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单克隆抗体的制备

单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备

单克隆抗体的制备

摘要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。下面主要讲述制备单抗的实验过程。

关键词:抗体,单克隆,肿瘤,细胞融合,淋巴细胞

现代生物技术制药工业始于1971年,现已创造出35个重要治疗药物,全球大约有2500多家公司,主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。

1.国外现代生物技术产业发展的现状

自1971年Cetus公司成立至今,现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程,创造出35个重要的治疗药物,目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良,糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中,传统生物技术(包括近代生物技术)已为人类提供了许多重要药品,在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用;现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现,使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时,应用现代生物技术DNA重组,细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平,为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产,构建了高产新菌株,创造新工艺,提高生产能力,降低生产成本,促进生产发展。

2.我国现代生物技术医药产业发展的现状

现代生物技术医药产业化进程:我国自80年代开始进行现代生物技术药品的研究和开发,虽然起步较晚,基础较差,但一开始就受到党和国家的高度重视,并列为“863”计划和国家重点攻关项目的主要内容,经过十多年的努力,特别是近五年来,现代生物技术医药产业有了突破性的进展,到1998年7月底我国已有十四种现代生物技术药品和疫苗投入生产,据初步统计,1997年的工业总产值约20亿(包括采用现代生物技术改造传统生物技术后新增加的产值在内)。

目前我国己有近200多个现代生物技术制药企业,其中约30家生产企业已具有不同规模的生产能力,陆续投入生产。因此,可以说我国现代生物技术制药产业化已经开始。

3. 单克隆抗体

3.1单克隆抗体的概念

抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞(浆细胞)和记忆B细胞,大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养,就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群,即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体,称为单克隆抗体。

3.1单克隆抗体的主要特点

1)由于来于单克隆细胞,所分泌的抗体分子在结构上高度均一,甚至在氨

基酸序列及空间构型上均相同;

2)由于抗体识别的是抗体分子上单一抗原位区,且所有抗体分子均相同,由此,单克隆抗体具有高度特异性;

3)产生该抗体的为一无性细胞系,且可长期传代并保存,为此可持续稳定的生产同一性质的抗体。

3. 2单克隆抗体的应用

作为亲合层析的配体:单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合,因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体,利用它作为配体,固定在层析柱上,通过亲合层析,即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱,就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比,具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。

作为生物治疗的导向武器:脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊,内含水相空间,可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体,可定向攻击靶细胞,称为免疫脂质体。这种“导向治疗”,在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体,由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰,抗体带上长的疏水碳链,部分插入脂质体的脂双层膜中,抗体Fab段仍暴露在膜表面,因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞),并通过相变温度引起脂质体破裂,从而定向释放药物。另外,可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联,利用其导向作用,使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效,也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物,在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是,要把这种方法应用于临床,目前还存在不少技术难关,包括人体对鼠源单抗的排异问题等。

作为免疫抑制剂:抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂,已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗,可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外,对用于同种骨髓移植的供体骨髓,在体外经抗T细胞单抗加补体处理,能减轻移植物抗宿主病的发生。

作为研究工作中的探针:单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合,利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时,可以从分子、细胞和器官的不同水平上,研究抗原物质的结构与功能的关系,

进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针,能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。

增强抗原的免疫原性:抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久,60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体,注射相应特异性抗体IgG,就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来,Celis等发现,抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖,并可诱生干扰素。在小鼠中发现,当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时,加入抗HBs抗体组成的复合物,则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用,现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。

作为医学检验试剂:单克隆抗体作为医学检验试剂,更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强,大大提高了抗原—抗体反应的特异性,减少了和其它物质发生交叉反应的可能性,使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性,使抗原—抗体区应结果便于控制,利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成,其主要用途如下:

(1)诊断各类病原体

这是单抗应用最多的领域,已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点,使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株,以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。

(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测

用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗,但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。

随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用,许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立,这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展,了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本,可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断,再结合X-线断层扫描技术,可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。

(3)检测淋巴细胞表面标志

用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志,有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化,这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测,将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容,应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。

(4)机体微量成分的测定

应用单抗结合其它技术,可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析,即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法,它可以测至10-9~10-12g,使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素,还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义.

