷积法、黄俊利用相调制技术研究了荧光寿命的测量。潘利华等[1-3]研究了激光诱导荧光寿命测量以及在稀土元素测定中的应用。其它关于金属配合物及镁、铝测定[4][5]及塑封料中铀的测定也有报道[6]。 导数光谱、多维光谱、偏振光谱、磁效应、时间分辨技术、恒能量、固定波长或可变角荧光法等，单独或几种方法的结合并借以化学计量学手段，在提高分析选择性方面具有很大的优越性，而且论文日趋增多，在医药临床、环境检测、石油勘探等领域得到广泛应用。吡哌酸的固体表面延迟荧光测定具有较好的灵敏度[7]。高灵敏检测器以及荧光成像技术对提高分析灵敏度、从有限样品中获取更丰富的化学信息显 示出大的威力。电感偶合检测器件（CCD ）[8-10]、增强型CCD （ICCD ）[11][12]结合毛细管电泳及激光诱导荧光技术，使得分析检出限显著降低。荧光成像技术[13]可望获得单细胞的化学信息。国外单细胞或单分子检测的研究非常活跃，而上述技术的联合应用对此是必不可少的。 荧光免疫及生化分析持续好的势头。赵启仁等[14]研究了铕标记抗癌胚抗原单克隆抗体C17的应用。周四元等[15]提出对氟苯酚2过氧化氢2辣根过氧化物酶体系酶联荧光免疫法，并用于人血清中乙肝表面抗原和表面抗体测定。姚凤姬等[16]用非标记铕络合物荧光免疫法测定了血清中金属硫蛋白。王敏灿等[17]合成了荧光免疫分析中增强22萘甲酰三氟 丙酮。李建中等用新合成的荧光标记试剂KLUK 标记靶细胞K562，采用时间分辨技术，测量了NK 细胞毒性，具有很好的应用前景。 2 荧光检测技术与其它仪器联用 荧光分析法因具有灵敏度高，线性范围宽等优点，愈来愈引起人们的重视，尤其是近年来激光、计算机、电子学等新技术的飞速发展，加速了荧光分光光度计与其它技术的结合而形成多种多样的新型荧光分析。 荧光分光光度计的联用技术与紫外可见分光光度计的联用技术有许多相似之处。首先它可以作为一种仪器的检测器，其次可以作为一个独立的主体与其它附件相连接，形成一种新的测试系统，最后它还可以与其它分析技术相结合构成一种新型的分析仪器。 2.1 荧光检测与HPLC 联用 液相色谱检测器种类很多，灵敏度较高、选择性较好的荧光检测器在进行微量分析中经常使用。如许多芳香族化合物如蒽、菲、芴等在特定条件下发出特征荧光，利用HPLC 的荧光检测器可以同时测定上述物质。Tanabe 等[18]设计一种供HPLC 用的多波长荧光检测系统，有4个干涉滤光片和光电倍增管通道;Gluckman 等[19]研制的荧光检测器，流通池为150μL ，可用于毛细管HPLC 和超临界色谱，其最小检测量为0.2pg 。 2.2 荧光检测与离子色谱联用 Mho 等人[20]研制一套供离子色谱用的双光束激光激发间接荧光检测器，它用具有荧光的淋洗离子维持恒定背景信号，当待测离子淋出时，信息观测信号减少。这种荧光检测器可以检测纳克级阴离子，方法灵敏度非常高。 2.3 激光光源引入荧光分光光度计 激光光源引入荧光计在我国开发较早，也是目前应用比较成熟的仪器之一，如测铀仪就是其中的代表[21]。时间分辨激光荧光分光光度计的研制成功，大大改善了荧光仪器的性能，这类仪器已广泛应用于环境监测、稀土分析、冶金、化

