冰冻切片漂片

免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）

免疫组化步骤：

1.将脑片放到，6 孔板（或12 孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；

2.吸去双氧水，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；

3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；

4.然后，4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃；

5.然后，PBS 洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。

6.DAB 配方为：10mg DAB 固体加到20ml 0.01MPBS，临用时加100-200 微升30%双氧水，注意避光。

7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。一般3 分钟显色就比较明显，如果20 分钟仍未显色，则看下面的参考。

8.然后PBS 洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。

9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。

免疫荧光步骤及注意事项：

1， 将脑片放到 6 空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）

2， 吸去山羊血清，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；

3， 然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS 稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；

4， 4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48 或72 小时；

5， 然后，PBS 洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。注意避光操作。

6， 0.01M PBS 洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干；

7， 滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观察。

常见问题：

1， 荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短；清洗次数过多；溶液pH 不合适；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过低或过高；激发波长不在抗体适用波段。

2， 背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻底；封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强；显微镜荧光强度过强。总之实验是喜欢强阳性，不喜欢假阴性，呵呵。任何实验都需要花时间摸索才能找到其最佳的工作条件。

另附免疫组化常见问题解析。原理是相同的，只是最后的显色方法不一样，有些问题有启发作用。

免疫组织化学

1. 边缘效应?

原因: 1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试 剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES 或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4 微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

2. 产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？

1. 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。解决办法: 这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。

2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

5. DAB 孵育时间过长或浓度过高；

6. PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP 孵育之后的浸洗尤为重要；

7. 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

3. 免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？

1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还

是国产的工作液，怎么这么高稀释度也没能做出阳性结果？另外不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。

2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合;建议微波修复用高火4 次*6min 试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。

3、组织切片本身这种抗原含量低；

4、血清封闭时间过长。

5、DAB 孵育时间过短。

6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。

7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

4. 背景强的原因?1, 考虑一抗浓度高；2,然后调整DAB 孵育时间；3,也要考虑血清封闭时间是否过短

4,适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。

5. DAB 显色真的需要3-10 分钟吗？我之前做的显色40 秒就够了，再多本底就太深，现在

做另一个显色3 分钟也不出，真的有必要延长显色时间吗？

1. DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；

2. DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；

3. 此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；

4. DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4 度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

6 . 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？，

1 烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度

二，用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做

三，有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲 PBS 不要直接冲到组织上，冲

到组织上方，

让它流下冲洗组织，四，用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

7. 年前爬的细胞片在-20 度放了半年（保鲜膜密封），现在取出来再作，做了两次，步骤均是按以前的作的，但今天做时，原来显色很强的片子现在显色很弱了，问什么呢？是不是片子放的时间太长了？抗体在 4 度放的时间也不长而且这次浓度比以前做的还高?

1. 首先，抗体浓度和孵育时间在免疫组化中至关重要。在抗原抗体反应并非抗体浓度越高，反应越强烈，这叫前带现象。所以选择最佳的一抗浓度和孵育条件也是十分重要的，其实抗体浓度过高或过低均会引起阴性。

2. 我到认为你这片子的影响可能更大。尽管在-20 度保存，但是时间一般超过3 个月就不能保证其中抗原的丢失，建议可以重新爬片，以排除方法和抗原的原因。

3. 你说抗体放在4 度保存是指未稀释还是稀释后抗体，存放多长时间？一般稀释后抗体不能保存很长时间的。

8. 为什么切片倾斜，抗体分布不均匀，就会造成一半阳性，一半阴性？我认为，即使切片倾斜，抗体覆盖少的那部分组织和其他部分抗体的浓度是一样的，只是抗体体积的大小差异！如果说抗体倾斜没覆盖好的地方是阴性，那为什么不是干片所导致的非特异性高背景的染色呢？当切片倾斜到有一半甚至都没液体时，就会出现阴阳脸样的着色。你认为呢？

9. 高温抗原修复后就没必要灭火内源性过氧化物酶?经过高温POD 已经灭活了，不错POD 是被被灭活了，但它仍有还原能力，仍能跟DAB发生氧化还原反应，使DAB 显色，我们用双氧水是耗竭POD 的还原能力，使之不能在跟

DAB 反应。所以无论修复与否都应该灭活POD，尽可能消除非特异性着色。

10. 冰冻切片有时会有小洞?

冰冻切片有时会发现切片上会有空洞，这是因为组织在冰冻过程中形成冰晶，形成冰晶的原因一是组织冰冻时间太慢，或者冰冻的温度不够低，慢慢形成冰晶，二是有些组织在冰冻之前需要做适当的固定，如脑组织，然后放入30%的蔗糖4 度冰箱过夜以减少冰晶形成，并且能最大程度保持组织细胞形态。另外在切片是组织块复温要在37 度速融，否则易造成组织块的破坏。

11. 常用免疫组化结果分析方法?