4实验方法

4.1材料

a.盐溶液:将NaCl8克,KClO4克,Na

2HPO

4

·2H

2

O1.77克, NaH

2

P0

4

·H

2

O0.69克,葡萄糖2克,酚红0.001克,溶于1000ml双蒸水中,pH7.2。高压115℃,15分钟,保存于室温。

标准培养液;RPMI

1640

,DMEM或者Iscove‘s培养液,加入10%灭活血清(马血清、小牛血清或胎牛血清),贮存于4℃。在使用前加入2%100×谷酰胺,1%100×丙酮酸钠,1%100 ×抗菌素(青霉素和链霉素各10000单位/m1),0.05%0.1M硫乙二醇。所有培养液均需于两天内用完。

选择性培养液:即所谓HAT培养液,

100× HAT培养液,

100×H:Hypoxanthine次黄嘌呤为10mM,必须在45℃溶解完全。

100×A:Aminopterine氨基喋呤为0.04mM.必须在45℃溶解于稀释NaOH溶液中,然后再用HCI中和。

I00×T;Thymidime胸腺嘧啶,1.6mM,在室温中溶解。

然后各溶液分别除菌过滤,分装5m1一支,-20℃保存。

HAT和HT的营养液都必须在应用前配制,方法把100×贮存液按1%加入营养液即成。

细胞冻存液:为9份营养浓加入l份DMSO二甲基亚砜,混匀。此时细胞株必须生长良好[1]。

b、骨髓瘤细胞株

BALB/c小鼠骨髓瘤细胞株,经过克隆纯化P3×63Ag8(简称×63) 和其衍生株SP—2/0,SP—2/0不产生球蛋白,此两株细胞均为本研究所Dr、G、Kohler所培育,这些细胞株都适应于各种标准培养液以及2.5cm2和7.5cm2的塑料培养瓶,分别装入4ml或12ml营养液,通入气体为10%CO

2、7%O

2

和83%N

2

,37℃恒温培养。

4.2 方法

a、小鼠免疫

成年BALB/c小鼠各种性别均可,用流感病毒1000个血凝单位腹腔注射,作为首次免疫。7一12周后,再给200血凝单位病毒腹腔注射,作为加强免疫。

在加强免疫后4—5天,即可进行细胞融合,处死小鼠、无菌取脾,把脾细胞轻轻压入10m1的盐溶液中,然后把细胞悬浮液转入15ml离心管中,毛细管吹打,然后至室温中10分钟,让其自然下沉,吸出大约9ml上清液,不要搅动底下的沉淀块,然后用TURK溶液作白细胞计数。

b、腹腔内巨噬细胞的采取

把成年BALB/c小鼠处死,剥开腹部皮肤,用4—5ml的标准培养液或0.34M(=11.6%)的蔗糖溶液注入腹腔,用18号针头从耻骨联合处,直接插入,把针头朝向肝右叶上方,然后轻轻按摩腹部,再行吸出腹腔液体。每鼠可得1.5—3×105的巨噬细胞,这些细胞可收集于塑料管中,用任何一种标准培养液洗细胞,并于30分钟内用完。

c、大孔培养

24孔培养板,每孔可容2m1培养液,培养于37℃,含7%CO

2

/DA大气恒温箱中。湿度为85—95%。

换营养液时,分别以无菌巴氏吸管联接于吸引装置上,吸出大约lml的血营养液,然后用一个小口的25m1吸管,分别加入预热的新鲜营养液。

如果细胞长得很密,可以用2ml吸管吸出培养液,转种于小瓶中,一般1.5ml细胞悬浮液可接种25㎝2的小瓶,当小瓶中细胞长至单层时,即可转种至75cm2的瓶中。以后即可按转种骨髓瘤细胞的方法,维持杂交瘤细胞。

d、微量培养法

平底的微量培养板每孔可容纳0.25mI的培养液,细胞培养条件与24孔培养板相同。当细胞长待很密时,第一步可转入24孔培养板的二个孔中,加入1m1培养液,然后按24孔培养板处理。