荧光光谱分析技术概述

荧光光谱分析技术概述....................................................................................................................... 1荧光光谱分析原理.1 ................................................................................................................................... 4荧光分析法.2 ........................................................................................................................ 4定性分析法.2.1 4 ......................................................................................................................... 2.2定量分析法 荧光光谱分析原理1光谱法是辐射能与物质组成和结构的相光学分析法 分为光谱法和非光谱法，不涉及能级跃非光谱法不包含物质内能的变化，互作用，以光谱的出来为基础，迁，而是辐射方向和物理性质的改变。 光学分析方法分类 1表分析法特征具体方法 射线荧光光谱、分子荧X光谱法原子发射光谱、原子荧光光谱、光的发射光光谱、分子磷光光谱、化学发光、电子能谱、俄歇电子能谱射线原子吸收光谱、紫外-可见分光光度法、红外光谱、X光的吸收吸收光谱、核磁共振光谱、电子自旋共振光谱、光声光谱拉曼光谱光的散射 比浊法、散射浊度法光的散射非光谱法 折射法、干涉法光的折射 X射线衍射、电子衍射光的衍射 旋光色散法、偏振法、圆二向色法光的转动 , 光波愈短荧光发光机理可按量子理论通俗解释: 光具有波动、粒子二重性, 当某些物质受到紫外线或较短波长其光子能量愈强; 反之波长愈长其能量则弱。当, , 吸收了全部或部分光能量, 使其分子的能级升高而处于亚稳定状态光照射其中一部分化为热量, , 这些分子就会立即释放多余的能量恢复到稳定的基态时因为有部分能, 向基态跃迁时是以“光”形式释放而消失。但对某些物质而言, 光波愈, 量被消耗所以重新发出的光能量总比吸收的能量要小。由于能量愈小, , 所以物质所激发的荧光总比照射它的光波要长。磷光的能量较荧光还要小长, 这就是两者的区别。寿命可达数小时之久所以它的波长比荧光要长, , 如果物质的分子吸收了紫外和可见区电磁辐射后，它的电子能跃迁至激发本身又回复到基态如果吸收辐然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，态，再发射的波射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量， 长可以同分子所吸收的波长相同，也可以不同，这一现象称为光致发光。最常见的两种光致发光现象是荧光和磷光。这两种光致发光的机理不同，荧光发光过程 -3s-10s的时间间隔。而磷光则往往能延续10因在激发光停止后10s内停止发光，此，可通过测定发光寿命的长短来区分荧光和磷光。 一些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射(即发光)称之为荧光。可产生荧光的分子

荧光光谱分析实验讲义

实验荧光光谱分析 一、实验目的与要求： 1. 了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用； 2. 掌握荧光分光光度计的工作原理； 3. 掌握激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试方法。 二、基本概念 1. 发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。 2. 激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长（或频率）变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。 3. 余辉衰减曲线 是指激发停止后发光强度随时间变化的曲线。横坐标为时间，纵坐标为发光强度（或相对发光强度）。 三、测试仪器 激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试采用日本岛津RF-5301PC型荧光分光光度计。 从150W氙灯光源发出的紫外和可见光经过激发单色器分光后，再经分束器照到样品表面，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，再经荧光端光电倍增管倍增后由探测器接收。另有一个光电倍增管位于监测端，用以倍增激发单色器分出的经分束后的激发光。 光源发出的紫外-可见光或者红外光经过激发单色器分光后，照到荧光池中的被测样品上，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，由光电倍增管转换成相应电信号，再经放大器放大反馈进入A/D转换单元，将模拟电信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。 四、样品制备 液体试样

荧光分析法基本概念

紫外可见吸收光谱一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征（即物质分子的能量具有不连续的特征）。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子：（1）形成单键的σ电子；（2）形成双键的π电子；（3）分子中非键电子即n电子。 化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是： （σ）＜（π）＜（n）＜（π*）＜（σ* ）σ,π是成键轨道，n 是非键轨道，σ* ,π* 是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法

紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长，用nm（纳米）为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、?(吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置，纵坐标为它的吸收强度。 四、紫外光谱中常用的几个术语 1.发色基团和助色基团 发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团，不论是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团（C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等）

第四章原子吸收光谱法与-原子荧光光谱法

第四章原子吸收光谱法与原子荧光光谱法 4-1 . Mg原子的核外层电子31S0→31P1跃迁时吸收共振线的波长为285.21nm,计算在2500K 时其激发态和基态原子数之比. 解: Mg原子的电子跃迁由31S0→31P1 ,则 g i／g0=3 跃迁时共振吸收波长λ=285.21nm ΔEi=h×c／λ =（6.63×10-34）×（3×108）÷（285.31×10-9） =6.97×10-19J 激发态和基态原子数之比： Ni／N0＝（g i／g0）×e-ΔEi／kT 其中: g i／g0=3 ΔEi／kT=-6.97×10-19÷〔1.38×10-23×2500〕 代入上式得： Ni／N0＝5.0×10-9 4-2 .子吸收分光光度计单色器的倒线色散率为1.6nm／mm，欲测定Si251.61nm的吸收值，为了消除多重线Si251.43nm和Si251.92nm的干扰，应采取什么措施？ 答： 因为: S1 =W1/D = (251.61-251.43)/1.6 = 0.11mm S2 =W2/D =（251.92-251.61）/1.6 =0.19mm S1＜S2 所以应采用0.11mm的狭缝. 4-3 .原子吸收光谱产生原理，并比较与原子发射光谱有何不同。 答： 原子吸收光谱的产生：处于基态原子核外层电子，如果外界所提供特定能量（E）的光辐射恰好等于核外层电子基态与某一激发态（i）之间的能量差（ΔEi）时，核外层电子将吸收特征能量的光辐射有基态跃迁到相应激发态，从而产生原子吸收光谱。 原子吸收光谱与原子发射光谱的不同在于： 原子吸收光谱是处于基态原子核外层电子吸收特定的能量，而原子发射光谱是基态原子通过电、热或光致激光等激光光源作用获得能量；原子吸收光谱是电子从基态跃迁至激发态时所吸收的谱线，而原子发射光谱是电子从基态激发到激发态，再由激发态向基态跃迁所发射的谱线。