1. 阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不重叠的10 个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6 张不同动物组织切片，然后进

行组间比较即可。

2. 灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j 进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

3. 评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3 分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4 分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。

12. DAB 呈色后到底什么样染色是特异性染色？

阳性标记可以从色度特征，阳性标记细胞学特征来进行基本的判断。色度特征：一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱抗原；棕黄色，提示为中等度抗原；棕黑色，示为强抗原。在结果判断中，后两者较有意义，可作为判断依据。细胞学特征：阳性表达必须在细胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的阳性表达即使阳性也不应作为判断依据。一般分为胞膜型，胞核型，胞质型，微绒毛型,复合型几种。这是需要结合背景知识的。

同样，非特异性染色也有一定的特点：它首先是指抗原无明确定位，各种细胞累及一片，色度无深浅之分，这种标记组织片不能作为免疫组织标记结果判断的依据，造成非选民性染色的原因常为组织标本固定不佳，抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等。因此，免疫组化特异性染色定位非常重要，一般情况下，阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深浅不一。如果缺乏细胞音的不均一性染色，即或呈阳性染色，常提示为非特异性染色。另外，组织片边缘反应和出血坏死灶周围阳笥反应不能作为诊断依据。

13. 1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？我用组织芯片和普通切片在多种条件下进行了抗原修复实验，发现在热修复后，组织脱片最主要原因是组织脱水不良，肿瘤组织黏附性差在小块组织时也容易撕脱（减小热修复加热功率，PBS 冲洗时不要直对组织冲洗、可以有效防范）。

2. DAB 显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？这就是免疫组化染色的阴阳脸，免疫组化实验是环环相扣的实验，任何一步试剂孵育不全（没有均匀的在组织上孵育）都可能导致这样的结果。

3. 免疫组化结果老是出现阴性结果？那就要考虑真阴性还是假阴性！假阴性是你操作不当或者试剂质量的问题了。

4. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？你的抗体是

否特异，孵育时间温度浓度是否过长！

5. 一抗从4 度拿出后，为什么有人说要37 度复温，目的是什么？我没遇到这样的说法，是否是想加速复温？还有我不知道国内的院校为什么对37℃孵育如此感兴趣，在你们买国外抗体时，他们的说明书上除了酶修复要37℃外，其他步骤中均没有说要在37℃中孵育。

6. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其微波修复。抗原修复没有什么最佳条件只有可能管用的修复条件。

7. 有人在一抗孵育前用tritonX100 来通透细胞，对石蜡切片需要否？tritonX100 是脂质溶解剂，做免疫细胞化学时细胞膜是完整的半透膜，孵育的抗体要自由的通过细胞膜就要用tritonX100 来破膜。石蜡切片细胞多数是切开状态了。但是脂质有时会吸附抗体，含脂质高的组织也可以用triton。

8. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？要看你是用什么苏木素，免疫组化复染，不比我们平常的HE，它只要一般的轻微染色就够了，染过了就凑合着看，或者试试1％盐酸酒精。

9. 抗原修复应在灭活POD之前还是之后？看过国外文献说是要在抗原修复之前修复内源性过氧化物酶，还用CD3 来说事，当初刚到病理科也傻乎乎的进行验证了，没有发现老外所说的情况，写信质问，可能是他看不懂我的英文，没回复。

10. DAB 显色时间到底多少为最佳？一定要是3~10 分钟吗？最佳显色时间应该镜下观察，但是平时片子太多没法一一看过，就大致订个时间。

11. DAB 呈色后到底什么样染色是特异性染色？这是到如何阅片的内容，不是三言两语可以说清的。

熟能生巧，边学习边练习边思考方能学好。

冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么 1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的 抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。 2、从研究目的来看。石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形 态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。 3、从抗原的保真性来看。冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程 中可能会对抗原的性质造成影响。 4、从操作步骤的繁琐程度看。染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。 5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立 即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 编辑本段冰冻切片的应用