5.结论

通过小鼠免疫培养,腹腔内巨噬细胞的采取,微量培养,大孔培养,可得到一定量的杂交瘤细胞,同时分析了实验的一些影响因素,结果如下。

(1).各次细胞融合结果的差别,只有在巨噬细胞活跃的培养孔中,才能得到抗体阳性的杂交瘤细胞克隆。

(2).巨噬细胞对杂交细胞的作用,不加巨噬细胞,没有杂交单克隆细胞,加入巨噬细胞,结果大大增加。

(3).加入巨噬细胞的用量和时间,投入实验的脾细胞的量减少10倍,培养28天后,活细胞多于104的阳性孔。

(4).用不同动物巨噬细胞作为喂养细胞,巨噬细胞来源于何种品系的动物并不重要,来自不同种动物的腹腔洗液,或者杂交动物的

小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬细胞都可促使杂交瘤细胞生长(5).限量脾细胞杂交试验可知脾细胞加入量为4×106时,结果较好,细胞融合数较多。

(6).骨髓瘤细胞株的比较中,选择合适的骨髓瘤细胞株(x63),产生单克隆抗体的几率较高,但不是都产生同一种抗体的。

(7).融合剂PEG聚乙二醇的比较中,所有低分子的PEG结果都差,其中有些是明显有毒性反应,但分子量太大阳性数也会有所下降。

(8).细胞融合温度的比较中,室温比常规的4℃和0℃往往结果较理想。

(9).各种营养液的比较,DMEM、RPMI、Iscove` s三种营养液都可得到较多的杂交细胞株,而对Iscove` s营养液比其他培养液要

更好些。

(10).不同细胞换液方案比较中,细胞融合物直接接种于HAT培养液中为优。

(11).在微量培养板上作杂交瘤细胞株选择培养,可知微量孔培养的杂交细胞数常多于常规培养孔。

(12).在无血清培养液中,所有的杂交瘤细胞克隆只在Iscovs`s完全培养液中才能生长旺盛。

参考文献

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单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体(antibody)是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而,常规血清抗体又称多克隆抗体(polyclonal antibody),简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质,加之不同批次的抗体制剂质量差异很大,使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现。 1975年,Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术,他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合,形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针

对同一抗原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),简称单抗。 与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次**,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒(Georges Ko1er)和英国科学家米尔斯坦(Cesar Milstein)两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 (一)杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日,Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 (一)动物的选择与免疫 1.动物的选择纯种BALB/C小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2.免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐 剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~1ml,0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价) ↓2~3周 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv(静脉内注射) ↓3天后 取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:① 将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。 (2)颗粒抗原免疫性强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例,免疫时要求抗原量为1~2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2~3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天)1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 (二)细胞融合

单克隆抗体制备流程

单抗制备流程 1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤,下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。 一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×107/0.5ml ip (腹腔内注射) ↓2~3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天) 1×107/0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,常用佐剂:福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0.8~1ml 0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同上,不加佐剂,ip │ (5~7天后采血测其效价,检测免疫效果) ↓2~3周后 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原反应性。 (二) 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中,许多环节需要加饲养细胞,如:在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞,也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便,照射后可放入液氮罐长期保存,随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系,常用BaLb/c小鼠6~10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75%酒精,消毒3~5分钟 ↓

单克隆抗体制备方法(全)

单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交瘤细胞既可产生抗体,又可无性繁殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备: 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱(-70℃)、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机(水平转子,4000r/min)、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括:100ml、50ml、25ml细胞培养瓶,10ml、1ml刻度吸管,试管,滴管(弯头、直头),平皿,烧杯,500ml、250ml、100ml盐水瓶,青霉素小瓶,10ml、5ml、1ml注射器等,96孔、24孔细胞培养板,融合管(50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管),眼科剪刀,眼科镊,血细胞计数板,可调微量加样器(~50ul,~200ul,~1000ul),弯头针头,200目筛网,小鼠固定装置等。此外,一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~1ml,0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价) ↓2~3周 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv(静脉内注射) ↓3天后取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中,总共有两次筛选,第一次筛选出杂交瘤细胞,第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法:细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径:一条途径是生物合成途径(“D途径”),即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径(“S途径”),它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。因此,在HAT培养液中,未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断,虽“S途径”正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT)细胞,因此自身没有“S途径”,且“D途径”又被氨基喋呤阻断,所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的“S途径”,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HA T培养液中选择性存活下来,并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法:在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此,从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的,经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异,所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞(理论上30%的孔中细胞数为0时,才能保证有些孔中是单个细胞),再由这些单细胞克隆生长,最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此,单克隆抗体制备过程中,两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理: B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程: 1)免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备,也可采用脾内直接免疫法。 2)骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前,骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选,防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性(恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活)。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养,融合前24h换液一次,使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3)细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。 4)阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测,过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质,以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便,RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次,均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5)克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的,有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多,而最常用的是有限稀释法。 (1)显微操作法:在显微镜下取单细胞,然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂,效率低,故不常用。 (2)有限稀释法:将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后,按每孔1个细胞接种在培养皿中,细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化,所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2~3次的再克隆才成。应该注意的是,每次克隆化过程中所有有意义的细胞都