荧光光谱分析讲义03

理解分子荧光分析的基本原理 理解激发光谱发射光谱同步光谱三维荧光光谱的含义 掌握分子荧光发射光谱的特性 了解荧光光谱仪器的组成及各部分作用 掌握影响荧光强度的内部结构因素和外部环境因素 了解光谱分析法的应用范围 第一章分子荧光光谱分析 1概述 分子荧光光谱分析也叫荧光分光光度法，是当前普遍使用并有发展前途的一种光谱分析技术。物质的分子吸收了紫外和可见光后它的电子跃迁到激发态，然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，本身回复到基态。。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长可以同分子所吸收的波长相同也可以不同，这个现象叫光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。 当用一种波长的光照射某种物质时，这个物质会在极短的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为荧光。对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即（10-9-10-6 S）停止; 当用一种波长的光照射某种物质时，这如果种物质在较长的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为磷光。对于磷光来说，当激发光停止照射后，发光过程将持续一段时间（10-1-10 S）; 磷光和荧光的发光机理是不同的。 由于物质分子结构不同，所吸收的光的波长和发射的荧光波长也有所不同，利用这个特性可以定性鉴别物质。同一种分子结构的物质用同一波长的激发光照射可以发射相同波长的荧光，若该物质的浓度不同，则浓度大时，所发射的荧光强度也强，利用这个性质可以进行定量测定。用荧光进行定性和定量的方法叫荧光分析法。 2荧光分析的原理 2.1分子荧光发生过程 2.1.1荧光与磷光

2.1.1.1 分子的电子能级与激发过程 分子除了电子不断运动外，分子本身还有振动和转动。量子力学表明，这些运动的能量是量子化的，所以分子有电子能级，分子振动能级，及分子转动能级。每个电子能级中有包含一系列的振动能级和转动能级。. . 图1 分子电子能级，振动能级和转动能级示意图 室温下大多数分子处于基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量（电能，热能，光能，化学能）后被激发为激发态。激发态不稳定将很快衰变为基态，若返回到基态伴随着光子的辐射，这种现象称为发光。现在从分子结构上讨论荧光发光产生的机理。 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级。而每个电子能级中又包含者一系列振动能级和转动能级。我们用S0 S1 Sn表示电子的基态，第一电子激发的单线态和第N电子激发的单线态。T1表示第一电子激发的三线态。 电子激发的单线态和相应的三线态的区别在于电子自旋方向不同，另外三线态的能级稍微低一些。 电子能态的的多重性用M= 2S+1表示, S为电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。大多数分子含有偶数个电子。基态时这些电子成对地填充在能量

荧光光谱分析讲义

荧光光谱分析 一、实验目的 1、了解荧光光谱的基本原理； 2、熟悉荧光光谱仪的基本原理和操作规程； 3、了解荧光光谱的基本分析方法。 二、荧光光谱原理 分子吸收辐射后,使其价电子处于不稳定的激发态，随后以光的形式辐射出能量、这称为“光致发光”。在二次发光的发射过程中，最常见的两种光致发光是分子荧光(fluorescence)和分子磷光(phosphorescence)。由测量分子荧光和磷光强度而建立起来的定量分析法称为分子荧光分析法和分子磷光分析法。在化学反应过程中，分子吸收反应释放出的化学能产生激发态物质，这种激发态物质发出的光辐射称为化学发光(chemiluminescence)。根据化学发光强度或发光总量来确定物质组分含量的分析方法称为化学发光分析法。化学发光分析、分子荧光分析和磷光分析统称为分子发光分析法。 2.1、荧光及磷光的产生原理 含有孤对电子n和π轨道的分子，吸收光能后产生π→π*和n→π*电子跃迁。在通常情况下，基态分子的电子自旋是配对的，净自旋S＝0，光谱项的多重性2S+1＝l，这种状态称为单重态。电子激发态的多重性也是2S+1。若有一个电子激发至高能轨道时，当S=0, 此时分子所处的状态就称为激发单重态；若—个电子激发至高能轨道，但S＝1时，即2S+l ＝3，这种状态的分子就处于激发三重态。假若分子中含有奇数电子，则S＝1/2时，分子处于二重态。 在图11-1电子激发能级图中，处于激发态的分子可以有多种辐射形式去激发而回到基态。首先由于与同类分子或其它分子碰撞，损失一部分能量，产生无辐射跃迁。然后，若能态的多重性不变(激发单重态向基态单重态跃迁)所产生的辐射称为荧光。而能态的多重性改变(激发三重态向基态单重态跃迁)时产生的辐射称为磷光。由图11-1可知，吸收光谱的能级高于荧光光谱能级，荧光光谱能级又高于磷光光谱能级。所以，荧光波长较磷光短；荧光的寿命约为10-9～10-6s, 而磷光的寿命约为10-3～10s; 一般荧光在常温下即可以发射，但磷光必须在极低的温度下（液氮，-196o C）才可以发射。