免疫组化技术全程原理

免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法

关于冰冻切片的若干问题

1.做冰冻切片用的固定后样品能在蔗糖溶液放多久？ 问：本人将样品固定过后冲洗过后，放入蔗糖溶液，因有事耽搁，放了一个星期了，不知是否还可切片．还有固定过后冲洗用普通蒸馏水冲洗可以吗？我是做免疫组化 答：1、不知道你放置的蔗糖浓度是多少，如果是30%最好是三天之内，50%的浓度可以方久一点，一两个月应该没什么问题。因为蔗糖是高渗环境，不会影响实验结果。祝好运吧！ 2、我认为组织在20％蔗糖放一周还是可以切片的，至于固定后的冲洗，可以免掉，也可用0.01MPBS涮洗一下，蔗糖液的量要多加一些 2、关于冰冻切片的问题(冰冻切片,免疫荧光,蔗糖,脱水)问：请拟准备做免疫荧光的标本,经前固定灌注后取全脑,后固定4小时后,30%的蔗糖脱水过夜,再用OCT包埋后保存在-80的冰箱,冰冻切片后HE染色,发现整个视野都是大小不等的圆形洞洞,不知道是什么原因. 答:1、个人认为可能是以下几个方面的问题: 30%的蔗糖脱水过夜---- 一般我所采取的是灌注固定后取脑,然后放入30%蔗糖的多聚甲醛溶液中,待脑下沉到底后(大约2天)再切片,用这样的高渗糖既可以防止冰晶又可以继续后固定.单纯的蔗糖过夜应该是不够的.

从30%蔗糖的多聚甲醛溶液中捞出脑后应放入液氮迅速冷冻然后进行切片,不建议用-80度冰箱,曾经用过-80度冰箱结果脑片出现许多冰晶孔.

2、用0.01M的PBS配置的4%多聚甲醛灌注固定后，20%蔗糖（沉底）→30%蔗糖（沉底），然后直接进冰冻切片机急冻15~20min，我们实验室的技术员曾说过，脑标本千万不能用OCT 包埋、液氮冷冻。只要蔗糖脱水彻底，是不会形成冰晶的；而用OCT包埋、液氮冷冻，你没做过，时间不好把握——时间长了，组织会冻裂；时间不够，冷冻效果不好，切片不好切。 3、这个就是实验室和实验室操作方法有所区别了,我说的方法肯定是没有问题的,我们都是这样操作没有出现过冰晶,不用OCT包埋,但确实用液氮,冻10秒,不会冻裂,效果良好. 4、液氮速冻可以防止组织冰晶的形成 冰冻切片心得 1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的 2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做 3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作. 4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤) 5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.

冰冻切片步骤 很全面

冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。 1.取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。 2.速冻： 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。 液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。 3．固定： 样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min 让OCT胶浸透组织。取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及

微小组织快速冰冻切片法

微小组织快速冰冻切片法 自1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法以来,国内外病理同仁在这方面做了大量工作,随着技术的不断完善,冰冻切片已成为病理科的常规工作,这为术中诊断提供了条件。随着人们生活水平的不断提高和医学科学技术的不断发展,人们对健康越来越重视,临床医生和患者常常要求对直径小于0.3 cm的微小组织作出快速诊断,由于组织小,有时难以制片和诊断,影响了此项工作的全面开展。为解决这一问题,在实际工作中,我们不断摸索、改进、完善,总结出了一种较实用的微小组织快速冰冻切片法,现介绍如下。 1材料与方法 1.1材料①微小组织包括纤维胃镜活检标本,肾穿刺标本,脱落细胞沉淀后剩余物等,均为我院门诊及住院部送检。②原西德产Leitz 1720型低温恒冷冰冻切片机。③组织包埋托的改进:找一直径为0.8～1 cm,高约1 cm的圆柱形铜质材料,一端可上螺丝,在机器所配的组织包埋托中央打一小孔,将铜质的圆柱体用螺丝与组织包埋托固定,铜质圆柱体周围缠以3～4圈医用胶布,周围略高于铜质圆柱体。④包埋剂:取适量甲基纤维素,然后加入适量蒸馏水调成糊状,煮沸,放凉,再加入适量麝香草酚,分装于空的超声耦合剂瓶内,贮存于4℃冰箱待用。 1.2方法①开机预冷:提前开机,将低温恒冷切片机冷台及切片刀冷至-22℃左右。②滴加包埋剂:在改进后的组织包埋托上滴加包埋剂,待冷冻好后修平,将微小组织平放于修好的平面上,冷冻片刻,修切,若是长条组织,如肾穿刺标本,组织与组织包埋托旋钮呈60°角,若是多块组织则应放置于同一平面,且不互相重叠。③切片:用手术刀片切去组织周围多余的包埋剂。使之成为长方形或正方形,然后开始切片,切片厚度3～5 μm。④固定:95%乙醇或乙醚酒精混合液(乙醚,95%乙醇等量混合)固定5～10 s。⑤染色:苏木素1～2 min,0.5%盐酸酒精分化1 s,0.25%氨水返蓝,伊红染1 min,95%乙醇3 s,无水乙醇3 s,在烘片机上烤干,封片。 2结果 组织切片完整,可连续切片,HE染色组织结构清晰,色彩鲜艳,细胞核、细胞质对比明显。 3讨论 快速低温恒冷冰冻切片是手术中病理诊断的方法之一,具有较广泛的应用,在很大程度上决定了手术的方式和治疗方案的确定,因此质量较好的冰冻切片,对病理医生和临床医生都至关重要。对于大块组织的冰冻切片基本不成问题,既可用一块组织多切,又可再次取材,然而,对于直径小于0.3 cm的微小组织来说,材料显得尤为珍贵,要作出正确的诊断,就必须要有一张高质量的冰冻切片。笔者将原组织包埋托进行改进,使切片刀与组织包埋托的接触面缩小,这样便于观察组织,又不至于损伤刀口,修切时防止将组织切完,有利于切片。