单克隆抗体的制备及应用.doc

单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique):一种免疫学技术,将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交,获得既能产生抗体,又能无限增殖的杂种细胞,并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体,对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性: 1.1 单克隆抗体的优点:(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代,只要不发生细胞株的基因突变,就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原,获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体,所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说,即:高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 1.2 单克隆抗体的局限性:(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应,所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂,而且费时费工,所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备: 单克隆抗体的制备原理:应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一,得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性,它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性,也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性,用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群,可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程:抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 2.1 抗原准备 抗原,是指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答,并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合,发生免疫效应(特异性反应)的物质。抗原的基本特性有两种,一是诱导免疫应答的能力,也就是免疫原性,二是与免疫应答的产物发生反应,也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原,抗原的具体分类可以参见抗原,在进行单克隆抗体制备过程中,很多物质都可以成为抗原,在常规的科研实验中,科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 2.2动物的选择与免疫

单克隆抗体制备简要流程

制备单克隆抗体是复杂而费时的工作,整个技术流程如图: 单克隆抗体制备(免疫2-3月,总周期4-6 月) 准备抗原 动物免疫——选择免疫动物 Elisa测抗血清--------- ? ¥ 分离脾细胞骨髓瘤细胞 细胞融合(融合剂:PEJ HAT培养基筛选杂交瘤细胞 筛选阳性细胞------- * (三天内做完流式)“ 阳性克隆并扩大培养呻—细胞冻存 性! 扩大培养收集上清动物接种收集腹水 单克隆抗体纯化保存 1、抗原提纯与动物免疫: 选择BALB/c健康小鼠。如为细胞抗原,可取 1 X 107个细胞作腹腔免疫;可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。免疫3?4只小鼠,间隔一般2?3周,末次免疫后3?4天,分离脾细胞。 2、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择Sp2/0细胞株,将昆明鼠的腹腔细胞作为饲养细胞 3、细胞融合 将两种细胞混合后加入PEG(融合剂)使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG 消除PEG的作用。注意:细胞比例、培养液成分、反应时间 4、有限稀释法筛选阳性株 筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株(一般稀释至0.8个细胞/孔)细胞培养至覆盖0 %?20%孔底时,吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔,将孔中细胞再行克隆化,尔后进行抗原特异的ELISA 测定,选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 5、单克隆抗体的制备与保存 筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠,先用液体石蜡进行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集5?10ml的腹水,冻存。6、单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法

单克隆抗体制备过程中的两次筛选

单克隆抗体制备过程中的两次筛选 动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。在单克隆抗体制备过程中,有两次筛选,这地方学生很容易弄混了。第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞,第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,两次筛选的原理和方法并不相同。 第一次筛选: 细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)。 其依据是细胞中的DNA合成有两条途径:一条途径是生物合成途径(“D途径”),即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径(“S途径”),它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。因此,在HAT培养液中,未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断,虽“S途径”正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT)细胞,因此自身没有“S途径”,且“D途径”又被氨基喋呤阻断,所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的“S途径”,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT培养液中选择性存活下来,并不断增殖。 第二次筛选: 在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此,从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的,经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异,所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞(理论上30%的孔中细胞数为0时,才能保证有些孔中是单个细胞),再由这些单细胞克隆生长,最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。 因此,单克隆抗体制备过程中,两次筛选的原理和方法是不相同的。