浅谈荧光分析法的特点及在环境分析中的应用

荧光分析法的特点及在环境分析中的应用 摘要：论文综述了荧光分析法的特点及在环境分析中的应用。重点分析了荧光分析法的原理、特点，以及常用的荧光分析法的讨论。分析了荧光分析法在环境监测中的应用，测定范围和发展情况。 关键词：荧光分析；环境分析；应用 1.引言 环境中分析、监测的对象往往是微量、超微量的物质，有很多还具有时间性和空间性，因此对分析技术要求越来越高。荧光分析法和分光光度法以其灵敏度高、检测限低、准确性好等优点在近年来得到了迅速发展。荧光分子探针的设计合成以及荧光分析法在环境分析化学中的应用是方兴未艾的研究方向[1]。 分子荧光分析具有检测限低，灵敏度高，选择性好，取样量少，方法简捷快速等特点，是一种重要的光谱化学分析手段，其中荧光分子探针检测技术在环境分析化学中占有重要的地位[2]。因此，在对环境的分析中，荧光分析法应用非常广泛，从天然水、饮用水到废水、污水；从土壤、大气到动植物；从人的头发、骨骼、血液到内脏等各个器官，涉及到的样品和应用范围几乎无所不有[3]。 2.荧光分析法的原理和特点 2.1.荧光分析法 2.1.1荧光及荧光分析 荧光是荧光化合物在受到紫外光、电和化学等能量激发后，电子从基态跃迁到激发态，然后通过辐射衰变释放出光子而回复到基态，即产生荧光。这些物质会在极短的时间内(8-10秒)发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外光停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失。 荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。1852年G.G.斯托克斯(G.G.Strokes)发现荧光，真正的荧光光谱测量则始于本世纪60年代。 2.1.2荧光激发光谱和发射光谱 荧光是一种光致发光现象，由于分子对光的选择性吸收，不同波长的入射光便具有不同的激发效率。如果固定荧光的发射波长不断改变激发光的波长，并记

荧光分析法基本概念

紫外可见吸收光谱 一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征（即物质分子的能量具有不连续的特征）。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子：（1）形成单键的σ电子；（2）形成双键的π电子；（3）分子中非键电子即n 电子。 化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是：（σ）＜（π）＜（n）＜（π*）＜（σ* ）σ,π是成键轨道，n 是非键轨道，σ* ,π* 是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法

紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长，用nm（纳米）为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置，纵坐标为它的吸收强度。

四、紫外光谱中常用的几个术语 1.发色基团和助色基团 发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团，不论是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团（C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等） 助色基团：指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团，但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波，同时使吸收强度增加。助色基团通常是由含有孤对电子的元素所组成（-NH2, -NR2, -OH , -OR , -Cl等），这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度，从而使电子跃迁的能量下降。 2．红移、蓝移、增色效应和减色效应 由于有机化合物分子中引入了助色基团或其他发色基团而产生

荧光分析法检测原理及应用举例

1荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 3.1 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1 o S为0或1,它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0 表示所有电子自旋的角动量代数和为0,即所有电子都是自旋配对的，那么2S+仁1,电子所处的激发态为单重态，用S i 表示，由此可推出，S0 即为基态的单重态，S1 为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+仁3,电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T1 即为第一激发 态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。 分子跃迁至各个激发态中，状态不稳定，随时会释放出能量，释放能量的类型有两种：一种是辐射跃迁，另一种是非辐射跃迁，释放能量会回到稳定的基态。