冰冻切片快速病理诊断30年总结

冰冻切片快速病理诊断30年总结 秦皇岛市肿瘤医院病理科康文喜谢芳芳王小聪李英邮编：066001 术中冰冻切片快速病理诊断是1818年由Pieter de Riemer首先创造发明的，1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法。目前国内外已将此项技术普遍应用于临床，解决手术中的病理诊断问题。并日益受到外科医生和患者的欢迎和肯定。随着冰冻切片技术和临床外科手术的发展，要求做冰冻的病例逐年增多，截止到2012年10月份，本院病理科开展快速冰冻病理诊断30余年，共完成冰冻快速病理诊断1476例，积累了一定的经验和教训，为了更进一步提高冰冻快速病理诊断水平，提高冰冻诊断准确率，降低误诊率，作者将30年来所有冰冻切片快速病理诊断病例进行总结分析如下。 1 材料和方法 1.1 一般资料本组1476例大部分来自本院住院病人，小部分来自其他医院。其中男897例，女579例，年龄最大81岁，最小5个月。 1.2 病变部位乳腺1052例，软组织42例，胃33例，淋巴结33例，骨12例，腹膜9例，睾丸及附睾8例，甲状腺47例，小肠15例，大肠25例，膀胱5例，脊椎5例，阑尾10例，胆道14例，阴茎19例，卵巢53例，脑及脑膜3例，前列腺3例，肝12例，肾26例，脊髓2例，喉2例，子宫42例，精索1例，纵隔1例，腹膜后1例，眼1例。 1.3 方法本组1476例均采用德国进口莱卡冰冻切片机切片，HE染色，普通光学显微镜观察。 1.4 结果1476例中，恶性肿瘤687例，良性肿瘤388例，瘤样病变170例，炎症202例，结核29例，确诊1457例，未能确诊15例，误

诊4例。 2. 讨论 冰冻切片质量差，最初很多著名的病理学家如Ewing、Brewer、Simpson等曾经怀疑冰冻切片的准确性，1960年Cryostat冰冻切片机正式应用于临床后，冰冻切片质量有了很大提高，但和石蜡切片相比仍很逊色，对准确的冰冻病理诊断带来一定困难，尤其对年轻的病理科医生来说难度较大，缺乏经验的病理科医生难以胜任此项工作，下面根据自己个人的经验发表一点看法。 2.1 冰冻切片快速病理诊断的优缺点：冰冻切片快速病理诊断的优点是在手术过程中随时取材，迅速做出准确可靠的病理诊断，同时也减少了病人二次手术的痛苦。缺点是切片厚，细胞大，层次多，易造成错觉。另外冰冻切片诊断要求报告快，没有更多思考讨论余地，一旦报错，将造成严重的无法弥补的后果。 2.2 准确率：本文对1476例冰冻切片进行了统计分析，结果准确率为98.7%，未能确诊率为1.02%，误诊率为0.3%，与国内报道相比准确率相仿，而误诊率低于各家报道。 2.3 未能确诊和误诊的原因：⑴取材不当：恰当准确的取材是正确诊断的必备条件，取材不当就不可能得出正确的病理诊断。当临床切取肿物困难时，所送检的肿物标本不一定是肿物中心组织，很可能是肿物边缘组织，这种组织大部分是肿物周围的正常成分，或仅带有少量肿物，此时应多切几个切面进行观察，在把握不足的情况下可多取几块组织做切片，以防漏诊。⑵切片质量不佳：切片过厚，组织未能展平出现折叠，组织缺损，染色深浅不均等都直接影响诊断结果。