单克隆抗体的制备

单克隆抗体的制备 摘要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。下面主要讲述制备单抗的实验过程。 关键词:抗体,单克隆,肿瘤,细胞融合,淋巴细胞 现代生物技术制药工业始于1971年,现已创造出35个重要治疗药物,全球大约有2500多家公司,主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。 1.国外现代生物技术产业发展的现状 自1971年Cetus公司成立至今,现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程,创造出35个重要的治疗药物,目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良,糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中,传统生物技术(包括近代生物技术)已为人类提供了许多重要药品,在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用;现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现,使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时,应用现代生物技术DNA重组,细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平,为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产,构建了高产新菌株,创造新工艺,提高生产能力,降低生产成本,促进生产发展。

单克隆抗体制备实验过程

单克隆抗体制备实验过程 I 细胸培养 选出所需要的细J腕 群,继续培养 免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞 的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器 官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B 淋巴细胞。 杂交瘤细腕 体内培养 体外培养 从培养液中 \ /从腹水中提取 单克隆抗体

说明:FCA弗氏完全佐剂;FIA,弗氏不完全佐剂;Quickantibody ,北京康碧泉公司研制 的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM,存在亲和力弱等缺点,慎用。 PS:1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原,每只小鼠注射6-8个点为宜。 2 、腹腔注射时,如果抗原混有弗氏佐剂,建议注射在左侧腹腔,如果采用右侧腹腔注射,则在免疫过程中,很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况,造成后期取出脾脏麻烦。 3 、冲击免疫完成后,应在96小时内完成细胞融合,否则相应的B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。 二、细胞融合(Cell fusion) 【材料和试剂】 (1)骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株,取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞,制备细胞悬液。 (2)免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠,眼眶放血,?分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠,浸泡于75%酒精中3?5min。无菌操作取出脾脏,置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤,剪去周围

的结缔组织,将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上,先用剪刀剪成3?5个小块,然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中,加不完全培养液50ml, 1000r/min 离心5min,弃上清,再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中,计活细胞数,一般一只小鼠可得0.5?2X 108个脾细胞。 (3)饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后,用消毒剪镊 从后腹掀起腹部皮肤,暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔,注意避免穿入肠管。右手固定注射器,使针头留置在腹腔内,左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟, 随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟,弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮,根据细胞计数结果,补加HAT培养基,使细胞浓度为2X 105/ml,备用。 (4)主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM (Dulberco Modified Eagles Medium )两种基础培养基,配好后过滤除菌 (0.22um),分装,4C保存。 不完全RPMI-1640培养基: 完全RPMI-1640或DMEI培养基: HT或HAT培养基:

制备单克隆抗体方法

制备单克隆抗体方法 1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上,创建立杂交瘤技术,他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合,成为杂交细胞系,既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性,又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养,可形成单细胞系,即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法,便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体,其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的,而且在培养过程中,只要没有变异,不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。 这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题,可用于探讨①蛋白质的精细结构;②淋巴细胞亚群的表面新抗原;③组织相容性抗原;④激素和药物的放射免疫(或酶免疫)分析;⑤肿瘤的定位和分类;⑥纯化微生物和寄生虫抗原;⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法(“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合,将药物带至病灶部位。因此,单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究,为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。 制备过程

1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B淋巴细胞。 2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠,无菌操作取出脾脏,在平皿内挤压研磨,制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合,并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞,一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中,未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性,因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞,因此,必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法,筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后,及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。 (1)体内诱生法取Balb/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后,腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖,并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周,可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,即可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中,杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体,收集培养上清液,离心去除细胞及其碎片,即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现,大大提高了抗体的生产量。

