小鼠脾细胞培养实验
山东大学实验报告2011年3月30日
姓名张行润系年级2009级生科4班学号 2 同组者张少华
科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号105 一、实验目的
了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。
二、实验原理
(一)细胞原代培养
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
(二)细胞死活鉴定
死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。
染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：
死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。
除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。
三、实验器材
剪子，棉球，75%酒精，移液枪，无菌操作台，正置光学显微镜，倒置光学显微镜，解剖盘，滴管，离心管，离心机，注射器，Eppendorf管，培养皿，酒精灯，塑料培养皿，载玻片，盖
玻片，血细胞计数板等。
四、实验材料
小鼠1只，细胞培养液（含生长因子），Trypen Blue染液，PBS缓冲液，
五、实验步骤
(一)细胞的原代培养
1.取材：
取小鼠一只，采用断头法处死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出转入超净工作台内的解剖盘中，无菌操作打开腹腔，取出其脾脏，除去其周围的脂肪组织，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，转入无菌培养皿中待用。
2.分离脾细胞：
用滴管向培养皿中注入30滴PBS缓冲液，再用’L’型针头注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾脏，注射时沿长轴注射。然后再用针头在脾脏上扎眼，并用’L’型针头轻轻刮出脾细胞。在均匀吹匀脾脏细胞。
吸取上述分离的单个脾细胞悬液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min离心5min。
3.培养脾细胞：
取塑料培养皿一套，用移液枪吸取培养液2mL加入塑料皿中，并将皿标记待用。取离心后的Eppendorf管，弃去上清液，用移液枪（200ul）吸取塑料皿中的培养液400ul加入弃去上清的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料皿中，混匀后放入37°C，5%CO2的培养箱中培养。
(二)细胞死活鉴定及计数
1.试剂配制：用生理盐水配成5%Tyrpen Blue染液，备用。
2.染色计数：
取0.5mL细胞悬浊液放入试管中，加入1-2滴染液。混合。2-5min后将细胞放在血细胞计数板上观察死活情况，注意不要有气泡产生，放大倍数为
10x10。染色后活细胞不着色，死细胞显示蓝色。注意染色时
间不能超过15min，否则染液将细胞毒杀。
3.计数：
在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板的4个4
小方格的细胞数量。包括细胞总数与死细胞数量。压线者计上
不计下，计左不计右。
4.计算细胞活力：
根据公式：
图1.血细胞计数板示例图
六、注意事项
1、严格进行动物消毒，需用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。
3、吸取液体前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液体时，避免碰撞。
4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
6、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。
七、实验结果
本次试验中计数所用材料为培养
1-2周后的小鼠脾细胞，培养液呈粉红
色，且未被染菌，说明原代细胞培养过
程中小鼠脾细胞得到增殖，部分营养物
质和其生存所必须的物质被消耗掉。
本次试验采取的是Tyrpen Blue染
液，活细胞不会被染色而呈无色，死细
胞会被其染色而呈蓝色，在光学显微镜
下以10×10的倍数来观察得细胞总数
和活细胞数，可由公式计算出细胞活力。
图2：细胞Trypen Blue染色后图片（10x10）
下面是我们小组的实验结果：
表1：总细胞数和活细胞数统计表（10×10）
项目总细胞数活细胞数细胞活力
1 114 23 20.2%
2 117 25 21.4%
3 148 30 20.3%
4 100 21 21.0%
总计479 99 20.7% 计算得其细胞活力为20.7%
八、分析总结
本次实验中我们小组所测细胞活力为20.7%，并不算高，分析得应有以下原因可能影响实验结果（包括误差）：
a)若在无菌操作的过程中操作不规范，导致染菌，会极大的影响观察，导致实验失败；
b)若在离心分离呈单细胞的过程中离心机转速过快或时间过长很可能会导致细胞破裂，
导致小鼠脾细胞大量死亡；
c)染色时间过长，或观察时间过长都会导致染色试剂将细胞杀死，使细胞活力骤降，这
是导致细胞活力比较低的重要原因；
d)实验中的一些操作不正确或不规范的情况、计算带来的误差等也会直接导致实验误差。