远程术中冰冻切片检查与诊断简介1

远程术中冰冻切片检查与诊断 一.简介及意义 冰冻切片检查与诊断（简称“术中冰冻”）是将手术中切除的病理组织在冰冻切片机中快速制片，经过特殊染色后供病理医师进行病理诊断的一种诊断方法；是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题请求病理医师快速进行的会诊方式，如果诊断为恶性肿瘤，就可以直接根据结果选择手术方式及范围，从而有效地避免了二次手术及损伤。 二．方法及原理 将手术中切除的病理组织无需固定、直接送检，在冰冻切片机中快速制片，经过特殊染色后供病理医师进行病理诊断，冰冻切片取材后剩余、未曾冷冻的组织（冻剩）均会制备石蜡切片并进行常规病理诊断。 三．应用范围 适用范围 1.需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤、良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案时。 2.了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。 3.确定肿瘤部位的手术边缘有无肿瘤组织残留。 4.确认切除的组织，例如甲状旁腺、输卵管、输精管及异位组织等。 不适用范围 1．疑为恶性淋巴瘤者。 2．过小的标本(标本长径≤0.2cm者)和含水分较多的脑组织。 3．术前易于进行常规活检者（例如：肠镜、胃镜、支气管镜、穿刺组织标本等）。 4．脂肪组织、骨组织和钙化组织。 5．需要依据核分裂计数判断良、恶性的软组织肿瘤。 6．主要根据肿瘤生物学行为特征（如浸润、转移）而不能依据组织形态判断良、恶性的肿瘤。 7．已知具有传染性的标本(例如结核病、病毒性肝炎、艾滋病等)。 8．钳夹、烧灼后的标本不能进行冰冻切片。

四、送检流程 1、预约： 1）项目开展时间为全周，工作时间是上午8:30－下午17:00。遇法定假期以具体通知为主。具体安排为：周一、三、五在本院病理科完成，周二、四、六、日送到金域检验中心病理科完成。推荐冰冻尽量安排在周一、三、五来完成。 2）预约方式：需要进行术中冰冻的临床科室需至少提前一天17:00前预约第二天手术。致电给病理科，登记患者姓名和手术时间等信息。 ① ②、电话预约客服中心(4001-111-120)工作时间为周一至周六8:00-21:00、周日8:00-17:30。 2、手术： 送检保存：手术标本送检冰冻时，无需加固定液，不要沾水，过小标本可用拧后的生理盐水湿棉布包裹防止坏死。 3、配送:由专门医护人员直接将手术标本从手术室送至本院病理科，并做好相关登记。 4、标本处理：标本处理依次经过标本接收、取材、冰冻切片、染色及封片等步骤制作成玻片，处理时间在20分钟内。 5、诊断： ①、病理医生上班时：直接阅片作病理诊断，做出诊断报告不超过10分钟。 ②、病理医生休息时：通过数字化远程病理系统将制片扫描上传，由金域检验中心病理室的病理医生（提前预约好）阅片作病理诊断。金域病理中心在收到远程图片后做出诊断报告不超过10分钟。 6、报告：病理医生做出诊断后，即时发送电话报告或传真报告，随后会再发出一份常规石蜡报告，确保结果准确性。

冰冻切片实验步骤

全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗？？？ 冰冻切片不能用热修复啊！！！ 以下是我的步骤： 1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。 2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色（DAB）。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。

冰冻切片免疫荧光取材

2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。 2.1.5.1 标本制备 1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只， 麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)， 先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上）， 将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳； 2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。 3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水； 脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋； 4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用； 5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。 6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。 7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。 2.1.5.2 免疫荧光染色步骤 1) 取出冰冻切片，室温放置30min，PBS 洗10min×3 次； 2) 0.4%Triton-100 浸泡10min（1000ml PBS+4ml Triton-100）； 3) PBS 洗10min×3 次； 4) 抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）； 5) PBS 洗10min×3 次；用组化笔在距离组织2mm 处划圈； 6) 5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h； 7) 一抗：甩去多余血清，不洗。滴加PBS配置的一抗，4℃过夜。阴性对照用PBS替代一抗； 8) PBS 洗10min×3 次； 9) 二抗：滴加Alexa Fluor488 标记的驴抗羊荧光二抗（均为1：200配置），20~25℃室温避光孵育2h； 10) PBS 洗10min×3 次； 11) Hochest33342 复染核10~20min； 12) PBS 洗10min×3 次； 13)抗荧光衰减封片剂封片，置于避光盒内； 14) Olympus F1000 激光共聚焦显微镜用488nm 波长的激光器激发绿色，计算机进行数据采集和成像。