最新单克隆抗体制备方案

单克隆抗体制备方案

单克隆抗体制备方案 细胞融合前准备 一、动物免疫 1.1 动物 选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠,雌雄皆可,鼠龄8周左右。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。 1.2免疫原制备 15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA(使用前需震摇) 50μg /只:称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入7mlPBS 中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。100μg/只:称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入3mlPBS 中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。150μg/只:称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入2mlPBS 中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。200μg/只:称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入1mlPBS 中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。250μg/只:称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入1mlPBS 中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。 1.3 实验步骤 初次免疫: 50μg、100μg、150μg、200μg、250μg抗原溶于PBS中,加等体积的福氏完全佐剂(CFA)腹腔和皮下注射。(共25只小鼠,每组5只,两只采用背部皮下注射,共1ml,0.2ml/点,3只采用腹腔注射) 3周后 第二次免疫:与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加福氏不完全佐剂(IFA),腹腔和皮下注射 3周后 第三次免疫:与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加IFA,腹腔和皮下注射,5天后内眦静脉或断尾取血以ELISA间接法测效价 2~3周后 加强免疫:取初次免疫抗原一半的量溶于PBS,静脉或脾内缓慢注射,以免动物发生过敏性休克而死亡。 3~4天后 腹腔注射 大鼠、小鼠一般一人即可注射:以左手大拇指与食指执住鼠两耳及头部皮肤,腹部向上,将鼠固定在手掌间,必要时,以左手无名指及小指夹住鼠尾;右手持连有5号针

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中,有两次筛选过程,第一次是选出杂交瘤细胞(用选择培养基),第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法: 细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径: 一条途径是生物合成途径(“D途径”),即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸,为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HA T培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径(“S途径”),她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。 因此,在HA T培养液中,未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断,随S途径正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞,因此自身没有S途径,且D途径又被氨基蝶呤阻断,所有在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的S途径,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT培养液中选择性存活下来,并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法: 在单克隆抗体的生产过程中,由于效应B细胞的特异性是不同的,经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异,必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选,选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,是每孔细胞不超过一个,通过培养让其增殖,然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体,上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞,继续进行有限稀释,一般重复3-4次,直至确信每孔中增殖的细胞为单克隆细胞。第二次筛选也是鉴定的过程。

单克隆抗体地制备(详细材料)

单克隆抗体的研制 一、单克隆抗体的概念 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而,常规血清抗体又称多克隆抗体(polyclonal antibody),简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质,加之不同批次的抗体制剂质量差异很大,使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现。 1975年,Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术,他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合,形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产 monoclonal antibody),简称单抗。 与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次革命,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 (一)杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日,Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity)的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase,HGPRT)的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导,杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)的培养基(HAT)中生长进行选择。在融合后的细胞群体里,尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+,但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活,只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自

单克隆抗体制备的基本原理

精心整理单克隆抗体制备的基本原理 ?一、单克隆抗体的概念 抗体(antibody)是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原 1975 交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb),简称单抗。

与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次**,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒(GeorgesKo1er)和英国科学家米尔斯坦(CesarMilstein)两人由此杰 抗 《自 ( 他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase,HGPRT)的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导,杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)的培养基(HAT)中生长进行选择。在融合后的细胞群体里,尽管未融合的正常脾细

胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+,但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活,只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性,而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样,最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞 题,NSO/1 合后细胞将以多种形式出现,如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活仅5~7天,无需特别筛选,细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。在细胞融合后,要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞,一般使用HAT培养进行筛选,HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋

单克隆抗体的制备方法

一、单克隆抗体的概念和原理免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇,各种抗原分子具有很多抗原决定簇,因此,免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限,且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外,要把这些不同的抗体分开也极困难。近年,单克隆抗体技术的出现,是免疫学领域的重大突破。 (1)单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙,即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆,并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养,就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群,即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体,称为单克隆抗体。

(2)单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需 先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴 1 细胞,但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖,应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一,得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性,它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性,也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性,用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群,可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下: 二、基本方法 2 1. 抗原提纯与动物免疫 7对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原,可取1×10个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原 需加完全福氏佐剂并经充分乳化,如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠,鼠龄在8~12周,雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。

单克隆抗体的制备方法

单克隆抗体的制备方法 动物的选择与免疫 1.动物的选择纯种BALB/C小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2.免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~1ml,0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价) ↓2~3周 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv(静脉内注射) ↓3天后 取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。 (2)颗粒抗原免疫性强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例,免疫时要求抗原量为1~2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2~3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天)1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 细胞融合 1.细胞融合前准备 (1)骨髓瘤细胞系的选择:骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。 表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系

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