原子荧光复习题

原子荧光法复习题 一、填空： 1.原子荧光分析中，荧光类型有、、、热助线荧光和敏化原子荧光等。 答案：共振荧光、直跃线荧光、阶跃线荧光 2.原子荧光光谱仪中，目前有和两类仪器。 答案：色散系统、非色散系统 3.七十年代末，由于、及各种高效原子化器的使用，AFS技术得到了较大发展。 答案：高强度空心阴极灯、激光器 4.荧光猝灭的程度与及有关。 答案：被测元素、猝灭剂的种类 5.在原子荧光分析中，原子浓度较高时容易发生，它可使荧光信号变化和荧光谱线，从而峰值强度。 答案：自吸、变宽、减少 6.在原子荧光分析中，无论是连续光源或者线光源，光源强度越高，其测量线性工作范围。答案：越宽 7.原子荧光光谱仪的检测部分主要包括、以及放大系统和输出装置。 答案：分光系统、光电转换装置 8.在原子荧光分析中，石英原子化器炉温过高会使降低、增高，但较高的炉温又有利于消除干扰，所以应根据实际情况确定原子化温度。 答案：灵敏度、噪声、气相 9.在原子荧光分析中，测定灵敏度随观测高度增加而，观测高度太低时，会增加，观测高度太高时，会使和下降。 答案：降低、噪声、灵敏度、精度 10.原子荧光光谱仪中，以供电的空心阴极灯，可以使增强几十至几百倍。 答案：脉冲、谱线 11.在原子荧光分析的实际工作中，会出现空白大于样品强度的情况，这是因为空白溶液中不存在的原因。 答案：荧光、干扰 12.在原子荧光分析中，样品分析时，标准溶液的应和样品完全一致，同时必须做。 答案：介质、空白 13.在原子荧光分析中，当光电倍增管的负高压增加时，和水平同时增加，当灵敏度可以满足要求时，应尽量采用的负高压。 答案：信号、噪声、较低 14. 原子荧光光谱仪一般由四部分组成：、、和。 答案：光源（激发光源）、原子化器、光学系统（单色仪）、检测器 15.石英原子化器的外屏蔽气是用以防止周围的进入，产生，以保证较高及稳定的。

原子荧光光谱

第4章原子荧光光谱分析 4.1 原子荧光光谱的产生和特性 4.2 原子荧光光谱分析的定量关系 4.3 原子荧光光谱仪器 4.4 蒸气发生样品导入技术 4.5 蒸气发生-原子荧光光谱分析技术4.6 蒸气发生-原子荧光光谱分析的干扰4.7 蒸气发生-原子荧光测量要点 4.8 非蒸气发生原子荧光光谱分析技术

4.1 原子荧光光谱的产生和特性 原子荧光光谱分析法是上世纪60年代中期发展起来的一种新的痕量分析方法。 原子荧光光谱分析法具有很高的灵敏度，校正曲线的线性范围宽，能进行多元素同时测定。 在冶金、地质、石油、农业、生物医学、地球化学、材料科学、环境科学等各个领域内获得了相当广泛的应用。

气态自由原子处于基态，当吸收激发光源发出的一定频率的辐射能量后，原子由基态跃迁至高能态，即处于激发状态。处于激发态的原子很不稳定，在极短的时间(≈10-8s)内即会自发地释放能量返回到基态。若以辐射的形式释放能量，则所发射的特征光即为原子荧光。 原子荧光是光致发光，所以当激发光源停止照射之后，再发射过程立即停止。

4.1.2.1 共振荧光 共振荧光是指激发波长与发射波长相同的荧光。 由于原子的激发态和基态之间共振跃迁的概率一般比其他跃迁的概率大得多，所以共振跃迁产生的谱线是最有用的分析谱线。 当原子处于由热激发产生的较低的亚稳能级，则共振荧光也可从亚稳能级上产生：称为热助共振荧光。

4.1.2.2 非共振荧光 非共振荧光是指激发波长与发射波长不同的荧光。 （1）斯托克斯荧光 当发射荧光波长比激发光波长长时，即为斯托克斯荧光。 ①直跃线荧光 直跃线荧光是指激发谱线和荧光谱线的高能级相同的荧光。原子受到光辐射激发，从基态跃迁到较高的激发态，然后直接跃迁到能量高于基态的亚稳态能级，发射出波长比激发光波长要长的原子荧光。 类似的，当原子处于由热激发产生的较低亚稳能级，再通过吸收非共振线而激发的直跃线荧光称为热助直跃线荧光。 ②阶跃线荧光 阶跃线荧光是指当激发谱线和发射谱线的高能级不同时所产生的荧光，也分为正常阶跃线荧光和热助阶跃线荧光两类。