关于开展术中快速冰冻切片病检的通知

关于开展术中快速冰冻切片病检的通知 各临床科室： 手术中快速冰冻切片病理检查是一项特殊的临床病理急会诊工作。我院与××医院病理科协作，开展术中快速病理冰冻检查，现将相关事宜通知如下： 1、目的： （1）明确送检标本是否有病变； （2）明确病变的性质（良性或恶性或交界性），确定淋巴结是否转移或邻近脏器有无浸润，以便制定手术方案； （3）了解手术切缘有无癌瘤残留，以决定手术范围。 2、预约： 手术前一天由手术者电话预约，预约电话：﹢﹢﹢﹢﹢（科室座机）或﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢（手机）。 已预约申请的患者，如根据术中实际情况或其它原因不再进行快速冰冻切片病理检查时，临床医师应及时通知病理科撤销预约申请。 3、送检标本注意事项： （1）对需做术中冰冻切片病理检查的标本请勿用生理盐水或流水冲洗，请勿固定，离体后尽快送达病理科。 （2)送检肿物要完整，不得只送检部分，否则病理科有权拒收标本。 （3）对于怀疑乳腺导管内病变的标本，请临床手术医师务必在病变导管开口标记（可系线）；对于乳腺不可触及的影像学检查有异常的病变部位请务必标记（可金属针定位）；对于保乳手术的标本，请务必标记切缘。 （4）对于肿物较小的标本请务必做好标记。 （5）对于肿瘤肉眼可见的种植或转移灶或转移的淋巴结，请与肿瘤一并送检，尤其是卵巢肿瘤。 4、收费： 凡送术中冰冻切片病理检查同时也应做常规病理检查。 冰冻﹢﹢元+常规﹢﹢元=﹢﹢元（一个标本）。 5、送检：由检验科协同司机班送检。 6、流程： 手术者术前填写好术中快速病检同意书——患者或家属签字——处置单上账——术中取出的标本、同意书、已上账的处置单一并送病理科——××分钟左右病理科电话反馈快速冰冻病检结果——×天后病理科反馈常规病检结果。 医务科 二〇××年×月×日

冰冻切片

有关细胞和组织学技术 一、细胞和组织 免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十 （一）细胞标本的取材 目前，免疫组化技术已经应用于细胞学诊断，如鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。近年来，培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程度、研究均起到了积极作用。 细胞标本的取材有以下3种方法: 1．印片法主要应用于活组织检查标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，玻片上，立即浸入细胞固定液内5-10min，取出后自然干燥，低温保存备用。 优点是简便省时，细胞抗原保存较好。缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞重叠，影响标记效果。 2．穿刺吸取涂片法主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。用细针穿刺吸抹在载玻片上，力求细胞分布均匀。如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法：将穿刺液滴入盛有1-2ml Hanks液（低速离心5-10min后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（浓度约2×106细胞/ml），吸取1滴于载玻片上，轻轻涂 该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。洗涂法片虽可弥补 3．体液沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。体液采取后，必须量的多少选用不同的处理方法：①细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上。②细胞数量较少者，可将液体自离心10min，弃上清液，将沉淀涂片，略干后固定备用。 如用细胞离心涂片器(Cytospin )，可将标本用上述离心沉淀法制成2×106细胞/ml的细胞悬液，吸取50μl加入细胞分布在直径约6mm的小圆圈内，每个圆圈内的细胞数约105个(Danos,1976)。 培养细胞标本的取材可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些细胞有贴壁生长的特性，如纤维母细入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片法处理。 制备细胞涂片应注意：①标本反复离心洗涤，细胞的粘附性降低，在免疫组化染色过程中容易脱片，因此，试剂和便于镜下观察和记数，应将细胞集中到直径0.6-1.0cm的圆圈内，细胞总数以105个为宜。③粘液丰富的标宜作免疫组化标记。 （二）组织标本的取材 组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜

术中快速冰冻诊断

术中快速冰冻诊断 1、什么叫“冰冻切片”？ 冷冻切片是利用物理降温的方法将新鲜的组织标本冷冻使其产生一定的硬度进行切片的技术方法。与石蜡切片相比，由于冷冻切片不需脱水包埋因此制片速度快，是为手术进行中的临床医师提供病理诊断的良好方法。冷冻切片的不足是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。冷冻切片目前最广泛应用于临床手术中的病理诊断，手术医生根据病理诊断结果决定手术范围。 2、什么叫“术中快速冰冻切片病理诊断（快速活检）”？ 手术中快速活体组织病理学检查是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题请求病理医师快速进行的急会诊，它是一种高技术、高难度、高风险的项目，是临床病理实践中最重要、最难的一项工作。快速活检要求病理医师在很短时间内，根据对切除标本的巨检和组织块快速冷冻切片（或快速石蜡切片）的观察，向手术医师提供的参考性病理诊断意见。与常规石蜡切片的病理诊断相比，快速活检会诊具有更多的局限性和误诊的可能性。有的病例难以快速诊断，需要等待常规石蜡切片进一步明确诊断。因此，应向临床医师说明快速活检的：①局限性、②适用范围、③慎用范围和④不宜应用范围。 3、“快速活检”的适用范围： ①需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤／良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案的标本。 ②了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。 ③确定肿瘤部位的手术切缘有无肿瘤组织残留。 ④确认切除的组织，例如甲状旁腺、输卵管、输精管及异位组织等。 4、“快速活检”的慎用范围： 涉及截肢和其他会严重致残的根治性手术切除的标本。需要此类手术治疗的患者，其病变性质宜于手术前通过常规活检确定。 5、“快速活检”的不宜应用范围： ①疑为恶性淋巴瘤。 ②过小的标本（检材长径≤0.2cm者）。 ③术前易于进行常规活检者。 ④脂肪组织、骨组织和钙化组织。 ⑤需要依据核分裂象计数判断良、恶性的软组织肿瘤。 ⑥主要根据肿瘤生物学行为特征而不能依据组织形态判断良、恶性的肿瘤。 ⑦已知具有传染性的标本（例如结核病、病毒性肝炎、艾滋病等）。

冰冻切片及电镜标本的制备

冰冻切片的制备 一、冰冻切片技术的概述 （一）优点： 1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。 2．快速，用时短。 3．组织变化不大。 4．能很好保存脂肪，类脂等成分。 5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。 （二）缺点： 1．不容易做连续切片。 2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。3．不容易制作较薄的切片。 4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。 （三）主要应用于： 1．用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。 2．用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。 3．用于临床手术的快速病理诊断。 二、冰冻切片机的使用及注意事项 （1）新鲜的组织制备 组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：①CO2气（－78℃）②丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃）③液氮（－190℃）④液氮冷却的丙烷（－19℃）。液氮适用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。（2）固定组织的制备 为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。 电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4％缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7．）84ml；蔗糖8g）固定较好。这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。 （3）恒冷箱温度 一般在冷冻后10分钟，到接近冷室温度时再切，一般组织在－15～－20℃切片最易成功。每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度，Pearse及Bancroft的经验如下：组织刀温度组织温度恒冷箱温度 肝-18 -10 -5

术中快速冰冻知情同意书

徐州矿务集团总医院 术中冰冻切片检查知情同意书 患者姓名性别年龄病区床号住院号 手术中冰冻切片检查是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题请求病理医师快速进行的紧急会诊，是将手术中切下的病变组织在冰冻切片机中迅速冻硬后制成切片供显微镜下病理检查，要求病理医师在短时间内，根据对切除标本快速冰冻切片观察后，向手术医师提供参考性病理学诊断意见，以决定下一步治疗的方案。限于医学技术的发展水平，目前冰冻切片的诊断准确率有限。 1. 冰冻切片诊断仅为手术医师提供参考意见，具有局限性，准确率一般在95%左右。2．休积较大的肿瘤发生局灶性恶变时，因冰冻切片时难以全部取材而可能未发现。 3．一些病变单靠冰冻切片难以鉴别良恶性，为防止对患者造成不必要的损伤，病理医师遇到不典型或可疑恶性时会在冰冻报告中提示等待常规石蜡诊断。 4. 冰冻报告不能作为最后诊断，最后诊断必须等待石蜡切片。 5．冰冻报告与常规石蜡切片报告可能不一致，此时以石蜡切片诊断报告为准。手术方案有可能因此发生改变。 6．送检下列标本者请注意:①骨组织、皮肤组织及过小的组织原则上不宜做冰冻切片；②淋巴结病变、依靠核分裂像计数判断良恶性的某些软组织肿瘤(如平滑肌肿瘤)及主要依赖于侵袭或转移才能判断为恶性的肿瘤，一般需做常规石蜡切片确诊；③脑组织含水量多，冰冻切片质量较差，诊断可能有难度。 由于上述原因，当冰冻切片不能达到预期的目的时，需患者及家属谅解。同时患者有权选择快速的术中冰冻切片病理检查，也可选择更精确的常规石蜡切片病理检查。常规检查一般需5天出报告（节假日顺延）。 医师签名：签署日期：20 年月日 医师已经告知我将要进行的检查方法、检查存在的潜在风险、可能存在的其他诊疗方法并且解答了我关于此次检查的相关问题。愿意接受手术中冰冻切片检查。 患者签名： 若患者无法签署，请其授权委托人或法定监护人签名：与患者的关系：

如何做好术中快速冰冻病理切片

如何做好术中快速冰冻病理切片 发表时间：2011-12-27T11:18:24.860Z 来源：《中外健康文摘》2011年第37期供稿作者：阮顺爱蔡爱英唐雅[导读] 术中快速冰冻染片用的苏木素须是新鲜配制的。 阮顺爱蔡爱英唐雅（福建省莆田市第一医院病理科福建莆田 351100） 【中图分类号】R472【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）37-0275-02 病理术中快速冷冻切片的优劣，直接关系到疾病的取舍，对病人至关重要。如何做好术中快速病理冷冻切片，笔者通过较长时间的实践与探索认为除了送检标本要新鲜外还有“三”个直接处理；不同的组织调整不同的冷冻时间；更新冰冻切片机设备及配备切片技术熟练的技术员进行冰冻切片操作等方法，有效提高了冰冻切片质量和诊疗工作质量，从而得到临床医生的充分认可和信任。 1.“三”个直接处理 1.1样本直接放置在冷冻头上，把包埋剂围绕在样本周围。 1.2直接在冷冻台上修整蜡块。 1.3冷冻切片组织平铺贴在玻片上后直接进行文火烘烤，然后再进入固定环节，这样就避免了脱片的危险。 2.有时同一部位有多块小组织须同时进行术中快速病理检查，如电切的前列腺组织，为节约时间，可将多块组织放在同一个冷冻头上，但要注意所有组织要在同一水平面上。 3.根据不同的组织调整不同的冷冻时间。（冰冻机恒温在负22—25度）。如甲状腺、前列腺组织则速冻时间稍短，一般3—5分钟即可，当然若组织块较大，速冻时间相对延长一些。但这些组织若速冻时间过长则切出的片会形成诸多大小不等的空洞而严重影响诊断，当出现空洞时可用拇指按压在组织块上2—3秒，使组织温度回升，再行切片。又如含脂肪较多的乳腺组织、淋巴结组织等则应相对延长速冻时间。一般8—15分钟，尤其是纯脂肪组织和畸胎瘤组织则冰冻时间相对更长。 4.为防止冷冻切片中出现“冰晶”，一般采取急速降温，并进行“快冻”“快切”。 5.冰冻机设备要现代化。俗话说“巧妇难为无米之炊”。若术中快速冷冻切片机设备简陋加上技术操作不过关，将明显影响冰冻切片质量而影响诊断结果。 6.术中快速冰冻染片用的苏木素须是新鲜配制的。 总之，病理学对疾病的确诊与鉴别具有极其重要的价值，但病理形态学本身同样存在着明显的局限性、相似性和模糊性。若切片质量差，势必增加术中快速诊断的风险，所以必须认真做好术中快速冷冻病理切片。 参考文献 [1]郭凤英，秦景.《影响冷冻切片技术的常规问题及处理》，宁夏医学院学报，2001、23.

免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)

免疫组化技术 原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 分类（常用） 1、免疫荧光方法 最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。 2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。 3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法 标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片

手术中快速冰冻切片检查知情同意书

手术中快速冰冻切片检查知情同意书

手术中快速冰冻切片检查须知 手术中快速活体组织病理学检查（快速活检）是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题请求病理医师快速进行的急会诊，需要临床医师与病理医师间的密切合作。故临床医师、患者及其家属应当明确快速活检的：①局限性、②适用范围、③慎用范围和④不宜应用范围。 一、局限性 快速活检要求病理医师在很短时间内（30～40分钟），根据对切除标本的巨检和组织块快速冷冻切片的观察，向手术医师提供的参考性病理诊断意见。由于冷冻切片取材有限，时间有限，制片质量有限，与常规石蜡切片的病理诊断相比，快速活检会诊具有更多的局限性和误诊的可能性，准确率在95%左右。有的病例难以快速诊断，需要等待常规石蜡切片进一步明确诊断。 二、适用范围 1.需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤／良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案的 标本。 2.了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。 3.确定肿瘤部位的手术切缘有无肿瘤组织残留。 4.确认切除的组织，例如甲状旁腺、输卵管、输精管及异位组织等。 三、慎用范围 涉及截肢和其他会严重致残的根治性手术（例如喉癌、阴茎癌等）切除的标本。需要此类手术治疗的患者，其病变性质宜于手术前通过常规活检确定。 四、不宜应用范围 1.疑为恶性淋巴瘤。 2.过小的标本（检材长径≤0.2cm者）。 3.术前易于进行常规活检者（例如胃癌、肠癌、肺癌等可通过内窥镜活检术前诊断）。 4.脂肪组织、骨组织和钙化组织。 5.需要依据核分裂象计数判断良、恶性的软组织肿瘤（例如子宫平滑肌肉瘤）。 6.主要根据肿瘤生物学行为特征而不能依据组织形态判断良、恶性的肿瘤（例如甲状 腺滤泡腺癌、某些乳头状癌）。 7.已知具有传染性的标本（例如结核病、病毒性肝炎、艾滋病等）。 以上内容，临床医师应于手术前向患者和／或患者授权人说明快速活检的意义和局限性等，取得患者和／或患方的知情和理解。患者和／或患者授权人应在由医院制定的《手术中快速冰冻切片检查知情同意书》签署意见和签名。 摘自《临床技术操作规范》（病理学分册）P10-11

免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)

免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
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